專利名稱：通用限制性酶切法測(cè)定單點(diǎn)dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定DNA序列中單個(gè)堿基的序列，特別是應(yīng)用于檢測(cè)與分析多態(tài)性(SNP)。
背景技術(shù)：
最近人類(lèi)基因組測(cè)序的基本完成，以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記的出現(xiàn)，被公認(rèn)將極大地加快確認(rèn)導(dǎo)致復(fù)雜疾病如糖尿病、癌癥和心血管疾病的遺傳變異的過(guò)程。結(jié)果之一就是將開(kāi)發(fā)出更準(zhǔn)確全面的診斷和預(yù)測(cè)，以及對(duì)于疾病的更安全有效的治療。SNP指的是在同一物種不同個(gè)體之間，在同一DNA位點(diǎn)上的核苷酸的不同(多態(tài)性)。SNP是最常見(jiàn)的遺傳變異，在所有物種中都存在，目前在人類(lèi)中的研究最為深入。在人類(lèi)基因組中SNP的發(fā)生頻率大約為1/1300堿基對(duì)。SNP是能引發(fā)人類(lèi)疾病的穩(wěn)定突變，與藥物的有效性和毒理性有關(guān)，而且不同族裔的SNP也不相同。另外最新的研究表明SNP可以作為遺傳標(biāo)記有效地發(fā)現(xiàn)疾病基因。具體來(lái)說(shuō)，在有三十億個(gè)堿基對(duì)的人類(lèi)基因組中掃描一個(gè)或一些與疾病易感性、藥物毒性、藥物有效性等有關(guān)的遺傳標(biāo)記，就象大海撈針一樣。目前公認(rèn)有效的是一個(gè)三階段使用SNP標(biāo)記逐步定位的方法。第一步是使用低分辨率連鎖圖譜確認(rèn)與目標(biāo)疾病有高連鎖的一個(gè)1至3分摩根長(zhǎng)度的遺傳區(qū)間。第二步是利用高分辨率SNP通過(guò)疾病相關(guān)性研究在所述遺傳區(qū)間內(nèi)確認(rèn)與目標(biāo)疾病相關(guān)的基因。第三步則是對(duì)這些基因內(nèi)的SNP的超細(xì)定位，確定可以用于疾病診斷的SNP及以其為基礎(chǔ)的進(jìn)一步研發(fā)。
因?yàn)镾NP有廣泛的用途，它的發(fā)現(xiàn)(discovery)、鑒定(validation)和測(cè)定(detection)就成為一種普遍需要。由于有無(wú)數(shù)多的病人和樣品，對(duì)于多達(dá)幾萬(wàn)個(gè)甚至幾十萬(wàn)個(gè)SNP進(jìn)行測(cè)定，如何簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、大規(guī)模、高通量地發(fā)現(xiàn)、鑒定和測(cè)定SNP就成為最近幾年研究者們努力解決的問(wèn)題，關(guān)于這方面的新方法和專利也不斷涌現(xiàn)。下面我們對(duì)一些主要的方法做一個(gè)簡(jiǎn)單介紹(參考了美國(guó)專利5,952,174的一些描述)。
1)DNA測(cè)序最明顯的方法莫過(guò)于對(duì)于包含SNP位點(diǎn)本身及其臨近區(qū)域的DNA序列直接進(jìn)行測(cè)序。這種測(cè)序可以通過(guò)兩種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，即“雙脫氧核苷酸鏈?zhǔn)街兄狗ā?，也稱作“山格Sanger法”(Sanger，E.，et al.，J.Mol.Biol.94441(1875))，和“化學(xué)降解法”，也稱作“馬克西姆-基爾伯特Maxam-Gilbert法”(Maxam，A.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)74560(1977))。對(duì)于特定基因組序列的擴(kuò)增放大，例如多聚酶鏈合反應(yīng)，可以幫助對(duì)于目標(biāo)多聚核苷酸鏈的收集及其測(cè)序。不過(guò)這類(lèi)方法相對(duì)來(lái)說(shuō)費(fèi)用較高，通量較低。
2)核苷酸外切酶抗性法(Exonuclease Resistance)曼迪Mundy，C.R.(美國(guó)專利號(hào)4,656,127)的方法使用了對(duì)于核苷酸外切酶具有特別抗性的核苷酸衍生物。首先從一個(gè)特定動(dòng)物、人類(lèi)或其他個(gè)體獲得目標(biāo)DNA，然后一個(gè)與目標(biāo)DNA互補(bǔ)，并且其3’端正好位于目標(biāo)SNP位點(diǎn)的前一個(gè)核苷酸的引物被使用與目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交。如果目標(biāo)SNP點(diǎn)的核苷酸與某種特定的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物互補(bǔ)，那么這種核苷酸衍生物就會(huì)在多聚酶的作用下被接合在所述雜交上的引物末端。這種接合可以使得雜交上的引物對(duì)核苷酸外切酶具有抗性，從而被檢測(cè)到。由于具體使用的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物的種類(lèi)已知，那么如果一個(gè)引物在某種核苷酸衍生物的作用下具有核苷酸外切酶抗性，那么就可以揭示目標(biāo)SNP點(diǎn)的核苷酸正好與使用的核苷酸衍生物具有互補(bǔ)關(guān)系。曼迪方法的優(yōu)點(diǎn)在于它不需要測(cè)定大量額外的序列。其缺點(diǎn)則在于擴(kuò)增的目標(biāo)DNA和未結(jié)合的引物都將被核苷酸外切酶所破壞，以及該方法對(duì)于特定的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物在多聚酶作用下的接合反應(yīng)的速率的極其敏感性。
3)微測(cè)序法(Microsequencing Methods)近年來(lái)，以引物來(lái)引導(dǎo)的核苷酸結(jié)合方式來(lái)分析DNA多態(tài)位點(diǎn)的幾種方法相繼出現(xiàn)(Komher，J.S.et al.，Nucl.Acids Res.177779-7784，(1989)；Sokolov，B.P.，Nucl.Acids Res.183671(1990)；Syvanen，A.-C.，et al.，Genomics 81143-1147(1991)；Prezant，T.R.，et al.，Hum.Mutat.1159-164(1992)；Ugozzoll，L.et al.，GATA 9107-112(1992)；Nyren，P.et al.，Anal.Biochem.208171-175(1993))。這些方法要么依賴于帶放射標(biāo)記的單個(gè)脫氧核苷酸的結(jié)合以及特殊的磁珠，要么依賴于雙脫氧核苷酸的使用。其共同點(diǎn)是在一個(gè)末端正好位于測(cè)定位點(diǎn)前的引物上結(jié)合單個(gè)核苷酸，并測(cè)定該結(jié)合核苷酸的種類(lèi)從而推斷出測(cè)定位點(diǎn)的核苷酸。
4)液相雙脫氧核苷酸延伸法科恩等人(Cohen，D.et al.)(法國(guó)專利號(hào)2,650,840；PCT申請(qǐng)?zhí)朩O91/02087)討論了一種液相測(cè)定一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)堿基的方法。該方法與前述的曼迪方法(美國(guó)專利號(hào)4,656,127)非常類(lèi)似，不過(guò)不是使用對(duì)于核苷酸外切酶具抗性的核苷酸衍生物，而是帶標(biāo)記的雙脫氧核苷酸衍生物。
科恩方法有一個(gè)顯著的缺陷在于它是一個(gè)使用帶標(biāo)記三磷酸雙脫氧核苷酸的液相延伸反應(yīng)。通常目標(biāo)DNA模版要經(jīng)過(guò)一步擴(kuò)增反應(yīng)，例如PCR，而這一過(guò)程要使用高濃度的DNA聚合酶天然底物即三磷酸脫氧核苷酸。這些單體將會(huì)在接下來(lái)的延伸反應(yīng)中和三磷酸雙脫氧核苷酸進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。因此，在PCR之后，需要一個(gè)額外的步驟來(lái)將目標(biāo)DNA模版與未結(jié)合的三磷酸脫氧核苷酸分開(kāi)，亦即清除掉多余的三磷酸脫氧核苷酸單體，而這一步在液相中很難實(shí)現(xiàn)，也因此該方法不適用于大容量測(cè)試。
5)固相雙脫氧核苷酸延伸法另一種可選擇的方法，被稱為GBA法，是格列特等人(Goelet，P.et al.)所發(fā)明的(PCT申請(qǐng)?zhí)?2/15712)。在一個(gè)更可取的實(shí)施方案中，格列特等人的方法使用了帶標(biāo)記的終止物的混合體，以及一個(gè)與目標(biāo)DNA互補(bǔ)并且其3’端正好位于目標(biāo)多態(tài)位點(diǎn)的前一個(gè)核苷酸的引物。這樣能夠與引物結(jié)合的終止物就由被測(cè)定位點(diǎn)的核苷酸所決定，而且實(shí)際上是與其互補(bǔ)。與前述科恩方法(法國(guó)專利號(hào)2,650,840；PCT申請(qǐng)?zhí)朩O91/02087)相反，格列特等人的方法的更可取之處在于它是一種多相方法，其中引物或者目標(biāo)DNA是固定在一個(gè)固相上。因此該方法更容易操作，也比科恩方法更精確。
6)寡核苷酸鏈連接反應(yīng)法另一種固相測(cè)定SNP的方法使用了不同的酶學(xué)方法，稱作“寡核苷酸鏈連接反應(yīng)法”(Oligonucleotide Ligation Assay，簡(jiǎn)稱OLA方法)(Landegren，U.et al.，Science2411077-1080(1988))。OLA方法使用了與一個(gè)目標(biāo)DNA的單鏈上的兩個(gè)毗連序列可以雜交的兩個(gè)寡核苷酸鏈。其中一個(gè)寡核苷酸鏈經(jīng)過(guò)生物素處理，另一個(gè)則加有可檢測(cè)的標(biāo)記。如果在目標(biāo)DNA上有一個(gè)完全互補(bǔ)的序列，這兩個(gè)寡核苷酸鏈將與目標(biāo)DNA雜交，并且它們的末端將毗連從而形成一個(gè)連接反應(yīng)的底物。接下來(lái)的連接反應(yīng)就使得帶標(biāo)記的寡核苷酸鏈能被阿維丁(avidin)或者另一種生物素配體結(jié)合在另一個(gè)寡核苷酸鏈上，并從而被檢測(cè)到。尼科松等人(Nickerson，D.A.et al.)描述了一種結(jié)合PCR和OLA的檢測(cè)核苷酸的方法(Nickerson，D.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)878923-8927(1990))。在這個(gè)方法里，目標(biāo)DNA首先用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用OLA方法來(lái)檢測(cè)。這種分析要求對(duì)于目標(biāo)多態(tài)位點(diǎn)的每個(gè)dNTP都要用與其配套的一對(duì)寡核苷酸鏈來(lái)分開(kāi)檢查。OLA方法的主要缺點(diǎn)在于連接反應(yīng)不是一個(gè)具有高識(shí)別率的過(guò)程，因而非特異性的信號(hào)是一個(gè)大問(wèn)題。
值得肯定的是，絕大多數(shù)所述的方法都要求有聚合酶來(lái)將一個(gè)核苷酸衍生物結(jié)合到引物的末端。目前所需要的是開(kāi)發(fā)一個(gè)更有選擇性的方式來(lái)分辨多態(tài)位點(diǎn)。我們這里報(bào)告的發(fā)明是為了滿足這方面的要求。
發(fā)明的描述本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)將DNA分子與一個(gè)附著在固相的寡核苷酸引物，及另一個(gè)在液相的引物，在聚合酶的作用下使用帶不同標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后利用一種通用限制性內(nèi)切酶處理的方法來(lái)測(cè)定所述DNA分子上單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)序列的方法，包括以下幾個(gè)步驟a)將一份或多份所述DNA分子與附著在固相的所述寡核苷酸引物，及另一個(gè)所述在液相的引物，在聚合酶的作用下使用帶不同標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)進(jìn)行PCR反應(yīng)；此處所述DNA分子包含有所述單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)，并且在所述預(yù)先選定位點(diǎn)的3’端有18或以上個(gè)核苷酸，同時(shí)所述附著在固相的寡核苷酸引物長(zhǎng)度為25個(gè)左右(設(shè)定為N個(gè)堿基)，在3’端有20個(gè)左右核苷酸與所述DNA在所述預(yù)先選定位點(diǎn)的上游部分互補(bǔ)，并且其3’端互補(bǔ)處正好位于所述單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)的前一個(gè)核苷酸，同時(shí)其5’端存在所述通用限制性內(nèi)切酶的識(shí)別片斷，而其酶切位點(diǎn)則在3’端的下一個(gè)堿基的位置，同時(shí)所述在液相的引物長(zhǎng)度為20個(gè)左右，與所述DNA在所述預(yù)先選定位點(diǎn)的下游部分互補(bǔ)，并且其3’端位于所述單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)的下游；b)將所述PCR產(chǎn)物用一種在DNA雙鏈從5’端第N+1個(gè)核苷酸位置作用的通用限制性內(nèi)切酶處理，這樣只有一個(gè)帶標(biāo)記的核苷酸會(huì)留在附著在固相的引物上；c)在約95攝氏度高溫洗滌附有引物的固相，以使得其只帶有酶切后的引物單鏈DNA；
d)測(cè)定所述附著在固相上的引物單鏈DNA上的標(biāo)記以決定何種dNTP在PCR反應(yīng)中被結(jié)合在所述預(yù)先選定位點(diǎn)，從而確定所述預(yù)先選定位點(diǎn)的序列。
本發(fā)明使用了一個(gè)附著在固相，3’端有約20個(gè)核苷酸與目標(biāo)DNA互補(bǔ)，并且其3’端頂點(diǎn)正好位于目標(biāo)SNP位點(diǎn)的前一個(gè)核苷酸；同時(shí)在5’端有一個(gè)酶切位點(diǎn)位于3’端下一個(gè)核苷酸的的限制性核苷酸內(nèi)切酶的識(shí)別片斷的引物。在將目標(biāo)DNA擴(kuò)增，并用該引物與目標(biāo)DNA雜交后，用聚合酶來(lái)將帶標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)結(jié)合到引物的末端進(jìn)行延伸。在使用所述限制性核苷酸內(nèi)切酶作用，并高溫處理后，附著在固相的引物將帶有單個(gè)延伸核苷酸，并由于其帶有標(biāo)記而被檢測(cè)到其種類(lèi)，從而檢測(cè)到在多態(tài)位點(diǎn)的核苷酸。
不同種類(lèi)的核苷酸是使用不同的標(biāo)記，但卻可以混合在一起進(jìn)行這種結(jié)合反應(yīng)，對(duì)于每個(gè)延伸反應(yīng)只有一個(gè)帶標(biāo)記的核苷酸會(huì)連接到引物上，因此只需關(guān)注所檢測(cè)到的標(biāo)記信號(hào)的種類(lèi)，從而使得檢測(cè)非常簡(jiǎn)單。
對(duì)于絕大部分SNP檢測(cè)來(lái)說(shuō)，只需要使用兩種不同的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)。顯然，如果使用所有四種dNTP，本發(fā)明的方法可以用來(lái)測(cè)定一個(gè)位點(diǎn)的核苷酸序列。因此，本發(fā)明并不局限于測(cè)定SNP。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于三磷酸脫氧核苷酸的標(biāo)記不只是限于通常的熒光標(biāo)記，而可以是任何可檢測(cè)到的標(biāo)記如放射性標(biāo)記，生物發(fā)光標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，核苷酸標(biāo)記，半抗原標(biāo)記和酶標(biāo)記。
本發(fā)明也可以用來(lái)檢測(cè)從多個(gè)個(gè)體中取得的混合樣品，而且這些樣品可以是來(lái)自于基因組DNA(genomic DNA)，環(huán)形DNA，cDNA，EST，或?qū)ζ溥M(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果；或者是來(lái)自于對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的結(jié)果。
本發(fā)明可以大規(guī)模操作，如用來(lái)同步測(cè)定多達(dá)數(shù)千個(gè)甚至數(shù)十萬(wàn)個(gè)位點(diǎn)的序列和SNP，并且可以實(shí)現(xiàn)高通量操作。一般來(lái)說(shuō)這是通過(guò)生物芯片來(lái)實(shí)施。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)將DNA分子與一個(gè)附著在固相的寡核苷酸引物，及另一個(gè)在液相的引物，在聚合酶的作用下使用帶不同標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后利用一種通用限制性內(nèi)切酶處理的方法來(lái)測(cè)定所述DNA分子上單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)序列的方法，包括以下幾個(gè)步驟a)將一份或多份所述DNA分子與附著在固相的所述寡核苷酸引物，及另一個(gè)所述在液相的引物，在聚合酶的作用下使用帶不同標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)進(jìn)行PCR反應(yīng)；此處所述DNA分子包含有所述單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)，并且在所述預(yù)先選定位點(diǎn)的3’端有18或以上個(gè)核苷酸，同時(shí)所述附著在固相的寡核苷酸引物長(zhǎng)度為25個(gè)左右(設(shè)定為N個(gè)堿基)，在3’端有20個(gè)左右核苷酸與所述DNA在所述預(yù)先選定位點(diǎn)的上游部分互補(bǔ)，并且其3’端互補(bǔ)處正好位于所述單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)的前一個(gè)核苷酸，同時(shí)其5’端存在所述通用限制性內(nèi)切酶的識(shí)別片斷，而其酶切位點(diǎn)則在3’端的下一個(gè)堿基的位置，同時(shí)所述在液相的引物長(zhǎng)度為20個(gè)左右，與所述DNA在所述預(yù)先選定位點(diǎn)的下游部分互補(bǔ)，并且其3’端位于所述單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)的下游；b)將所述PCR產(chǎn)物用一種在DNA雙鏈從5’端第N+i個(gè)核苷酸位置作用的通用限制性內(nèi)切酶處理，這樣只有一個(gè)帶標(biāo)記的核苷酸會(huì)留在附著在固相的引物上；c)在約95攝氏度高溫洗滌附有引物的固相，以使得其只帶有酶切后的引物單鏈DNA；d)測(cè)定所述附著在固相上的引物單鏈DNA上的標(biāo)記以決定何種dNTP在PCR反應(yīng)中被結(jié)合在所述預(yù)先選定位點(diǎn)，從而確定所述預(yù)先選定位點(diǎn)的序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中通用限制性內(nèi)切酶及其酶切位點(diǎn)選自Mmel，TCCRAC(20/18)(指Mmel酶識(shí)別的片斷為T(mén)CCRAC，其酶切位點(diǎn)則位于該片斷下游第20個(gè)核苷酸，在互補(bǔ)鏈上的酶切位點(diǎn)則位于該片斷下游第18個(gè)核苷酸)；Eco57I，CTGAAG(16/14)；Eco57MI，CTGRAG(16/14)；Bce83I，CTTGAG(16/14)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中用于標(biāo)記三磷酸脫氧核苷酸的標(biāo)記選自放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、核苷酸標(biāo)記、半抗原標(biāo)記或酶標(biāo)記。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述DNA分子是來(lái)源于同一個(gè)體的不同染色體，或者是來(lái)源于不同個(gè)體的染色體。
5.權(quán)利要求1或4的方法，其中所述DNA分子是經(jīng)過(guò)了以另一個(gè)單鏈或雙鏈核酸模板進(jìn)行擴(kuò)增。
6.權(quán)利要求5的方法，其中用于擴(kuò)增的核酸模板選自基因組DNA(genomic DNA)、環(huán)形DNA、cDNA、EST。
7.權(quán)利要求5的方法，其中用于擴(kuò)增的核酸模板是RNA，使用的聚合酶是反轉(zhuǎn)錄酶。
8.權(quán)利要求5的方法，其中用于擴(kuò)增的DNA或RNA模板來(lái)自一個(gè)或多個(gè)個(gè)體。
全文摘要
本發(fā)明涉及測(cè)定脫氧核糖核酸(DNA)序列中單個(gè)堿基的序列，特別是應(yīng)用于檢測(cè)與分析多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)將DNA分子與一個(gè)附著在固相的寡核苷酸引物，及另一個(gè)在液相的引物，在聚合酶的作用下使用帶不同標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后利用一種通用限制性內(nèi)切酶處理的方法來(lái)測(cè)定所述DNA分子上單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)序列的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1451761SQ0211685
公開(kāi)日2003年10月29日 申請(qǐng)日期2002年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月12日
發(fā)明者劉湘軍 申請(qǐng)人:劉湘軍