專利名稱：增強(qiáng)基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)中的基因免疫，特別是涉及能增強(qiáng)基因免疫效果的載體與方法及其在抗體生產(chǎn)、疫苗制備及免疫接種方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的原理是根據(jù)APC介導(dǎo)B細(xì)胞及T細(xì)胞免疫反應(yīng)的基本原理、抗原-抗體復(fù)合物增強(qiáng)APC抗原呈遞效果的事實(shí)，將抗原與Fc段融合，借Fc段將抗原導(dǎo)向APC，從而增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫反應(yīng)，并通過(guò)這種增強(qiáng)了的免疫反應(yīng)，使DNA疫苗產(chǎn)生更好的保護(hù)性或治療效果，同時(shí)還可以用核酸免疫制備高效價(jià)的抗血清。
本發(fā)明所述的APC介導(dǎo)B細(xì)胞及T細(xì)胞免疫反應(yīng)的基本原理是通過(guò)基因免疫誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生加強(qiáng)的免疫反應(yīng)，一般都涉及到多種細(xì)胞及分子的復(fù)雜過(guò)程。DNA疫苗可以通過(guò)幾個(gè)不同的途徑誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，其中一個(gè)途徑是DNA疫苗進(jìn)入注射部位的細(xì)胞(比如肌細(xì)胞或上皮細(xì)胞)，這些細(xì)胞表達(dá)并釋放疫苗編碼的抗原，根據(jù)疫苗載體的不同，表達(dá)的抗原或者通過(guò)分泌過(guò)程以完整的蛋白而釋放，或者表達(dá)在這些細(xì)胞的膜表面。假若這些細(xì)胞因某種原因而死亡，其表達(dá)的蛋白也會(huì)釋放出來(lái)。這些不同來(lái)源的細(xì)胞外抗原與細(xì)胞表面(通過(guò)細(xì)胞表面IgM或非Ig受體)結(jié)合，然后抗原與受體的復(fù)合物被吞噬細(xì)胞外抗原也可通過(guò)胞飲機(jī)理進(jìn)入APC系統(tǒng)。在與APC結(jié)合之前、之后或過(guò)程中，抗原有被細(xì)胞外間隙的蛋白酶降解的可能。總之，DAN疫苗產(chǎn)生的抗原進(jìn)入APC，在APC內(nèi)被加工，與MHCI及MHCII型抗原相結(jié)合形成抗原-MHC復(fù)合物，然后活化CD4+T(Th1及/或Th2)細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。由于B細(xì)胞的活化、增殖、分化以及其Ig類型轉(zhuǎn)換都需要CD4+T細(xì)胞的協(xié)助，將抗原以抗原-MHC II復(fù)合物的方式呈遞給B細(xì)胞，對(duì)產(chǎn)生抗原特異性抗體至關(guān)重要。正就是通過(guò)這一途徑，DNA疫苗除了具有能夠活化CD8+CTL的功能外，還能夠刺激CD4+T細(xì)胞。
另外一個(gè)平行的途徑是DNA疫苗進(jìn)入APC或其它組織細(xì)胞并表達(dá)抗原，抗原在APC胞漿內(nèi)被蛋白酶降解，由此產(chǎn)生的蛋白片段被TAP-1及TAP-2所識(shí)別，轉(zhuǎn)運(yùn)至粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)腔，與MHC I形成復(fù)合物并表達(dá)于APC表面，被具有特異性T細(xì)胞受體的CD8+CTL識(shí)別，在與其它適當(dāng)因子的協(xié)調(diào)下，這種CD8+CTL分化為具有活性功能的CTL。
DNA疫苗還可以誘導(dǎo)那些結(jié)合了或者吞噬了其編碼的抗原的細(xì)胞因子。APC與抗原的相互作用會(huì)刺激對(duì)相關(guān)細(xì)胞具有正反饋效果的細(xì)胞因子，比如使CD4+Th細(xì)胞分化增殖為Th1及Th2的細(xì)胞因子。因此，在DNA疫苗中除了抗原的基因外，有的還包括一種或幾種編碼細(xì)胞因子的基因。
總之，B細(xì)胞參與體液免疫，產(chǎn)生抗體；T細(xì)胞參與細(xì)胞免疫并輔助B細(xì)胞成為可以產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞。一個(gè)高效價(jià)、長(zhǎng)期的保護(hù)性免疫需要T細(xì)胞的活化。其它免疫活性細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、以及其它APC在介導(dǎo)B細(xì)胞的成熟、T細(xì)胞的活化等免疫反應(yīng)中也起著至關(guān)重要的作用。不同的APC可以誘導(dǎo)T細(xì)胞不同程度的反應(yīng)。之所以有這種量上的差別，其釋放的細(xì)胞因子的作用不可忽視。
本發(fā)明所述的抗原-抗體復(fù)合物增強(qiáng)APC抗原呈遞效果的事實(shí)為疫苗的免疫效果取決于對(duì)淋巴細(xì)胞的抗原呈遞的有效性。由于網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞可以通過(guò)激活靜態(tài)T細(xì)胞而誘發(fā)初次免疫反應(yīng)，因此網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞具有抗原呈遞效果。將抗原導(dǎo)向APC上的特異性受體可以影響抗原在細(xì)胞內(nèi)的加工過(guò)程，從而也會(huì)影響到所產(chǎn)生的多肽片段的性質(zhì)，以及這些片段與MHC I、MHC II分子結(jié)合的效果，還有它們刺激的T細(xì)胞的類型。所以，將抗原特異地導(dǎo)向APC是增強(qiáng)疫苗免疫效果的有力措施。
本發(fā)明所述的增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫發(fā)應(yīng)的原理是抗原和其它可與APC表面結(jié)合的導(dǎo)向分子相連接可增強(qiáng)APC對(duì)抗原的攝取。這些導(dǎo)向分子包括C3b、β-2微球蛋白、IgFc受體特異性抗獨(dú)特型抗體、以及MHC II型分子等。免疫球蛋白Fc片段可與APC以及B細(xì)胞表面的特異性Fc受體(FcR)相結(jié)合。Fc片段位于每一免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)，由鉸鏈區(qū)一部分、CH2、及CH3功能區(qū)組成。不同類型的免疫球蛋白的Fc段的DNA序列具有交叉同源性。單核細(xì)胞及網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞等APC細(xì)胞表面的FcR介導(dǎo)的抗原呈遞反應(yīng)具有不可忽視的作用，它們可以有效地引起T細(xì)胞的活化。當(dāng)抗原-抗體復(fù)合物與單核巨噬細(xì)胞表面的FcR結(jié)合后，抗原進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，接著被加工、呈遞，使其活化T細(xì)胞的效應(yīng)大大增強(qiáng)，只需1/100至1/10的抗原量就可引起同樣強(qiáng)大的T細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明是采用含有嵌合DNA的質(zhì)粒在體內(nèi)表達(dá)可以導(dǎo)向APC表面FcR的由抗原及Ig的Fc段組成的以肽鍵聯(lián)結(jié)的融合蛋白，并用編碼抗原的核酸免疫。
本發(fā)明所述的嵌合DNA分子是插在含有蛋白轉(zhuǎn)錄及翻譯的調(diào)控序列的真核表達(dá)載體中的，比如啟動(dòng)子及多聚A等；嵌合DNA分子含有SP、IE、靶蛋白(抗原)及Fc。
本發(fā)明所述的Fc段來(lái)源于不同類型的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)包括鉸鏈區(qū)在內(nèi)的C-端部分，其含有與FcR全部或者部分結(jié)合序列的結(jié)合位點(diǎn)，能與抗原融合并將其導(dǎo)向B細(xì)胞及APC而促進(jìn)APC對(duì)抗原的攝取及加工。
本發(fā)明所述的靶抗原包括病毒、細(xì)菌抗原、真菌抗原、原蟲及其它寄生蟲抗原、腫瘤抗原、自身免疫性抗原、過(guò)敏性抗原、移植排斥抗原、任何異源性(抗原性)蛋白質(zhì)等。
本發(fā)明嵌合DNA分子的SP是位于融合蛋白N-端的任何蛋白的信號(hào)肽，有助于融合蛋白的翻譯、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)及釋放。分泌的蛋白質(zhì)經(jīng)多肽酶的作用除去SP。
本發(fā)明嵌合DNA分子的IE是由T細(xì)胞抗原位點(diǎn)組成并位于SP之后激活T細(xì)胞。如果抗原本身含有SP，則可直接將抗原與Fc融合而不要載體提供的SP；或者可除去抗原的SP，再將不含SP的抗原與載體的SP-IE相連。如果抗原分子足夠大，并有較強(qiáng)的T細(xì)胞位點(diǎn)，可不要載體上的IE。如果抗原是個(gè)小分子并缺乏T細(xì)胞位點(diǎn)，載體上的IE就會(huì)起到很大的作用。
本發(fā)明所述的載體是指由常規(guī)真核表達(dá)載體所具有的關(guān)鍵構(gòu)件和抗原與Fc段的融合體之前的一個(gè)信號(hào)肽片段SP及一個(gè)免疫增強(qiáng)片段IE組成，本發(fā)明將上述載體稱為pseFc(見

圖1)。
本發(fā)明所述的常規(guī)真核表達(dá)載體是指任何含有抗原及Fc、可以自我復(fù)制、含有基因表達(dá)以及質(zhì)粒在原核細(xì)胞內(nèi)增殖的關(guān)鍵部件的核酸序列，包括線型核酸、質(zhì)粒、噬菌體及各種不同的DNA和/或RNA病毒載體。
本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)是指由肽鍵聯(lián)在一起的與長(zhǎng)度及翻譯后是否修飾(如糖基化、磷酸化)無(wú)關(guān)的兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸。
本發(fā)明所述的編碼抗原的核酸片段是指編碼已知的和/或未知的蛋白的基因片段，比如病原體抗原以及腫瘤抗原等，抗原可以是一個(gè)，也可以是多個(gè)同源或異源性抗原的串聯(lián)。
本發(fā)明所述的機(jī)體包括嚙齒類及非嚙齒類，即所有的脊椎動(dòng)物，如靈長(zhǎng)類及人類。
本發(fā)明在免疫方面的應(yīng)用如下A、通過(guò)將來(lái)自同屬或者不同種屬的編碼抗原的基因片段與編碼免疫球蛋白Fc段的基因片段可以前后順序互換地連接到一起，誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)抗原產(chǎn)生高效的細(xì)胞免疫反應(yīng)及保護(hù)性抗體反應(yīng)。
B、通過(guò)非蛋白類抗原在體內(nèi)制備出用于科研或者疾病的診斷和治療的抗體。
C、通過(guò)在體內(nèi)表達(dá)的抗原-Fc融合體來(lái)直接制備不需在體內(nèi)表達(dá)及純化的已知抗原的抗體或者未知抗原的抗體。
D、通過(guò)核酸免疫制備高效價(jià)的抗血清。
附圖及圖面說(shuō)明圖1 pseFc載體結(jié)構(gòu)示意2 HIV-1gp120基因疫苗結(jié)構(gòu)示意3 HIV-1gp120 誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)圖4 HIV-1Gag基因疫苗結(jié)構(gòu)示意5 HIV-1Gag 誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)圖6 pesMucl基因疫苗結(jié)構(gòu)示意7 誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)本發(fā)明的抗原與Fc是通過(guò)重組DNA技術(shù)在體內(nèi)直接產(chǎn)生并以肽鍵相連接的，其結(jié)合牢固而穩(wěn)定，既提供了高效的機(jī)體保護(hù)性反應(yīng)，同時(shí)又對(duì)機(jī)體無(wú)副作用；利用基因制備的抗體，其抗原不需在體外表達(dá)及純化；通過(guò)在體內(nèi)表達(dá)抗原-Fc融合蛋白的增強(qiáng)DNA疫苗，不是用抗原免疫，而是用編碼抗原的核酸免疫機(jī)體，可在體內(nèi)產(chǎn)生分泌性蛋白，不管這種分泌性融合蛋白是由APC還是非APC產(chǎn)生，它都可被導(dǎo)向APC，從而提高了抗原的穩(wěn)定性，增高了抗原的免疫原性，加強(qiáng)了抗原與APC的相互作用以及APC對(duì)抗原的攝取和呈遞。
以4只3周大的Balb/c小鼠為一組，于前腿肌肉注射100微克的pse120Fc、pse120或pseFc，2周后用同一質(zhì)粒再加強(qiáng)免疫一次。初次免疫后第4周采血，用ELISA夾心法檢測(cè)HIV-lgp120的特異性抗體。結(jié)果pse120Fc及pse120組血清中HIV-lgp120的特異性抗體效價(jià)分別為16561和1234；pseFc組的血清中沒(méi)有HIV-1gp120的特異性抗體(見圖3)。
實(shí)施例2HIV-lGagDNA疫苗對(duì)Balb/c小鼠的免疫原性把HIV-1pNL4-3毒株Gag的基因插于pseFc載體的KpnI和XhoI位點(diǎn)，IE及Fc之間，或者插于pseFc載體的KpnI和XhoI位點(diǎn)，IE之后而無(wú)Fc，形成的疫苗分別叫做pseGagFc及pseGag(見圖4)。質(zhì)粒DNA是由Qiagen公司的Max試劑盒制備。
以4只3周大的Balb/c小鼠為一組，于前腿肌肉注射100微克的pseGagFc、pseGag或pseFc，2周后用同一質(zhì)粒再加強(qiáng)免疫一次。初次免疫后第4周采血，用裂解的HIV-1Gag病毒顆粒為抗原通過(guò)Western雜交法檢測(cè)對(duì)HIV-1Gag的特異性抗體。結(jié)果以pseGagFc組的HIV-1Gag的特異性抗體效價(jià)為100，pseGag組的血清中HIV-1Gag的特異性抗體效價(jià)則為12；pseFc組的血清中沒(méi)有HIV-1Gag的特異性抗體(見圖5)。
實(shí)施例3Mucl20肽DNA疫苗對(duì)Balb/c小鼠的免疫原性人的Mucl基因編碼一個(gè)20氨基酸的多肽(PDTRPAPGATAPPAHGVTSA)，我們把Mucl 20個(gè)氨基酸的編碼基因插于pseFc載體的HindIII和XhoI位點(diǎn)，IE及Fc之間，或者插于pseFc載體的HindIII和XhoI位點(diǎn)，IE之后而無(wú)Fc，形成的疫苗分別叫做pseMuclFc及pseMucl(見圖6)。質(zhì)粒DNA是由Qiagen公司的Max試劑盒制備。
以4只3周大的Balb/c小鼠為一組，于前腿肌肉注射100微克的pseMuclFc、pseMucl或pseFc，2周后用同一質(zhì)粒再加強(qiáng)免疫一次。初次免疫后第4周采血，用細(xì)菌表達(dá)的GST-Mucl蛋白通過(guò)Western雜交法檢測(cè)對(duì)Mucl的特異性抗體。結(jié)果以pseMuclFc組的Mucl特異性抗體效價(jià)為100，pseMucl組血清中Mucl的特異性抗體效價(jià)則小于2；pseFc組的血清中沒(méi)有Mucl的特異性抗體(見圖7)。
本發(fā)明的抗原與Fc以肽鍵相連接，其結(jié)合牢固而穩(wěn)定，既提供了高效的機(jī)體保護(hù)性反應(yīng)，同時(shí)又對(duì)機(jī)體無(wú)副作用；利用基因制備的抗體，其抗原不需在體外表達(dá)及純化；加強(qiáng)的DNA疫苗不是用抗原免疫，而是用編碼抗原的核酸免疫機(jī)體，可在體內(nèi)產(chǎn)生分泌性蛋白，不管這種分泌性融合蛋白是由APC還是非APC產(chǎn)生，它都可被導(dǎo)向APC，從而提高了抗原的穩(wěn)定性，增高了抗原的免疫原性，加強(qiáng)了抗原與APC的相互作用以及APC對(duì)抗原的攝取和呈遞。
權(quán)利要求
1.增強(qiáng)基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應(yīng)用，其特征在于采用含有嵌合DNA的質(zhì)粒在體內(nèi)表達(dá)可以導(dǎo)向APC表面FcR的由抗原及Ig的Fc段組成的以肽鍵聯(lián)結(jié)的融合蛋白，并用編碼抗原的核酸免疫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應(yīng)用，其特征在于嵌合DNA分子是插在含有蛋白轉(zhuǎn)錄及翻譯的調(diào)控序列的真核表達(dá)載體中的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應(yīng)用，其特征在于Fc段來(lái)源于不同類型的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)包括鉸鏈區(qū)在內(nèi)的C-端部分，其含有與FcR全部或者部分結(jié)合序列的結(jié)合位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應(yīng)用，其特征在于嵌合DNA分子的SP是位于融合蛋白N-端的任何蛋白的信號(hào)肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應(yīng)用，其特征在于嵌合DNA分子的IE是由T細(xì)胞抗原位點(diǎn)組成并位于SP之后激活T細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應(yīng)用，其特征在于載體是指由常規(guī)真核表達(dá)載體所具有的關(guān)鍵構(gòu)件和抗原與Fc段的融合體之前的一個(gè)信號(hào)肽片段SP及一個(gè)免疫增強(qiáng)片段IE組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應(yīng)用，其特征在于通過(guò)將來(lái)自同屬或者不同種屬的編碼抗原的基因片段與編碼免疫球蛋白Fc段的基因片段可以前后順序互換地連接到一起，誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)抗原產(chǎn)生高效的細(xì)胞免疫反應(yīng)及保護(hù)性抗體反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應(yīng)用，其特征在于通過(guò)非蛋白類抗原在體內(nèi)制備出用于科研或者疾病的診斷和治療的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應(yīng)用，其特征在于通過(guò)在體內(nèi)表達(dá)的抗原-Fc融合體來(lái)直接制備不需在體內(nèi)表達(dá)及純化的已知抗原的抗體或者未知抗原的抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應(yīng)用，其特征在于通過(guò)核酸免疫制備高效價(jià)的抗血清。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種增強(qiáng)基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方方面的應(yīng)用，采用含有嵌合DNA的質(zhì)粒在體內(nèi)表達(dá)可以導(dǎo)向APC表面FcR的由抗原及Ig的Fc段組成的以肽鍵聯(lián)結(jié)的融合蛋白，從而增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)的體液免疫及細(xì)胞免疫效應(yīng)，通過(guò)增強(qiáng)的免疫反應(yīng)，DNA疫苗可以產(chǎn)生更好的保護(hù)性或治療效果，同時(shí)，還可以用核酸免疫制備高效價(jià)的抗血清。
文檔編號(hào)C12N15/79GK1442482SQ0211342
公開日2003年9月17日 申請(qǐng)日期2002年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月6日
發(fā)明者余力, 張明杰 申請(qǐng)人:余曉紅