專利名稱：改良的分子信標(biāo)探針及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及選擇性地檢測(cè)特異性靶核酸分子的寡核苷酸探針，特別是涉及改良的具有“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)探針及其在檢測(cè)靶核酸分子中的應(yīng)用。
在臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，以更靈敏、特異和快速的方法檢測(cè)和定量分析各種來(lái)源的核酸和/或蛋白質(zhì)分子，對(duì)于提供疾病的診斷和預(yù)后信息將發(fā)揮重要的作用。近年來(lái)，一種主要用于核酸檢測(cè)的試劑——分子信標(biāo)探針(MB)的研究與開發(fā)已取得了十分迅速的進(jìn)展。
結(jié)構(gòu)上看，分子信標(biāo)探針(MB)是一種含有“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)單分子核酸分子。莖部分是由于分子內(nèi)兩互補(bǔ)序列，即核酸分子的5’和3’末端的堿基配對(duì)而形成的。環(huán)部分則與構(gòu)成莖的兩條鏈相連，并且包括與待檢序列互補(bǔ)的序列。分子的一個(gè)末端連接有熒光素基團(tuán)，而另一個(gè)末端則連接有熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)處于莖-環(huán)構(gòu)象時(shí)，這兩個(gè)部分在物理上是彼此相鄰近的。當(dāng)用相當(dāng)與熒光基團(tuán)發(fā)射波長(zhǎng)的光照射分子信標(biāo)探針時(shí)，因?yàn)闊晒饣鶊F(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，使熒光基團(tuán)受激發(fā)后由之發(fā)射出來(lái)的光被淬滅基團(tuán)所吸收，所以不能觀察到熒光。當(dāng)分子信標(biāo)探針與互補(bǔ)于環(huán)的靶序列接觸時(shí)，環(huán)即與該序列雜交。又由于如此形成的分子間雙鏈比莖區(qū)域中形成的分子內(nèi)雙鏈更長(zhǎng)，所以能量上更為穩(wěn)定。隨著該分子間雙螺旋的形成，即產(chǎn)生一種使莖區(qū)域松解并伸展的扭力。結(jié)果，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，以至淬滅基團(tuán)不再能有效地吸收由熒光基團(tuán)發(fā)出的光。因此，分子信標(biāo)探針與其靶核酸序列的結(jié)合即伴隨著熒光發(fā)射的增加，并據(jù)此構(gòu)成檢測(cè)的基礎(chǔ)。
例如，當(dāng)MB游離存在于溶液中而沒(méi)有與第二個(gè)核酸(靶核酸)雜交時(shí)，MB的莖因堿基配對(duì)而穩(wěn)定化。這種自身互補(bǔ)配對(duì)便形成了使其中熒光部分和淬滅部分彼此接近的所謂“發(fā)夾環(huán)”結(jié)構(gòu)。在這種構(gòu)象下，熒光基團(tuán)被淬滅基團(tuán)淬滅。如果分子信標(biāo)探針的環(huán)序列互補(bǔ)于靶核酸中的待檢序列，則環(huán)序列便與之雜交并因此而導(dǎo)致莖區(qū)域解鏈，使熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離開，進(jìn)而導(dǎo)致MB的熒光增加。(附

圖1)(參見美國(guó)專利5,925,517、5,989,823、6,150,097和6,355,421號(hào))。
另外，從功能上看，分子信標(biāo)探針的全序列又分為可與靶核酸序列雜交的特異性識(shí)別序列(即靶序列的反向互補(bǔ)序列)，和并不與靶核酸序列雜交的所謂無(wú)關(guān)序列(即不與靶序列反向互補(bǔ)的序列)。
作為一種核酸的檢測(cè)和實(shí)時(shí)定量分析試劑，分子信標(biāo)探針正在被越來(lái)越多的研究者和實(shí)驗(yàn)室所接受，并且近年來(lái)也已針對(duì)MB和相關(guān)技術(shù)進(jìn)行了許多有益的改進(jìn)和商業(yè)開發(fā)。盡管如此，在MB的設(shè)計(jì)、合成和純化等技術(shù)領(lǐng)域仍存在許多有待解決的問(wèn)題。例如，目前的合成和純化手段有限，因而導(dǎo)致MB的生產(chǎn)成本很高，特別是在使用有較長(zhǎng)序列的MB的情況下。更為不幸的是，對(duì)于一個(gè)設(shè)計(jì)并合成好的特定MB，甚至有高達(dá)70％的終產(chǎn)品經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)是無(wú)效或不能使用的。因此，如何進(jìn)一步改進(jìn)分子信標(biāo)探針的設(shè)計(jì)、合成和純化就成為本領(lǐng)域技術(shù)人員面臨的一個(gè)重要課題。特別是鑒于MB設(shè)計(jì)是繼后合成、純化和商業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)，所以基于以前失敗的教訓(xùn)改進(jìn)MB分子的設(shè)計(jì)，對(duì)于MB及相關(guān)技術(shù)的廣泛應(yīng)用和發(fā)展將具有重要意義。
本發(fā)明人基于多年來(lái)從事分子信標(biāo)探針設(shè)計(jì)與研究的經(jīng)驗(yàn)，在經(jīng)過(guò)反復(fù)失敗后，全面改進(jìn)了這種發(fā)夾狀熒光探針的設(shè)計(jì)，特別是我們創(chuàng)造性地將信標(biāo)探針的特異識(shí)別區(qū)域延伸到傳統(tǒng)MB分子的莖區(qū)域，從而提高了MB分子與靶序列的雜交效率和強(qiáng)度，改善了信標(biāo)探針的敏感性和特異性。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種改良的分子信標(biāo)探針，特征在于其中分子信標(biāo)探針的環(huán)區(qū)域與部分或全部莖區(qū)域的連續(xù)核苷酸構(gòu)成所說(shuō)的探針的靶核酸識(shí)別序列。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中靶核酸識(shí)別序列是由分子信標(biāo)探針的環(huán)區(qū)域和與之相連的部分或全部莖區(qū)域構(gòu)成的。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中探針序列的總長(zhǎng)度約為15至50個(gè)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中構(gòu)成分子信標(biāo)探針莖區(qū)域的長(zhǎng)度約為0-8個(gè)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中與靶核酸雜交的環(huán)區(qū)域的Tm值為50℃以上。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種改善分子信標(biāo)探針與待檢靶核酸的雜交效率的方法，該方法包括將分子信標(biāo)探針的靶核酸識(shí)別序列由環(huán)區(qū)域延伸到與之相連的部分或全部莖區(qū)域。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中構(gòu)成靶核酸識(shí)別序列的分子信標(biāo)探針的環(huán)區(qū)域和與之相連的部分莖區(qū)域的總長(zhǎng)度約為15至45個(gè)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中構(gòu)成分子信標(biāo)探針莖區(qū)域的長(zhǎng)度約為0-8個(gè)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中與靶核酸雜交的環(huán)區(qū)域的Tm值為40至50℃以上。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)生物學(xué)樣品中存在的靶核酸的方法，該方法包括(1)使用一組寡核苷酸引物對(duì)所說(shuō)的樣品進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以得到其中存在靶核酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)在適于探針與靶核酸序列雜交的條件下，使擴(kuò)增產(chǎn)物與如上限定的分子信標(biāo)探針與生物學(xué)樣品中的靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物接觸；(3)以常規(guī)方法監(jiān)測(cè)所說(shuō)的探針的熒光并借以檢測(cè)靶核酸序列的存在。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的靶核酸序列來(lái)源于選自病毒、細(xì)菌、真菌、霉菌和原生動(dòng)物的病原或非病原生物體。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的靶核酸序列來(lái)源于選自病毒、細(xì)菌、真菌、霉菌和原生動(dòng)物的病原生物體。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用于上述檢測(cè)方法中的試劑盒，所說(shuō)的試劑盒包含對(duì)所說(shuō)的靶核苷酸序列特異的如上限定的分子信標(biāo)探針。
圖1A和1B分別顯示常規(guī)分子信標(biāo)探針和本發(fā)明改良的分子信標(biāo)探針的工作原理圖。其中空心小圓圈代表熒光基團(tuán)；實(shí)心小圓圈代表淬滅基團(tuán)。
圖2顯示使用某一靶核酸序列設(shè)計(jì)并合成的特異性分子信標(biāo)探針檢測(cè)所說(shuō)的靶核酸序列的動(dòng)態(tài)雜交反應(yīng)曲線。其中●代表本發(fā)明改良的、以整個(gè)環(huán)區(qū)域和莖區(qū)域作為識(shí)別序列的分子信標(biāo)探針(探針1)；■代表以傳統(tǒng)方法設(shè)計(jì)的、僅以環(huán)區(qū)域作為識(shí)別序列的分子信標(biāo)探針(探針2)。
圖3顯示使用本發(fā)明設(shè)計(jì)的乙型肝炎病毒S區(qū)特異性分子信標(biāo)探針，以均相熒光聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)檢測(cè)所說(shuō)的靶核酸序列，在不同熱循環(huán)次數(shù)下的相對(duì)熒光強(qiáng)度曲線。
本發(fā)明涉及選擇性地檢測(cè)特異性靶核酸分子的寡核苷酸探針，特別是涉及改良的具有“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)探針、含有所說(shuō)的探針的試劑盒及所說(shuō)的探針和其試劑盒在檢測(cè)靶核酸分子中的應(yīng)用。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“分子信標(biāo)探針”(MB)是指在適當(dāng)?shù)碾s交條件下自身雜交以形成莖和環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。MB在其寡核苷酸兩末端分別連有熒光劑和淬火劑。因此，在允許分子內(nèi)雜交的條件下，熒光標(biāo)記通常被淬滅劑淬滅。當(dāng)在MB不發(fā)生分子內(nèi)雜交的條件下(即與靶核酸結(jié)合時(shí))，MB分子上的熒光標(biāo)記即不被淬滅。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“莖區(qū)域”是指MB的“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)中位于“莖”部分的寡核苷酸?！碍h(huán)區(qū)域”是指MB的“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)中位于“環(huán)”部分的寡核苷酸。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“靶核酸識(shí)別序列”又稱為“中心靶核酸識(shí)別序列”或“探針序列”，一般是指兩側(cè)翼連著莖區(qū)域的并可與靶序列雜交的探針部分。當(dāng)探針不與靶鏈雜交時(shí)，兩莖區(qū)域彼此雜交使探針形成“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)。此時(shí)，靶識(shí)別序列呈現(xiàn)為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈環(huán)，而莖序列則形成莖部分雙鏈雜交體。
核酸分子的穩(wěn)定性通常是根據(jù)其熔解溫“Tm”值確定的。特定的核酸雙鏈在特定條件下的Tm值是指雙鏈分子的1/2堿基對(duì)發(fā)生解離(即沒(méi)有以堿基配對(duì)的形式彼此雜交)時(shí)的溫度。
如前所述，使用基于分子信標(biāo)探針的檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)靶核酸時(shí)，序列的特異性和檢測(cè)的敏感性水平，以及信號(hào)出現(xiàn)的速度均在很大程度上受到探針與靶序列的結(jié)合效率的影響。眾所周知，探針與靶核酸序列的雜交過(guò)程是一個(gè)要首先消耗能量斷開發(fā)夾結(jié)構(gòu)(二級(jí)結(jié)構(gòu))的過(guò)程。當(dāng)反應(yīng)體系降低溫度時(shí)，探針因兩末端互補(bǔ)而形成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)。在有靶核酸存在下，探針與之雜交并放出能量，并導(dǎo)致探針因末端自身雜交而形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖區(qū)域的解離。這種能量轉(zhuǎn)移過(guò)程的發(fā)生和大小主要取決于莖區(qū)域解離所需的能量。而所需能量的大小又在相當(dāng)程度上取決于莖區(qū)域與靶識(shí)別區(qū)域(序列)的相對(duì)長(zhǎng)度比例。因此，有可能通過(guò)延長(zhǎng)靶核酸識(shí)別(雜交)序列的長(zhǎng)度來(lái)提高M(jìn)B與靶序列的雜交效率。
基于上述認(rèn)識(shí)，本發(fā)明人在制備MB的實(shí)踐中，成功地設(shè)計(jì)了將靶核酸識(shí)別(雜交)序列延長(zhǎng)到部分或全部莖區(qū)域的MB探針。結(jié)果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，如此得到的探針顯著地改善了其與靶核酸序列的特異性雜交的成功率，由以前原設(shè)計(jì)的MB的約30％成功率提高到目前新設(shè)計(jì)的50％以上成功率。
與傳統(tǒng)的MB相比，本發(fā)明改良的分子信標(biāo)探針?biāo)坪蹙哂邢鄬?duì)較低的特異性。然而，就MB的實(shí)際應(yīng)用目的(主要是在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用于定性和/或定量檢測(cè)某些病原微生物)而言，關(guān)鍵的是如何提高探針與靶核酸的雜交效率和成功率，而不一定要具有極端的特異性。特別是，在檢測(cè)對(duì)象基本上是使用特異性引物經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增的靶序列的情況下，使用本發(fā)明的分子信標(biāo)探針也幾乎不可能因靶序列的一或兩個(gè)堿基突變而出現(xiàn)假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種改良的分子信標(biāo)探針，特征在于其中分子信標(biāo)探針的環(huán)區(qū)域與部分或全部莖區(qū)域的連續(xù)核苷酸構(gòu)成所說(shuō)的探針的靶核酸識(shí)別序列。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中靶核酸識(shí)別序列是由分子信標(biāo)探針的環(huán)區(qū)域和與之相連的部分或全部莖區(qū)域構(gòu)成的。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中探針序列的總長(zhǎng)度約為15至50個(gè)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中構(gòu)成分子信標(biāo)探針莖區(qū)域約為0-8個(gè)核苷酸。
使用本發(fā)明的探針，由于延長(zhǎng)了與引物延伸產(chǎn)物雜交的靶結(jié)合區(qū)，所以使特異性在一定程度上得到提高。由于新合成的引物延伸產(chǎn)物是靶衍生的，所以該產(chǎn)物與延長(zhǎng)了靶結(jié)合區(qū)的探針雜交時(shí)，即很容易定量地反映在輸出的信號(hào)上。由于探針結(jié)合區(qū)或結(jié)合位點(diǎn)的分子內(nèi)或分子間結(jié)合受到限制，所以也簡(jiǎn)化了探針設(shè)計(jì)。本發(fā)明改良的探針不僅適用于均相分析，而且能很好地完成常規(guī)探針不能完成的檢測(cè)。
應(yīng)特別指出的是，Taq酶的聚合反應(yīng)具有一定的錯(cuò)配率，所以用Taq酶聚合合成的擴(kuò)增產(chǎn)物可能含有堿基錯(cuò)配的產(chǎn)物，而傳統(tǒng)的分子信標(biāo)因其及高的特異性，使其無(wú)法和這些產(chǎn)物雜交。因此也檢測(cè)不到這些擴(kuò)增產(chǎn)物。由于本發(fā)明改良的分子信標(biāo)將特異識(shí)別序列延長(zhǎng)到莖區(qū)域，雖然在一定程度上降低了探針的特異性，但本發(fā)明改良的分子信標(biāo)探針卻可以與含有堿基錯(cuò)配的PCR產(chǎn)物雜交，從而提高了探針的雜交效率和敏感性。在出現(xiàn)我們無(wú)法避免的因Taq酶本身性質(zhì)決定的堿基錯(cuò)配問(wèn)題時(shí)，使用我們改良的分子信標(biāo)尤其重要。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)生物學(xué)樣品中存在的靶核酸的方法，該方法包括(1)使用一組寡核苷酸引物對(duì)所說(shuō)的樣品進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以得到其中存在靶核酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)在適于探針與靶核酸序列雜交的條件下，使擴(kuò)增產(chǎn)物與如上限定的分子信標(biāo)探針與生物學(xué)樣品中的靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物接觸；(3)以常規(guī)方法監(jiān)測(cè)所說(shuō)的探針的熒光并借以檢測(cè)靶核酸序列的存在。
在本發(fā)明的方法中，引物延伸反應(yīng)可重復(fù)10、20、30、40、甚至50次。由于探針的靶結(jié)合區(qū)基本上是不與用于靶序列擴(kuò)增的上、下游引物重疊的，所以三者“協(xié)同把關(guān)”，基本上能夠完全避免可能出現(xiàn)的特異性問(wèn)題。在適當(dāng)?shù)娜姿岷塑蘸途酆厦傅拇嬖谙拢飳⑴c模板核酸上的互補(bǔ)序列雜交并延伸形成引物擴(kuò)增產(chǎn)物。然后，對(duì)應(yīng)于靶序列中段的探針之靶結(jié)合序列與相當(dāng)于靶核酸的引物延伸產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列雜交。結(jié)果，使探針不能形成發(fā)夾狀二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而這種靶特異性雜交導(dǎo)致信號(hào)發(fā)生系統(tǒng)(熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)對(duì))的可檢測(cè)的改變。這樣，樣品中靶核酸存在與否，即可根據(jù)是否存在可檢測(cè)的熒光信號(hào)改變來(lái)測(cè)知。
一般說(shuō)來(lái)，本發(fā)明的其中探針序列的總長(zhǎng)度約為15至50個(gè)核苷酸，并且莖區(qū)域約為0-8個(gè)核苷酸。也就是說(shuō)，由于整個(gè)探針或其一端與靶序列(擴(kuò)增或延伸產(chǎn)物)互補(bǔ)并雜交，所以此時(shí)探針便不能形成發(fā)夾形二級(jí)結(jié)構(gòu)。
為了得到本發(fā)明的分子信標(biāo)探針，可首先基于以下步驟并使用市售的引物和探針設(shè)計(jì)軟件，完成本發(fā)明改良的信標(biāo)探針的設(shè)計(jì)。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，所說(shuō)的步驟包括(1)基于任何細(xì)胞或微生物來(lái)源之待測(cè)核酸的已知序列，從中選擇一段具有特征性的約包括15至50個(gè)核苷酸的序列；(2)寫出(1)中所選序列的反向互補(bǔ)序列，并以其作為探針的靶特異性識(shí)別或結(jié)合序列；(3)分別確定探針環(huán)區(qū)域和莖區(qū)域的核苷酸一般環(huán)區(qū)域的約包括15-40個(gè)核苷酸；位于環(huán)區(qū)域一側(cè)末端的莖區(qū)域的長(zhǎng)度一般不大于8bp；(4)確定了作為探針之一側(cè)莖區(qū)域的核苷酸序列后，在步驟(2)確定的反向互補(bǔ)序列的另一端補(bǔ)加與(3)中所述的莖區(qū)域互補(bǔ)的核苷酸，以其作為探針另一端莖區(qū)域的序列；(5)在如上設(shè)計(jì)的探針莖區(qū)域序列較短，環(huán)區(qū)域的Tm值較低的情況下，可在探針兩末端的莖區(qū)域不加幾對(duì)核苷酸，以使環(huán)區(qū)域的Tm值達(dá)到約40-50℃。設(shè)計(jì)完成后，可以使用常規(guī)方法合成并制備MB，例如使用Tyagi和Kramer(Nature Biotechnology 14303-308，1996)或Kostrikis等人(Science 2791228-1229，1998)介紹的常規(guī)方法制備MB。但也可以使用國(guó)際專利WO 01/83820中描述的基于連接的組裝方法制備MB，即分別植備MB的莖、環(huán)、標(biāo)記和淬火等部分，然后再用化學(xué)或酶學(xué)方法將他們連接并組裝在一起。
常用的標(biāo)記部分包括德克薩斯紅、熒光素、IAEDANS、EDANS或其衍生物等。常用的淬火部分包括異硫氰基四若丹明(TRITC)、EDANS、DABCYL、四甲基若丹明和熒光素等。適用于連接反應(yīng)的連接酶包括Taq DNA連接酶、DNA連接酶和T4DNA連接酶。
再一個(gè)方面，本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于檢測(cè)和定量分析核酸的試劑盒，所說(shuō)的試劑盒包含對(duì)待檢的靶核苷酸序列特異的如上文限定的分子信標(biāo)探針，以及其他常規(guī)試劑盒組成成分，如包裝材料、使用說(shuō)明書、一個(gè)或多個(gè)容器。另外，本發(fā)明的試劑盒中還可包括標(biāo)準(zhǔn)靶序列、擴(kuò)增靶序列的擴(kuò)增引物等標(biāo)準(zhǔn)品。
本發(fā)明的探針適用于檢測(cè)和分析任何常規(guī)核酸，特別是經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的DNA。樣品核酸的來(lái)源包括循環(huán)血細(xì)胞、頰黏膜上皮細(xì)胞、培養(yǎng)的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等人細(xì)胞，以及其他哺乳動(dòng)物、血液和細(xì)胞等。再者，病毒、噬菌體、細(xì)菌、真菌及其他微生物也可以是待檢核酸的來(lái)源。DNA可以是游離DN因組DNA或克隆到質(zhì)粒、噬菌體或人工染色體中的DNA。
本發(fā)明的分子信標(biāo)探針和其試劑盒亦可用于檢測(cè)人或動(dòng)物基因組DNA中變異，以及遺傳性疾病。例如必要時(shí)可將靶核酸連接到有益于分析的序列或區(qū)域上。特別是，本發(fā)明的探針適用于檢測(cè)細(xì)菌、病毒等感染因子如免疫缺陷病毒(HIV)和其特定的變異體，以及丙型肝炎病毒(HCV)等。
在使用溫度控制和選擇性地改變莖區(qū)域密碼子的情況下，本發(fā)明的探針也可用于錯(cuò)配靶的等位基因鑒別。
由于本發(fā)明的探針產(chǎn)生信號(hào)迅速而且只需要單分子反應(yīng)，所以特別適用于實(shí)時(shí)檢測(cè)。
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍。
實(shí)施例1本實(shí)施例以序列5’-GAGTTCTTCTTCTAGGGGAGGACGC-3’作為靶序列，舉例說(shuō)明按照本發(fā)明的基本原則設(shè)計(jì)的分子信標(biāo)探針與常規(guī)分子信標(biāo)探針在靶核酸檢測(cè)中的不同效果。
然后分別設(shè)計(jì)并制備兩個(gè)探針一個(gè)是基于本發(fā)明的原則和精神設(shè)計(jì)的(探針1)；一個(gè)是按照傳統(tǒng)分子信標(biāo)探針的原則和精神設(shè)計(jì)的(探針2)。如下所示的序列中，陰影部分為探針的靶識(shí)別序列，即探針與靶序列雜交的部分；探針兩端的下劃線部分構(gòu)成發(fā)夾探針的莖區(qū)域。由此可見，探針1是以環(huán)部分加上莖部分的序列一起作為探針的靶識(shí)別(結(jié)合)序列；而探針2則是僅以環(huán)部分作為探針的靶識(shí)別(結(jié)合)序列。
探針1 探針2. 在含有10mM Tris-HCl(Ph8.0)，1.5mM MgCl2和濃度為0.8μmol/L探針的50μl反應(yīng)體系中，首先測(cè)定預(yù)先加入之標(biāo)記探針的熒光強(qiáng)度。加入較高濃度待檢靶序列后，在使用兩種不同的探針的情況下每15秒鐘定時(shí)檢測(cè)并記錄熒光強(qiáng)度。結(jié)果如圖2所示。
由圖2所示的結(jié)果可以看出，與探針2產(chǎn)生的熒光信號(hào)相比，使用探針1產(chǎn)生的熒光升高的更快。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明探針1的雜交效率高于探針2的雜交效率。
實(shí)施例2本實(shí)施例以乙型肝炎S區(qū)作為靶序列，舉例說(shuō)明按照本發(fā)明的基本原則設(shè)計(jì)的分子信標(biāo)探針在靶核酸檢測(cè)中的積極效果。
(1)基于上述靶核酸的已知核苷酸序列，首先設(shè)計(jì)一對(duì)用于以PCR方法擴(kuò)增所說(shuō)的靶序列的引物引物S15’-CAA CCT CCA ATC ACT CAC CAA C-3’引物S25’-AGA TGA GGC ATA GCA GCA GGA T-3’同時(shí)，基于靶序列中相當(dāng)于引物對(duì)中間的區(qū)域設(shè)計(jì)并合成下列探針序列，并且該探針的5’和3’端是分別連接了所示的熒光劑和淬滅劑 所示探針序列中陰影部分為探針的靶識(shí)別序列，即探針與靶序列雜交的部分；探針兩端的下劃線部分構(gòu)成發(fā)夾探針的莖區(qū)域。
引物、探針在靶基因組中的位置如下所示 (2)樣品提取取臨床病人血清100μl，向其中加入裂解液(內(nèi)含1％NP-40，2％Triton X-100)50μl，混勻后100℃放置10分鐘，并以15000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，然后取上清20μl備用。
取預(yù)先提取的備用靶DNA樣品，進(jìn)行10倍系列稀釋。
(3)PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)混合物內(nèi)含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/LKCl，，2.0U Taq酶，200μmol/L dNTP，2.0mmol/L MgCl2，0.4μmol/L兩引物，0.2μmol/L探針，不同濃度梯度的模板各5μl。反應(yīng)總體積為50μl。經(jīng)95℃，5min預(yù)變性，再95℃30秒，50℃30秒，72℃1分鐘，共40個(gè)循環(huán)后，在退火階段即50℃時(shí)采集熒光數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖2所示。
由圖2所示的結(jié)果可以看出，可使用我們?cè)O(shè)計(jì)的改良的分子信標(biāo)探針進(jìn)行PCR反應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，所得到的熒光動(dòng)態(tài)曲線光滑，并且完全符合PCR反應(yīng)的靶序列擴(kuò)增規(guī)律初始靶序列濃度高的樣品的熒光信號(hào)首先開始升高，并依據(jù)靶序列濃度的減小而依次降低。相反，沒(méi)有靶序列的樣品熒光信號(hào)則呈現(xiàn)低平趨勢(shì)。
權(quán)利要求
1，一種改良的分子信標(biāo)探針，特征在于其中分子信標(biāo)探針的環(huán)區(qū)域與部分或全部莖區(qū)域的連續(xù)核苷酸構(gòu)成所說(shuō)的探針的靶核酸識(shí)別序列。
2，根據(jù)權(quán)利要求1的分子信標(biāo)探針，其中探針序列的總長(zhǎng)度約為15至50個(gè)核苷酸。
3，根據(jù)權(quán)利要求1的分子信標(biāo)探針，其中構(gòu)成分子信標(biāo)探針莖區(qū)域的長(zhǎng)度約為0-8個(gè)核苷酸。
4，根據(jù)權(quán)利要求1的分子信標(biāo)探針，其中與靶核酸雜交的環(huán)區(qū)域的Tm值為50℃以上。
5，一種改善分子信標(biāo)探針與待檢靶核酸的雜交效率的方法，該方法包括將分子信標(biāo)探針的靶核酸識(shí)別序列由環(huán)區(qū)域延伸到與之相連的部分或全部莖區(qū)域。
6，一種檢測(cè)生物學(xué)樣品中存在的靶核酸的方法，該方法包括(1)使用一組寡核苷酸引物對(duì)所說(shuō)的樣品進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以得到其中存在靶核酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)在適于探針與靶核酸序列雜交的條件下，使擴(kuò)增產(chǎn)物與如上限定的分子信標(biāo)探針與生物學(xué)樣品中的靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物接觸；(3)以常規(guī)方法監(jiān)測(cè)所說(shuō)的探針的熒光并借以檢測(cè)靶核酸序列的存在。
7，根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說(shuō)的靶核酸序列來(lái)源于選自病毒、細(xì)菌、真菌、霉菌和原生動(dòng)物的病原或非病原生物體。
8，根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說(shuō)的靶核酸序列來(lái)源于選自病毒、細(xì)菌、真菌、霉菌和原生動(dòng)物的病原生物體。
9，用于完成如權(quán)利要求6限定的檢測(cè)的試劑盒，其中所說(shuō)的試劑盒包含對(duì)所說(shuō)的靶核苷酸序列特異的如權(quán)利要求1限定的分子信標(biāo)探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及選擇性地檢測(cè)特異性靶核酸分子的寡核苷酸探針，特別是涉及改良的具有“莖－環(huán)”結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)探針及其在檢測(cè)靶核酸分子中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1488763SQ0213081
公開日2004年4月14日 申請(qǐng)日期2002年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月9日
發(fā)明者李慶閣, 欒國(guó)彥, 梁基選 申請(qǐng)人:英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司, 廈門大學(xué)