專利名稱：一種臨床感染性疾病基因芯片制備設(shè)計(jì)方案的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明確定了一種臨床診斷應(yīng)用基因芯片的制備設(shè)計(jì)方案，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因芯片技術(shù)是一種新興的生物技術(shù)，它在生物學(xué)各領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。臨床診斷是其應(yīng)用領(lǐng)域之一。感染性疾病是臨床上最普遍的疾病，基因芯片具有替代現(xiàn)有診斷技術(shù)的極大潛力。應(yīng)用于臨床的感染性疾病診斷基因芯片目前尚無(wú)產(chǎn)品面市。由于診斷芯片的特殊要求，作為基礎(chǔ)研究的表達(dá)譜芯片技術(shù)照搬于診斷基因芯片上，很難滿足診斷芯片的技術(shù)要求。另一方面，感染性病原物是人體的一種生物，它們?cè)谶M(jìn)化上有相當(dāng)大的差異，因而可以找到與人類不同的特異DNA片段，這為建立感染性病原物的DNA芯片技術(shù)帶來(lái)便利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)感染性病原物的特點(diǎn)和臨床診斷的特殊要求，建立了一種臨床診斷應(yīng)用基因芯片的制備設(shè)計(jì)方案，該方案為1.利用短的特異DNA片段(100-200bp)作為探針。該種探針的優(yōu)點(diǎn)是(1)由于寡核苷酸序列雖然特異性較高，但其雜交條件要求嚴(yán)格，不同的探針在同一條件下進(jìn)行雜交，很難找到一個(gè)使所有探針的雜交效果都一樣好的條件。而較長(zhǎng)的DNA序列對(duì)雜交條件要求相對(duì)寬松，已建立的雜交條件對(duì)所有探針的雜交都合適。(2)寡核苷酸雜交對(duì)一個(gè)堿基的突變都非常敏感，而病原物的變異相對(duì)較快，這就使得檢測(cè)技術(shù)的假陰性率較高，而DNA片段是檢測(cè)序列，個(gè)別堿基的變異不會(huì)引起漏檢而引起假陰性。(3)較長(zhǎng)的DNA序列作探針的缺點(diǎn)是遇到其他微生物或宿主的同源序列而導(dǎo)致假陽(yáng)性。(4)寡核苷酸的制作成本較高，而DNA片段的成本相對(duì)較低。
2.設(shè)置多個(gè)對(duì)照位點(diǎn)。本方案設(shè)置對(duì)照位點(diǎn)，臨床使用時(shí)可將其中的幾個(gè)設(shè)為陽(yáng)性，將另一部分位點(diǎn)設(shè)為陰性位點(diǎn)。這樣一方面避免偶然原因使單個(gè)陽(yáng)性(或陰性)位點(diǎn)的檢測(cè)失誤，另一方面可為診斷時(shí)，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照模板濃度梯度，配以適當(dāng)?shù)难h(huán)數(shù)，建立半定量檢測(cè)技術(shù)體系。
3.每種病原物設(shè)置多個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)。為避免因不同患者病原物的差異而出現(xiàn)假陰性，對(duì)同一病原物選擇多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，這樣可以減少因病原物的變異導(dǎo)致假陰性的可能性。
4.每個(gè)位點(diǎn)設(shè)置重復(fù)，重復(fù)次數(shù)為4.在芯片檢測(cè)操作中，會(huì)因洗脫，載片上的雜點(diǎn)，雜交液分布不均勻等，造成某個(gè)位點(diǎn)的假信號(hào)，或沒(méi)有信號(hào)。如果只有一個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)，就會(huì)引起判斷失誤。每個(gè)位點(diǎn)有4個(gè)重復(fù)，上述的雜質(zhì)信號(hào)，雜交不均勻等錯(cuò)誤不可能同時(shí)在2個(gè)以上的位點(diǎn)發(fā)生。這樣就可以避免上述等原因?qū)е碌募訇?yáng)性或假陰性。
5.點(diǎn)陣設(shè)計(jì)，盡可能地使對(duì)照和檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)總和是某一個(gè)數(shù)的平方，將所有位點(diǎn)組成一個(gè)正方形矩陣，重復(fù)4次還是一個(gè)正方形矩陣。對(duì)照位點(diǎn)分別占據(jù)4角，或中心，或?qū)蔷€上，或形成菱形。每個(gè)位點(diǎn)的4個(gè)重復(fù)盡可能對(duì)稱。以5個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)4個(gè)對(duì)照位點(diǎn)為例，點(diǎn)陣設(shè)計(jì)圖見(jiàn)圖1。
本發(fā)明具有成本低、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果精確等優(yōu)點(diǎn)。本技術(shù)方案既可用于臨床感染性疾病基因芯片制備，也適用于利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行所有以特異序列為檢測(cè)靶點(diǎn)的種群、類群和個(gè)體鑒定。


附圖1為為點(diǎn)陣示意圖。圖中4個(gè)對(duì)照位點(diǎn)，5個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的點(diǎn)陣設(shè)計(jì)圖。只有對(duì)照信號(hào)的雜交圖譜。
圖中2為只有對(duì)照信號(hào)的雜交圖譜。圖中4個(gè)對(duì)照位點(diǎn)和5個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)組成一個(gè)正方形小矩陣，4個(gè)重復(fù)并成一個(gè)大矩陣，大矩陣也是正方形。每個(gè)位點(diǎn)的4個(gè)重復(fù)對(duì)稱分布。對(duì)照位點(diǎn)的I、III和IV形成對(duì)角線，而II形成菱形。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施按如下程序進(jìn)行1.通過(guò)網(wǎng)絡(luò)搜索獲得病原物特異DNA片段，然后設(shè)計(jì)PCR引物并從臨床標(biāo)本中克隆，測(cè)序。然后設(shè)計(jì)探針引物，使序列長(zhǎng)度在100-200bp。
2.采用常規(guī)質(zhì)粒DNA擴(kuò)增，提取及純化方法擴(kuò)增克隆的探針質(zhì)粒，利用PCR方法擴(kuò)增探針序列，并采用常規(guī)的PCR產(chǎn)物純化方法純化PCR產(chǎn)物。純化PCR產(chǎn)物即可用作芯片制備的探針。
3.按常規(guī)的方法配制探針點(diǎn)樣液(如3XSSC溶液)，用點(diǎn)樣儀制備DNA芯片，點(diǎn)陣按前述設(shè)計(jì)方案設(shè)計(jì)。
4.點(diǎn)樣后，在紫外交聯(lián)儀中交聯(lián)固定DNA探針，通常用紫外光強(qiáng)65-120mJ/cm2，交聯(lián)時(shí)間10-30分鐘。交聯(lián)固定后沸水煮2分鐘變性探針DNA，用甲基吡咯烷酮封閉，芯片制備完成。
權(quán)利要求
1.一種臨床感染性疾病基因芯片制備設(shè)計(jì)方案，該方案的特征在于1.1選擇病原物特異的100-200bp短序列的PCR產(chǎn)物作為探針；1.2設(shè)置多個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)時(shí)所加入的陽(yáng)性對(duì)照位點(diǎn)模板濃度按幾何級(jí)數(shù)呈梯度，進(jìn)行半定量檢測(cè)；1.3對(duì)同一病原物選擇多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)；1.4設(shè)置4個(gè)重復(fù)，3個(gè)以上位點(diǎn)有信號(hào)則為陽(yáng)信。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種臨床感染性疾病基因芯片制備設(shè)計(jì)方案，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該方案為1.利用短的特異DNA片段(100－200bp)作為探針；2.設(shè)置多個(gè)對(duì)照位點(diǎn)；3.每種病原物設(shè)置多個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)；4.每個(gè)位點(diǎn)設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每個(gè)位點(diǎn)的4個(gè)重復(fù)盡可能對(duì)稱。本發(fā)明具有成本低、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果精確等優(yōu)點(diǎn)。本技術(shù)方案既可用于臨床感染性疾病基因芯片制備，也適用于利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行所有以特異序列為檢測(cè)靶點(diǎn)的種群、類群和個(gè)體鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1508263SQ02128068
公開(kāi)日2004年6月30日 申請(qǐng)日期2002年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月18日
發(fā)明者譚德勇, 賴建華, 余敏 申請(qǐng)人:云南大學(xué)