專利名稱：通過檢測人類t細(xì)胞受體tcr基因在治療前后的變化來評(píng)價(jià)治療hiv藥物療效的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物療效的評(píng)價(jià)方法，特別是指通過檢測人類T細(xì)胞受體TCR基因在治療前后的變化來評(píng)價(jià)治療HIV藥物的療效的方法。
背景技術(shù)：
人類免疫缺陷病毒(HIV)是一種嗜T細(xì)胞性病毒，感染的靶細(xì)胞是CD4T淋巴細(xì)胞，從而引起艾滋病(AIDS)。HIV感染可以引起CD4T細(xì)胞數(shù)量的減少和免疫功能的失調(diào)，也能引起CD8T淋巴細(xì)胞的高度活化及功能上的紊亂。有效的藥物治療不僅能控制病毒的復(fù)制而且能有效的改善或恢復(fù)T細(xì)胞的數(shù)量及功能。檢測T細(xì)胞數(shù)量及功能狀態(tài)是鑒定藥物療效的最有力的生物學(xué)及免疫學(xué)依據(jù)。
目前普遍采用的方法是用流式細(xì)胞記數(shù)儀檢測T細(xì)胞數(shù)量的改變。此種方法是采用熒光標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行跟蹤觀察細(xì)胞數(shù)量的改變情況。然而要觀察病人體內(nèi)細(xì)胞的免疫狀態(tài)，只靠這一細(xì)胞表型的定量分析是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。因此采用分子生物學(xué)及分子免疫學(xué)技術(shù)來觀察T細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)微變化已經(jīng)成為一個(gè)重要檢測手段。
T淋巴細(xì)胞是通過T細(xì)胞受體(TCR)來識(shí)別蛋白抗原的特異性的。組成T細(xì)胞受體的多肽鏈包括αβ異二聚γδ異二聚體。其中T細(xì)胞受體的β鏈因其含有非模板依賴的N區(qū)序列的插入和D區(qū)的存在(ND或NDN)，是TCR重排多樣性可獨(dú)特性的關(guān)鍵區(qū)域。因此以檢測TCRβ鏈基因或氨基酸表達(dá)頻具有臨床價(jià)值。TCRβ鏈?zhǔn)怯煽勺儏^(qū)基因(V基因)，多變區(qū)基因(D基因)，結(jié)合區(qū)基因(J基因)及恒區(qū)基因(C基因)編碼而成的。病毒通常引起一個(gè)選擇性的Vβ基因家族的改變。已建立的半定量分析方法是采用同位素標(biāo)記C區(qū)基因末端引物定量每一基因家族基因表達(dá)的相對(duì)百分比。這種定量方法的靈敏度及特異性都較低，而且需要大量的T細(xì)胞(1×107細(xì)胞)。由V-D-J組成都TCR的互補(bǔ)決定族區(qū)(CDR3)是抗原特異的識(shí)別區(qū)。該區(qū)是TCR產(chǎn)生多樣性和特異性的關(guān)鍵區(qū)。因此可利用重排的T細(xì)胞受體基因，作為T細(xì)胞克隆的標(biāo)志。目前研究資料表明，CDR3區(qū)段重排或稱改變幾乎發(fā)生在所有的T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病中。檢測此區(qū)基因及氨基酸的變化在鑒定藥物療效上具有廣闊的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種有效的通過檢測人類T細(xì)胞受體TCR基因在治療前后的變化來評(píng)價(jià)治療HIV藥物的療效的方法。
本發(fā)明的上述目的可以通過如下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。
1.T細(xì)胞的采集、分離血樣經(jīng)采集后，用Ficoll-Hypaque分層液分離，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，再以偶聯(lián)有CD4或CD8抗體的磁化珠進(jìn)一步分離出CD4或CD8 T細(xì)胞。
2.cDNA的合成淋巴細(xì)胞的mRNA的分離和提純的方法是采用已經(jīng)公布的技術(shù)(Chen，Z.W等1994 proc，Matl.Acai.Sci.Usa.917501-7505)，將mRNA同1μg任意的hexanucleotides(Promega，美國威斯康星州麥迪遜州)，5μl supertranscriptaseII(GibcoBRL，美國紐約長島)在37℃混合反應(yīng)后加熱到70℃終止，得到cDNA。
3.TCR基因組引物的設(shè)計(jì)首先設(shè)計(jì)5′端引物。然后在C基因區(qū)設(shè)計(jì)3′端引物。這一引物用于第一步放大之用。
為了更精確地測定當(dāng)HIV病毒與TCR分子相互作用時(shí)，其CDR 3區(qū)核酸或氨基酸序列的變化，我們?cè)O(shè)計(jì)了一組內(nèi)側(cè)引物用于TCR分子的CDR3區(qū)段圖譜分析。在極其靠近CDR3區(qū)段V基因區(qū)設(shè)計(jì)24個(gè)內(nèi)側(cè)Vβ基因引物和一個(gè)內(nèi)側(cè)Cβ基因引物。Cβ基因引物采用高靈敏度的熒光(6-FAM)標(biāo)記。我們首次在C區(qū)基因引物的5′端插入七個(gè)非模板堿基(GTTTCTT)。
4.PCR反應(yīng)條件為使得PCR反應(yīng)具有高度的特異性，不僅需要高度特異的引物，而且在引物濃度上也應(yīng)嚴(yán)格控制。我們所用的引物濃度只是常規(guī)用量的十分之一到二十分之一，即在50μl反應(yīng)體積中只需2.5Dmol。為了防止TaqDNA酶引起的反應(yīng)物的堿基錯(cuò)配，我們將PCR的循環(huán)次數(shù)降至15個(gè)循環(huán)(通常為35-40個(gè)循環(huán))。
5.CDP3基因變化的分析經(jīng)熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物連同尺寸標(biāo)記物與甲酰胺混合后在94℃變性2分鐘，將樣本置于含6％丙烯酰胺的測序凝膠中，在DNA測序機(jī)上運(yùn)行6小時(shí)，將得到的數(shù)據(jù)用ABIPRISMGeneScan分析軟件進(jìn)行分析和量化，得出相應(yīng)的結(jié)果。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明填補(bǔ)了技術(shù)領(lǐng)域的空白，是首次用此方法來評(píng)價(jià)治療HIV藥物的療效。
2.高度的敏感性，本發(fā)明提供的方法可以將T細(xì)胞的需求量由約1×107減少到1×105。
3.高度的特異性，本發(fā)明提供的方法所用的引物濃度只是常規(guī)用量的十分之一到二十分之一。
4.高度的可重復(fù)性，本發(fā)明提供的方法不僅在同一標(biāo)本中有高度的重復(fù)性，而且在同一病人不同時(shí)間采集的樣本都呈現(xiàn)出一致的核酸的定位。


圖1是Vβ1基因在有效的藥物治療后展示的基因圖譜。
圖2是Vβ2基因在有效的藥物治療后展示的基因圖譜。
圖3是Vβ7基因在有效的藥物治療后展示的基因圖譜。
a表示未感染HIV病毒時(shí)的基因圖譜
b表示HIV病毒感染者治療前的基因圖譜c表示HIV病毒感染者治療后的基因圖譜
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)闡述本發(fā)明的
具體實(shí)施例方式將接受艾滋病藥物治療的患者和健康志愿者的血樣分別采集后，用Fico11-Hypaque分層液分離，水平式離心后，單個(gè)核細(xì)胞密集在血漿層和分層液的界面中，吸取該層細(xì)胞遞經(jīng)洗滌高心重懸，得到PBMC。再以偶聯(lián)有CD4或CD8抗體的磁化珠進(jìn)一步分離出CD4或CD8T細(xì)胞。
T細(xì)胞的mRNA的分離和提純的方法是采用已經(jīng)公布的技術(shù)(Chen，Z.W等1994 proc，Matl.Acai.Sci.Usa.917501-7505)，將mRNA同1μg任意的hexanucleotides(Promega，美國威斯康星州麥迪遜州)，5μl supertranscriptaseII(Gibco BRL，美國紐約長島)總的體積控制在20μl，在37℃混合1小時(shí)后加熱到70℃10分鐘終止反應(yīng)，得到cDNA。
引物設(shè)計(jì)如附表1所示。
PCR參數(shù)設(shè)計(jì)如下第一次反應(yīng)變性95℃，45秒；復(fù)性60℃，45秒；延伸72℃，45秒，34個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘。
5′引物(10pm) 1μl3′引物(10pm) 1μldNTPs(10mM) 1μl
10x反應(yīng)緩沖液 2.5μl三蒸水 18.75μlcDNA0.5μlTaq DNA聚合酶 0.25μl第二次反應(yīng)變性95℃，30秒；復(fù)性60℃，30秒；延伸72℃，30秒，15個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘。
5′引物(10pm) 0.5μl3′引物(10pm) 0.5μldNTP s(10mM)1μl10x反應(yīng)緩沖液 2.5μl三蒸水 19.75μl第一次PCR產(chǎn)物 0.5μlTaq DNA聚合酶 0.25μl其中10x反應(yīng)緩沖液*的組分如下，Tris-HCl(pH8.3) 300mMMgCl250mMKCl 25mM明膠0.01％反應(yīng)完成后，用熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物連同尺寸標(biāo)記物與甲酰胺混合后在94℃變性2分鐘，將樣本置于含6％丙烯酰胺的測序凝膠中，在DNA測序機(jī)上運(yùn)行6小時(shí)，將得到的數(shù)據(jù)通過使用ABIPRISMGeneScan分析軟件進(jìn)行分析，得出相應(yīng)的結(jié)果。
采用此技術(shù)我們已對(duì)50例HIV病毒感染的病人與20例正常人進(jìn)行比較測定，結(jié)果表明，HIV感染的病人與正常人相比其TCR基因圖譜有顯著性差異(P＜0.001)。圖1圖2圖3是3個(gè)代表性Vβ基因家族在有效的藥物治療后展示的基因圖譜。由圖可見治療前基因圖譜為克隆化增殖，只有一個(gè)主要的峰，而經(jīng)有效藥物治療后則完全恢復(fù)到正常的分布狀態(tài)。由此可見，此項(xiàng)技術(shù)在評(píng)價(jià)藥物療效方面是十分成功的。
表1人類TCR Vβ和Cβ引物Vβ out PCR引物 Vβ in PCR引物Vβ1out5’GGA GTC ACA CAA ACC CCA AAG CAC CTG 3’ Vβ1in 5’CTA AAC CTG AGC TCT CTG G 3’Vβ2out5’GTT ATC TGT AAG AGT GGA ACC 3’ Vβ2in 5’GCA GCT TCT ACA TCT GCA G 3’Vβ3out5’CTC GTA GAT GTG AAA GTA ACC CAG AG 3’Vβ3in 5’GAT TCT GGA GTC CGC CAG 3’Vβ4out5’GAT AGC CAA GTC ACC ATG ATG TTC 3’ Vβ4in 5’CAG CAG CAT ATA TCT CTG C 3’Vβ5.1out 5’GTC GAT TCT CAG GGC GCC AGT TCT C 3’ Vβ5.1in 5’GAC TCG GCC CTT TAT CTT TG 3’Vβ6out5’GAG TCT CCC AGA ACC CCA GAC ACA AG 3’ Vβ6in 5’GGA GAT CCA GCG CAC AGA G 3’Vβ7out5’GGT CAT GGG AAT GAC AAA TAA GAA G 3’ Vβ7in 5’CCT GAA TGC CCC AAC AGC TC 3’Vβ8out5’CGA TAG ATG ATT CAG GGA TGC CCG AG 3’ Vβ8in 5’CCA GCC CTC AGA ACC CAG G 3’Vβ9out5’GAC AAG TCC ATT AAA TGT GAA C 3’Vβ9in 5’CTG GAG CTT GGT GAC TCT GTG 3’Vβ11out 5’CTG ACA TCT ACC AGA CCC CAA GAT AC 3’ Vβ11in5’CCT GGA GTC TGC CAG GCC 3’Vβ12out 5’GAT ACT GAC AAA GGA GAA GTC 3’Vβ12in5’CTC ACT CTG GAG TCG CTA C 3’Vβ13out 5’CAA GAC CCA GGC ATG GGG CTG AAG 3’Vβ13in5’GAG GAT TTC CCG CTC AGG C 3’Vβ14out 5’GGG AGA TGT TCC TGA AGG GTA C 3’Vβ14in5’GAG AAG AGG AAT TTC AAT TTC C 3’Vβ15out 5’CTC GAC AGG CAC AGG CTA AAT TC 3’ Vβ15in5’GAG TCT GCC ATC CCC AAC 3’Vβ16out 5’GAT TCT TAG CTG AAA GGA CTG GAG G 3’ Vβ16in5’CAG AAC TGG AGG ATT CTG G 3’Vβ17out 5’GAA GGG TAC AGC GTC TCT CGG GAG AAG 3’ Vβ17in5’CGG CCC AAA AGA ACC CGA CAG C 3’Vβ18out 5’GCC GGC GTC ATG CAG AAC CCA AGA C 3’Vβ18in5’GTG CGA GGA GAT TCG GCA G 3’Vβ20out 5’CTC TCA GCC TCC AGA CCC CAG 3’Vβ20in5’CAG GAC CGG CAG TTC ATC TTC 3’Vβ21out 5’GCC TGT GGC TTT TTG GTG CAA TC 3’ Vβ21in5’CCT GCA GAG CTT GGG GAC 3’Vβ22out 5’CAC ACA GAT GGG ACA GGA AG 3’ Vβ22in5’CAC TCT GAA GAT CCG GTC C 3’Vβ23out 5’CCC TGA TCG ATT CTC AGC TCA AC 3’ Vβ23in5’GAG CTC CTT GGA GCT GGG G 3’Vβ24out 5’CGG CCG AAC ACT TCT TTC TG 3’ Vβ24in5’CAT CCG CTC ACC AGG CCT GGG 3’Cβout 5’CAG GCC TCG GCG CTG ACG ATC TGG GTG AC 3’ 3’Cβin*5’GTT TCT TGA TCTCT GCT TCT GAT GGC TCA AAC 3’*6-FAM labelling
權(quán)利要求
1.通過檢測人類T細(xì)胞受體TCR基因在治療前后的變化來評(píng)價(jià)治療HIV藥物療效的方法，其步驟為a.血樣經(jīng)采集分離后，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，再進(jìn)一步分離出CD4或CD8T細(xì)胞；b.分離和提純出T細(xì)胞的mRNA后，通過mRNA合成得到cDNA；c.在極其靠近CDR3區(qū)段V基因區(qū)設(shè)計(jì)24個(gè)內(nèi)側(cè)Vβ基因引物和一個(gè)側(cè)Cβ基因引物，C區(qū)基因引物的5′端插入七個(gè)非模板堿基(GTTTCTT)，Cβ基因引物采用高靈敏度的熒光(6-FAM)標(biāo)記；d.將設(shè)計(jì)的引物和由mRNA合成的cDNA通過兩次PCR反應(yīng)來擴(kuò)增cDNA；e.將經(jīng)過兩次PCR反應(yīng)擴(kuò)增并被熒光標(biāo)記的T細(xì)胞受體基因，與甲酰胺混合后94℃變性，將樣本置于含6％丙烯酰胺的測序凝膠中，在DNA測序機(jī)上運(yùn)行，得到的數(shù)據(jù)用ABIPRISMGeneScan分析軟件進(jìn)行分析和量化，得出藥物療效的評(píng)價(jià)結(jié)果。
2.權(quán)利要求1所述的通過檢測人類T細(xì)胞受體TCR基因在治療前后的變化來評(píng)價(jià)治療HIV藥物療效的方法，其特征還在于所設(shè)計(jì)的PCR反應(yīng)引物為Vβ out PCR引物 Vβin PCR引物Vβ1out 5’GGA GTC ACA CAA ACC CCA AAG CAC CTG 3’Vβ1in5’CTA AAC CTG AGC TCT CTG G 3’Vβ2out 5’GTT ATC TGT AAG AGT GGA ACC 3’Vβ2in5’GCA GCT TCT ACA TCT GCA G 3’Vβ3out 5’CTC GTA GAT GTG AAA GTA ACC CAG AG 3’ Vβ3in5’GAT TCT GGA GTC CGC CAG 3’Vβ4out 5’GAT AGC CAA GTC ACC ATG ATG TTC 3’Vβ4in5’CAG CAG CAT ATA TCT CTG C 3’Vβ5.1out5’GTC GAT TCT CAG GGC GCC AGT TCT C 3’Vβ5.1in 5’GAC TCG GCC CTT TAT CTT TG 3’Vβ6out 5’GAG TCT CCC AGA ACC CCA GAC ACA AG 3’ Vβ6in5’GGA GAT CCA GCG CAC AGA G 3’Vβ7out 5’GGT CAT GGG AAT GAC AAA TAA GAA G 3’ Vβ7in5’CCT GAA TGC CCC AAC AGC TC 3’Vβ8out 5’CGA TAG ATG ATT CAG GGA TGC CCG AG 3’ Vβ8in5’CCA GCC CTC AGA ACC CAG G 3’Vβ9out 5’GAC AAG TCC ATT AAA TGT GAA C 3’Vβ9in5’CTG GAG CTT GGT GAC TCT GTG 3’Vβ11out 5’CTG ACA TCT ACC AGA CCC CAA GAT AC 3’ Vβ11in 5’CCT GGA GTC TGC CAG GCC 3’Vβ12out 5’GAT ACT GAC AAA GGA GAA GTC 3’Vβ12in 5’CTC ACT CTG GAG TCG CTA C 3’Vβ13out 5’CAA GAC CCA GGC ATG GGG CTG AAG 3’Vβ13in 5’GAG GAT TTC CCG CTC AGG C 3’Vβ14out 5’GGG AGA TGT TCC TGA AGG GTA C 3’ Vβ14in 5’GAG AAG AGG AAT TTC AAT TTC C 3’Vβ15out 5’CTC GAC AGG CAC AGG CTA AAT TC 3’ Vβ15in 5 GAG TCT GCC ATC CCC AAC 3’Vβ16out 5’GAT TCT TAG CTG AAA GGA CTG AGG 3’ Vβ16in 5’CAG AAC TGG AGG ATT CTG G 3’Vβ17out 5’GAA GGG TAC AGC GTC TCT CGG GAG AAG 3’ Vβ17in 5’CGG CCC AAA AGA ACC CGA CAG C 3’Vβ18out 5’GCC GGC GTC ATG CAG AAC CCA AGA C 3’ Vβ18in 5’GTG CGA GGA GAT TCG GCA G 3’Vβ20out 5’CTC TCA GCC TCC AGA CCC CAG 3’ Vβ20in 5’CAG GAC CGG CAG TTC ATC TTC 3’Vβ21out 5’GCC TGT GGC TTT TTG GTG CAA TC 3’Vβ21in 5’CCT GCA GAG CTT GGG GAC 3’Vβ22ot 5’CAC ACA GAT GGG ACA GGA AG 3’Vβ22in 5’CAC TCT GAA GAT CCG GTC C 3’Vβ23out 5’CCC TGA TCG ATT CTC AGC TCA AC 3’Vβ22in 5’GAG CTC CTT GGA GCT GGG G 3’Vβ24out 5’CGG CCG AAC ACT TCT TTC TG 3’Vβ24in 5’CAT CCG CTC ACC AGG CCT GGG 3’Cβout 5’CAG GCC TCG GCG CTG ACG ATC TGG GTG AC 3’3’Cβin*5’GTT TCT TGATCTCT GCT TCT GGC TCA AAC 3’*6-FAM Imbelling
3.權(quán)利要求1所述的通過檢測人類T細(xì)胞受體TCR基因在治療前后的變化來評(píng)價(jià)治療HIV藥物療效的方法，其特征還在于PCR反應(yīng)的條件為第一次反應(yīng)變性95℃，45秒；復(fù)性60℃，45秒；延伸72℃，45秒，34個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘；5′引物(10pm) 1μl3′引物(10pm) 1μldNTPs(10mM) 1μl10x反應(yīng)緩沖液 2.5μl三蒸水 18.75μlcDNA0.5μlTaq DNA聚合 0.25μl第二次反應(yīng)變性95℃，30秒；復(fù)性60℃，30秒；延伸72℃，30秒，15個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘；5′引物(10pm) 0.5μl3′引物(10pm) 0.5μldNTPs(10mM) 1μl10x反應(yīng)緩沖液 2.5μl三蒸水 19.75μl第一次PCR產(chǎn)物 0.5μlTaq DNA聚合酶 0.25μl其中10x反應(yīng)緩沖液的組分如下Tris-HCl(pH8.3) 300mMMgCl250mMKCl 25mM明膠0.01％
全文摘要
發(fā)明提供一種通過設(shè)計(jì)的特定引物來完成PCR反應(yīng)，放大感染HIV病毒的患者的T細(xì)胞受體TCR基因在接受藥物治療前后的變化，進(jìn)而評(píng)價(jià)藥物的療效的方法，本發(fā)明提供的技術(shù)不但填補(bǔ)了技術(shù)上的空白而且具有靈敏度高，準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1480537SQ02131070
公開日2004年3月10日 申請(qǐng)日期2002年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月28日
發(fā)明者寇忠琛 申請(qǐng)人:北京佰仁思生物工程有限責(zé)任公司