專(zhuān)利名稱(chēng)：利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人血清白蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人血清白蛋白的方法，特別公開(kāi)了一種利用轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)人白蛋白的方法。
如果能用動(dòng)物生產(chǎn)人白蛋白，本身就能避免許多人源性病源因子的污染，如多種型號(hào)肝炎病毒和愛(ài)滋病毒。加之，能對(duì)動(dòng)物進(jìn)行嚴(yán)格管理和規(guī)模化采集生產(chǎn)，首先保證了生產(chǎn)原料的安全性。使用動(dòng)物來(lái)源的生產(chǎn)原料也能使生產(chǎn)成本減低。考慮到人白蛋白分子量較大，每次使用量為數(shù)毫克至數(shù)十克，使用其他表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，如大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物需要復(fù)性，動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)量低、成本高，酵母表達(dá)也存在修飾、產(chǎn)量問(wèn)題，其優(yōu)勢(shì)遠(yuǎn)不如使用動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。人白蛋白與牛白蛋白的氨基酸序列同源性為76.4％，與豬的同源性為75.7％。如果將動(dòng)物血液的白蛋白完全用人白蛋白替代其產(chǎn)量極為可觀，可達(dá)50g/L血清左右，其蛋白折疊完全與人體一樣。而且， 本項(xiàng)目的成功將為進(jìn)一步地研制其他血源性因子提供技術(shù)和基礎(chǔ)動(dòng)物，有望用一種動(dòng)物生產(chǎn)多種產(chǎn)品。
國(guó)外，曾使用動(dòng)物乳腺、植物和酵母表達(dá)人白蛋白，目前還未產(chǎn)業(yè)化。以色列的動(dòng)物科研究所近十年來(lái)一直研究用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺表達(dá)人白蛋白，表達(dá)水平最高達(dá)10mg/ml(Houdebine LMTransgenic animal bioreactors.Transgenic Res 2000；9(4-5)301-4；Barash I，F(xiàn)aerman A，Richenstein M at alInvivo and in vitro expression of human serum albumin genomic sequences inmammary epithelial cells with beta-lactoglobulin and whey acidic proteinpromoters.Mol Reprod Dev，1999 52(3)241-52)。國(guó)內(nèi)有人正在使用羊乳腺生產(chǎn)人白蛋白，還未獲得動(dòng)物，而且用動(dòng)物乳腺生產(chǎn)人白蛋白也存在一些問(wèn)題，首先是高效表達(dá)問(wèn)題，然后是分離回收難和成本高。
本發(fā)明的發(fā)明人分別從構(gòu)建的人和豬的基因組文庫(kù)中克隆出人血清白蛋白的基因組和豬血清白蛋白的基因組序列，將人血清白蛋白基因組序列插入豬血清白蛋白翻譯起始位點(diǎn)和翻譯終止密碼之間，構(gòu)建了完整基因打靶載體，打靶載體中含抗生素抗性基因和tk基因。由于人血清白蛋白基因組較長(zhǎng)，本發(fā)明的發(fā)明人同時(shí)構(gòu)建兩種打靶載體一種是由豬血清白蛋白翻譯起始位點(diǎn)前5端序列、人血清白蛋白的基因組全長(zhǎng)序列、pCMV-neo序列、豬血清白蛋白后部分序列和pSV40-tk序列組成；另一種由兩個(gè)打靶載體組成，采用兩次打靶，一個(gè)打靶載體含有豬血清白蛋白翻譯起始位點(diǎn)前5端序列、人血清白蛋白的基因組前部分、pCMV-neo序列、豬血清白蛋白后部分序列和pSV40-tk序列。另一短的打靶載體則為人血清白蛋白的基因組全長(zhǎng)序列、pCMV-neo序列、豬血清白蛋白翻譯終止密碼后部分序列和pSV40-tk序列。我們?cè)谥苽滢D(zhuǎn)基因豬中引進(jìn)Cre/LoxP系統(tǒng)，在核移置前去掉抗性基因。分離豬胚胎成纖維細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后用電穿孔法或者其他轉(zhuǎn)染方法將線(xiàn)性化的載體導(dǎo)入豬胚胎成纖維細(xì)胞中，用抗生素和HAT進(jìn)行篩選，以人和豬血清白蛋白基因序列作引物或探針進(jìn)行PCR和Southem印跡試驗(yàn)，確信人血清白蛋白基因組置換了豬白蛋白基因組。將在完成體細(xì)胞打靶后，取出豬的卵母細(xì)胞，體外活化，然后去掉活化的卵母細(xì)胞的核，然后，將已被人血清白蛋白基因組替代了豬白蛋白基因組的豬成纖維細(xì)胞的核移植到去核豬卵中。體外培養(yǎng)觀察，選擇成活的移核卵胚移植到代孕豬的輸卵管。用PCR和Southem印跡方法對(duì)出生的小豬進(jìn)行DNA檢測(cè)，用穿刺的方法獲取肝臟組織，提取RNA，分別用人和豬血清白蛋白基因作探針，同時(shí)以野生型豬的RNA為對(duì)照，進(jìn)行Northem試驗(yàn)；用反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，分別用人和豬的血清白蛋白基因的序列作引物，進(jìn)行PCR鑒定；并且構(gòu)建文庫(kù)，用人血清白蛋白基因作探針，獲得多個(gè)克隆，進(jìn)行序列分析，與人血清白蛋白基因一致。抽取轉(zhuǎn)基因豬的血液，分離和純化出血清白蛋白，進(jìn)行蛋白序列分析、肽圖分析、蛋白修飾分析和免疫原性分析，與來(lái)自人血清的白蛋白一樣。
生產(chǎn)的人白蛋白為585個(gè)氨基酸的蛋白，其氨基酸序列為DAHKSEVAHRFKDLGE ENFKALVLIA FAQYLQQCPF EDHVKLVNEVTEFAKTCVAD ESAENCDKSL HTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEP ERNECFLQHK DDNPNLPRLV RPEVDVMCTAFHDNEETFLK KYLYEIARRH PYFYAPELLF FAKRYKAAFTECCQAADKAA CLLPKLDELR DEGKASSAKQ RLKCASLQKFGERAFKAWAV ARLSQRFPKA EFAEVSKLVT DLTKVHTECCHGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK ECCEKPLLEKSHCIAEVEND EMPADLPSLA ADFVESKDVC KNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADPHECYAKVFDE FKPLVEEPQN LIKQNCELFE QLGEYKFQNALLVRYTKKVP QVSTPTLVEV SRNLGKVGSK CCKHPEAKRMPCAEDYLSVV LNQLCVLHEK TPVSDRVTKC CTESLVNRRPCFSALEVDET YVPKEFNAET FTFHADICTL SEKERQIKKQ TALVELVKHKPKATKEQLKA VMDDFAAFVE KCCKADDKET CFAEEGKKLVAASQAALGL。
2、基因克隆與鑒定分別從人基因組文庫(kù)和豬基因組文庫(kù)用常規(guī)方法篩選出人alb基因全長(zhǎng)序列和豬基因全長(zhǎng)序列，分別進(jìn)行序列分析(Minghetti PP.Ruffner DE，Kuang WJ，et alMolecular structure of the human albumin gene isrevealed by nucleotide sequence within q11-22 of chromosome 4.J.Biol.Chem.1988，261(15)，6747-6757.Weinstock J and Baldwin GNucleotide sequence ofporcine liver albumin.Nucleic Acids Res.1988，16(18)，9045.)。
3、從性成熟或性成熟前的母豬獲取成熟的卵母細(xì)胞對(duì)性成熟后的母豬，在懷孕21-40天時(shí)，肌肉注射0.2mg前列腺素F2(a)類(lèi)似物，(+)-Cloprostenol，24小時(shí)后再注射0.2mg(+)-Cloprostenol和1500IU eCG，誘導(dǎo)流產(chǎn)。在注射eCG猴2小時(shí)后，注射500IU hCG誘導(dǎo)超排卵。對(duì)性成熟前母豬，在注射1500IU eCG后72小時(shí)，再注射500IU hCG。在注射hCG后45小時(shí)屠宰母豬，用無(wú)Ca、無(wú)Mg的Dulbecco磷酸緩沖鹽水，補(bǔ)充有01％BSA。獲得的卵母細(xì)胞置于38.5℃的5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從屠宰場(chǎng)取到的卵巢獲取卵母細(xì)胞從屠宰場(chǎng)取到的卵巢，用0.9％鹽水浸洗兩次，放入DPBS(含100μl/ml青霉素和100μl/ml硫酸連霉素)溶液內(nèi)，用25-30℃的冷藏箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。卵巢收集到卵泡吸出的時(shí)間控制在2-5h。預(yù)先在39℃、CO2培養(yǎng)箱平衡卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)成熟培養(yǎng)基備用。選擇卵巢表面直徑3-6mm的中等卵泡，用18G針頭的10ml注射器吸出COC，放入COC成熟培養(yǎng)基，挑選出至少被兩層卵丘細(xì)胞包裹的卵母細(xì)胞，洗三次，然后將50-60枚COC轉(zhuǎn)移到4孔板里用石蠟油覆蓋500μl COC成熟培養(yǎng)基內(nèi)。在39℃、CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。培養(yǎng)22h后，卵母細(xì)胞用無(wú)激素的NCSU23培養(yǎng)基洗三次，再加500μl不含激素的NCSU 23培養(yǎng)基在39℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)22h。
4、胚胎成纖維細(xì)胞制備取受精后30-35天的豬胚胎，將胚胎組織剪成小塊，用含0.25％胰酶和1mM EDTA的PBS在4℃培養(yǎng)3小時(shí)，分散細(xì)胞。然后用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)洗一次。用10％FBS的DMEM高密度地培養(yǎng)胚胎成纖維細(xì)胞。每次傳代一傳二，傳到2-6代用于轉(zhuǎn)染。核供體細(xì)胞培養(yǎng)到長(zhǎng)滿(mǎn)，不補(bǔ)充培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16天。培養(yǎng)3天時(shí)，用增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)檢測(cè)仍為陽(yáng)性，10天后檢測(cè)為陰性，繼續(xù)培養(yǎng)6天，細(xì)胞進(jìn)入G0期。用Giemsa染色確定每一細(xì)胞的正常核型。
5、電擊轉(zhuǎn)染按常規(guī)復(fù)蘇胚胎成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)3天。用0.25％胰酶消化細(xì)胞，用10％FCS的DMEM培養(yǎng)基洗一次，用Hepes緩沖鹽水懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，取2×107細(xì)胞，1000RPM離心，去上清。用0.8ml含有0.5pmol/ml載體DNA的Hepes緩沖鹽水懸浮細(xì)胞。轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸浮液到電擊池。電擊條件260V、960，D。電擊后的細(xì)胞，用無(wú)選擇劑的10％FCS DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)在使用膠原蛋白包被的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿。培養(yǎng)兩天后，消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，懸浮在含20％FCS和100μg/ml G418的Hams營(yíng)養(yǎng)混合物，以2×104細(xì)胞/孔的濃度培養(yǎng)在膠原蛋白包被96孔板。(正常成纖維細(xì)胞在50-75的G418培養(yǎng)5-7天被殺死。)培養(yǎng)14天后，一傳三復(fù)制。一塊用于PCR篩選和DNA提取；一塊用于保存。保存方法用0.25％胰酶消化，凍存在20μl凍存液內(nèi)，細(xì)胞數(shù)大約為1000-2000。
6、COC的顯微操作和核移植將COC從NCSU23培養(yǎng)基移到0.3mg/ml透明質(zhì)酸酶溶液，用巴斯德管打掉卵丘細(xì)胞。成熟卵母細(xì)胞放入5μg/mlBisbenzimide(Hoechst 33258)溶液30min，然后轉(zhuǎn)移到含4mg/ml BSA和7.5μg/ml Cytochalase B的TL-Hepes溶液中。用25-30μm的玻璃管吸掉第1極和M II板以及周?chē)纳倭堪麧{，完成去核。在紫外光下觀察玻璃管內(nèi)的核體，確定是否成功地去掉胞核。去核的的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含4mg/ml BSA和01mg/ml半胱氨酸的NCSU 23培養(yǎng)基，在39℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h。然后移到加有300μl TL-Hepes+4mg/ml BSA的顯微注射池，放到顯微鏡的載物臺(tái)上。預(yù)先制備好鋒利斜面口徑10μm的注射玻璃管。每次注射后，用含15％Polyvinylpyrrolidone(分子量40,000)NCSU23洗注射管。刺破成纖維細(xì)胞，輕輕吸入可見(jiàn)的胞漿，去掉胞漿。然后將胞核和殘存細(xì)胞碎片，通過(guò)去核的同一裂口注射到去核卵母細(xì)胞胞漿中，盡可能少地將培養(yǎng)基注射到卵母細(xì)胞胞漿中。
7、移植核的活化將顯微注射的卵細(xì)胞移到含4mg/ml BSA和0.1mg/ml半胱氨酸NCSU23培養(yǎng)基，在39℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min。用不同濃度的Thimerosal在不同時(shí)間活化卵母細(xì)胞，然后在DTT中培養(yǎng)?；罨穆涯讣?xì)胞及時(shí)地轉(zhuǎn)移到NCSU 23培養(yǎng)基，在39℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
8、代孕豬的制備給孕20-30天豬，注射0.2mg的cloprostenol，24小時(shí)后注射0.2mg的cloprostenol和1000 IU eCG誘導(dǎo)流產(chǎn)。在注射eCG 72小時(shí)后，注射500 IU hCG誘導(dǎo)發(fā)情。在注射hCG 24小時(shí)后，進(jìn)行人工受精，產(chǎn)生輔助胚胎。沖洗準(zhǔn)備用于移植的一側(cè)輸卵管，在激活后20或40小時(shí)，注射hCG 48或68小時(shí)轉(zhuǎn)移克隆胚胎。
9、PCR和Southern印跡鑒定方法留取出生時(shí)小豬的胎血或取新生豬的耳朵組織，用組織DNA提取試劑盒，提取DNA。以基因鑒定引物15’GGTTGA TGT GAT GTG CAC TGC T3’和基因鑒定引物25’CCT TCC CTT CATCCC GAA CTT C3’、基因鑒定引物35’GCA ACT GAA AGC TGT TATGGA TG3’和基因鑒定引物45’GTT ATA AGC CTA AGG CAG CTT GACTTG3’引物進(jìn)行PCR，出現(xiàn)PCR產(chǎn)物者為陽(yáng)性動(dòng)物；分別用BamHI、HpaI、SalI和SpeI酶切電泳后做Southern印跡和雜交。
10、hALB的鑒定抽取新生小豬血液，分離血清，分別進(jìn)行Western blot和ELISA試驗(yàn)。純化出ALB進(jìn)行N端氨基酸序列分析，在N端15個(gè)氨基酸中，人ALB與豬ALB有3個(gè)氨基酸不同。然后進(jìn)行肽圖分析。
11、生理生化檢查對(duì)人ALB檢查陽(yáng)性的小豬，進(jìn)行生理生化檢查，判斷其健康情況。
結(jié)果1、基因打靶載體的構(gòu)建分別從人基因文庫(kù)和豬基因獲取人ALB全長(zhǎng)序列和豬的ALB全部編碼及5’端和3’端編碼序列。按下圖構(gòu)建基因打靶載體。
在這一載體中的palb5’端序列長(zhǎng)度為5kb、palb3’端序列3kb。在palb3’端后連接有tk基因。halb基因包含14個(gè)外顯子，外顯子1-14，共16kb。抗性基因?yàn)閜CMV調(diào)控的neor。全長(zhǎng)26kb。在轉(zhuǎn)染前切去所有細(xì)菌質(zhì)粒的序列。
2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染與鑒定復(fù)蘇胚胎成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)3天后用于基因打靶。打靶后的細(xì)胞培養(yǎng)在10％FCS DMEM培養(yǎng)基中48h，然后，換成含G418和FIAUHams營(yíng)養(yǎng)混合物培養(yǎng)基。培養(yǎng)14天后，一傳三復(fù)制。按圖2的部位序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，進(jìn)行PCR，其產(chǎn)物長(zhǎng)度與設(shè)計(jì)長(zhǎng)度一致者為陽(yáng)性。
PCR鑒定為陽(yáng)性的細(xì)胞克隆，繼續(xù)進(jìn)行Southern blot試驗(yàn)，分別用BamHI、HpaI和KpnI酶細(xì)胞DNA，用圖2標(biāo)示部位的序列作探針，其顯影片段與理論推測(cè)一致的細(xì)胞為基因打靶陽(yáng)性細(xì)胞，將其擴(kuò)增，凍存?zhèn)溆谩?br> 3、核移植和胚胎的體外培養(yǎng)將基因打靶陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)至80％的覆蓋率，調(diào)整大多數(shù)細(xì)胞到G0期后用于核移植其過(guò)程見(jiàn)圖3。將核移植的卵細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含4mg/ml BSA和0.1mg/ml半胱氨酸NCSU 23培養(yǎng)基，在39℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min，再按材料和方法中敘述方法進(jìn)行活化處理?；罨穆涯讣?xì)胞及時(shí)地轉(zhuǎn)移到NCSU 23培養(yǎng)基，在39℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24-48h，胚胎可發(fā)育到4-16細(xì)胞。代孕母豬為杜羅克豬，在核移植的前三天開(kāi)始給代孕母豬注射eCG，72h后注射hCG，發(fā)情后，進(jìn)行人工受精，20h后選擇24-48h、發(fā)育良好的胚胎用于輸卵管的植入。
4、新生小豬的鑒定由于胚胎成纖維細(xì)胞來(lái)自大白豬(約克夏種)，毛色為白色，代孕豬毛色為紅色。出生小豬從顏色可分出克隆豬和野生型小豬。抽取克隆小豬的血液或取耳朵組織，提取DNA，作為摸板，如圖4用兩對(duì)基因鑒定引物進(jìn)行PCR，前者產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1588bp；后者長(zhǎng)度為748bp。這兩對(duì)基因鑒定引物的序列與豬明顯不同，同源性小于60％。
對(duì)PCR陽(yáng)性的小豬的DNA進(jìn)行5種內(nèi)切的Southern blot試驗(yàn)，用鑒定細(xì)胞(見(jiàn)圖2)相同的探針雜交。在halb基因組的序列中沒(méi)有BamHI和SalI位點(diǎn)，這兩個(gè)酶切片段較大，三個(gè)探針都為顯影；其他兩個(gè)內(nèi)切酶在halb基因組的序列中各有兩個(gè)切點(diǎn)，探針2為E10前后的500bp，顯影片段應(yīng)為8.3kb和2.0kb大小不同。抽取轉(zhuǎn)基因豬和野生型新生豬血液，分離血清，用抗hABL的單抗做Western blot。
5、產(chǎn)物的鑒定當(dāng)轉(zhuǎn)基因豬生長(zhǎng)到10kg以上時(shí)，抽取血液，分離血清，純化出rhALB，進(jìn)行N端15個(gè)氨基酸的序列分析，在1N端15個(gè)氨基酸中有三個(gè)氨基酸不同(見(jiàn)下表)。
表1.人和豬ALB的N端15個(gè)氨基酸的比較

由于hALB與pALB的氨基酸序列的同源性為76％，采用酶切肽圖和質(zhì)譜分析，鑒別出hALB與pALB。
序列表<110> 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所<120> 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人血清白蛋白的方法<130><160> 1<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 585<212> PRT<213> 人<400> 1Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu15 10 15Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln20 25 30Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu35 40 45Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys50 55 60Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu65 70 75 80Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro85 90 95Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu100 105 110Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His115 120 125Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg130 135 140Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg145 150 155 160Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala165 170 175Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser180 185 190Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu195 200 205Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro210 215 220Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys225 230 235 240Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp245 250 255Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser260 265 270Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His275 280 285Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser290 295 300Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala305 310 315 320Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg325 330 335Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr340 345 350Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu355 360 365Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro370 375 380Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu385 390 395 400Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro405 410 415Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys420 425 430Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys435 440 445Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His450 455 460Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser465 470 475 480Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr485 490 495Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp500 505 510Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala515 520 525Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu530 535 540Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys545 550 555 560Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val565 570 575Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu580 58權(quán)利要求
1.利用轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)人血清白蛋白的方法，包括以下步驟(1)豬和人的血清白蛋白基因組克隆與鑒定；(2)基因打靶載體的構(gòu)建；(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染與鑒定；(4)核移植和胚胎的體外培養(yǎng)；(5)新生小豬及白蛋白產(chǎn)物的鑒定。
2.權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)人血清白蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟(1)從人和豬的基因組文庫(kù)中克隆人血清白蛋白的基因組和豬血清白蛋白的基因組序列，利用豬血清白蛋白的5’端調(diào)控序列表達(dá)外源基因產(chǎn)物；(2)將人血清白蛋白基因組序列插入豬血清白蛋白翻譯起始位點(diǎn)和翻譯終止密碼之間，構(gòu)建完整基因打靶載體；(3)分離豬胚胎成纖維細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后將(2)所述的載體導(dǎo)入豬胚胎成纖維細(xì)胞中；(4)確證人血清白蛋白基因組置換了豬白蛋白基因組；(5)將已被人血清白蛋白基因組替代了豬白蛋白基因組的豬成纖維細(xì)胞的核移植到去核豬卵中；(6)選擇成活的移核卵胚移植到代孕豬的輸卵管；(7)對(duì)出生小豬的血清白蛋白進(jìn)行分析鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)人血清白蛋白的方法。該方法包括血清白蛋白的基因克隆與鑒定、基因打靶載體的構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染與鑒定、核移植和胚胎的體外培養(yǎng)和新生小豬及白蛋白產(chǎn)物的鑒定等步驟。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1463983SQ0212158
公開(kāi)日2003年12月31日 申請(qǐng)日期2002年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月27日
發(fā)明者鄧?yán)^先 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所