專利名稱：測定血紅素突變基因的方法及使用此方法的固態(tài)基材的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于一種測定血紅素(hemoglobin)突變基因的方法，更明確地是，本發(fā)明是一種測定血紅素中α血球蛋白基因(α globin gene，以下簡稱α基因)-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI突變型的方法，并進一步包含使用此測定方法的固態(tài)基材。
海洋性貧血形成的主要原因為構成紅血球之血紅素合成發(fā)生問題，正常血紅素的合成是由四條血球蛋白鏈(globin chain)2條α鏈及2條β鏈所構成，而當控制α鏈或β鏈生成的基因發(fā)生問題時，便會造成血紅素的合成發(fā)生問題，進而產生貧血的現象，臨床癥狀可從全無癥狀到致命的重度貧血。
海洋性貧血可分為兩大類α型海洋性貧血及β型海洋性貧血。α型海洋性貧血多為基因缺失(deletion)所致，β型海洋性貧血則是基因突變(如點突變、基因缺失、或插入基因)所致，α型和β型海洋性貧血兩者皆是獨立遺傳，所以有的人可能同時遺傳到兩型海洋性貧血。
對于α型海洋性貧血而言，全臺灣約有100萬人帶有α型海洋性貧血的致病基因，若有兩個帶因者結婚，胎兒就有1/4的機會為罹患中度至重度α型海洋性貧血的水腫新生兒，而可能于妊娠末期在子宮內死亡，或者出生后不久，即因肺部發(fā)育不良及嚴重貧血缺氧死亡。為了落實優(yōu)生保健，節(jié)省社會成本，所以婚前健康檢查及早期的產前診斷相當地重要。
已知的海洋性貧血檢測，通常采用Hb電泳、等電焦距、高效液相色譜分析和胺基酸分析測序等關于血液學上的檢定結果，像是在血液常規(guī)檢查中，如果平均紅血球體積(MCV)和平均血紅蛋白量(MCH)皆顯著偏低，則可能為海洋性貧血帶因者。值得注意的是，因為α型海洋性貧血是小血球性貧血，臨床上除了紅血球體積較小外，大部份的帶因者并無其它癥狀。但是，其它的疾病，像是缺鐵性貧血、慢性疾病、含鐵母細胞性貧血也會造成小血球性貧血，造成診斷病因上的不確定。
近年來，隨著分子生物學技術的進步，已可直接從α型海洋性貧血帶因者體內選殖出(cloning)α血球蛋白基因，并對α血球蛋白基因作進一步定序。最近，已發(fā)現一些缺失性突變會導致海洋性貧血的表現型，而這些表現型會與特定的片段缺失有關聯。所以，隨著DNA分析技術的不斷發(fā)展，使用基因型檢查是可對α型海洋性貧血有較佳確認診斷，從而對揭露其發(fā)病原理、有效監(jiān)控此類疾病、提高人口素質有重要意義。
在人體內HBA1基因(hemoglobin，alphal gene，以下稱為α1基因)及HBA2基因(hemoglobin，alpha2gene，以下稱為α2基因)是專司表現α血球蛋白之基因，同時位于第16條染色體上。絕大多數的α型海洋性貧血，是因缺少至少一個以上的α基因片段所致，見Kazazian(1990)，supra；Embury et al.(1980)。例如-α3.7突變型便是α2和α1基因片段部份缺失，其缺失片段長度約為3.7千堿基(kilobase，kb)。若是個體所遺傳到的異型結合子(heterozygotes)中的第16對染色體上，有一條是-α3.7缺失的染色體，一條為正常的染色體，此種情況可以用-α3.7/αα來表示。另外，-α4.2突變型則是α2基因向左缺失了4.2千堿基的片段，可以用-α4.2/αα來表示。在整個美國的族群中，-α4.2/αα的基因型是很少見的(Higgs et al.(1989))，但在某些中國人的族群中約有58％有此種基因型(Baysal and Huisman(1994))。
為了研究疾病背后的基因異常組合，且探測這些基因的缺失片段，便發(fā)展出各式的聚合酵素鏈鎖反應(PCR)，見Innis et al.，PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications.San DiegoAcademic Press(1990)。使用PCR來放大DNA或病變基因的部分片段，以協助了解被放大部分的特性。不過，當PCR技術放大(amplify)出來的產物已非常干凈的同時，有部分(Dode et al.(1990)；Lebo et al.(1990))在分析之前，仍需要使用限制酵素切割放大的產物，才能達到適當的效果。另外，上述的方法中，并未在使用定量PCR(Quantitative PCR)時，能客觀及可信賴地辨別出同型結合子(homozygotes)、雜合子(heterozygotes)及正常型之間的差別，見Lundeberget al.(1991)；Lubin et al.，Mol.Cell.Probes，5307-17(1991)。所以，在測定α血紅素蛋白突變基因上，目前需要一種快速且花費較少的改良方法，且能夠準確地分別出α血紅素蛋白的各種基因型。
上述提到以聚合酵素鏈鎖反應(PCR)為基礎的各種方法中，使用于基因診斷例如有缺口PCR(Gap-PCR)，其原理是，設計的引子和缺失序列的兩側端序列互補，由于缺失兩端相接，使本來在正常DNA序列中相距很遠的這一對引子之間的距離，因斷端連接而靠近，以至于能擴增出特定長度的片段。另外一對引子則設計位于缺失區(qū)域，這樣僅在雜合子或完全正常的情況下，其中的正常等位基因才會擴增出來。此法可以檢出大片段缺失的雜合子，如東南亞國家常見的SEA型。此法針對分析突變型-α3.7和-α4.2會有相當地困難度。因在第16條染色體上的α基因群區(qū)存在著大量同源序列，對設計PCR引子造成困難并會影響反應的結果。
另外，還有一種用于診斷基因的聚合酵素鏈鎖反應為多重PCR(Multiplex PCR)，其原理為同時引入數對引子，使數個PCR得以在同一反應體是中完成?，F已能用于同時診斷以下幾種類型的突變(--SEA)、(--MED)、-(α20.5)(Bowden DK et al.BrJ Haematol，1992，81104)，或(--MED)(-α3.7)(Bowie IJ et al.Clin Chem，1994，40(12)2260)，或是(-α3.7)(-α4.2)(-MED)(Oron Karni V et al.Am J Hematol，1998，58306)，但并非所有的突變類型都能并在一起同時檢測出，其中最大的困難是反應中的基因片段會彼此干擾，而大幅降低檢測的準確度及可靠度。
目前在α型海洋性貧血基因型檢查方面，最常見的是基因電泳分析法利用聚合酵素鏈鎖反應(PCR)將基因放大后，再由電泳結果判斷，或用雜交方式進行確認，例如凝膠電泳法配合使用特定的探針，就可以測定未知片段的尺寸、核酸序列、以及雜交的研究，可參見Sambrook et al.，Molecular Cloning--ALaboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarborCold Spring Harbor Press(1989)。
美國專利第6322981號中所揭示的檢測血紅素突變基因方法，是在聚合酵素鏈鎖反應(PCR)過程中，藉由三種引子(primers)放大檢體染色體的α1及α2基因，且與對照組的PCR產物量作定量方式比較，以間接推測是否有基因缺失。同樣地，在美國專利第5750345號中所揭示的方法，則是以比較染色體三個位置PCR的產物量，而間接推測是否有基因缺失。上述對于基因缺失的檢測方法，皆需加上定量方式來判斷基因缺失，不過由于人類有兩套染色體，且PCR通常會造成過量的反應，因此這種方法很可能造成結果不易判讀(見Acta ChemicaScandinavia，199650141-145)。另一方面，若以定量實時PCR(Quantitative real-time PCR)來執(zhí)行則大大提高檢測的成本。

發(fā)明內容
本發(fā)明主要(aspect)是提供一種快速、簡便測定血紅素突變基因的方法，所有反應均能在相同的反應體系中進行，并可同時檢測出α血球蛋白基因的突變型，能使用在像是海洋性貧血帶因者檢測、婚前健康檢查、或是產前檢查。
本發(fā)明的另一方面是提供一種測定血紅素中α血球蛋白基因突變型的固態(tài)基材，此處的突變型是指-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI型基因缺失，而此固態(tài)基材能在低成本達到高準確度的效果，并預防因電泳定量缺失所造成的錯誤。
鑒于已有技術存在應用上與使用上的缺失，本發(fā)明遂提供一種在生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，此種生物檢體中內含編碼出血紅素的核酸序列，而在此方法中可檢測出亞洲人常見的-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI五種突變型，這些突變型會與α型海洋性貧血有關。本發(fā)明以聚合酵素鏈鎖(PCR)放大檢體核酸序列，并用標定物標定放大的序列，進一步使用具有探針的固態(tài)基材，把放大的序列與探針進行雜交反應后，進行呈色反應，而呈色結果可迅速用肉眼判斷出。
為了達到上述目的，在本發(fā)明的一種較佳實施例中，測定此生物檢體中血紅素突變基因的方法，可測定-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI五種突變型，是包含下列步驟利用引子(primers)，以多重引子-缺口聚合酵素鏈鎖(Multiplex-Gap-PCR)做兩管放大含編碼(encode)出α血球蛋白核酸序列的生物檢體，其中一個反應管內含可把FIL、SEA、-α4.2缺失突變基因放大的引子，而另一個反應管內含可把THAI缺失突變基因放大的引子(包含SEQ ID NO1的核酸序列)和-α3.7缺失突變基因放大的引子(包含SEQ ID NO2的核酸序列)，并以標定物標定此放大的檢體核酸序列；提供一種具有特定序列群組的探針(SEQ ID NOs3至10)的之固態(tài)基材，并把已標定的放大檢體序列于此固態(tài)基材與上述探針雜交，進行呈色反應。
在本發(fā)明進一步實施例中，根據本發(fā)明測定血紅素突變基因的方法所使用到的固態(tài)基材，是包含一檢測區(qū)及一對照區(qū)，其中此檢測區(qū)中放置一種以上突變型的探針，此一種以上突變型包含-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI突變型，而對照區(qū)放置一檢定基因探針和對照組探針，此檢定基因探針是為此一種以上突變型共同缺失的基因部分。一種用于測定血紅素突變基因方法中引子的核酸組成物，其中該引子是包含SEQ ID NO1的核酸序列及SEQID NO2的核酸序列。其中該SEQ ID NO1的核酸序列是用于把THAI缺失突變的基因組DNA進行放大。其中該SEQ ID NO2的核酸序列是用于把-α3.7缺失突變的基因組DNA進行放大。一種用于測定血紅素突變基因方法中探針的核酸組成物，其中該探針是包含選自SEQ ID NOs3至7組成的序列群組。所述的核酸組成物，其中該探針進一步包含選自SEQID NOs8至10組成的序列群組。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，供測定-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI五種突變型，該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；放置選自SEQ ID NOs3至8組成之序列群組的探針于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中該生物檢體中內含編碼出血球蛋白的核酸序列。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中放大該生物檢體是以聚合酵素鏈鎖反應進行放大。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中放大該生物檢體是以一管以上的多重引子-缺口聚合酵素鏈鎖反應進行放大。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中一管內含可把FIL、SEA、-α4.2缺失突變基因放大的引子，而另一管內含可把THAI、-α3.7缺失突變基因放大的引子。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中該可把THAI、-α3.7缺失突變基因放大的引子，是包含SEQ ID NO1的核酸序列以及SEQ ID NO2的核酸序列。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中SEQ ID NOs3是探測α血球蛋白基因的SEA缺失突變。其中SEQ ID NOs4是探測α血球蛋白基因的FIL缺失突變。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中SEQ ID NOs5是探測α血球蛋白基因的THAI缺失突變。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中SEQ ID NOs6是探測α血球蛋白基因的-α3.7缺失突變。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中SEQ ID NOs7是探測α血球蛋白基因的-α4.2缺失突變。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中SEQ ID NOs8是α2基因探針，用以探測制造α血球蛋白基因是否正常。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中該固態(tài)基材選自于玻璃、硅芯片、尼龍、高分子聚合物、金屬以及合金組成的群組。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因 的方法，其中該固態(tài)基材是為一生物芯片。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中該生物芯片選自于玻璃、硅芯片、尼龍、高分子聚合物、金屬以及合金組成的群組。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中該放置的步驟進一步包含放置SEQ ID NOs9與10組成的序列群組的探針于該固態(tài)基材上。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中SEQ ID NOs9與10為對照組探針，用于確定該放大生物檢體步驟是否完成。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，供檢測出SEA突變型，該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；放置SEQ ID NOs3與8的探針于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，供檢測出FIL突變型，該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；放置SEQ ID NOs4與8的探針于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，供檢測出THAI突變型，該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；放置SEQ ID NOs5與8的探針于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，供檢測出-α3.7突變型，該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；放置SEQ ID NOs6與8的探針于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，供檢測出-α4.2突變型，該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；放置SEQ ID NOs7與8的探針于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，供檢測出一種以上突變型，該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；
放置對應該一種以上突變型的探針以及一檢定基因探針，于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其中該檢定基因探針為該一種以上突變型共同缺失的基因部分。一種用于測定血紅素突變基因的固態(tài)基材，是包含一檢測區(qū)及一對照區(qū)，其中該檢測區(qū)包含一種以上突變型的探針，而該對照區(qū)包含一檢定基因探針為其特征。一種用于測定血紅素突變基因的固態(tài)基材，其中該對照區(qū)進一步包含對照組探針。一種用于測定血紅素突變基因的固態(tài)基材，其中該一種以上突變型包含-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI突變型。一種用于測定血紅素突變基因的固態(tài)基材，其中該檢定基因探針為該一種以上突變型共同缺失的基因部分。如上所述，本發(fā)明方法是為首例以固態(tài)基材檢測方式進行α型海洋性貧血的檢測，可以迅速確定不同類型的突變基因型，且不需要昂貴的儀器(如HPLC)，一般分子生物實驗室即可，改善了已知電泳技術的技術操作繁雜、或是定量PCR分析的高價、耗時、難以滿足臨床實驗室常規(guī)檢測的需要。
更進一步，本發(fā)明的方法準確率高，藉由具有多種專一性探針的固態(tài)基材，同時鑒定多種引成疾病之缺失基因片段，且避免噪聲及誤判，大大提高檢測結果之可信度。
另一方面，使用本發(fā)明的方法檢測結果容易判讀，直接以肉眼判讀即可，不需借助任何儀器，并且操作過程對環(huán)境友善，不使用有毒的反應藥劑(如電泳檢測法之EtBr)，故操作安全性高， 同時可兼具環(huán)保功效。
進一步完整地說明本發(fā)明，及其伴隨的諸多優(yōu)點，將從下述詳細說明及所附圖式，得到進一步地了解。
在進一步描述本發(fā)明的詳細說明前，本發(fā)明所使用的”引子”一詞，是指一段寡核苷酸，可藉由使用限制酵素做出或是藉由人工合成制作。當想要合成一段特定的核酸序列時，便把引子置于有模板DNA、核酸、誘導劑像是DNA聚合酵素、并有適當溫度及pH值的環(huán)境中，在此種環(huán)境下，引子是作為合成的起始點，開始進行核 酸序列的延展。單股的引子在放大時有較佳的效果，不過，也可以是雙股的結構，而長度則需要足夠長到能在誘導劑出現的情況下，進行接合延長。而引子的精確長度實際上需考量到多種因素，像是溫度、引子的來源和所使用的方式。舉例來說，使用目的為檢測疾病的基因型時，依照目標序列的復雜度，引子通常包含15-25個或是更多的核酸，若是其它的使用目的，則引子長度通常較短，像是7-15個核苷酸。
首先參考

圖1所示，是顯示本發(fā)明方法的流程圖100。本發(fā)明用于測定血紅素突變基因的方法，是供-α3.7、-α4.2、SEA、FIL和THAI五種突變型的測定，此方法在步驟102至步驟106的作用，是在聚合酵素鏈鎖反應(PCR)中，利用引子(primers)以放大含編碼出血球蛋白的核酸序列之生物檢體。
在本發(fā)明的較佳實施例中，關于步驟102，需做生物檢體的采樣，一般為人體血液，但不限于此，只要能取得人體的DNA即可(如絨毛、羊水分泌物)，接下來，步驟104時使用市面上商業(yè)化產品的操作進行萃取DNA，而萃取純化后的DNA(濃度至少100ng/μl)便進一步進行步驟106，一多重引子-缺口-非對稱性聚合酵素鏈鎖反應(Multiplex-gapAsymmetric PCR)的放大，并在PCR反應的同時加入標定物質(如毛地黃Digoxigenin，DIG)作標定。
在步驟106的具體實施例，PCR反應的操作過程中，是有二個反應管進行反應，其中PCR各管的內容物含有模板DNA 0.7μl、引子混合物2μl、10XPCR緩沖液1μl、dNTP 1mM 3.6μl、Dig-dNTP(2mM)0.4μl、Taq 0.3μl、甜菜堿(Betaine)2μl。在本發(fā)明的較佳實施例中，PCR的反應步驗如下分別先進行先前變性反應(92至97℃，5分鐘)然后再進行以下三個步驗之循環(huán)反應1)，變性(denaturation)，以高溫(92至97℃，45秒)加熱變性，使雙股模板DNA成為單股模板DNA，2)，令引子于一定的溫度下附著于模板DNA兩端(60至62℃，1分鐘15秒)，3)，再將溫度調整到DNA聚合酵素作用的有效溫度而合成新的DNA股(72℃，2.5分鐘)，在重復進行上述3個反應步驟30個循環(huán)后，最后再以72℃10分鐘進行最終延展，整個PCR反應較好是在2至3小時之內執(zhí)行完成。
在上段描述中，其中一個PCR反應管內的引子混合物含有可把FIL、SEA、-α4.2缺失突變基因放大的引子，而另一個PCR反應管內的引子混合物含有可把THAI缺失突變基因放大的引子(包含SEQ IDNO1的核酸序列)和-α3.7缺失突變基因放大的引子(包含SEQ ID NO2的核酸序列)。之后把各管的10μl PCR放大產物加入含200μl緩沖溶液的管中，以95℃溫度加熱10分鐘，使PCR放大產物的雙股序列變性(denature)為單股序列，并接著在冰上(4℃)保持10分鐘，以避免單股序列重新回復為雙股序列，此種單股序列有利于接下來與置于固態(tài)基材上的探針進行雜交。
而上述多重引子-缺口聚合酵素鏈鎖反應的原理，是由缺口連接PCR的原理進一步衍生出，缺口連接PCR所設計的引子，會與缺失序列的兩側端序列互補，當片段有所缺失時，缺失兩端會連接，使本來在正常DNA序列中相距很遠的一對引子之間的距離，因斷端連接而靠近，此時即可擴增出特定長度的片段。而同時，另外一對引子則設計位于缺失區(qū)域，這樣僅在雜合子或完全正常的情況下，其中的正常等位基因才會擴增出來。因此，能測定出大片段缺失的雜合子，而由于α型海洋性貧血是基因缺失所致，故只有基因缺失者才可以使聚合酵素鏈鎖反應進行，而推知出是否為帶因型。
特別值得注意的是，α型海洋性貧血的基因缺失是有多種不同片段缺失，本發(fā)明便在反應中利用針對不同種片段缺失的多對引子，在同一反應體系中進行數個聚合酵素鏈鎖反應(多重-PCR)，而此種聯合多重-PCR和缺口連接-PCR的反應，便稱為多重引子-缺口聚合酵素鏈鎖反應。此外，本發(fā)明在進行PCR的聚合反應時，加入標定物質，使放大增幅的片段帶有標定物。
上述PCR反應所利用的多對引子(primers)，是在同一操作條件下，同時進行多段的聚合反應，而此多對引子是從血紅素α基因組序列區(qū)域內選出，其中部分的引子序列，如測定SEA、FIL、THAI(F)、3.7(R)、4.2及α2基因的序列可參考Foglietta et al.，Haematologica，81387-396(1996)、Barry et al.，Amer.J.Hematology，6354-56(2000)、以及Chong et al.，Blood，95(1)360-362(2000)，其中引子的(F)意謂是5’端的引子，而(R)意謂是3’端的引子，而測定α2基因引子的設計，是位于各個突變型共同的缺失區(qū)域，這樣僅在雜合子或完全正常的情況下，其中的正常α2基因才會擴增出來。
接著參考圖2，顯示第16條染色體上(粗黑線)α血紅素蛋白基因缺失的位置和范圍，以及在PCR反應中各個引子的相關位置。在圖2中，第16條染色體上的基因”HBA1(hemoglobin，alpha 1)”50是指α1基因，而”HBA2(hemoglobin，alpha 2)”60是指α2基因。在第16條染色體下方所對應的關系，是指α-海洋性貧血所缺失的各種基因片段，其中缺失片段32為-α3.7缺失、缺失片段34為-α4.2缺失、缺失片段36為SEA缺失、缺失片段38為FIL缺失、以及基因片段40為THAI缺失，而基因片段兩側的虛線，是代表基因片段的邊界，可看出-α3.7是α1和α2的基因部分有缺失，-α4.2是α2基因缺失α1基因仍然存在，SEA、FIL和THAI是α1和α2的基因全部缺失。
另外，在第16條染色體上方的三角形記號，是表示多對引子的起始位置。在反應管1中的引子混合物引子22(F，R)對應缺失片段34，引子23(F，R)對應缺失片段36、引子24(F，R)對應缺失片段38、以及引子26(F，R)對應α2基因引子，而在反應管2中的引子混合物引子21(F，R)對應缺失片段32、以及引子25(F，R)對應缺失片段40，而引子25(R)即為THAI(R)引子(SEQ ID NO1)，引子21(F)即為-α3.7(F)引子(SEQ ID NO2)。
另外，因α1和α2基因中存在著大量同源序列，設計PCR引子有一定的難度，本發(fā)明為了達到較佳的測定效果，及避免單個基因間的干擾，因此在測定THAI和3.7時，特別設計包含5’-GGTGGAGATTGCAGCGAGTTGAG-3’序列(即SEQ IDNO1)的THAI(R)引子，以及包含5’-CCTCCCCCTCGCCAAGTC-3’序列(即SEQ ID NO2)的3.7(F)引子，可參見圖3，其中SEQ ID NO1序列是用于把THAI缺失突變的基因組DNA進行放大(amplification)，而SEQ ID NO2的核酸序列是用于把-α3.7缺失突變的基因組DNA進行放大。
因此，本發(fā)明方法中步驟102至106的目的，是針對檢體進行特定缺失型進行放大(amplification)、標志(labeling)、制成單股DNA標的物(target)，以增加訊號強度。
在圖1所示的步驟108，提供一種含有探針的固態(tài)基材，此探針是與步驟106得到的檢體單股DNA進行雜交。此種固態(tài)基材是包含一檢測區(qū)及一對照區(qū)，皆含有特定序列的探針，藉由探針與檢驗樣品的單股DNA結合，而以肉眼檢驗固態(tài)基材的呈色結果及呈色位置，分析檢體的提供者是否為α海洋性貧血的病患或帶因者。在本發(fā)明的一種實施例中，步驟108提供的固態(tài)基材同時針對α型海洋性貧血五種突變型SEA、FIL、THAI、α3.7、α4.2進行檢測。
上述的固態(tài)基材的材質，是選自于玻璃(glass)、硅芯片(silica)、尼龍(nylon)、高分子聚合物(polymer)、金屬以及合金組成之群組，并也能是固態(tài)基材。而此固態(tài)基材上探針配置的平面圖，可參考圖4(A)，其中-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI探針是位于檢測區(qū)，而α2基因探針、ControlI(ACTB基因)探針和ControlII(GAPD基因)探針是位于對照區(qū)。另外，固態(tài)基材所包含的探針，是選自SEQID NOs3至10組成之序列群組，可參見圖3，探針放置的方式可有點制、噴墨、壓電等，密度為Probe/dot0.1ul(200nmole/200ul)，經由UV照射以使探針序列與基材材質進行交聯(crosslink)。在固態(tài)基材的檢測區(qū)所放置的SEQ ID NOs3至7的序列探針，是各自檢測α血球蛋白基因的SEA、FIL、THAI、-α3.7、-α4.2的缺失突變，而在對照區(qū)的SEQ ID NO8序列探針是為α2基因檢定探針，此α2基因檢定探針是為各個突變型共同缺失區(qū)域的序列，用以探測制造α血球蛋白基因的DNA是否正常。另外，可進一步在此固態(tài)基材上的對照區(qū)放置SEQ ID NOs9與10組成之序列群組的探針，其中SEQ ID NO9是為ACTB(actin-beta)基因的序列，而SEQ ID NO10是為GAPD(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因的序列，這兩種基因是人類的基本基因(hosuekeepinggene)。上述的二探針序列(SEQ ID NOs9與10)是位于其它條染色體上，可用于確定該放大生物檢體的步驟是否完成。
在本發(fā)明的另一實施例中，放置于固態(tài)基材上的探針，包含有對照區(qū)的SEQ ID NO8序列探針，以及在檢測區(qū)的一種探針，此探針是選自SEQ ID NOs3至7的序列群組探針的任一種，也就是可以只單獨測定SEA、FIL、THAI、-α3.7、-α4.2的其中一種突變型。
繼續(xù)參考圖1，步驟110至114是將已標定的放大檢體于此固態(tài)基材上與探針進行雜交反應，在同一個反應中，以含有多種專一性探針數組(probes array)的固態(tài)基材，同時針對多種標的物進行雜交反應確認多種疾病之基因型。如果有因為基因缺失而能進行PCR放大增幅的片段存在，便可與固態(tài)基材上的探針進行專一性互補雜交反應，并在反應一段時間后，用緩沖液洗掉過量未進行互補雜交反應的放大檢體，接下來，加入呈色反應試劑，呈色反應后，便能用肉眼判讀結果。
在本發(fā)明的較佳實施例中，為了在步驟110達到較佳的雜交效果，便先把含有探針的固態(tài)基材置于反應槽中，并以400μl緩沖液浸潤，置于63℃之雜交箱中搖動3分鐘，接著，倒掉反應槽中的緩沖液，再把含有已標定放大檢體的緩沖溶液加入反應槽中，此溶液要蓋滿整片固態(tài)基材，并置于63℃雜交箱搖動60分鐘，以進行雜交反應，反應一段時間后，倒掉上述緩沖液，加入400μl、60℃的緩沖液搖動5分鐘，并重復一次，以洗掉未進行雜交反應的放大檢體，接下來，倒掉上述沖洗緩沖液，加入200μl的阻隔緩沖液(blockingbuffer)搖動30分鐘，以阻斷抗體不專一結合的作用位置。
緊接著步驟6便是呈色反應的進行，是在倒掉阻隔緩沖液之后，加入含有呈色反應試劑(抗-DIG抗體和其它試劑)的反應緩沖液200μl，此呈色反應試劑像是接合上堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase)的抗-DIG抗體，及阻隔緩沖液(兩者比例為1∶12500)。搖動反應緩沖液30分鐘后，倒掉上述緩沖液，加入400μl的沖洗緩沖液搖動5分鐘，并重復一次，以洗掉未進行結合的抗體，接下來，倒掉上述沖洗緩沖液，加入200μl的平衡緩沖液(Balance buffer)搖動2分鐘，使固態(tài)基材與呈色反應溶液達到平衡。最后，倒掉上述緩沖液，加入200μl的顯色緩沖液(color developbuffer)，此緩沖液的成分為NBT/BCIPdetectionbuffer(1∶50)，室溫下避光靜置，以使抗體上攜帶之堿性磷酸酵素分解NBT/BCIP，便出現呈色結果。
在本發(fā)明方法之步驟114，呈色結果只要用肉眼判讀，并藉由呈色與否和呈色的位置，便可以輕易了解是否有血紅素突變基因，而進一步了解是否為α型海洋性貧血之帶因者。
在本發(fā)明的較佳實施例中，可同時針對五種α型海洋性貧血SEA、FIL、THAI、α3.7、α4.2型進行檢測，而呈色結果的顯示，可參見圖4(B)至圖4(H)，是為圖4(A)中的探針與正常人和不同基因型的α海洋性貧血病人檢體雜交后，進行呈色反應的結果，而因為人類的染色體是成對的，所以在檢測結果中常有在同一對染色體中，一條基因缺失，一條為正常染色體的異型結合子現象，例如基因型為SEA缺失/正常。
圖4(B)顯示出正常的α2基因，表示檢體來源不具有此五種α海洋性貧血帶因者；圖4(C)同時顯示出正常的α2基因與SEA缺失片段，其基因型為SEA缺失/正常，表示檢體來源為SEA型的α海洋性貧血帶因者；圖4(D)同時顯示出正常的α2基因與FIL缺失片段，其基因型為FIL缺失/正常，表示檢體來源為FIL型的α海洋性貧血帶因者；圖4(E)同時顯示出正常的α2基因與THAI缺失片段，其基因型為THAI缺失/正常，表示檢體來源為THAI型的α海洋性貧血帶因者；圖4(F)同時顯示出正常的α2基因與α4.2缺失片段，其基因型為α4.2缺失/正常，表示檢體來源為-α4.2型的α海洋性貧血帶因者；圖4(G)同時顯示出正常的α2基因與α3.7缺失片段，其基因型為α3.7缺失/正常，表示檢體來源為α3.7型的α海洋性貧血帶因者；圖4(H)顯示出SEA缺失片段，其基因型為SEA缺失/SEA缺失，表示檢體來源為SEA型的重度α海洋性貧血病患。
雖然本發(fā)明以具體實施例顯示并描述如上，惟熟悉此技藝者應當了解的是，任何不脫離本發(fā)明精神下所為之修飾或改變，都將包含于本發(fā)明之中，因此本發(fā)明的保護范圍當視后附之申請專利范圍所界定者為準。
權利要求
1.一種用于測定血紅素突變基因方法中引子的核酸組成物，其特征在于，其中該引子是包含SEQ ID NO1的核酸序列及S EQ ID NO2的核酸序列。
2.如權利要求1所述的核酸組成物，其特征在于，其中該SEQ ID NO1的核酸序列是用于把THAI缺失突變的基因組DNA進行放大。
3.如權利要求1所述的核酸組成物，其特征在于，其中該SEQ ID NO2的核酸序列是用于把-α3.7缺失突變的基因組DNA進行放大。
4.一種用于測定血紅素突變基因方法中探針的核酸組成物，其特征在于，其中該探針是包含選自SEQ ID NOs3至7組成的序列群組。
5.如權利要求4所述的核酸組成物，其特征在于，其中該探針進一步包含選自SEQ ID NOs8至10組成的序列群組。
6.一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，其特征在于，供測定-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI五種突變型，該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；放置選自SEQ ID NOs3至8組成之序列群組的探針于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中該生物檢體中內含編碼出血球蛋白的核酸序列。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中放大該生物檢體是以聚合酵素鏈鎖反應進行放大。
9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中放大該生物檢體是以一管以上的多重引子-缺口聚合酵素鏈鎖反應進行放大。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，其中一管內含可把FIL、SEA、-α4.2缺失突變基因放大的引子，而另一管內含可把THAI、-α3.7缺失突變基因放大的引子。
11.如權利要求10所述之方法，其特征在于，其中該可把THAI、-α3.7缺失突變基因放大的引子，是包含SEQ IDNO1的核酸序列以及SEQ ID NO2的核酸序列。
12.如權利要求6所述之方法，其特征在于，其中SEQID NOs3是探測α血球蛋白基因的SEA缺失突變。
13.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中SEQID NOs4是探測α血球蛋白基因的FIL缺失突變。
14.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中SEQID NOs5是探測α血球蛋白基因的THAI缺失突變。
15.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中SEQID NOs6是探測α血球蛋白基因的-α3.7缺失突變。
16.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中SEQID NOs7是探測α血球蛋白基因的-α4.2缺失突變。
17.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中SEQID NOs8是α2基因探針，用以探測制造α血球蛋白基因是否正常。
18.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中該固態(tài)基材選自于玻璃、硅芯片、尼龍、高分子聚合物、金屬以及合金組成的群組。
19.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中該固態(tài)基材是為一生物芯片。
20.如權利要求19所述的方法，其特征在于，其中該生物芯片選自于玻璃、硅芯片、尼龍、高分子聚合物、金屬以及合金組成的群組。
21.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中該放置的步驟進一步包含放置SEQ ID NOs9與10組成的序列群組的探針于該固態(tài)基材上。
22.如權利要求21所述的方法，其特征在于，其中SEQID NOs9與10為對照組探針，用于確定該放大生物檢體步驟是否完成。
23.一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，供檢測出SEA突變型，其特征在于，該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；放置SEQ ID NOs3與8的探針于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。
24.一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，供檢測出FIL突變型，其特征在于，該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；放置SEQ ID NOs4與8的探針于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。
25.一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，供檢測出THAI突變型，其特征在于，該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；放置SEQ ID NOs5與8的探針于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。
26.一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，供檢測出-α3.7突變型，其特征在于，該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；放置SEQ ID NOs6與8的探針于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。
27.一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，供檢測出-α4.2突變型，其特征在于，該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；放置SEQ ID NOs7與8的探針于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。
28.一種在一生物檢體中測定血紅素突變基因的方法，供檢測出一種以上突變型，其特征在于該方法包含下列步驟放大該生物檢體，并以標定物標定該放大生物檢體的核酸序列；放置對應該一種以上突變型的探針以及一檢定基因探針，于一固態(tài)基材上；以及把已標定的該放大生物檢體于該固態(tài)基材上與探針進行雜交，進行呈色反應。
29.如權利要求28所述的方法，其特征在于，其中該檢定基因探針為該一種以上突變型共同缺失的基因部分。
30.一種用于測定血紅素突變基因的固態(tài)基材，其特征在于，是包含一檢測區(qū)及一對照區(qū)，其中該檢測區(qū)包含一種以上突變型的探針，而該對照區(qū)包含一檢定基因探針為其特征。
31.如權利要求30所述的固態(tài)基材，其特征在于，其中該對照區(qū)進一步包含對照組探針。
32.如權利要求30所述的固態(tài)基材，其特征在于，其中該一種以上突變型包含-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI突變型。
33.如權利要求30所述之固態(tài)基材，其特征在于，其中該檢定基因探針為該一種以上突變型共同缺失的基因部分。
全文摘要
一種測定血紅素突變基因的方法，是在檢體的血紅素基因中，可同時檢測多種基因缺失突變。另外，本發(fā)明進一步提供一種使用此方法的固態(tài)基材，是包含多種專一性的探針，以便對于常出現于亞洲族群的血紅素基因突變，做特定的篩選。
文檔編號C12Q1/68GK1465711SQ0212305
公開日2004年1月7日 申請日期2002年6月11日 優(yōu)先權日2002年6月11日
發(fā)明者吳滿潮, 杜明哲, 黃獻龍, 趙守宇 申請人:晶碁生化科技股份有限公司, 晶 生化科技股份有限公司