專利名稱：一種乙烯不敏感的植物表達載體pBinETR1及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領域。構建了ETR1基因797bp的cDNA片段的反義植物表達載體pBinETR1，包括ETR1第一、二疏水區(qū)。用含有該表達載體的根癌農桿菌轉化矮牽牛，轉基因植株對乙烯不敏感。該項技術在改造觀賞植物品質中具有非常重要的實用價值。
二是乙烯信號轉導途徑，既通過改變植物對乙烯的敏感性來延緩衰老。目前已經從擬南芥中分離出5個乙烯受體基因，分為兩個基因家族，分別是ETR1家族的ETR1、ERS1及ETR2家族的ETR2、EIN4和ERS2。其中研究比較透徹的是ETR1，它是乙烯信號轉導途徑中首先響應乙烯的基因，已經從許多植物中得到克隆。
通過轉入ETR1基因改變乙烯敏感性已經在番茄、香石竹、矮牽牛等植物中獲得成功。如Wilkinson等(1997)構建了雙元載體質粒pMON11063和pMON26601。前者包括擬南芥etr1-1(編碼一個顯性乙烯敏感性的突變受體)cDNA、CaMV 35S啟動子和一個豌豆rbcs-E9基因3’末端上游序列；后者包括etr1-1/NR基因嵌和體cDNA、FMV 35S啟動子和一個胭脂堿合成酶基因的3’末端。構建好的雙元載體從大腸桿菌轉化到根癌農桿菌ABI構建Ti質粒。轉基因番茄的果實成熟期大大滯后，矮牽牛花朵衰老和脫落也延遲。外源etr1-1基因在非同源植物中功能的表達，顯示出乙烯識別和響應途徑在植物體內是高度保守的。
利用基因工程改變花卉的乙烯敏感性，可以延長花期和切花的瓶插壽命。Clark等(1999)將帶有CaMV 35S啟動子的擬南芥突變體等位基因etr1-1轉入矮牽牛中，轉基因植株花朵衰老都有不同程度的延遲，但自花授粉后轉基因植株的座果率與對照相比降低，果實成熟推后，不定根的發(fā)生率也大大減少。這表明想要獲得花朵壽命延長的轉基因矮牽牛，還需要乙烯不敏感性的組織特異性。Bovy等(1999)構建了擬南芥etr1-1等位基因的雙元植物表達載體，所用的啟動子分別為etr1-1基因本身帶有的2.7kb的組成型啟動子、矮牽牛花特異啟動子FBP1以及組成型強啟動子CaMV 35S，雙元載體轉化根癌農桿菌AGLO構建Ti質粒。根癌農桿菌轉化香石竹后，轉基因植株瓶插壽命都得到延長。
目前乙烯受體基因轉化植物的研究，主要是用擬南芥etr1-1突變體的全長基因轉化植物，未見對從其它植物中克隆出來的乙烯受體基因或基因片段的功能進行研究，并成功轉化異源植物的報道。ETR1的疏水區(qū)是乙烯結合區(qū)域，主要影響植物對外源ETR1基因的響應。月季ETR1 cDNA片段正好包括了該疏水區(qū)。因此該基因片段轉化植物后，會對轉基因植株的乙烯敏感性、衰老及瓶插壽命等產生重要影響。
結果表明，用月季ETR1基因的797bp的cDNA片段構建的表達載體轉化矮牽牛產生的意想不到的效果，得到了乙烯敏感性降低的轉基因植株，這說明反義ETR1基因片段的轉化，可以抑制內源ETR1的作用，降低植物的乙烯敏感性，從而延長花朵的壽命。所以，本發(fā)明乙烯不敏感的植物表達載體在改造植物品質，尤其延長花卉植物花期的植物基因工程中的應用有十分重要的意義。
實施例2(轉化)雙元表達載體電激轉化利福平和卡那霉素抗性的根癌農桿菌LBA4404，然后轉化產物涂抹在加入利福平和卡那霉素的YEP平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3天后，會長出單菌落，然后挑取部分單菌落進行菌落PCR，可以得到800bp左右的條帶。PCR陽性的單菌落重新劃到YEP平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)至長出菌落。挑取長出的單菌落接種到加入利福平和卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基上，于250rpm搖床上28℃搖菌過夜。次日，將農桿菌培養(yǎng)液用共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L+NAA0.01mg/L稀釋30-50倍。以無菌培養(yǎng)的矮牽牛組培苗葉片為外植體。將幼嫩葉片切去邊緣，并用刀片在葉片表面劃一些傷口，放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，侵染5分鐘。取出葉片，用無菌濾紙吸干剩余的菌液，放入不含抗生素的愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L+NAA0.01mg/L+Kan100mg/L+Cab 200mg/L+瓊脂7g/L的平板上，使葉片邊緣切口與培養(yǎng)基充分接觸，然后用Parafilm膜封口，25℃光培養(yǎng)3天。
當葉片邊緣出現(xiàn)白色的菌落時，可將共培養(yǎng)的外植體取出，用無菌水沖洗3次，洗掉殘余的根癌農桿菌，無菌濾紙吸干，轉移至選擇培養(yǎng)基上，25℃光照培養(yǎng)。外植體在選擇培養(yǎng)基上1周-2周后可見愈傷組織發(fā)生，2周-4周后愈傷組織上可再生抗性小芽體。每3周在選擇培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次。將叢生芽分株后轉入生根培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan100mg/L+Cab 200mg/L+瓊脂7g/L誘導生根。轉化再生苗如圖2所示。
實施例3(PCR檢測)當再生芽長至3-4cm高時進行DNA的PCR檢測，陽性株系進行擴繁。矮牽牛的提取采用CTAB法，取矮牽牛葉片約50mg，在200μL CTAB提取液中研磨，再加入300μL提取液，輕輕打勻后，65℃水浴30min，然后加入500μL 4℃預冷的氯仿，輕微打勻并振蕩。10000rpm離心5min，吸取上清至另一離心管中，加入等體積4℃預冷的異丙醇，輕微顛倒直至DNA沉淀。10000rpm離心5min，棄上清，加入4℃預冷的70％乙醇，用槍頭輕輕打散沉淀。10000rpm離心5min，棄上清。待管內液體徹底干燥后，用20-50μL ddH2O溶解DNA，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 提取的DNA用ddH2O稀釋10倍，取0.5μL(約25ng)作為PCR反應的模板。以擴增NPTII基因的一對引物和擴增ETR1 cDNA片段的一對反向引物分別進行PCR反應，PCR反應體積均為10μL，同時設水對照、陽性對照和野生型對照各一個。NPTII基因PCR的反應條件為94℃預變性4min；94℃變性50s，60℃退火50s，72℃延伸1min，共28個循環(huán)；72℃延伸10min。ETR1 cDNA片段PCR的反應條件為94℃預變性4min；94℃變性1min，53℃退火1min30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR反應完成后，取8μL產物在1％瓊脂糖膠上電泳檢測。陽性轉基因植株以NPTII引物擴增的產物有850bp的條帶，以ETR1引物擴增的產物有800bp的條帶，野生型沒有條帶。
實施例4(RT-PCR檢測)對總DNA的PCR結果為陽性的轉基因植株進行總RNA的RT-PCR的檢測。首先提取植物組織的RNA。吸取15mL抽提緩沖液于50mL離心管中，65℃水浴加熱。研缽及杵用液氮預冷。稱取轉基因矮牽牛葉片1g，加液氮充分研磨后，轉入上述65℃預熱的離心管中，充分混勻。加入14.4mL氯仿和0.6mL異戊醇，混勻。室溫離心5min，分相。吸上清于另一50mL離心管，再加入12mL氯仿和0.5mL異戊醇，混勻。吸上清于另一50mL離心管中，加入1/4體積的10mmol/l LiCl，顛倒混勻，4℃沉淀過夜。
次日將沉淀過夜的混合液于10000rpm離心20min，棄上清，收集沉淀的RNA。將沉淀溶于300μL的SSTE中，轉入1.5mL離心管；再用200μLSSTE洗管壁，轉入同一離心管。分別加入480μL氯仿和20μL異戊醇，混勻，抽提。10000rpm離心5min，分相。吸取上清于另一1.5mL離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，混勻，于-70℃沉淀RNA 30min以上或-20℃放置2h。10000離心20min，沉淀RNA，棄上清；70％乙醇洗2次，干燥后溶于40μL兩次滅菌的ddH2O中。取2μL總RNA，加入1000μL兩次滅菌的ddH2O中，混勻。測定230nm、260nm、280nm的光密度值。計算A260nm/A280nm，A260nm/A230nm的比值，并通過1％瓊脂糖凝膠電泳，檢測提取的RNA質量。
檢測后的RNA進行總RNA的DNAase處理。分別加入RNA 20μL、Rnasin 1μL、10×buffer 5μL、ddH2O 2μL、DNase 2μL，反應總體積為30μL，混勻后于37℃保持30min。加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，離心5min，取上清。加入1/10體積的3mol/L NaAc和2倍體積的無水乙醇，置于-70℃2h沉淀RNA。12000rpm離心10min，棄上清。用70％乙醇洗沉淀2次，溶于20μL兩次滅菌的ddH2O中。
處理后的RNA在1％瓊脂糖凝膠上電泳檢測后，即可進行反轉錄。取RNA5μL，分別加入Oligo dT(0.5mol/L)1μL和ddH2O 6μL，70℃放置10min，快速置于冰上冷卻2min，離心。再分別加入5×First Strand buffer 4μL、DTT(0.1mol/L)2μL和dNTP(10mmol/L)1μL，混勻后置于42℃放置2min。加入1μL Superscript II反轉錄酶，混勻后離心，42℃保持50min，70℃保持15min以終止反應。
以反轉錄產生的第一鏈cDNA為模板進行PCR反應，同時以反轉錄所用總RNA模板作對照。反應體系50μL，其中包括10×PCR buffer 5μL、MgCl23μL、dNTP(2.5mmol/L)4μL、引物12.5μL、引物22.5μL、模板DNA 2μL、Taq酶(5Units/μL)0.5μL、去離子水30.5μL。反應條件同實施例3。反應結束后在1％瓊脂糖凝膠上電泳檢測。轉基因植株可以得到800bp的條帶，野生型沒有條帶。這說明月季ETR1 cDNA可以在矮牽牛體內進行轉錄。
實施例5(乙烯敏感性檢測)對RT-PCR陽性的轉基因植株和野生型植株進行乙烯敏感性的試驗。將純乙烯(106ppm)稀釋到濃度為103。矮牽牛組培所使用的容器容積為100mL，因此，本發(fā)明三個濃度處理10ppm、20ppm和30ppm分別取103濃度的乙烯1mL、2mL和3mL，并且注射到野生型及轉基因矮牽牛組培容器中。乙烯處理24h后將封口膜打開(注意勿造成組培苗污染)，釋放瓶內乙烯，6h后，用封口膜重新將瓶口封好，培養(yǎng)2天后觀察結果。結果表明，如圖3所示，乙烯處理后，野生型植株出現(xiàn)不同程度的萎蔫，轉基因植株與處理前沒有表型差異。這說明轉基因植株對外源乙烯不敏感，本發(fā)明轉入的月季ETR1 cDNA已經在矮牽牛轉基因植株中具備了耐乙烯敏感性的生物學功能。
權利要求
1.一種耐乙烯敏感性的植物表達載體pBinETR1，其結構如下所示
2.根據(jù)權利要求1所述的表達載體，在轉基因植物工程中的應用。
3.根據(jù)權利要求1所述的表達載體，在抗衰老轉基因植物中的應用。
4.根據(jù)權利要求1所述的表達載體，在花卉植物延長花期轉基因植物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領域。具體地說，構建了一種乙烯不敏感的植物表達載體pBinETR1，含有該表達載體pBinETR1的轉基因植物具有抗衰老的功能，在轉基因花卉植物中應用，可以延長植株開花和插花的花期。
文檔編號C12N15/63GK1470636SQ0212683
公開日2004年1月28日 申請日期2002年7月22日 優(yōu)先權日2002年7月22日
發(fā)明者劉青林, 白雙義, 馬祎 申請人:中國農業(yè)大學園藝學院