專利名稱：一種外切菊粉酶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種外切菊粉酶的生產(chǎn)方法，屬于制糖工業(yè)領(lǐng)域。
蔗糖作為甜味劑的統(tǒng)治地位，因其營(yíng)養(yǎng)弊端正受到其它更優(yōu)越產(chǎn)品的挑戰(zhàn)。長(zhǎng)期大量食用蔗糖引起了一系列營(yíng)養(yǎng)與健康問(wèn)題——肥胖癥、糖尿病、齲齒、高血壓和心血管疾病等，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展這一問(wèn)題越發(fā)突出。因此蔗糖替代品研發(fā)工作倍受重視。
目前國(guó)際上，在眾多的蔗糖替代品或者甜味劑品種中果糖產(chǎn)量一直上升緊追蔗糖，位居第二。這是因?yàn)楣仟?dú)具優(yōu)勢(shì)。其低熱值性成為甜味劑和低熱值食品原料新寵。目前國(guó)內(nèi)外果糖生產(chǎn)途徑之一是以淀粉為原料經(jīng)過(guò)三種酶催化的多步化學(xué)反應(yīng)生產(chǎn)果糖即多步法途徑。以菊粉為原料依靠菊粉酶一步催化反應(yīng)生產(chǎn)高純度果糖即一步酶法生產(chǎn)途徑的產(chǎn)業(yè)化，處于起步階段。
多采用多步法工藝生產(chǎn)高果糖漿(HFS)，即以玉米或水稻淀粉為原料，經(jīng)過(guò)3種酶(淀粉酶，糖化酶和葡萄糖異構(gòu)酶)催化反應(yīng)和4～5個(gè)反應(yīng)步驟，反應(yīng)初產(chǎn)物為含果糖42％的果葡糖漿(第1代產(chǎn)品，F(xiàn)-42)，原料利用率和產(chǎn)物得率均很低。通過(guò)膜分離和循環(huán)反應(yīng)可以制備含果糖55％(第2代產(chǎn)品，F(xiàn)-55)和90％(第3代產(chǎn)品，F(xiàn)-90)的高果葡糖漿，但成本增加高。一步法工藝具有與多步法工藝不同的特點(diǎn)或者優(yōu)勢(shì)一步法工藝只有一步菊粉酶催化反應(yīng)，生產(chǎn)工序大為簡(jiǎn)化，生產(chǎn)成本降低，糖化初產(chǎn)物為高純度(＞90％)果糖HFS，產(chǎn)物得率＞100％；多步法工藝需要3種不同酶催化反應(yīng)和多步產(chǎn)物分離反應(yīng)，初產(chǎn)物果糖得率＜50％。顯然，菊粉酶是一步酶法生產(chǎn)菊粉高果糖漿的唯一重要酶種。
一般采用液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶。據(jù)報(bào)道一種產(chǎn)菊粉酶的黑曲霉在搖床水平下，在30℃140r/min，至120h酶活達(dá)到27U/ml，168h酶活達(dá)到高峰為48.4U/ml，生物量達(dá)到28.8g/L(OhtaK.，Akimoto H.，Matsuda.，et al.，Molecular cloning and sequence analysis of two endo-inulinasegenes from Aspergillus niger.Biosci.Biotechnol.Biochem.，1998，621731-1738.)。最近報(bào)道(Ongen-Baysal G.and Sukan S.S.Production of inulinase mixed culture of Aspergillius nigerand Kluyveromyces marxianus.Biotechnol.Lett.1996，181431-1434.)一種產(chǎn)菊粉酶的黑曲霉在搖瓶水平下，28℃ 200r/min，菊粉酶至168h達(dá)到50U/ml的高峰值。一株K.marxianus最適生長(zhǎng)與產(chǎn)酶溫度為40～45℃，在1L發(fā)酵罐中采用無(wú)機(jī)培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基碳源限制為0.25％蔗糖，發(fā)酵參數(shù)為pO2控制在50％～70％，由1M KOH和0.5M H2SO4控制pH4.5，在0.1/h稀釋速率下，最高胞外酶活32U/ml，I/S＝1/15，胞外酶與胞內(nèi)酶比例依培養(yǎng)時(shí)間大致為50％～65％/50％～35％，培養(yǎng)基中殘余蔗糖濃度與酶產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)(Rouwenhorst R.J.，Hensing M.，Verbakel J.，et al.Structure and properties of the extracellular inulinase of Kluyveromycesmarxianus CBS6556，Appl.Environ.Microbiol.，1988，541311-1137；1990，563337-3345.)。另一株K.marxianus NCYC 587在28℃ 200r/min，120h菊粉酶活性達(dá)34.5U/ml(Ongen-BaysalG.and Sukan S.S.Production of inulinase mixed culture of Aspergillius niger andKluyveromyces marxianus.Biotechnology Lett.1996，181431-1434.)。又一株Kluyveromyces菌株在由牛肉膏、玉米漿、尿素和菊芋汁組成的有機(jī)培養(yǎng)基上經(jīng)搖瓶產(chǎn)酶正交試驗(yàn)結(jié)果最高菊粉酶胞外酶活性為15U/ml，在15L和1000L發(fā)酵罐上試驗(yàn)所得最高胞外酶產(chǎn)量分別為17.63和18.7U/ml(魏文鈴等，克魯維酵母Y-85合成菊粉酶最適條件的研究.微生物學(xué)報(bào)，1998，38208-212)。最新報(bào)道Bacillus sphaericus產(chǎn)菊粉酶的最佳碳源為0.75％菊粉，產(chǎn)菊粉酶178.4U/ml；最佳氮源為牛肉膏，產(chǎn)菊粉酶196.1U/ml(Kwon S.J，Yoo，J.Y.，Lee J.S.Isolation ofintracellular inulinase-producing bacterirum and culture condition for inulinase production.FoodSci.Biotechnol.，1999，824-29)。王建華等采用酵母高密度細(xì)胞發(fā)酵方法，當(dāng)選天然菌株Kluyveromyces(CGMCC 0360)在120h(35～40℃，500～800r/min)最高菊粉酶產(chǎn)量達(dá)289U/ml，為20世紀(jì)90年代國(guó)際最高產(chǎn)量酶水平(王建華等。一種產(chǎn)生菊粉酶的酵母菌株及其在高果糖漿中的應(yīng)用，1998，中國(guó)專利，專利申請(qǐng)?zhí)朜o.98120697.2；王建華等。菊粉酶高產(chǎn)酵母高密度培養(yǎng)及酶學(xué)性質(zhì)研究。生物工程學(xué)報(bào)，2000；16(1)60-64)。
菊粉酶(Inulinase)是能夠水解β-2，1-D-果聚糖果糖苷鍵的一類水解酶，學(xué)名β-2，1-D-果聚糖酶，又叫β-果糖苷酶，或β-果聚糖水解酶，或2，1-D-果聚糖果聚糖水解酶，酶學(xué)編號(hào)為EC 3.2.1。根據(jù)菊粉酶酶切果聚糖鏈的方式分為內(nèi)切酶(EC 3.2.1.7)和外切酶(EC3.2.1.80)；20世紀(jì)30年代初從微生物細(xì)胞中提取出菊粉酶，深入研究菊粉酶始于20世紀(jì)80年代中期，這是因?yàn)橥馇芯辗勖杆饩辗劭傻酶呒兌裙?，?nèi)切菊粉酶水解菊粉可得高純度低聚果糖。果糖和低聚果糖是比蔗糖更為優(yōu)秀的甜味劑、功能性食品原料和添加劑。
本發(fā)明的目的是為選擇一株菊粉酶的高產(chǎn)菌株并將該菌株用于菊粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)的方法，以提高菊粉酶產(chǎn)量和縮短產(chǎn)酶發(fā)酵高峰期，解決生產(chǎn)實(shí)踐中菊粉酶產(chǎn)量低、成本高的問(wèn)題。
本發(fā)明人采用基因重組方法，獲得一株高效表達(dá)外切菊粉酶的重組酵母菌株，命名為巴斯德畢赤酵母重組Pichia pastoris EXI2086菌株，并在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(中國(guó)北京中關(guān)村北一條13號(hào)，100080)進(jìn)行保藏，保藏號(hào)為CGMCCNo.0763，保藏日期為2002年7月10日。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由本發(fā)明所獲得的重組酵母菌株高密度發(fā)酵生產(chǎn)外切菊粉酶的方法。將以上方法生產(chǎn)出的發(fā)酵產(chǎn)物利用本發(fā)明人1999年1月29日提交的98120697.2專利申請(qǐng)的方法生產(chǎn)的菊粉酶降解菊粉生產(chǎn)高果糖漿的方法。
本發(fā)明的技術(shù)路線見(jiàn)附圖1。
本發(fā)明的具體描述如下首先篩選出一株外切菊粉酶產(chǎn)生菌株，即外切菊粉酶基因供體菌株為克魯維酵母菌Kluyveromyces IW9801菌株(CGMCC0360)；并對(duì)起所產(chǎn)菊粉酶的性質(zhì)進(jìn)行研究(見(jiàn)本發(fā)明人1999年1月29日提交的98120697.2專利申請(qǐng))，擴(kuò)增和保存質(zhì)粒用大腸桿菌為E.coliTOP10F’；設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物并對(duì)外切菊粉酶基因進(jìn)行克隆，再經(jīng)重組載體構(gòu)建、受體酵母轉(zhuǎn)化(受體菌株巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris GS115(His-Mut-))及重組子篩選和重組子功能性測(cè)定等一整套基因重組和表達(dá)優(yōu)化操作獲得高效表達(dá)外切菊粉酶的工程酵母菌Pichia pastoris EXI2086株。
本發(fā)明以上的工作獲得1.克隆的外切菊粉酶基因全長(zhǎng)1599bp(不含信號(hào)肽)，編碼533氨基酸，同源性比較分析發(fā)現(xiàn)與國(guó)外最早報(bào)道的克魯維外切菊粉酶基因序列同源性＞99％，認(rèn)定為同一起源基因。從氨基酸推斷理論分子量為59.2KD。在編碼的氨基酸序列上發(fā)現(xiàn)了10個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)(Asn-X-Ser/Thr，X為任意氨基酸)。外切菊粉酶基因中G+C含量達(dá)到47.3％。
2.成功構(gòu)建外切菊粉酶重組酵母Pichia pastoris EXI2086，在96h達(dá)最高產(chǎn)酶水平577U/ml；產(chǎn)酶水平顯著高于我們已知的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的各菌株最高產(chǎn)酶水平。
由本發(fā)明所獲得的重組酵母菌株高密度發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶的方法描述如下(除非特別說(shuō)明，本發(fā)明所用的百分比均為重量百分比)在pH、溶解氧(DO)、溫度自動(dòng)控制的6.6L發(fā)酵罐中培養(yǎng)本發(fā)明研制的工程菌株P(guān)ichiapastoris EXI2086生產(chǎn)菊粉酶。在發(fā)酵罐的起始培養(yǎng)基裝料容積是罐容量的30％基礎(chǔ)培養(yǎng)基2.67％磷酸，0.093％硫酸鈣，1.82％硫酸鉀，1.49％硫酸鎂，0.413％氫氧化鉀，4.0％葡萄糖，0.437％PTM1，補(bǔ)水至1L。其中PTM1成分和配制濃度為0.6％硫酸銅，0.008％碘化鈉，0.3％硫酸錳，0.002％鉬酸鈉，0.02％硼酸，0.05％氯化鈷，2.0％氯化鋅，6.5％硫酸亞鐵，0.025％生物素，0.5％硫酸，補(bǔ)水至1L。工程菌株接種量5％～7.5％(工程菌株搖瓶種子培養(yǎng)基1.0％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，加水至1L)，發(fā)酵溫度控制在28～32℃，攪拌速度為800～1,200r/min，pO2均控制在30％以上，入口氣流速度大于9L/min，發(fā)酵液的pH用2Mol/l氨水始終控制在pH5.6水平上(所補(bǔ)加氨水同時(shí)在培養(yǎng)基中起氮源作用)；產(chǎn)菊粉酶工程菌株具有不同的調(diào)控方式，主要由兩部分組成(1)通過(guò)基礎(chǔ)培養(yǎng)基和生長(zhǎng)階段補(bǔ)料液(生長(zhǎng)階段補(bǔ)料液25％葡萄糖，1.2％PTM1，補(bǔ)水至1L。當(dāng)培養(yǎng)基中殘?zhí)堑陀?.5％或生物量低于200g/L時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料)提供足夠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以加速酵母細(xì)胞繁殖獲得最大生物量200g/L以上；(2)采用混合誘導(dǎo)培養(yǎng)基(混合誘導(dǎo)培養(yǎng)基(補(bǔ)料液)25％葡萄糖，10％甲醇，1.2％PTM1，補(bǔ)水至1L)進(jìn)行補(bǔ)料，其目的是在進(jìn)一步提高生物量的同時(shí)，使酵母菌適應(yīng)甲醇碳源，并由此進(jìn)入誘導(dǎo)外源蛋白質(zhì)表達(dá)的起始階段；(3)其后采用純粹誘導(dǎo)培養(yǎng)基(純粹誘導(dǎo)培養(yǎng)基(補(bǔ)料液)純甲醇，1.2％PTM1，補(bǔ)水至1L)進(jìn)行補(bǔ)料，在此其間，只有補(bǔ)加流量的變化，其他條件不變；補(bǔ)料流量變化的依據(jù)是保持DO值在一個(gè)合適的水平上，如果太低(＜30％)，說(shuō)明生長(zhǎng)快、氧消耗多，表明培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)不足，此時(shí)需要提高補(bǔ)料流量；如果太高(＞40％)，說(shuō)明生長(zhǎng)慢、氧消耗少，表明培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)充足，此時(shí)需要減低補(bǔ)料流量。誘導(dǎo)表達(dá)的條件與優(yōu)化原則與Jayne Stratton et al.方法(High Cell-DensityFermentaion.InDavid RH.，James MC.ed.Methods in Molecular Biology-ProtocolsPichia，1998，vol.103 Humana Press Inc.，New York107-120)基本一致，只是將培養(yǎng)基中使用的碳源甘油改由葡萄糖代替，這樣既降低產(chǎn)酶發(fā)酵成本又不影響營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和外源蛋白質(zhì)表達(dá)效果?？偱囵B(yǎng)時(shí)間達(dá)90～144h時(shí)可以獲得最大量的菊粉酶總產(chǎn)量和最好的產(chǎn)酶經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明利用以上獲得的培養(yǎng)液，經(jīng)菌體與酶液分離后，將菊粉酶液與含糖8～17％的菊粉溶液按照1∶8～17的體積比混合，在45～55℃下酶解糖化30～40小時(shí)，得到高果糖漿。生產(chǎn)菌株的構(gòu)建包括以下以下實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一外切菊粉酶基因的克隆 外切菊粉酶基因供體菌株為Kluyveromyces IW9801(CGMCC0360)(1)供體菌株基因組DNA提取(采用中性裂解法)收集菌體，用蒸餾水洗滌一次；菌體懸浮于0.2ml破壁體系中(1.0M山梨醇，0.1M醋酸鈉pH7.0，60mM EDTA，1％Zymolyase5000達(dá)終濃度1mg/ml，1％巰基乙醇)于37℃下處理30min加入如下物質(zhì)0.5％SDS，100mM Tris-HClpH7.0，50mM EDTA pH8.5，混勻，放于-70℃冰箱中，再加入0.2ml 5M醋酸鉀，置0℃，45min，再于4℃離心10,000r/min，10min，留上清分成兩份。用等體積Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，15,000r/min，離心5min，收集上清，再用等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次，加入2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，于室溫下靜止30min。4℃，10,000r/min，離心20min，棄上清液留沉淀。用1ml預(yù)冷70％乙醇連續(xù)洗兩次，4℃10,000r/min，離心20min，留沉淀。沉淀即DNA，溶于50μlTE于-20℃下保存?zhèn)溆谩?br> (2)外切菊粉酶基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)與合成 按照已經(jīng)報(bào)道的克魯維酵母菊粉酶全基因序列為依據(jù)，在exoinu基因的5’端有一個(gè)編碼23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽編碼序列，通過(guò)PCR的方法，以信號(hào)肽編碼序列之后的堿基序列(長(zhǎng)35個(gè)的堿基)和基因3’端序列(長(zhǎng)29個(gè)的堿基)為引物，以分段或者一次性釣取目的基因?yàn)槟康?，設(shè)計(jì)特異性引物若干對(duì)，并且交由上海Genecore Inc合成，能夠一次性成功釣取全目的基因的一對(duì)引物P15’CAAAGCTTGATTGCGGCCGATGGATGGTGACAGCA 3’P25’CAGAATTCTCAATTTCACCAATAACGTTG 3’(3)PCR擴(kuò)增目的基因 設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃變性5min，后在反應(yīng)體系中加入Taq酶，6000r/min，離心20秒，然后進(jìn)行循環(huán)30--35次，每次循環(huán)94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)結(jié)束后72℃保溫10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳。
目標(biāo)基因克隆和核苷酸結(jié)構(gòu)分析擴(kuò)增產(chǎn)物低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳。判斷擴(kuò)增片段大小1.6kb左右，試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，送上海Genecore生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序克隆得到的目標(biāo)基因，經(jīng)測(cè)定得到該基因核苷酸序列，結(jié)果如下5’GATGGTGACA GCAAGGCCAT CACTAACACC ACTTTTAGTT TGAACAGACC TTCTGTGCAT 60TTCACTCCAT CCCATGGTTG GATGAACGAT CCAAATGGTT TGTGGTACGA TGCCAAGGAA120GAAGACTGGC ATTTGTACTA CCAGTACAAC CCAGCAGCCA CGATCTGGGG TACTCCATTG180TACTGGGGTC ACGCTGTTTC CAAGGATTTG ACTTCCTGGA CAGATTACGG TGCTTCTTTG240GGCCCAGGTT CCGACGACGC TGGTGCGTTC AGTGGTAGTA TGGTTATCGA TTATAACAAT300ACTTCTGGTT TCTTCAACAG CTCTGTGGAC CCAAGACAAA GAGCAGTTGC AGTCTGGACT360TTGTCTAAGG GCCCAAGCCA AGCCCAACAC ATCAGTTACT CATTGGACGG TGGTTACACC420TTCGAGCACT ACACCGACAA CGCCGTGTTG GACATCAACA GCTCCAACTT CAGAGACCCT480AAGGTGTTCT GGCACGAGGG CGAGAACGGC GAAGATGGTC GTTGGATCAT GGCCGTTGCT540GAATCGCAAG TGTTCTCTTG TTTGTTCTAC TCTTCTCCAA ACTTGAAAAA CTGGACCTTG600GAATCCAACT TCACCCACCA CGGCTGGACT GGTACCCAAT ACGAATGTCC AGGTCTAGTT660
AAGGTTCCAT ACGACAGTGT TGTTGACTCT TCGAACTCCT CCGACTCCAA GCCAGACTCC 720GCATGGGTCT TGTTTGTCTC TATCAACCCT GGTGGTCCAT TGGGTGGTTC CGTTACCCAA 780TACTTTGTTG GTGACTTCAA CGGTACTCAC TTCACTCCAA TCGACGGCCA AACCAGATTC 840CTAGACATGG GTAAGGACTA CTACGCACTA CAAACTTTCT TCAACACTCC AAACGAGAAG 900GACGTCTACG GTATCGCATG GGCTTCTAAC TGGCAATACG CCCAACAAGC CCCAACTGAC 960CCATGGCGTT CATCTATGAG TTTGGTTAGA CAATTCACAT TGAAAGACTT CAGCACAAAC1020CCTAACTCCG CTGATGTCGT CTTGAACAGT CAACCAGTCT TGAACTATGA TGCATTGAGA1080AAGAACGGTA CCACTTACAG TATCACAAAC TACACCGTCA CCTCCGAAAA CGGCAAGAAG1140ATCAAGCTAG ACAACCCATC CGGTTCTCTT GAATTCCATC TTGAATACGT GTTTAACGGC1200TCCCCAGATA TCAAGAGCAA CGTGTTCGCT GATCTTTCCT TGTACTTCAA GGGTAACAAC1260GACGACAACG AATACTTGAG ATTGGGTTAC GAAACCAACG GTGGTGCCTT CTTCTTGGAC1320CGTGGCCACA CCAAGATTCC TTTCGTGAAG GAGAACTTGT TCTTCACCCA CCAATTGGCA1380GTTACCAACC CAGTTTCCAA CTACACCACA AACGTCTTCG ACGTTTACGG TGTCATTGAC1440AAGAACATCA TCGAATTGTA CTTCGATAAC GGTAACGTCG TCTCCACCAA CACTTTCTTC1500TTCTCTACCA ACAACGTTAT TGGTGAAATT GACATCAAGT CGCCATACGA CAACCCTTAC1560ACCATTAACT CATTTAACGT TACCCAATTT AACGTTTGA 3’ 1599由核苷酸密碼翻譯的氨基酸序列如下GAT GGT GAC AGC AAG GCC ATC ACT AAC ACC ACT TTT AGT TTG AAC AGA CCT TCT 54D G D S K A I T N T T F S L N R P S 18GTG CAT TTC ACT CCA TCC CAT GGT TGG ATG AAC GAT CCA AAT GGT TTG TGG TAC 108V H F T P S H G W M N D P N G L W Y 36GAT GCC AAG GAA GAA GAC TGG CAT TTG TAC TAC CAG TAC AAC CCA GCA GCC ACG 162D A K E E D W H L Y Y Q Y N P A A T 54ATC TGG GGT ACT CCA TTG TAC TGG GGT CAC GCT GTT TCC AAG GAT TTG ACT TCC 216I W G T P L Y W G H A V S K D L T S 72TGG ACA GAT TAC GGT GCT TCT TTG GGC CCA GGT TCC GAC GAC GCT GGT GCG TTC 270W T D Y G A S L G P G S D D A G A F 90AGT GGT AGT ATG GTT ATC GAT TAT AAC AAT ACT TCT GGT TTC TTC AAC AGC TCT 324S G S M V I D Y N N T S G F F N S S 108GTG GAC CCA AGA CAA AGA GCA GTT GCA GTC TGG ACT TTG TCT AAG GGC CCA AGC 378V D P R Q R A V A V W T L S K G P S 126CAA GCC CAA CAC ATC AGT TAC TCA TTG GAC GGT GGT TAC ACC TTC GAG CAC TAC 432Q A Q H I S Y S L D G G Y T F E H Y 144ACC GAC AAC GCC GTG TTG GAC ATC AAC AGC TCC AAC TTC AGA GAC CCT AAG GTG 486T D N A V L D I N S S N F R D P K V 162TTC TGG CAC GAG GGC GAG AAC GGC GAA GAT GGT CGT TGG ATC ATG GCC GTT GCT 540F W H E G E N G E D G R W I M A V A 180GAA TCG CAA GTG TTC TCT TGT TTG TTC TAC TCT TCT CCA AAC TTG AAA AAC TGG 594E S Q V F S C L F Y S S P N L K N W 198ACC TTG GAA TCC AAC TTC ACC CAC CAC GGC TGG ACT GGT ACC CAA TAC GAA TGT 648T L E S N F T H H G W T G T Q Y E C 216CCA GGT CTA GTT AAG GTT CCA TAC GAC AGT GTT GTT GAC TCT TCG AAC TCC TCC 702
P G L V K V P Y D S V V D S S N S S 234GAC TCC AAG CCA GAC TCC GCA TGG GTC TTG TTT GTC TCT ATC AAC CCT GGT GGT 756D S K P D S A W V L F V S I N P G G 252CCA TTG GGT GGT TCC GTT ACC CAA TAC TTT GTT GGT GAC TTC AAC GGT ACT CAC 810P L G G S V T Q Y F V G D F N G T H 270TTC ACT CCA ATC GAC GGC CAA ACC AGA TTC CTA GAC ATG GGT AAG GAC TAC TAC 864F T P I D G Q T R F L D M G K D Y Y 288GCA CTA CAA ACT TTC TTC AAC ACT CCA AAC GAG AAG GAC GTC TAC GGT ATC GCA 918A L Q T F F N T P N E K D V Y G I A 306TGG GCT TCT AAC TGG CAA TAC GCC CAA CAA GCC CCA ACT GAC CCA TGG CGT TCA 972W A S N W Q Y A Q Q A P T D P W R S 324TCT ATG AGT TTG GTT AGA CAA TTC ACA TTG AAA GAC TTC AGC ACA AAC CCT AAC1026S M S L V R Q F T L K D F S T N P N 342TCC GCT GAT GTC GTC TTG AAC AGT CAA CCA GTC TTG AAC TAT GAT GCA TTG AGA1080S A D V V L N S Q P V L N Y D A L R 360AAG AAC GGT ACC ACT TAC AGT ATC ACA AAC TAC ACC GTC ACC TCC GAA AAC GGC1134K N G T T Y S I T N Y T V T S E N G 378AAG AAG ATC AAG CTA GAC AAC CCA TCC GGT TCT CTT GAA TTC CAT CTT GAA TAC1188K K I K L D N P S G S L E F H L E Y 396GTG TTT AAC GGC TCC CCA GAT ATC AAG AGC AAC GTG TTC GCT GAT CTT TCC TTG1242V F N G S P D I K S N V F A D L S L 414TAC TTC AAG GGT AAC AAC GAC GAC AAC GAA TAC TTG AGA TTG GGT TAC GAA ACC1296V F N G S P D I K S N V F A D L S L 432AAC GGT GGT GCC TTC TTC TTG GAC CGT GGC CAC ACC AAG ATT CCT TTC GTG AAG1350N G G A F F L D R G H T K I P F V K 450GAG AAC TTG TTC TTC ACC CAC CAA TTG GCA GTT ACC AAC CCA GTT TCC AAC TAC1404E N L F F T H Q L A V T N P V S N Y 468ACC ACA AAC GTC TTC GAC GTT TAC GGT GTC ATT GAC AAG AAC ATC ATC GAA TTG1458T T N V F D V Y G V I D K N I I E L 486TAC TTC GAT AAC GGT AAC GTC GTC TCC ACC AAC ACT TTC TTC TTC TCT ACC AAC1512V F D N G N V V S T N T F F F S T N 504AAC GTT ATT GGT GAA ATT GAC ATC AAG TCG CCA TAC GAC AAC CCT TAC ACC ATT1566N V I G E I D I K S P Y D N P Y T T 522AAC TCA TTT AAC GTT ACC CAA TTT AAC GTT TGA1599N S F N V T Q F N V Z 533分析外切菊粉酶基因的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列，具有如下特征(1)克隆的外切菊粉酶基因(不含信號(hào)肽)全長(zhǎng)1599個(gè)核苷酸，編碼533個(gè)氨基酸，同源性比較分析發(fā)現(xiàn)與國(guó)外最早報(bào)道的克魯維外切菊粉酶基因序列同源性＞99％(Laloux O.，J-P.Cassart，J.Delcour，et al.，1991)，認(rèn)定二者具有同一起源基因。
(2)從氨基酸推斷理論分子量為59.2KDa。
(3)在編碼的氨基酸序列上發(fā)現(xiàn)了10個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(Asn-X-Ser/Thr，X為任意氨基酸)，成熟酶蛋白的分子量為78KDa。
(4)該基因G+C含量47.3％。
實(shí)驗(yàn)二以Pichia pastoris GS115為受體菌的重組載體構(gòu)建用EcoRI和HindIII分別酶切exoinu基因和pUC18，酶切后進(jìn)行低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳進(jìn)行回收純化所需片段，exoinu與pUC18以3∶1比例(摩爾比例)混合后，在T4DNA連接酶作用下，于16℃過(guò)夜。取連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM103，在37℃過(guò)夜培養(yǎng)的LB固體培養(yǎng)基(含Amp 50～100μg/ml)上篩選重組子pUC18A，提取質(zhì)粒，酶切鑒定。從已經(jīng)驗(yàn)證的pUC18A上用EcoRI和SnaBI酶切下包含exoinu的片段，同樣用EcoRI和SnaBI酶切pPIC9，酶切后進(jìn)行低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳進(jìn)行回收純化所需片段，exoinu與pPIC9以3～5∶1(摩爾比例)混合后，在T4DNA連接酶作用下，于16℃過(guò)夜。然后取連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli TOP10F’，在LB培養(yǎng)基(含Amp50～100μg/ml)上涂平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑選陽(yáng)性重組子。PCR驗(yàn)證重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為Template DNA，以5’AOX1 sequencing primer5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和3’AOX1 sequencingprimer5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)釣取特征性DNA片段(見(jiàn)附圖2)。
用PCR驗(yàn)證重組載體，測(cè)序結(jié)果表明經(jīng)改造的exoinu基因通過(guò)EcoRI和SnaBI位點(diǎn)以正確的閱讀框架與酵母表達(dá)載體pPIC9(pPIC9長(zhǎng)度為8023bp，帶有Amp抗性標(biāo)記，具有酒精氧化酶啟動(dòng)子序列3’AOX1(1-948bp)和alpha--分泌因子信號(hào)肽序列(948-1218bp)，具有多克隆位點(diǎn)XhoI，SnaBI，EcoRI，NotI等，位于1192-1241bp之間。)上的alpha-factor信號(hào)肽編碼序列3’端融合，得到重組載體pPIC9A。這樣重組載體上的外源基因exoinu基因受AOX1(酒精氧化酶1)啟動(dòng)子控制。
實(shí)驗(yàn)三酵母轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性重組子篩選受體菌株為巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris GS115(His-Mut-)，在500ml YPD(1.0％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中30℃培養(yǎng)至A600＝1.3～1.8時(shí)離心收集菌體；依次用500ml和250ml預(yù)冷的無(wú)菌水洗菌體，離心去上清，收集菌體；用20ml預(yù)冷的1mol/L山梨醇懸浮菌體；離心后再用0.5ml預(yù)冷的山梨醇懸浮菌體；取40μl，加入1～5μg線性化重組質(zhì)粒，冰浴5min，用LN-101電擊儀電擊轉(zhuǎn)化，參數(shù)0.8kV，11.5μF。電擊結(jié)束后立即加入0.5ml預(yù)冷的1mol/L山梨醇，取200μl于固體YSDB上涂板，30℃培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。用無(wú)菌牙簽挑取YSDB上的轉(zhuǎn)化子對(duì)應(yīng)點(diǎn)種到MM和MD平板上，30℃下培養(yǎng)2d，在MD上生長(zhǎng)正常而在MM上生長(zhǎng)不正?；虿簧L(zhǎng)的克隆子(his+Mut-)為陽(yáng)性克隆子。
轉(zhuǎn)化子可以在培養(yǎng)基YSDB(不含His)上生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)化子不能生長(zhǎng)，這是因?yàn)槭荏w菌為組氨酸缺陷型(his-)，而載體上雖然有His4基因，但是沒(méi)有酵母復(fù)制子，所以載體上的His4基因必須整合進(jìn)酵母基因組中才能表達(dá)。另外，由于重組的酵母細(xì)胞中AOX1基因受到破壞，所以它不能再利用甲醇作為碳源，這樣在以甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化子就不能夠生長(zhǎng)或者生長(zhǎng)很慢，表現(xiàn)為甲醇利用缺陷型(Mut-)。
實(shí)驗(yàn)四重組酵母的分子鑒定重組酵母于10ml BMGY中30℃劇烈振搖，使細(xì)胞生長(zhǎng)至飽和狀態(tài)，離心收集菌體，加入10ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY，30℃下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5～7天，重組酵母于BMGY中培養(yǎng)后，提取基因組DNA。進(jìn)行PCR反應(yīng)，以重組酵母基因組DNA作為DNA模板，以5’AOX1sequencing primer 5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和3’AOX1 sequencing primer5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以證明外切菊粉酶基因是否正確插入表達(dá)載體。將PCR產(chǎn)物外送上海Genecore生物技術(shù)公司測(cè)序，證明外切菊粉酶基因正確插入基因組DNA中。
實(shí)驗(yàn)五重組酵母表達(dá)產(chǎn)物菊粉外切酶SDS-PAGE分析重組酵母30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)36h后離心去菌體，取3μl上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，(丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺為29∶1)分離膠濃度為8％，濃縮膠濃度為5％，電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮蘭染色30min，接著用10％冰乙酸脫色。
蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳結(jié)果表明表達(dá)的外切菊粉酶分子量大小約為78KDa，在用Endo H(Endo-β-N-acetylglyco-saminidase H)脫糖基化處理后，分子量降為60KDa左右，從蛋白質(zhì)水平證明了重組子能夠正常表達(dá)和分泌外源外切菊粉酶蛋白質(zhì)，表達(dá)產(chǎn)物能夠進(jìn)行蛋白翻譯后的糖基化修飾。
實(shí)驗(yàn)一至實(shí)驗(yàn)五使用以下實(shí)驗(yàn)材料1 菌株與質(zhì)粒 外切菊粉酶基因供體菌株為Kluyveromyces IW9801(CGMCC0360)、擴(kuò)增和保存質(zhì)粒用大腸桿菌為E.coli DH5α，E.coli TOP10F’、受體菌株P(guān)ichia pastorisGS115(His-Mut-)、質(zhì)粒pUC18和pPIC9均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所飼料生物技術(shù)研究室王建華課題組和姚斌課題組保存和提供材料。5’AOX1 sequencing primer5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和3’AOX1 sequencing primer5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’引物為Invitrogen產(chǎn)品；其他材料均為普通研究用商品材料。
2 酶與試劑盒 從北京欣經(jīng)科試劑公司和Promega公司購(gòu)買。包括限制性內(nèi)切酶EcoRI，HindIII，SnaBI，TaqDNA聚合酶，T4DNA連接酶，RNase，通用PCR反應(yīng)試劑盒，基因組DNA提取與純化試劑盒，DNA片段回收與純化試劑盒。
3 培養(yǎng)基(1)大腸桿菌培養(yǎng)基1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0。
(2)完全培養(yǎng)基YPD1.0％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。
(3)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基YSDB1.34％YNB，18.6％山梨醇，2％葡萄糖，0.00004％Biotin，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％賴氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％異亮氨酸，2％瓊脂。
(4)選擇培養(yǎng)基MM1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇，2.0％瓊脂。
(5)選擇(對(duì)照)培養(yǎng)基MD1.34％YNB，0.00004％Biotin，2％葡萄糖，2.0％瓊脂。
(6)誘導(dǎo)(適應(yīng))培養(yǎng)基BMGY1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油，由0.1Mol/l磷酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH6.0。
(7)誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇，由0.1Mol/l磷酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH6.0。
實(shí)驗(yàn)六重組酵母Pichia pastoris EXI2086表達(dá)外切菊粉酶研究從200個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)挑選120個(gè)，接種于裝有BMGY培養(yǎng)基的指形試管和15毫升離心管，在250r/min，30℃下培養(yǎng)24h，然后離心轉(zhuǎn)換BMMY培養(yǎng)基，3d后直接檢測(cè)誘導(dǎo)的發(fā)酵液的菊粉酶活性，依據(jù)活性大小，選定若干株繼代10代以上，選1高產(chǎn)重組子(定名為EXI2086)上6.6升Braun實(shí)驗(yàn)發(fā)酵罐(Biostat)研究產(chǎn)酶條件和曲線。主要發(fā)酵方法與Jayne Stratton et al.方法(InDavid RH.，James MC.ed.，Methods in MolecularBiology-Protocols Pichia，1998，vol.103 Humana Press Inc.，New York107-120.)基本相同，裝料系數(shù)0.30，為后期產(chǎn)酶誘導(dǎo)補(bǔ)料予留足夠空間。
1 培養(yǎng)基(1)工程菌株搖瓶種子培養(yǎng)基1.0％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，加水至1L。
(2)發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分2.67％磷酸，0.093％硫酸鈣，1.82％硫酸鉀，1.49％硫酸鎂，0.413％氫氧化鉀，(前5種成分可以配制成為，5～10倍濃縮母液)，4％葡萄糖，0.437％PTM1溶液，消泡劑GP 0.2ml，GPE 0.8ml，補(bǔ)水到1升。
(3)微量元素PTM1成分0.6％硫酸銅，0.08％碘化鈉，0.3％硫酸猛，0.02％鉬酸鈉，0.02％硼酸，0.05％氯化鈷，2％氯化鋅，6.5％硫酸亞鐵，0.025％生物素，0.5％濃硫酸，補(bǔ)水到1升。
(4)生長(zhǎng)階段補(bǔ)料液成分25％葡萄糖，含PTM1成分12ml/l(補(bǔ)料液)。
(5)混合誘導(dǎo)補(bǔ)料液成分25％葡萄糖，10％甲醇，含PTM1成分12ml/l(補(bǔ)料液)；(6)純粹誘導(dǎo)培養(yǎng)基純甲醇，含PTM1成分12ml/l(補(bǔ)料液)。
2 發(fā)酵條件 在pH、DO、溫度自動(dòng)控制的6.6L Braun發(fā)酵罐(Biostat，德國(guó)產(chǎn))中培養(yǎng)工程菌株P(guān)ichia pastoris EXI2086生產(chǎn)外切菊粉酶，工程菌株在發(fā)酵罐的起始裝料容積是2.0L，接種量5％～7.5％，發(fā)酵溫度分別控制在30℃，攪拌速度為1,200r/min，pO2均控制在30％以上，入口氣流速度大于9L/min，發(fā)酵液的pH用2Mol/l氨水分別控制在pH5.6(所補(bǔ)加氨水同時(shí)在培養(yǎng)基中起氮源作用)；產(chǎn)外切菊粉酶工程菌株具有不同的調(diào)控方式，主要由三個(gè)部分組成(1)通過(guò)初始培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基提供足夠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以加速酵母細(xì)胞繁殖獲得最大生物量，(2)補(bǔ)飼目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)誘導(dǎo)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混合培養(yǎng)在進(jìn)一步提高生物量的同時(shí)，開(kāi)始誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)的條件與Jayne Stratton et al.方法(High Cell-Density Fermentation，InDavid RH.，James MC.ed.Methods in MolecularBiology-Protocols Pichia，1998，vol.103 Humana Press Inc.，New York107-120)基本一致，只是將培養(yǎng)基中使用的碳源甘油改由葡萄糖代替，這樣既降低成本又不影響營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)效果。其他的變化還包括生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充料和表達(dá)誘導(dǎo)補(bǔ)充料流速的調(diào)控，具體參數(shù)見(jiàn)后面的實(shí)施例1中的詳細(xì)敘述。
表1.重組酵母Pichia pastoris EXI2086產(chǎn)外切菊粉酶時(shí)間進(jìn)程時(shí)間(h) 生物量(g/l，F(xiàn)W，經(jīng)5000g，10min離心) 酶活性單位(U/ml)0 10 --2498 --30165--3618060.3448198104.1656210141.1960230300.95
72 230314.7684 250393.8096 254577.14表1可見(jiàn)Pichia pastoris EXI2086最高產(chǎn)菊粉酶水平在96h達(dá)到577.14U/ml，比原始供體出發(fā)菌株Kluyveromyces marxianus IW9801(CGMCC0360)最高水平(289U/ml)高1倍，且時(shí)間縮短24h，根據(jù)該酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)其他異源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，還有足夠的優(yōu)化余地，預(yù)期能夠達(dá)到更理想產(chǎn)酶水平。
實(shí)驗(yàn)七外切菊粉酶活性的測(cè)定方法本研究菊粉酶反應(yīng)條件為經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液0.50ml和2.5％～3.0％菊糖(上?；瘜W(xué)試劑二廠)0.50ml在55℃反應(yīng)10min，反應(yīng)體系為1ml，反應(yīng)體系pH值為4.5，由0.02mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液提供。由斐林試劑法測(cè)定反應(yīng)體系中還原糖含量。菊粉酶活性單位定義為--反應(yīng)體系中每毫升每分鐘產(chǎn)生1μmol己糖所需酶量為1個(gè)酶活性單位。


圖1本發(fā)明的技術(shù)路線圖2.重組載體pPIC9A和高表達(dá)外切菊粉酶重組酵母Pichia pastoris EXI2086構(gòu)建本發(fā)明有以下特點(diǎn)(1)工程菌株P(guān)ichia pastoris EXI2086產(chǎn)酶水平577.14U/ml，高于發(fā)明人查到的同類研究或?qū)＠麍?bào)道的最高值，2002年3月4日經(jīng)過(guò)國(guó)家一級(jí)科技查新站檢索表明(200101c1400033)這是迄今為止唯一具有生產(chǎn)意義的成功構(gòu)建的外切菊粉酶工程菌株；(2)達(dá)到最高產(chǎn)酶水平時(shí)間從出發(fā)菌株的120h縮短到96h，提前24h；(3)獲得相同酶水平所需要的生物量比出發(fā)菌株更低；(4)工程菌株發(fā)酵溫度30℃比出發(fā)菌株低8℃；(5)用葡萄糖替換該表達(dá)系統(tǒng)的指定碳源甘油，前5點(diǎn)都意味著發(fā)酵能源和成本的大幅度降低；(6)在產(chǎn)外切菊粉酶誘導(dǎo)培養(yǎng)期間葡萄糖和甲醇的適當(dāng)比例以及培養(yǎng)基pH控制是優(yōu)化產(chǎn)酶條件的2個(gè)重要因子之一；(7)是目前報(bào)道中唯一只產(chǎn)外切菊粉酶的高產(chǎn)菌株，節(jié)省酶的純化成本。
實(shí)施例1種子液制備斜面種子(1環(huán))接入裝有培養(yǎng)基(搖瓶種子培養(yǎng)基(YPD)1％酵母培養(yǎng)物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，H2O 1000ml)的250ml搖瓶中經(jīng)30℃ 24h，300r/min成種子液，再轉(zhuǎn)入裝有同樣培養(yǎng)基的500ml搖瓶中經(jīng)30℃ 24h，300r/min成二級(jí)種子液。
生長(zhǎng)階段將2.0L培養(yǎng)基基礎(chǔ)料配制(含2.67％磷酸，0.093％硫酸鈣，1.82％硫酸鉀，1.49％硫酸鎂，0.413％氫氧化鉀，4.0％葡萄糖，0.437％PTM1(PTM1成分0.6％硫酸銅，0.08％碘化鈉，0.3％硫酸錳，0.02％鉬酸鈉，0.02％硼酸，0.05％氯化鈷，2.0％氯化鋅，6.5％硫酸亞鐵，0.025％生物素，0.5％濃硫酸)消泡劑GP 0.2ml/L，GPE 0.8ml/L，裝入6.6L發(fā)酵罐經(jīng)121℃蒸汽滅菌30min，冷卻至30℃接入種子液，30℃培養(yǎng)，1,200r/min攪拌，發(fā)酵液的pH用2Mol/L氨水始終控制在pH5.6水平上(所補(bǔ)加氨水同時(shí)在培養(yǎng)基中起氮源作用)，pO2≥30％。培養(yǎng)24h后，按36ml/h/L的速度補(bǔ)料(補(bǔ)料液成分25％葡萄糖，含PTM1成分12ml/L)30℃，pO2≥40％，5h后，以9L/min通氣；1,200r/min攪拌，pH5.6(自動(dòng)補(bǔ)充氨水調(diào)控)。
誘導(dǎo)階段至48h后用混合誘導(dǎo)培養(yǎng)基(25％葡萄糖，10％甲醇，含PTM1成分12ml/L)進(jìn)行補(bǔ)料，其流量為第1h為36ml/h/L，第2至4h為19.2ml/h/l，其他條件同上。再后以3ml/h/L的速度用純粹誘導(dǎo)補(bǔ)料液進(jìn)行補(bǔ)料(補(bǔ)料液成分10％純甲醇，含PTM1成分12ml/L)，pO2＞＝50％，其他條件同上。補(bǔ)料12h后又以6ml/h/L的速度用混合誘導(dǎo)培養(yǎng)基(25％葡萄糖，10％甲醇，含PTM1成分12ml/L)再補(bǔ)料6h，pO2為50％～55％，其他條件同上。再后以12～10ml/h/L的速度用純粹誘導(dǎo)補(bǔ)料液進(jìn)行補(bǔ)料，其他條件同上至96h結(jié)束培養(yǎng)。此時(shí)發(fā)酵液中的產(chǎn)酶水平達(dá)到577.14U/ml。
權(quán)利要求
1.一株外切菊粉酶產(chǎn)生菌株，其特征為該菌株是本發(fā)明人采用分子生物學(xué)的方法，獲得的一株工程菌株，命名為Pichia pastoris EXI2086，并在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.0763，保藏日期為2002年7月10日。
2.按照權(quán)利要求1所述的外切菊粉酶產(chǎn)生菌株，其特征為該菌株是通過(guò)以下方法獲得的，即首先篩選出一株外切菊粉酶產(chǎn)生菌株，即外切菊粉酶基因供體菌株為KluyveromycesIW9801，CGMCC No.0360)；經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，并對(duì)外切菊粉酶基因進(jìn)行克隆，再經(jīng)重組載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化到受體菌株畢赤酵母菌Pichia pastoris GS115(His-Mut-)中，再對(duì)獲得的重組子經(jīng)過(guò)鑒定、篩選獲得高效表達(dá)外切菊粉酶的酵母工程菌株。
3.一種外切菊粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于在pH、溶解氧、溫度自動(dòng)控制的6.6L發(fā)酵罐中培養(yǎng)本發(fā)明研制的工程菌株P(guān)ichia pastoris EXI2086生產(chǎn)菊粉酶。在發(fā)酵罐的起始的基礎(chǔ)培養(yǎng)基裝料容積是罐容量的30％工程菌株接種量5％～7.5％，發(fā)酵溫度控制在28～32℃，攪拌速度為800～1,200r/min，pO2均控制在30％以上，入口氣流速度大于9L/min，發(fā)酵液的pH用2Mol/l氨水始終控制在pH5.6水平上，所補(bǔ)加氨水同時(shí)在培養(yǎng)基中起氮源作用；產(chǎn)外切菊粉酶工程菌株具有不同的調(diào)控方式，主要由兩部分組成(1)通過(guò)基礎(chǔ)培養(yǎng)基和生長(zhǎng)階段補(bǔ)料液提供足夠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以加速酵母細(xì)胞繁殖獲得最大生物量至少達(dá)到200g/L，當(dāng)培養(yǎng)基中殘?zhí)堑陀?.5％或生物量低于200g/L時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料；(2)采用混合誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料，其目的是在進(jìn)一步提高生物量的同時(shí)，使重組酵母菌適應(yīng)甲醇碳源，并由此進(jìn)入誘導(dǎo)外源蛋白質(zhì)表達(dá)的起始階段；(3)其后采用純粹誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料，在此其間，只有補(bǔ)加流量的變化，其他條件不變；補(bǔ)料流量變化的依據(jù)是保持溶解氧在一個(gè)合適的水平上，如果＜30％，說(shuō)明生長(zhǎng)快、氧消耗多，表明培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)不足，此時(shí)需要提高補(bǔ)料流量；如果＞40％，說(shuō)明生長(zhǎng)慢、氧消耗少，表明培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)充足，此時(shí)需要減低補(bǔ)料流量。誘導(dǎo)表達(dá)的條件與優(yōu)化原則與Jayne Stratton et al.方法基本一致，只是將培養(yǎng)基中使用的碳源甘油改由葡萄糖代替，這樣既降低產(chǎn)酶發(fā)酵成本又不影響營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和外源蛋白質(zhì)表達(dá)效果?？偱囵B(yǎng)時(shí)間達(dá)90～144h時(shí)可以獲得最大量的菊粉酶總產(chǎn)量和最好的產(chǎn)酶經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明利用以上獲得的培養(yǎng)液，經(jīng)菌體與酶液分離后，將菊粉酶液與含糖8～17％的菊粉溶液按照1∶8～17的體積比混合，在45～55℃下酶解糖化30～40小時(shí)，得到高果糖漿。
4.權(quán)利要求3所述的外切菊粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為2.67％磷酸，0.093％硫酸鈣，1.82％硫酸鉀，1.49％硫酸鎂，0.413％氫氧化鉀，4.0％葡萄糖，0.437％PTM1，補(bǔ)水至1L。其中PTM1成分和配制濃度為0.6％硫酸銅，0.008％碘化鈉，0.3％硫酸錳，0.002％鉬酸鈉，0.02％硼酸，0.05％氯化鈷，2.0％氯化鋅，6.5％硫酸亞鐵，0.025％生物素，0.5％硫酸，補(bǔ)水至1L。
5.按照權(quán)利要求3所述的外切菊粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所用的工程菌株搖瓶種子培養(yǎng)基1.0％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，加水至1L。
6.按照權(quán)利要求3所述的外切菊粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所用的生長(zhǎng)階段補(bǔ)料液為25％葡萄糖，1.2％PTM1，補(bǔ)水至1L。
7.按照權(quán)利要求3所述的外切菊粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所用的混合誘導(dǎo)培養(yǎng)基為25％葡萄糖，10％甲醇，1.2％PTM1，補(bǔ)水至1L。
8.按照權(quán)利要求3所述的外切菊粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所用的純粹誘導(dǎo)培養(yǎng)基為純甲醇，1.2％PTM1，補(bǔ)水至1L。
9.按照權(quán)利要求3所述的外切菊粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵液中最高外切菊粉酶活性達(dá)到577.14U/ml。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用本發(fā)明人采用基因重組方法，獲得一株高效表達(dá)外切菊粉酶的巴斯德畢赤酵母重組Pichia pastoris EXI 2086菌株(CGMCC No.0763)作為生產(chǎn)菌株，采用高密度發(fā)酵生產(chǎn)方法生產(chǎn)外切菊粉酶(發(fā)酵液中最高外切菊粉酶活性達(dá)到577.14U/ml)。利用本發(fā)明可提高菊粉酶的產(chǎn)量并縮短產(chǎn)酶發(fā)酵高峰期，克服生產(chǎn)實(shí)踐菊粉酶產(chǎn)量低、成本高的問(wèn)題，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/56GK1495252SQ0212414
公開(kāi)日2004年5月12日 申請(qǐng)日期2002年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者王建華, 王明華, 滕達(dá), 張帆, 姚怡, 劉艷艷, 王亞茹 申請(qǐng)人:王建華, 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所