專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基因芯片上的酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因芯片信號(hào)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因芯片上的酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
基因芯片技術(shù)大致包括四個(gè)部分樣品的前期處理、芯片制作、制作后的生物學(xué)反應(yīng)、信號(hào)檢測(cè)。信號(hào)檢測(cè)是基因芯片技術(shù)中一個(gè)不可或缺的組成部分，目前已經(jīng)有多種芯片信號(hào)檢測(cè)方法，主要包括熒光檢測(cè)法、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法、質(zhì)譜檢測(cè)法、納米放大信號(hào)檢測(cè)技術(shù)等。熒光信號(hào)檢測(cè)方法是目前應(yīng)用最多的基因芯片信號(hào)檢測(cè)方法，普通的熒光掃描儀可以在半徑100微米的區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到10-18mol熒光分子，符合高密度、高通量的基因芯片信號(hào)檢測(cè)的要求，但高靈敏度也帶來(lái)了高背景等問(wèn)題，特別是采用該方法進(jìn)行基因芯片信號(hào)檢測(cè)需要價(jià)格不菲等專(zhuān)門(mén)檢測(cè)儀器；20世紀(jì)90年代后期，有研究報(bào)道通過(guò)質(zhì)譜對(duì)基因芯片的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)該方法可以檢測(cè)到10-12-10-15mol核酸分子，所獲得的信號(hào)檢測(cè)結(jié)果精確度高，但采用該方法需要質(zhì)譜儀，操作復(fù)雜，目前僅限制在有關(guān)的科研院校中使用；采用化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)方法檢測(cè)核酸需要對(duì)核酸進(jìn)行相關(guān)化學(xué)修飾，而且必需專(zhuān)門(mén)的信號(hào)檢測(cè)儀器，因而該方法在基因芯片信號(hào)檢測(cè)應(yīng)用上的報(bào)道較少；隨著納米技術(shù)的發(fā)展以及納米技術(shù)與生物技術(shù)的相互融合，近幾年出現(xiàn)了一種基因芯片上的納米放大信號(hào)檢測(cè)技術(shù)，有文獻(xiàn)報(bào)道用納米金進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，結(jié)合銀染方法，核酸檢測(cè)靈敏度可高出熒光檢測(cè)方法兩個(gè)數(shù)量級(jí)，但該方法尚處于發(fā)展初期，離實(shí)用化還有一定距離。
綜上所述，研究者們一直在為尋找實(shí)用化的基因芯片信號(hào)檢測(cè)方法而努力，但以上幾種方法都難以實(shí)現(xiàn)實(shí)用化這一目標(biāo)。
2002年，首次出現(xiàn)了酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)技術(shù)在基因芯片上應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道。酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的傳統(tǒng)的信號(hào)檢測(cè)技術(shù)之一，其基本技術(shù)流程為在待檢測(cè)的核酸中摻入半抗原生物素；通過(guò)化學(xué)交聯(lián)方法將親和素(或鏈霉親和素)與信號(hào)檢測(cè)用酶(堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶等)交聯(lián)在一起；用交聯(lián)產(chǎn)物親和素-堿性磷酸酶(或辣根過(guò)氧化物酶等)進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，利用親和素(鏈霉親和素)與核酸中的生物素的特異性作用將信號(hào)檢測(cè)用酶引入核酸，酶催化底物(如5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氯化硝基四氮唑藍(lán)混合液)產(chǎn)生顏色反應(yīng)。與熒光等方法相比較而言，該方法信號(hào)檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，因此很難在高密度基因芯片上進(jìn)行應(yīng)用；但其核酸檢測(cè)靈敏度可達(dá)1-5皮克，能夠滿足中低密度基因芯片(≤400點(diǎn)/cm2)信號(hào)檢測(cè)的要求，而且該方法操作簡(jiǎn)便，可根據(jù)顏色的有無(wú)判斷生化反應(yīng)的結(jié)果，結(jié)合簡(jiǎn)易型信號(hào)檢測(cè)儀即可進(jìn)行定量或半定量分析，易于推廣應(yīng)用；2000年，本研究室邵文海等人報(bào)道了一種可定向交聯(lián)堿性磷酸酶與鏈霉親和素的方法(Wen-Hai Shao et al.，Anchor-Chain Molecular System forOrientation Control in Enzyme Immobilization.Bioconjugate Chem.2000，11，822-826)，通過(guò)該方法實(shí)現(xiàn)了堿性磷酸酶與鏈霉親和素(Straptactin)的定向交聯(lián)。采用堿性磷酸酶-連接肽-鏈霉結(jié)合肽(II型)融合蛋白與鏈霉親和素的定向交聯(lián)復(fù)合物進(jìn)行酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)，核酸檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1皮克(圖2)，信號(hào)檢測(cè)的穩(wěn)定性和重復(fù)性也有很大提高。因此酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)方法可望發(fā)展成為實(shí)用化的中低密度基因芯片信號(hào)檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基因芯片上的酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)方法。首先制作好有關(guān)基因芯片，并進(jìn)行芯片生化反應(yīng)，在反應(yīng)過(guò)程中引入生物素；芯片生化反應(yīng)結(jié)束后，采用堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物或自行制備的堿性磷酸酶-連接肽-鏈霉結(jié)合肽-鏈霉親和素復(fù)合物進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)；在信號(hào)檢測(cè)過(guò)程中，對(duì)酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)方法的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，簡(jiǎn)化反應(yīng)步驟，提高了信號(hào)檢測(cè)的穩(wěn)定性和重復(fù)性；通過(guò)采用自行制備的堿性磷酸酶-連接肽-鏈霉結(jié)合肽-鏈霉親和素定向交聯(lián)復(fù)合物進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，提高了信號(hào)檢測(cè)靈敏度。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施。首先根據(jù)以下步驟制作基因芯片并進(jìn)行芯片PCR等生化反應(yīng)，在反應(yīng)過(guò)程中引入生物素A)首先通過(guò)氫氟酸蝕刻，在普通載玻片上制作點(diǎn)陣；其次對(duì)載玻片進(jìn)行巰基硅烷化修飾；B)合成相關(guān)引物，對(duì)引物的5’末端進(jìn)行二硫鍵修飾；通過(guò)二硫鍵修與巰基的交換反應(yīng)將引物固定于載玻片，形成引物陣列；至此基因芯片制作完畢；C)在基因芯片上構(gòu)建生化反應(yīng)室，進(jìn)行芯片PCR等生化反應(yīng)，在反應(yīng)過(guò)程中引入生物素。芯片PCR等生化反應(yīng)結(jié)束后，采用堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物或堿性磷酸酶-連接肽-鏈霉結(jié)合肽-鏈霉親和素復(fù)合物，按下述步驟進(jìn)行芯片信號(hào)檢測(cè)a)用溶液I(10mM Tris-HCl，pH7.5；150mM NaCl，0.05％Tween-20)37℃漂洗芯片5分鐘，洗去非特異性結(jié)合的核酸；b)以溶液II(100mM Tris-HCl，pH7.5；150mMNaCl，50mg/ml BSA)37℃封阻芯片10分鐘，防止信號(hào)檢測(cè)酶的非特異性吸附；c)堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物或堿性磷酸酶-連接肽-鏈霉結(jié)合肽-鏈霉親和素復(fù)合物在芯片上37℃作用10分鐘，使復(fù)合物中的親和素或鏈霉親和素與芯片上DNA中的生物素充分作用；d)以溶液I 37℃漂洗芯片兩次，每次10分鐘，除去非特異性吸附的堿性磷酸酶復(fù)合物；e)在芯片上滴加5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)/氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)混合液，其中BCIP與NBT的終濃度均為200微克/毫升，于37℃下反應(yīng)，30分鐘以?xún)?nèi)出現(xiàn)藍(lán)紫色陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果。由上可知，在研究過(guò)程中，我們對(duì)酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)方法進(jìn)行了以下優(yōu)化將酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)方法中所有步驟的反應(yīng)溫度恒定于37℃；配置新的通用洗脫液(溶液I)，在每個(gè)洗脫步驟中應(yīng)用；省去了傳統(tǒng)酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)過(guò)程中底物緩沖液洗滌這一步驟。通過(guò)上述手段，增加了信號(hào)檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性，使其更適合于中低密度基因芯片的信號(hào)檢測(cè)。
本發(fā)明與其他基因芯片信號(hào)檢測(cè)技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果本方法的核酸檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1皮克，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，特別適合中低密度基因芯片的信號(hào)檢測(cè)；本方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快，整個(gè)操作流程僅需70分鐘，可根據(jù)顏色的有無(wú)判斷生化反應(yīng)的結(jié)果，結(jié)合簡(jiǎn)易型信號(hào)檢測(cè)儀即可進(jìn)行定量或半定量分析，因此本發(fā)明易于推廣應(yīng)用，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成基因芯片信號(hào)檢測(cè)試劑盒。


圖1.優(yōu)化后酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)方法的靈敏度檢驗(yàn)結(jié)果a為陽(yáng)性對(duì)照，采用商品化堿性磷酸酶作為信號(hào)檢測(cè)用酶；B為采用定向交聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)所得結(jié)果；I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX，分別對(duì)應(yīng)不同DNA(摻入生物素)量25納克、5納克、1納克、100皮克、50皮克、10皮克、0.5皮克、0.1皮克；X為陰性對(duì)照。
圖2.芯片PCR電泳結(jié)果
M為DNA Marker DL-20001號(hào)泳道為芯片PCR液相產(chǎn)物；2號(hào)泳道和3號(hào)泳道均為玻片PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2號(hào)摻入生物素，3號(hào)未摻入生物素。
圖3.芯片半巢式PCR酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)結(jié)果采用優(yōu)化后酶標(biāo)方法進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)； 為陽(yáng)性對(duì)照，點(diǎn)加未經(jīng)二硫鍵修飾內(nèi)引物； 為陽(yáng)性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)核菌rpoB基因芯片PCR結(jié)果。其步驟是1、對(duì)普通載玻片進(jìn)行巰基硅烷化修飾后，固定rpoB基因特異性引物W10685(5’-TTTTTTTTTTAGTTCTTCGGCACCAGCCAG-3’)，形成引物陣列(芯片)根據(jù)結(jié)核菌rpoB基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)外引物(上游引物為5’-CAGACCACGATGACCGTTCC-3’，編號(hào)54684下游引物為5’-GAGCCGATCAGACCGATGTT-3’，編號(hào)54685)在PCR反應(yīng)液中加入一對(duì)外引物，使PCR反應(yīng)在引物陣列上進(jìn)行，PCR過(guò)程中摻入生物素，液相擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖-2；2、采用堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物，按下述步驟進(jìn)行酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)①用溶液I在37℃下漂洗芯片5分鐘，除去非特異性結(jié)合于芯片上的核酸和生物素；②以溶液II在37℃下封阻芯片10分鐘，防止堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物在芯片上的非特異吸附；③用堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物37℃下在芯片上作用10分鐘，使其充分與芯片上DNA中的生物素充分結(jié)合④以溶液I37℃漂洗兩次，10分鐘每次，洗脫非特異性結(jié)合于芯片上的堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物⑤在芯片上滴加5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)/氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)混合液，其中BCIP與NBT的終濃度均為200微克/毫升，于37℃下反應(yīng)，30分鐘以?xún)?nèi)出現(xiàn)藍(lán)紫色陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種基因芯片上的酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟1)制作基因芯片并進(jìn)行芯片生化反應(yīng)，在反應(yīng)過(guò)程中引入生物素；具體包括以下步驟A.首先在普通載玻片上制作點(diǎn)陣；其次對(duì)載玻片進(jìn)行巰基硅烷化修飾；B.合成相關(guān)引物，對(duì)引物的5’末端進(jìn)行二硫鍵修飾；將修飾后引物固定于載玻片，形成引物陣列，基因芯片制作完畢；C.在基因芯片上構(gòu)建生化反應(yīng)室，進(jìn)行芯片生化反應(yīng)，在反應(yīng)過(guò)程中引入生物素；2)采用堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物，按下述步驟進(jìn)行酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)a)用溶液I 37℃漂洗芯片5分鐘，溶液I的組成成份為10mMTris-Cl，pH7.5；150mM NaCl，0.05％Tween-20；b)以溶液II 37℃封阻芯片10分鐘，溶液II的組成成份為100mMTris-Cl，pH7.5；150mM NaCl，50mg/ml BSA；c)用堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物在芯片上37℃作用10分鐘，使其與芯片上DNA中的生物素充分結(jié)合；d)用溶液I 37℃漂洗芯片兩次，每次10分鐘；e)在芯片上滴加5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氯化硝基四氮唑藍(lán)混合液，37℃下反應(yīng)，30分鐘內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)紫色陽(yáng)性結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基因芯片上的酶標(biāo)信號(hào)檢測(cè)方法。其步驟是制作基因芯片;構(gòu)建芯片生化反應(yīng)室,進(jìn)行芯片生化反應(yīng),在反應(yīng)過(guò)程中引入生物素;生化反應(yīng)完成后采用堿性磷酸酶復(fù)合物進(jìn)行芯片信號(hào)檢測(cè)。在信號(hào)檢測(cè)過(guò)程中,優(yōu)化了反應(yīng)條件,簡(jiǎn)化了反應(yīng)步驟,提高了信號(hào)檢測(cè)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。本發(fā)明核酸檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1皮克,檢測(cè)速度快,重復(fù)性和穩(wěn)定性好;操作簡(jiǎn)便,成本低,易于推廣應(yīng)用;可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成基因芯片信號(hào)檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1384210SQ0211583
公開(kāi)日2002年12月11日 申請(qǐng)日期2002年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月14日
發(fā)明者張先恩, 鄧教宇, 黃旭, 張治平, 邵文海, 文繼開(kāi), 陸紅兵, 劉強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所