專利名稱：熒光PCR定量檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米探針序列及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光PCR定量檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米探針序列及試劑盒。
背景技術(shù)：
據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用咨詢服務(wù)中心(ISAAA)統(tǒng)計(jì)，2001年全世界轉(zhuǎn)基因作物種植面積為5260萬公頃，十多個(gè)國家已種植轉(zhuǎn)基因作物，其中99％的轉(zhuǎn)基因作物種植在美國、阿根廷、加拿大和中國，已批準(zhǔn)商品化轉(zhuǎn)基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯、甜椒、西葫蘆、木瓜、甜菜、香石竹、矮牽牛、亞麻、煙草、西瓜、菊苣等，已批準(zhǔn)商業(yè)化種植的已近90種。據(jù)估計(jì)，用這些轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)加工的食品全世界有近萬種。
對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性，特別是轉(zhuǎn)基因食品對人和動(dòng)物的健康及對生態(tài)環(huán)境的影響，自轉(zhuǎn)基因技術(shù)出現(xiàn)以來，就一直是世界各國及聯(lián)合國等國際組織關(guān)心的焦點(diǎn)問題，2000年聯(lián)合國通過了“生物安全議定書”，該議定書對除了藥物以外的所有進(jìn)出境活性轉(zhuǎn)基因生物有關(guān)過境、審批、檢測、風(fēng)險(xiǎn)評估和管理、賠償責(zé)任等做出了詳細(xì)的規(guī)定，其中最重要的措施之一就是對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品要進(jìn)行檢驗(yàn)，以明確其種類，確定是否為已批準(zhǔn)的或已獲得許可的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，以防止一些具有風(fēng)險(xiǎn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品任意擴(kuò)散，造成不可挽回的損失。2001年歐盟要求對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超過1％的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品(閾值)則不用標(biāo)識(shí)，這樣轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測不但需要定性，還需要定量檢測。不同國家閾值大小不一樣，從1-5％不等。我國于2001年5月9日公布并實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，并于2002年1月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)、標(biāo)識(shí)和進(jìn)口安全管理三個(gè)配套管理辦法。目前全世界36個(gè)國家和地區(qū)出臺(tái)了各種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品有關(guān)的法律法規(guī)?？傊D(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研究、生產(chǎn)、銷售都要在政府有關(guān)部門的許可和監(jiān)督下，在特定的環(huán)境和地點(diǎn)進(jìn)行。
雖然聯(lián)合國所屬機(jī)構(gòu)(FAO、WHO等)及一些地區(qū)性國際組織在召集建立世界統(tǒng)一的檢測技術(shù)和方法標(biāo)準(zhǔn)，但由于對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性、風(fēng)險(xiǎn)管理措施及其它利益等方面的不一致，目前各國尚難達(dá)成一致的意見。綜合世界各國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測技術(shù)，根據(jù)檢測目標(biāo)主要分成下面三個(gè)類型檢測插入的外源基因，檢測外源基因表達(dá)物(RNA或蛋白質(zhì))，檢測插入外源基因?qū)κ荏w生物基因表達(dá)的影響(主要檢測外源基因?qū)Σ迦胛稽c(diǎn)附近基因影響及對整個(gè)代謝產(chǎn)物的影響)。由于第三類型的檢測成本高、所需時(shí)間長，并且被認(rèn)為重要性較低，目前對這方面的檢測在實(shí)際工作中較少涉及。在前兩種類型的檢測工作中所涉及的檢測目標(biāo)包括三種類型DNA、RNA和蛋白質(zhì)。對于蛋白質(zhì)的檢測主要用血清學(xué)方法，由于有些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不表達(dá)蛋白質(zhì)或表達(dá)量不穩(wěn)定，血清學(xué)檢測方法僅在個(gè)別轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中應(yīng)用。對于DNA和RNA的檢測主要采用PCR及直接核酸雜交等基因診斷技術(shù)。基因擴(kuò)增診斷方法到目前為止已經(jīng)歷了以下幾個(gè)方面的發(fā)展PCR/電泳檢測、傳統(tǒng)雜交或測序；PCR-ELISA；實(shí)時(shí)熒光PCR。
在目前已商品化的多種轉(zhuǎn)基因玉米中，有四種(Bt-176，Bt-11，MON810和MON80100)含有插入的來源于蘇云金桿菌(Bt)且具有抗蟲活性的Cry1Ab外源基因序列和玉米內(nèi)源基因zein序列，可作為檢測的靶序列。
Cry1Ab基因的其他寫法如cryIA(b)等含義相同，它是一個(gè)人工合成的截短了的抗蟲基因，來源于蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki strain HD-1)。含有Cry1Ab基因的轉(zhuǎn)基因作物具有抗蟲特性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是要提供一種熒光PCR定量檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米探針序列及試劑盒。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案熒光PCR定量檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米探針序列包括序列ccgccgcgagctgaccctgaccgtg向上游位移5個(gè)堿基、向下游位移5個(gè)堿基的區(qū)域內(nèi)形成的序列。
試劑盒組成核酸提取試劑核酸擴(kuò)增試劑Cry PCR反應(yīng)液(定量)Zein PCR反應(yīng)液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)定量標(biāo)準(zhǔn)品Cry-STND1(2.0％)Cry-STND2(0.5％)Cry-STND3(0.1％)Cry定量陰性對照全基因序列見附錄一核酸提取試劑可使用傳統(tǒng)的植物DNA提取方法的試劑，例如CTAB法，也可采用Promega公司的Wizard Magnetic DNA Purification System for Food試劑盒(Cat FF3750，200 tests)。
本試劑盒采用PCR方法結(jié)合熒光探針的擴(kuò)增雙檢測技術(shù)，在同一試管中以Fam和Tet兩種熒光通道信號分別追蹤C(jī)ry1Ab基因序列和內(nèi)源基因zein序列的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)變化，為消除DNA樣品上樣量的差異，以ΔCt值(Fam-Ct值與Tet-Ct值之差)對梯度GMO含量的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測玉米樣本的GMO含量。


圖1熒光PCR定量檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米的擴(kuò)增圖(目的基因Cry1Ab)圖2熒光PCR定量檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米的擴(kuò)增圖(內(nèi)標(biāo)基因Zein)圖1中，陽性樣品為0.1％，0.5％，1.0％，2.0％，5.0％，F(xiàn)luka玉米標(biāo)準(zhǔn)品，待測樣品1，待測樣品2，陰性樣品為0％Fluka玉米標(biāo)準(zhǔn)品和陰性玉米。圖1中，1為0.5％，2，3為0.1％，4為0％。圖2中，5為0.5％，6為0.1％，7為0.1％，8為0％具體實(shí)施方式
靶區(qū)域的選擇以及引物和探針的設(shè)計(jì)本試劑盒選擇轉(zhuǎn)基因玉米的轉(zhuǎn)入基因片段作為外源檢測的靶片段，以玉米內(nèi)源基因zein作為檢測監(jiān)控的參照基因。引物長度一般為20個(gè)堿基左右，GC含量為50％-60％，引物內(nèi)無二級結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無互補(bǔ)序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5℃。探針的長度在25個(gè)堿基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。
Cry1A(b)的引物和探針名稱(5′-3′方向)區(qū)域1探針165，176，266，282，366，422上游引物Cy-2F下游引物Cy-2R，410r，485r區(qū)域2探針633，647，703上游引物576，590，626，648，657，677下游引物689，734，741，752，807，829區(qū)域3探針851上游引物792下游引物1015，1078Zein片段的引物和探針名稱(5′-3′方向)區(qū)域1探針183上游引物63，77，110，131，下游引物218，228，313，328，348區(qū)域2探針352上游引物197，206，215，220，252下游引物403，406，422，505單檢反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化中所采用的靶區(qū)域陽性模板以如下方法獲得用含有靶序列的轉(zhuǎn)基因玉米2％標(biāo)準(zhǔn)品100mg(粉末)按Promega Kit方法提取DNA，以最末端的兩對引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物(35cycles)稀釋10000倍作為引物與探針初篩的模板，以2％標(biāo)準(zhǔn)品原液作為再次篩選的模板。
引物和探針的篩選引物篩選實(shí)驗(yàn)中將上述上游引物和下游引物任意配對，在PE7700上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
擴(kuò)增反應(yīng)體系配置根據(jù)以往引物篩選經(jīng)驗(yàn)，引物篩選所采用的PCR反應(yīng)體系如下表所示。
PCR反應(yīng)體系組分 終濃度10×PCR反應(yīng)液 1×dNTP(含dUTP) 0.2mmol/LTaq酶 2UnitMg2+濃度 2.5mmol/L引物I 約0.2umol/L引物II約0.2umol/L探針 0.1umol/L模板DNA 2ul補(bǔ)DEPC水至40ul循環(huán)參數(shù)的設(shè)置根據(jù)引物篩選經(jīng)驗(yàn)，篩選引物所采用的PCR循環(huán)條件如下
94℃4min95℃15sec，60℃1min，40個(gè)循環(huán)初篩結(jié)果Cry1Ab引物與探針的初篩表明探針165，266，282，366，422，633，647，703，851都工作，探針176不工作。工作的探針中，703最好，其余探針效果較差，主要表現(xiàn)在與703配對的引物對擴(kuò)增的Ct普遍較小，熒光增值普遍較高，而與其余探針配對的引物對擴(kuò)增Ct普遍較大，熒光增值普遍較低。
Zein片段引物與探針的初篩表明探針183，352都工作，且效果都不錯(cuò)。其中183比352略好。
次篩結(jié)果在初篩的基礎(chǔ)上，我們以2％標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，對Cry1Ab初次篩選效果不錯(cuò)的703的組合對進(jìn)行了再次篩選，另外對初次篩選效果不錯(cuò)的其它引物探針組合也進(jìn)行了再次篩選，結(jié)果表明非703探針檢測熒光增值在40-100范圍(閾值38，基線3-22)，而703配對的引物對檢測結(jié)果仍然普遍較好(見下表)。
引物探針組合次篩結(jié)果

用2％標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，對Zein初次篩選效果不錯(cuò)的183組合及352組合進(jìn)行了再次篩選(第一次合成的引物探針)，結(jié)果表明183探針較352探針略好。352探針熒光值從20至210(閾值40，基線3-23)不等。183探針引物組合篩選結(jié)果如下表183探針引物組合篩選結(jié)果

三篩結(jié)果經(jīng)過初次與再次篩選，我們選擇703探針的5對引物組合作為Cry1Ab檢測的候選引物探針組合，進(jìn)行重復(fù)性與穩(wěn)定性檢。這5對引物對分別是657u-752r，677u-734r，657u-807r，677u-741r，677u-807r。
以0.6ul 2％標(biāo)準(zhǔn)品DNA為反應(yīng)模板，5種組合(第一次合成)檢測結(jié)果如下表(閾值28.3，極限3-25)。
703fb探針引物組合篩選結(jié)果

最終，我們把677u-734r，703fb作為首選，其余4種組合作為候選。
經(jīng)過初次與再次篩選，我們選擇183探針的3對引物組合作為參照檢測的侯選引物探針組合，進(jìn)行重復(fù)性與穩(wěn)定性檢測。這3對引物對分別是131u-313r，110u-313r，77u-348r。
以按標(biāo)準(zhǔn)方法提取的0％陰性樣品DNA 2ul作為反應(yīng)模板，3種組合(第一次合成)檢測結(jié)果如下表(閾值29.3，基線3-22)。
183探針與3對引物組合篩選結(jié)果

最終，我們把131u-313r，183tb作為首選，其它兩種作為候選。
最終篩選結(jié)果cry1Ab基因檢測的首選引物探針組合是677u-734r，703fb。其余4組657u-752r，703fb；657u-807r，703fb；677u-741r，703fb；677u-807r，703fb為候選組合。
Zein基因檢測的首選引物探針組合是131u-313r，183tb。110u-313r，183tb；77u-348r，183tb是候選。
cry1Ab基因最優(yōu)引物/探針序列如下上游引物Cryab pen 677uCGCGACTGGATCAGGTACA下游引物Cryab pen 734rTGGGGAACAGGCTCACGAT探針Cryab pen703fbFam-ccgccgcgagctgaccctgaccgtg-tamraZein基因最佳引物/探針序列如下上游引物zea131utgaacccatgcatgcagt下游引物zea313rggcaagaccattggtga探針zea183tb-78Tet-tggcgtgtccgtccctgatgc-tamra用選出的最佳上下游引物及探針對進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。雙檢反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化從多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中選定下述最佳引物/探針組合上游引物 下游引物探針外源基因cry1Ab 677 734703fb
內(nèi)源基因zein 131 313 183tb-78引物和探針濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中將引物濃度從0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L遞增，探針濃度從0.025umol/L至0.2umol/L以0.025umol/L遞增。對引物和探針不同濃度的配比進(jìn)行了比較。最佳引物和探針終濃度結(jié)果見下表最佳引物和探針終濃度

循環(huán)參數(shù)的設(shè)置根據(jù)既往引物篩選經(jīng)驗(yàn)，篩選引物所采用的PCR循環(huán)條件如下95℃4min95℃15sec，60℃1min，40個(gè)循環(huán)鎂離子濃度和的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中將鎂離子濃度從1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L遞增，從多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中選定2.5mmol/L MgCl2為試劑盒反應(yīng)體系鎂離子濃度。
Taq酶用量的優(yōu)化Taq酶用量(以單位U計(jì))的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定2U Taq酶作為試劑盒中使用Taq酶量。
dNTP濃度的優(yōu)化dNTP濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中選定0.2mmol/L作為試劑盒dNTP的終濃度。
雙檢系統(tǒng)的合一方法先確立外源性cry1Ab擴(kuò)增系統(tǒng)(見上述)，然后逐一加入zea系統(tǒng)的模板、引物和探針，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩系統(tǒng)合并之后，各自的Ct值大約后延一個(gè)單位，Rn值有所下降，見下表雙檢系統(tǒng)參數(shù)

為觀察兩系統(tǒng)合并后對實(shí)際定量的影響，用玉米標(biāo)準(zhǔn)品作下述測定雙檢合一系統(tǒng)Fam和Tet通道的Ct值

為減少上樣的DNA模板量的差異，采用以ΔCt值(Fam-Ct值與Tet-Ct值之差)對梯度GMO含量的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到y(tǒng)＝-4.1581x-2.5356 R2＝0.9982提示該雙檢合一系統(tǒng)可以用于定量檢測。
反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化組合綜上所述在反應(yīng)體系的建立所進(jìn)行的各環(huán)節(jié)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本熒光檢測試劑盒優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系見下表優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為37℃ 5min；95℃ 4min；95℃ 15sec，60℃ 1min 40個(gè)循環(huán)試劑盒組成組成成份(48tests/盒) 體積


UNG為UNG酶(尿嘧啶-N-糖苷酶，Uracil-N-glycosylase)核酸提取試劑依方法而定，可使用傳統(tǒng)的植物DNA提取方法，例如CTAB法，也可采用Promega公司的Wizard Magnetic DNA Purification System for Food試劑盒(CatFF3750，200 tests)。
CTAB法樣本處理試劑配方

純化水的制備用自來水一次蒸餾，經(jīng)過Millipore MILLI-Q PF PLUS純水儀純化，收取電阻率≥18.0MΩ.cm的水，貯于無菌瓶中。
Cry1Ab定量PCR反應(yīng)液配方

Zein PCR反應(yīng)液配方


定量標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對照品的制備定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備購買歐盟的Fluka公司的0.1％，0.5％，，2.0％和5.0％轉(zhuǎn)基因玉米粉，用Promega試劑盒(Wizard Magnetic DNA Purification System for Food，Promega Cat# A7710)提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 陰性對照的制備購買市場上的非轉(zhuǎn)基因玉米，洗凈、烘干，磨成粉，用合格的《轉(zhuǎn)基因玉米熒光PCR定量檢測試劑盒》試劑盒提取基因組DNA，做PCR擴(kuò)增，平行做3個(gè)復(fù)管，如果檢測結(jié)果為Cry1Ab序列檢測為陰性，GMO含量＜0.1％，視為合格非轉(zhuǎn)基因玉米粉。用CTAB法大量提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 自備設(shè)備及試劑水浴鍋，離心機(jī)；氯仿、異丙醇(-20℃預(yù)冷)、70％乙醇(-20℃預(yù)冷)適用儀器PE Gene Amp7700熒光PCR檢測儀或其他合適的熒光PCR儀使用方法1.樣本核酸提取1.1 CTAB法提取DNA1.1.1 稱取100mg充分粉碎后的玉米樣品放入2ml離心管中，加800ul CTAB緩沖液，混勻后于65℃溫育30分鐘；1.1.2 15500g離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上層液至含400ul氯仿的管中，混勻30秒，再以15500g離心10分鐘直至液相分層，吸取上層液至干凈離心管中；1.1.3 加入2V CTAB沉淀緩沖液，室溫下溫育60分鐘；1.1.4 混合液以15500g離心5分鐘，棄上清；1.1.5 加入500ul沉淀溶解液溶解沉淀，并加入500ul氯仿，混勻30秒后以15500g離心10分鐘；1.1.6 轉(zhuǎn)移上清至另一新管中，加入0.6倍體積異丙醇，充分混勻后15500g離心10分鐘，棄上清液；1.1.7 加入70％乙醇500ul于含有沉淀的小管中，小心混勻洗滌管壁后離心10分鐘(15500g)，棄上清；1.1.8 室溫干燥，然后將DNA溶解在100ul無菌去離子水中(如果樣本DNA當(dāng)天不使用，請于-20℃保存)。
1.2 Promega法提取DNA的步驟(備選)原方法樣本稱取量為200mg。根據(jù)本公司的經(jīng)驗(yàn)，此量極難混勻，故將樣本稱取量改為100mg，其后的試劑用量和操作則完全按原方法進(jìn)行。
2. 核酸擴(kuò)增2.1. 試劑配制(PCR前準(zhǔn)備區(qū))從試劑盒中取出各管試劑，室溫融化，2000rpm離心5秒。設(shè)所需要的管數(shù)為n(n＝樣本數(shù)×3+2管陰性對照+6管定量標(biāo)準(zhǔn)品)。這里每個(gè)樣本要做3個(gè)平行管，每個(gè)定量標(biāo)準(zhǔn)品及1個(gè)陰性對照品則只做兩個(gè)平行管。每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表

計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向設(shè)定的n個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入35ul，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
2.2. 加樣(樣本處理區(qū))若樣本DNA保存在-20℃，先置室溫解凍。
在設(shè)定的n個(gè)PCR反應(yīng)管中，分別加入樣本DNA溶液各5ul；0.1％、0.5％、2.0％定量標(biāo)準(zhǔn)品以及陰性對照品各5ul；蓋好PCR反應(yīng)管蓋，轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)，置于定量PCR檢測儀上并記錄樣本擺放順序。
2.3. PCR擴(kuò)增(檢測區(qū))2.3.1. 循環(huán)條件設(shè)置37℃5min；95℃3min；95℃15sec，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系設(shè)為40ul。
(不同的熒光PCR儀循環(huán)條件可能略有調(diào)整)2.3.2.儀器檢測通道選擇所有PCR反應(yīng)管熒光信號收集分別設(shè)為Fam和Tet熒光通道。
具體設(shè)置方法請參照儀器使用說明書。
3.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)3.1 定量標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照品的zein基因Tet熒光通道Ct值應(yīng)在18至25之間，否則需重做PCR反應(yīng)。
3.2 待測玉米DNA樣品的zein基因Tet熒光通道Ct值應(yīng)在18至25之間；否則，樣本DNA提取過程有誤，需從樣本DNA提取開始重做。
3.3 陰性對照品Cry1Ab基因的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性；否則需重做PCR反應(yīng)。
3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬和度(R平方值)應(yīng)大于等于0.90，否則應(yīng)重做PCR反應(yīng)。
4. 結(jié)果分析4.1 無論Fam熒光通道或Tet熒光通道，基線都取3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號；閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，使陰性對照品成陰性結(jié)果為準(zhǔn)。
4.2 記錄每個(gè)定量標(biāo)準(zhǔn)品以及每個(gè)待測樣品的Fam熒光通道的Ct值和Tet熒光通道的Ct值，并分別計(jì)算出定量標(biāo)準(zhǔn)品在Fam和Tet熒光通道Ct值的平均值。將各標(biāo)準(zhǔn)品的平均Ct值和各待測樣品的Ct值輸入到所配軟件的相應(yīng)位置，軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本的ΔCt值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的已知GMO含量和所得的ΔCt值之間的對應(yīng)關(guān)系，軟件可計(jì)算出回歸曲線方程。
4.3 根據(jù)此回歸方程，軟件可通過每個(gè)待測樣品的ΔCt值自動(dòng)計(jì)算其GMO的含量，并在表格的對應(yīng)位置顯示結(jié)果。
4.4 GMO含量的報(bào)告方式
如果某待測樣品的GMO含量計(jì)算值在0.1～2.0％之間，按實(shí)際值報(bào)告；如果某待測樣品的GMO含量計(jì)算值小于0.1％，報(bào)告GMO低于檢測限；如果某待測樣品的GMO含量計(jì)算值大于2.0％，報(bào)告GMO大于2.0％；儲(chǔ)存條件及有效期本試劑盒中樣本處理試劑在室溫保存；核酸擴(kuò)增試劑-20℃保存；避免反復(fù)凍融。有效期為一年，連續(xù)生產(chǎn)的三批試劑盒自檢定合格之日起試劑盒要求的儲(chǔ)存溫度下保存，每個(gè)月按成品檢定規(guī)程檢測一次，一直到14個(gè)月時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)均合格，因此確定試有效期為12個(gè)月(請于有效期內(nèi)使用)。
實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范請嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。
實(shí)施例1定量檢測選取待檢樣品，以Promega磁珠法提取基因組DNA，具體為稱重100mg植物材料，置于2ml離心管中；加入500ul Lysis Buffer A和5ul RNase A，與材料混勻；加入250ul Lysis Buffer B，混勻，室溫放置10分鐘；加入750ul沉淀緩沖液，混勻后高速離心(13000×g)10分鐘；吸取上清于干凈的2ml離心管中，加入50ul磁粉液，混勻；混合液中加入0.8體積異丙醇，混勻，室溫放置5分鐘；將離心管置于磁架上1分鐘，去澄清液；取出離心管，再加入250ul Lysis Buffer B，混勻后置于磁架上1分鐘，去澄清液；用1ml 70％乙醇清洗磁粉，置于磁架上1分鐘，去澄清液；步驟重復(fù)2次；取出離心管，于65℃干浴鍋中干燥5分鐘或室溫下干燥15-30分鐘；離心管中加入100ul去離子水，混勻后于65℃干浴鍋中孵育5分鐘，再移至磁架上1分鐘，吸取澄清液于0.5ml干凈離心管中，做為DNA模板備用。
用本試劑盒做熒光PCR定量檢測，熒光PCR儀采用PE7700。其結(jié)果如下表用本試劑盒做熒光PCR定量檢測，標(biāo)準(zhǔn)品及樣品ct值

從上述數(shù)據(jù)得到的回歸曲線是y＝-0.2622x+7.6419；相關(guān)性r2＝0.989；再用1.0％和2.0％的標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)做被測樣品，測得的GMO含量分別為0.94％和2.26％，定量偏差為5％-20％(歐盟的GENESCAN公司同類檢測定量偏差為≤20％)，提示所用引物的檢測效率已達(dá)到核酸擴(kuò)增檢測領(lǐng)域里的該項(xiàng)目的國際水平。具體試劑盒靈敏度為0.1％GMO玉米。
試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度≥0.95。
試劑盒精密性公司中3位技術(shù)熟練的操作人員在3個(gè)不同時(shí)間，各做3次精密性檢測實(shí)驗(yàn)(總計(jì)9次)，每次平行處理10份精密性參比品。對每10次所得的Ct值用Microsoft Excel分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，得出平均值和10個(gè)Ct值的CV值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ct值的CV值在4.5％以下，表明該試劑盒有良好的精密性。結(jié)果如下表玉米定量測定結(jié)果表


試劑盒特異性發(fā)明的效果對經(jīng)過反復(fù)篩選確立的試劑盒進(jìn)行測試。
以符合國際標(biāo)準(zhǔn)的Fluka玉米標(biāo)準(zhǔn)品0.1％轉(zhuǎn)基因玉米提取的DNA做模板，得到的Ct值在29.0-33.0之間，這是目前不同熒光測定儀器的可靠檢測下限；而0.1％的檢測靈敏度已達(dá)到了目前同類產(chǎn)品的檢測標(biāo)準(zhǔn)。
用于作定量檢測，定量偏差為5-20％(歐盟的GENESCAN公司同類檢測定量偏差為≤20％)，提示本試劑盒的檢測效率已達(dá)到核酸擴(kuò)增檢測領(lǐng)域里的該項(xiàng)目的國際水平。
該試劑盒對陰性大豆、玉米、油菜、馬鈴薯標(biāo)本均無非特異性擴(kuò)增，表明該試劑盒具有良好的特異性。
該試劑盒中的引物、探針可用作雜交探針檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米。
PCR-ELISA的方法原理簡介該實(shí)驗(yàn)要設(shè)計(jì)一對PCR引物和一條探針，它們均與模板DNA鏈互補(bǔ)，且探針的結(jié)合部位在引物結(jié)合部位之間。將PCR的一條引物5’端標(biāo)記上熒光素(Fluorescein)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物帶有熒光素標(biāo)記。同時(shí)將探針的5’端標(biāo)記上生物素(Biotin)，酶聯(lián)板上包被有親和素(Avidin)，通過生物素與親和素的親和作用，將探針包被在酶聯(lián)板上。檢測時(shí)，將擴(kuò)增產(chǎn)物變性成單鏈，在酶聯(lián)板上與探針進(jìn)行特異的結(jié)合，洗板，再加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的熒光素抗體，通過顯色劑顯色，在酶標(biāo)板上讀取OD值，根據(jù)OD值判斷樣品的陰陽性。
實(shí)施內(nèi)容將上述探針35s7270FAM的5’端標(biāo)記生物素，3’端不做標(biāo)記；將引物35s2r的5’端標(biāo)記上熒光素。預(yù)先將探針包被在有親和素的酶聯(lián)板上。
按常規(guī)方法(CTAB法或磁珠法)提取樣本中的DNA。由10×PCR緩沖液、dNTPs、Mg2+、Taq酶、上下游引物、H2O，以及DNA模板組成PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增。
擴(kuò)增結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物變性成單鏈，加到包被了探針的酶聯(lián)板上，如果有特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中的一條鏈與探針雜交，洗板，加入酶聯(lián)熒光素抗體，洗板，加入顯色劑，顯色10分鐘，停止顯色，在酶標(biāo)儀上讀取OD值，根據(jù)OD值判斷樣本的陰陽性。下表是一次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明只要含有Cry1Ab基因序列的轉(zhuǎn)基因作物經(jīng)該系統(tǒng)檢測結(jié)果均為陽性，而不含有Cry1A(b)基因的作物經(jīng)該系統(tǒng)檢測均為陰性本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.本試劑盒對于轉(zhuǎn)入35s啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因作物檢測靈敏度可達(dá)0.1％，說明本試劑盒具有良好的靈敏度。
2.本試劑盒對于非轉(zhuǎn)基因的農(nóng)產(chǎn)品如大豆、玉米等均無擴(kuò)增信號，說明本試劑盒具有良好的特異性。
3.用本試劑盒做熒光PCR定量檢測，定量偏差為5％-20％(歐盟的GENESCAN公司同類檢測定量偏差為≤20％)，提示該試劑盒的檢測效率已達(dá)到核酸擴(kuò)增檢測領(lǐng)域里的該項(xiàng)目的國際水平。
4.由于本試劑盒采用了熒光PCR作為檢測方法，整個(gè)反應(yīng)均閉管進(jìn)行，避免了其他核酸檢測方法如PCR-電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽性。
5.由于本試劑盒采用了植物內(nèi)源基因Zein作為內(nèi)標(biāo)，避免了核酸提取的對定量造成的誤差及假陰性的產(chǎn)生。
6.由于本方法對PCR產(chǎn)物實(shí)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測，大大節(jié)省了檢測時(shí)間，節(jié)約了人力物力。
備注以英文字母表示的引物探針的名稱、引物探針的序列/基因的名稱等大小寫通用；Ct值的英文全稱“Threshold Cycles”，意指熒光值超過閾值時(shí)所處的循環(huán)數(shù)。在不同熒光PCR儀上有不同的名稱，但含意是一樣的。
附錄一ATGGACAACA ACCCCAACAT CAACGAGTGC ATCCCCTACA ACTGCCTGAG CAACCCCGAG61 GTGGAGGTGC TGGGCGGCGA GCGCATCGAG ACCGGCTACA CCCCCATCGA CATCAGCCTG121AGCCTGACCC AGTTCCTGCT GAGCGAGTTC GTGCCCGGCG CCGGCTTCGT GCTGGGCCTG181GTGGACATCA TCTGGGGCAT CTTCGGCCCC AGCCAGTGGG ACGCCTTCCT GGTGCAGATC241GAGCAGCTGA TCAACCAGCG CATCGAGGAG TTCGCCCGCA ACCAGGCCAT CAGCCGCCTG301GAGGGCCTGA GCAACCTGTA CCAAATCTAC GCCGAGAGCT TCCGCGAGTG GGAGGCCGAC361CCCACCAACC CCGCCCTGCG CGAGGAGATG CGCATCCAGT TCAACGACAT GAACAGCGCC421CTGACCACCG CCATCCCCCT GTTCGCCGTG CAGAACTACC AGGTGCCCCT GCTGAGCGTG481TACGTGCAGG CCGCCAACCT GCACCTGAGC GTGCTGCGCG ACGTCAGCGT GTTCGGCCAG541CGCTGGGGCT TCGACGCCGC CACCATCAAC AGCCGCTACA ACGACCTGAC CCGCCTGATC601GGCAACTACA CCGACCACGC CGTGCGCTGG TACAACACCG GCCTGGAGCG CGTGTGGGGT661CCCGACAGCC GCGACTGGAT CAGGTACAAC CAGTT Cryab pen 677u Cryab pen703fb721CTGGACATCG TGAGCCTGTT CCCCAACTAC GACAGCCGCA CCTACCCCAT CCGCACCGTGCryab pen 734r781AGCCAGCTGA CCCGCGAGAT TTACACCAAC CCCGTGCTGG AGAACTTCGA CGGCAGCTTC841CGCGGCAGCG CCCAGGGCAT CGAGGGCAGC ATCCGCAGCC CCCACCTGAT GGACATCCTG901AACAGCATCA CCATCTACAC CGACGCCCAC CGCGGCGAGT ACTACTGGAG CGGCCACCAG961ATCATGGCCA GCCCCGTCGG CTTCAGCGGC CCCGAGTTCA CCTTCCCCCT GTACGGCACC1021 ATGGGCAACG CTGCACCTCA GCAGCGCATC GTGGCACAGC TGGGCCAGGG AGTGTACCGC1081 ACCCTGAGCA GCACCCTGTA CCGTCGACCT TTCAACATCG GCATCAACAA CCAGCAGCTG1141 AGCGTGCTGG ACGGCACCGA GTTCGCCTAC GGCACCAGCA GCAACCTGCC CAGCGCCGTG1201 TACCGCAAGA GCGGCACCGT GGACAGCCTG GACGAGATCC CCCCTCAGAA CAACAACGTG1261 CCACCTCGAC AGGGCTTCAG CCACCGTCTG AGCCACGTGA GCATGTTCCG CAGTGGCTTC1321 AGCAACAGCA GCGTGAGCAT CATCCGTGCA CCTATGTTCA GCTGGATTCA CCGCAGTGCC1381 GAGTTCAACA ACATCATCCC CAGCAGCCAG ATCACCCAGA TCCCCCTGAC CAAGAGCACC1441 AACCTGGGCA GCGGCACCAG CGTGGTGAAG GGCCCCGGCT TCACCGGCGG CGACATCCTG1501 CGCCGCACCA GCCCCGGCCA GATCAGCACC CTGCGCGTGA ACATCACCGC CCCCCTGAGC1561 CAGCGCTACC GCGTCCGCAT CCGCTACGCC AGCACCACCA ACCTGCAGTT CCACACCAGC1621 ATCGACGGCC GCCCCATCAA CCAGGGCAAC TTCAGCGCCA CCATGAGCAG CGGCAGCAAC1681 CTGCAGAGCG GCAGCTTCCG CACCGTGGGC TTCACCACCC CCTTCAACTT CAGCAACGGC1741 AGCAGCGTGT TCACCCTGAG CGCCCACGTG TTCAACAGCG GCAACGAGGT GTACATCGAC1801 CGCATCGAGT TCGTGCCCGC CGAGGTGACC TTCGAGGCCG AGTACGACCT GGAGAGGGCT1861 CAGAAGGCCG TGAACGAGCT GTTCACCAGC AGCAACCAGA TCGGCCTGAA GACCGACGTG1921 ACCGACTACC ACATCGATCA AGTATCCAAT TTAGTTGAGT GTTTATCTGA TGAATTTTGT1981 CTGGATGAAA AAAAAGAATT GTCCGAGAAA GTCAAACATG CGAAGCGACT TAGTGATGAG2041 CGGAATTTAC TTCAAGATCC AAACTTTAGA GGGATCAATA GACAACTAGA CCGTGGCTGG2101 AGAGGAAGTA CGGATATTAC CATCCAAGGA GGCGATGACG TATTCAAAGA GAATTACGTT2161 ACGCTATTGG GTACCTTTGA TGAGTGCTAT CCAACGTATT TATATCAAAA AATAGATGAG2221 TCGAAATTAA AAGCCTATAC CCGTTACCAA TTAAGAGGGT ATATCGAAGA TAGTCAAGAC2281 TTAGAAATCT ATTTAATTCG CTACAATGCC AAACACGAAA CAGTAAATGT GCCAGGTACG2341 GGTTCCTTAT GGCCGCTTTC AGCCCCAAGT CCAATCGGAA AATGTGGGGA GCCGAATCGA2401 TGCGCTCCGC ACCTGGAGTG GAACCCGGAC CTAGACTGCA GCTGCAGGGA CGGGGAGAAG2461 TGCGCCCATC ATTCCCATCA TTTCTCCTTG GACATTGATG TTGGATGTAC AGACTTAAAT2521 GAGGACTTAG GTGTATGGGT GATATTCAAG ATTAAGACGC AAGATGGCCA TGCAAGACTA2581 GGAAATCTAG AATTTCTCGA AGAGAAACCA TTAGTAGGAG AAGCACTAGC TCGTGTGAAA2641 AGAGCGGAGA AAAAATGGAG AGACAAACGT GAAAAATTGG AATGGGAAAC AAATATTGTT2701 TATAAAGAGG CAAAAGAATC TGTAGATGCT TTATTTGTAA ACTCTCAATA TGATAGATTA2761 CAAGCGGATA CCAACATCGC GATGATTCAT GCGGCAGATA AACGCGTTCA TAGCATTCGA2821 GAAGCTTATC TGCCTGAGCT GTCTGTGATT CCGGGTGTCA ATGCGGCTAT TTTTGAAGAA2881 TTAGAAGGGC GTATTTTCAC TGCATTCTCC CTATATGATG CGAGAAATGT CATTAAAAAT2941 GGTGATTTTA ATAATGGCTT ATCCTGCTGG AACGTGAAAG GGCATGTAGA TGTAGAAGAA3001 CAAAACAACC ACCGTTCGGT CCTTGTTGTT CCGGAATGGG AAGCAGAAGT GTCACAAGAA3061 GTTCGTGTCT GTCCGGGTCG TGGCTATATC CTTCGTGTCA CAGCGTACAA GGAGGGATAT3121 GGAGAAGGTT GCGTAACCAT TCATGAGATC GAGAACAATA CAGACGAACT GAAGTTTAGC3181 AACTGTGTAG AAGAGGAAGT ATATCCAAAC AACACGGTAA CGTGTAATGA TTATACTGCG3241 ACTCAAGAAG AATATGAGGG TACGTACACT TCTCGTAATC GAGGATATGA CGGAGCCTAT3301 GAAAGCAATT CTTCTGTACC AGCTGATTAT GCATCAGCCT ATGAAGAAAA AGCATATACA3361 GATGGACGAA GAGACAATCC TTGTGAATCT AACAGAGGAT ATGGGGATTA CACACCACTA3421 CCAGCTGGCT ATGTGACAAA AGAATTAGAG TACTTCCCAG AAACCGATAA GGTATGGATT3481 GAGATCGGAG AAACGGAAGG AACATTCATC GTGGACAGCG TGGAATTACT TCTTATGGAG3541 gaataa
序列表<110>國家出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)所深圳市匹基生物工程股份有限公司<120>一種熒光PCR定量檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米探針序列及試劑盒<130><160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>1ccgccgcgag ctgaccctga ccgtg 25<210>2<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>2cgcgactgga tcagtaca 19<210>3<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>3tggggaacag gctcacgat 19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>4tggcgtgtcc gtccctgatg c 21<210>5<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>5tgaacccatg catgcagt 18<210>6<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>6ggcaagacca ttggtga1權(quán)利要求
1.一種熒光PCR定量檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米探針序列，其特征在于所述的探針序列包括序列ccgccgcgagctgaccctgaccgtg向上游位移5個(gè)堿基、向下游位移5個(gè)堿基的區(qū)域內(nèi)形成的探針序列。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光PCR定量檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米探針序列，其特征在于所述的探針序列為ccgccgcgagctgaccctgaccgtg。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒光PCR定量檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米探針序列做成的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒的組成為核酸提取試劑核酸擴(kuò)增試劑Cry PCR反應(yīng)液Zein PCR反應(yīng)液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)定量標(biāo)準(zhǔn)品Cry-STND1(2.0％)Cry-STND2(0.5％)Cry-STND3(0.1％)Cry-定量陰性對照其中PCR反應(yīng)液的上游引物序列CGCGACTGGATCAGGTACA下游引物序列TGGGGAACAGGCTCACGAT所述的Zein基因最佳引物/探針序列如下上游引物序列tgaacccatgcatgcagt下游引物序列g(shù)gcaagaccattggtga探針tggcgtgtccgtccctgatgc
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種熒光PCR定量檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米探針序列做成的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒的組成為CTAB法核酸提取試劑CTAB緩沖液 40ml×1管CTAB沉淀緩沖液 40ml×1管沉淀溶解液 24ml×1管核酸擴(kuò)增試劑Cry PCR反應(yīng)液 1ml×1管Zein PCR反應(yīng)液 1ml×1管Taq酶(5U/ul) 20ul×1管UNG(1U/ul) 5ul×1管定量標(biāo)準(zhǔn)品Cry-STND1(2.0％) 30ul×1管Cry-STND2(0.5％) 30ul×1管Cry-STND3(0.1％) 30ul×1管Cry-定量陰性對照 30ul×1管其中Cry定量PCR反應(yīng)液配方試劑成份 終濃度或體積10×buffer 2ul25mM MgCl22ul100mM dATP 0.04ul100mM dCTP 0.04ul100mM dGTP 0.04ul100mM dUTP 0.04ulCrylAb上游引物 0.46mMCrylAb下游引物 0.46uMCrylAb探針 0.23uM加水至 17.3ulZein-PCR反應(yīng)液配方試劑成份 終濃度或體積10×buffer 2ul25mM MgCl22ul100mM dATP 0.04ul100mM dCTP 0.04ul100mM dGTP 0.04ul100mM dUTP 0.04ulZein上游引物 0.46mMZein下游引物 0.46uMZein探針 0.23uM加水至 17.3ul
5.權(quán)利要求2所述的一種熒光PCR定量檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米探針，其特征在于所述的探針用作雜交探針檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米。
全文摘要
一種熒光PCR定量檢測含有Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)基因玉米探針序列及試劑盒，所述的探針序列包括序列ccgccgcgagctgaccctgaccgtg向上游位移5個(gè)堿基、向下游位移5個(gè)堿基的區(qū)域內(nèi)形成的探針序列。試劑盒包括核酸提取試劑，核酸擴(kuò)增試劑，定量標(biāo)準(zhǔn)品，其中，核酸擴(kuò)增試劑包括CryPCR反應(yīng)液、ZeinPCR反應(yīng)液、Taq酶、UNG等，標(biāo)準(zhǔn)品包括Cry1A(b)不同濃度的陽性品以及陰性對照品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是對轉(zhuǎn)基因作物檢測靈敏度可達(dá)0.1％，具有良好的靈敏度和特異性。定量偏差為5％－20％，檢測效率已達(dá)核酸擴(kuò)增檢測領(lǐng)域里的該項(xiàng)目的國際水平。采用了植物內(nèi)源基因Zein作為內(nèi)標(biāo)，避免核酸提取造成的誤差及假陰性的產(chǎn)生。實(shí)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測，大大節(jié)省檢測時(shí)間，節(jié)約人力物力。
文檔編號C12Q1/68GK1485435SQ02131290
公開日2004年3月31日 申請日期2002年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月24日
發(fā)明者朱文斯, 朱水芳, 黃茜華 申請人:深圳市匹基生物工程股份有限公司, 國家出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)所