專(zhuān)利名稱(chēng)：利用海藻酸鈉－殼聚糖－海藻酸鈉微囊包埋細(xì)胞或組織的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用微囊包埋細(xì)胞或組織的方法，特別是涉及一種利用海藻酸鈉—?dú)ぞ厶恰Ｔ逅徕c微囊包埋細(xì)胞或組織的方法。
在微囊技術(shù)中，包埋不同的細(xì)胞或組織需要采用不同孔徑的微囊，以滿足不同分子量的物質(zhì)通過(guò)的需要。因此，微囊孔徑的大小是非常重要的指標(biāo)。現(xiàn)有技術(shù)中的APA微囊的主要原料是海藻酸鈉和聚賴氨酸，在海藻酸鈉的分子量確定的條件下，APA微囊的孔徑主要決定于聚賴氨酸的分子量。但是，由于聚賴氨酸的分子量不易控制，所以很難制備出不同孔徑的APA微囊。而且APA微囊的表面結(jié)構(gòu)呈條索狀，造成APA微囊的孔徑分布不均勻，影響其通透性。此外，聚賴氨酸的制備工藝相當(dāng)復(fù)雜，特別是在制備大量微囊細(xì)胞或組織時(shí)，其價(jià)格昂貴，難以在臨床大量推廣應(yīng)用。
殼聚糖(chitosan)是一種天然高分子直鏈多糖，它不但具有良好的生物相容性，而且其分子量容易控制。如用殼聚糖取代聚賴氨酸，可望制備出不同孔徑的海藻酸鈉—?dú)ぞ厶恰Ｔ逅徕c(ACA)微囊。而且ACA微囊的表面結(jié)構(gòu)為網(wǎng)狀，其孔徑分布均勻，通透性能良好。此外，殼聚糖的來(lái)源豐富，將蝦殼、蟹殼等經(jīng)脫鈣、脫蛋白質(zhì)、脫乙酰基處理后即可制備大量不同分子量的殼聚糖。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用海藻酸鈉—?dú)ぞ厶恰Ｔ逅徕c微囊包埋細(xì)胞或組織的方法，包括混合、成球、包覆殼聚糖、包覆海藻酸鈉和洗出游離海藻酸鈉五個(gè)步驟，即首先將細(xì)胞或組織與適當(dāng)濃度的海藻酸鈉溶液混合，然后用氮?dú)馇懈罘ɑ蜢o電液滴法將上述混合液在等滲的氯化鈣溶液中形成海藻酸鈣微球，然后將海藻酸鈣微球投入適當(dāng)濃度和分子量的殼聚糖溶液中，以包覆殼聚糖，然后再將包覆有殼聚糖的海藻酸鈣微球投入適當(dāng)濃度的海藻酸鈉溶液中包覆海藻酸鈉，最后將包覆有殼聚糖和海藻酸鈉的海藻酸鈣微球投入等滲的檸檬酸鈉溶液中洗出游離的海藻酸鈉并經(jīng)生理鹽水洗滌即獲得ACA微囊細(xì)胞或組織。
利用本發(fā)明可獲得不同孔徑的ACA微囊細(xì)胞或組織，且其孔徑分布均勻，通透性能良好。
以下結(jié)合利用ACA微囊包埋肝細(xì)胞的具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
a、混合將肝細(xì)胞與濃度為1.5～1.8％的海藻酸鈉溶液混合，肝細(xì)胞與海藻酸鈉溶液的體積比為1∶10；b、成球用靜電液滴法將上述混合液滴入濃度為1.1％的等滲氯化鈣溶液中，以形成海藻酸鈣微球，靜置后除去上清液并用生理鹽水洗滌；C、包覆殼聚糖將上述海藻酸鈣微球投入濃度為0.05～0.1％，分子量為1.98×104～6.02×104的殼聚糖溶液中振搖5分鐘，靜置后除去上清液并用生理鹽水洗滌；d.包覆海藻酸鈉將上述包覆有殼聚糖的海藻酸鈉微球投入濃度為0.15～0.2％的海藻酸鈉溶液中振搖5分鐘，靜置后除去上清液并用生理鹽水洗滌；e、洗出游離海藻酸鈉將上述包覆有殼聚糖和海藻酸鈣微球投入濃度為1.615％的等滲檸檬酸鈉溶液中振搖5分鐘，以洗出游離的海藻酸鈉，靜置后除去上清液并用生理鹽水洗滌即可獲得ACA微囊肝細(xì)胞。
利用本發(fā)明獲得的ACA微囊肝細(xì)胞可在培養(yǎng)液中短期保存，也可在液氮中長(zhǎng)期保存。
經(jīng)掃描電鏡觀察，利用本發(fā)明獲得的ACA微囊肝細(xì)胞的孔徑隨殼聚糖分子量的增加而遞增，其表面結(jié)構(gòu)呈網(wǎng)狀。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ACA微囊包埋紅細(xì)胞，其紅血蛋白釋放趨勢(shì)與APA微囊紅細(xì)胞相似。ACA微囊肝細(xì)胞培養(yǎng)17天內(nèi)，能穩(wěn)定釋放尿素并能測(cè)出GPT，GPT活性第一天出現(xiàn)高峰，之后趨于平穩(wěn)。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定經(jīng)真空干燥濃縮后的ACA微囊肝細(xì)胞培養(yǎng)液的蛋白質(zhì)表明，ACA微囊肝細(xì)胞在17天內(nèi)能合成并釋放低分子量蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分子量均在7×104以下。ACA微囊肝細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，與不包囊肝細(xì)胞和空囊相比，ACA微囊肝細(xì)胞能提高由氨基半乳糖誘發(fā)的急性肝功能衰竭大鼠的存活率，延長(zhǎng)其存活時(shí)間并改善其肝功能。
權(quán)利要求
1.一種利用海藻酸鈉—?dú)ぞ厶恰Ｔ逅徕c微囊包埋細(xì)胞或組織的方法，其特征在于包括混合、成球、包覆殼聚糖、包覆海藻酸鈉和洗出游離海藻酸鈉五個(gè)步驟，即首先將細(xì)胞或組織與適當(dāng)濃度的海藻酸鈉溶液混合，然后用氮?dú)馇懈罘ɑ蜢o電液滴法將混合液在等滲的氯化鈣溶液中形成海藻酸鈣微球，然后將微球投入適當(dāng)濃度和分子量的殼聚糖溶液中包覆殼聚糖，然后再將包覆殼聚糖的微球投入適當(dāng)濃度的海藻酸鈉溶液中包覆海藻酸鈉，最后將包覆有殼聚糖和海藻酸鈉的微球投入等滲的檸檬酸鈉溶液中洗出游離的海藻酸鈉而獲得海藻酸鈉—?dú)ぞ厶恰Ｔ逅徕c微囊細(xì)胞或組織。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用海藻酸鈉—?dú)ぞ厶恰Ｔ逅徕c微囊包埋細(xì)胞或組織的方法，其特征在于所述包覆殼聚糖步驟中殼聚糖的分子量為1.98×104～6.02×104。
全文摘要
利用海藻酸鈉—?dú)ぞ厶恰Ｔ逅徕c微囊包埋細(xì)胞或組織的方法，包括混合、成球、包覆殼聚糖、包覆海藻酸鈉和洗出游離海藻酸鈉五個(gè)步驟，即首先將細(xì)胞或組織與適當(dāng)濃度的海藻酸鈉溶液混合，然后用氮?dú)馇懈罘ɑ蜢o電液滴法將混合液在等滲的氯化鈣溶液中形成海藻酸鈣微球，然后再將微球先后投入適當(dāng)濃度的殼聚糖溶液和海藻酸鈉溶液中包覆殼聚糖和海藻酸鈉，最后將包覆有殼聚糖和海藻酸鈉的微球投入等滲的檸檬酸鈉溶液中洗出游離海藻酸鈉，即獲得不同孔徑的ACA微囊細(xì)胞或組織。ACA微囊孔徑容易控制且分布均勻，通透性能好，故可廣泛用于包埋肝、腎上腺、甲狀腺、甲狀旁腺、性腺等細(xì)胞或胰島等組織。
文檔編號(hào)C12N11/10GK1454995SQ0211698
公開(kāi)日2003年11月12日 申請(qǐng)日期2002年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月29日
發(fā)明者李濤 申請(qǐng)人:天津市肝膽疾病研究所