專利名稱：一種熒光PCR定性檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物探針序列及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光PCR定性檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物探針序列及試劑盒。
背景技術(shù)：
據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用咨詢服務(wù)中心(ISAAA)統(tǒng)計(jì)，2001年全世界轉(zhuǎn)基因作物種植面積為5260萬(wàn)公頃，十多個(gè)國(guó)家已種植轉(zhuǎn)基因作物，其中99％的轉(zhuǎn)基因作物種植在美國(guó)、阿根廷、加拿大和中國(guó)，已批準(zhǔn)商品化轉(zhuǎn)基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯、甜椒、西葫蘆、木瓜、甜菜、香石竹、矮牽牛、亞麻、煙草、西瓜、菊苣等，已批準(zhǔn)商業(yè)化種植的已近90種。據(jù)估計(jì)，用這些轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)加工的食品全世界有近萬(wàn)種。
對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性，特別是轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人和動(dòng)物的健康及對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響，自轉(zhuǎn)基因技術(shù)出現(xiàn)以來(lái)，就一直是世界各國(guó)及聯(lián)合國(guó)等國(guó)際組織關(guān)心的焦點(diǎn)問(wèn)題，2000年聯(lián)合國(guó)通過(guò)了“生物安全議定書(shū)”，該議定書(shū)對(duì)除了藥物以外的所有進(jìn)出境活性轉(zhuǎn)基因生物有關(guān)過(guò)境、審批、檢測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和管理、賠償責(zé)任等做出了詳細(xì)的規(guī)定，其中最重要的措施之一就是對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品要進(jìn)行檢驗(yàn)，以明確其種類，確定是否為已批準(zhǔn)的或已獲得許可的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，以防止一些具有風(fēng)險(xiǎn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品任意擴(kuò)散，造成不可挽回的損失。2001年歐盟要求對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超過(guò)1％的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品(閾值)則不用標(biāo)識(shí)，這樣轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)不但需要定性，還需要定量檢測(cè)。不同國(guó)家閾值大小不一樣，從1-5％不等。我國(guó)于2001年5月9日公布并實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，并于2002年1月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)、標(biāo)識(shí)和進(jìn)口安全管理三個(gè)配套管理辦法。目前全世界36個(gè)國(guó)家和地區(qū)出臺(tái)了各種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品有關(guān)的法律法規(guī)?？傊D(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研究、生產(chǎn)、銷(xiāo)售都要在政府有關(guān)部門(mén)的許可和監(jiān)督下，在特定的環(huán)境和地點(diǎn)進(jìn)行。
雖然聯(lián)合國(guó)所屬機(jī)構(gòu)(FAO、WHO等)及一些地區(qū)性國(guó)際組織在召集建立世界統(tǒng)一的檢測(cè)技術(shù)和方法標(biāo)準(zhǔn)，但由于對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性、風(fēng)險(xiǎn)管理措施及其它利益等方面的不一致，目前各國(guó)尚難達(dá)成一致的意見(jiàn)。綜合世界各國(guó)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)，根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)主要分成下面三個(gè)類型檢測(cè)插入的外源基因，檢測(cè)外源基因表達(dá)物(RNA或蛋白質(zhì))，檢測(cè)插入外源基因?qū)κ荏w生物基因表達(dá)的影響(主要檢測(cè)外源基因?qū)Σ迦胛稽c(diǎn)附近基因影響及對(duì)整個(gè)代謝產(chǎn)物的影響)。由于第三類型的檢測(cè)成本高、所需時(shí)間長(zhǎng)，并且被認(rèn)為重要性較低，目前對(duì)這方面的檢測(cè)在實(shí)際工作中較少涉及。在前兩種類型的檢測(cè)工作中所涉及的檢測(cè)目標(biāo)包括三種類型DNA、RNA和蛋白質(zhì)。對(duì)于蛋白質(zhì)的檢測(cè)主要用血清學(xué)方法，由于有些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不表達(dá)蛋白質(zhì)或表達(dá)量不穩(wěn)定，血清學(xué)檢測(cè)方法僅在個(gè)別轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中應(yīng)用。對(duì)于DNA和RNA的檢測(cè)主要采用PCR及直接核酸雜交等基因診斷技術(shù)?；驍U(kuò)增診斷方法到目前為止已經(jīng)歷了以下幾個(gè)方面的發(fā)展PCR/電泳檢測(cè)、傳統(tǒng)雜交或測(cè)序；PCR-ELISA；實(shí)時(shí)熒光PCR。
在目前所見(jiàn)到的轉(zhuǎn)基因作物中，轉(zhuǎn)入的目的基因種類繁多，功能各異。為了轉(zhuǎn)入的基因成功表達(dá)，均需要插入一定的外源性調(diào)控序列，統(tǒng)計(jì)表明，35S啟動(dòng)子，F(xiàn)MV啟動(dòng)子，nos終止子，nptII，cry3A，bar和pat這七種基因片段，用做篩查目的靶核苷酸序列時(shí)則可覆蓋絕大多數(shù)的GMO品種(詳見(jiàn)附錄一商品化的轉(zhuǎn)基因作物品種含有的定性篩選基因)。Pat基因的英文名稱為phosphinothricin acetyltransferase(簡(jiǎn)寫(xiě)為Pat)，PAT基因(或其人工改建序列)作為一種抗除草劑基因，不僅可以作為目的基因轉(zhuǎn)入作物，而且可以作為轉(zhuǎn)基因過(guò)程中的篩選基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種熒光PCR定性檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物探針序列及試劑盒。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案熒光PCR定性檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物探針序列包括序列TGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA向上游延伸5個(gè)堿基、向下游延伸5個(gè)堿基的區(qū)域內(nèi)形成的序列。上游引物序列GTCGACATGTCTCCGGAGAG下游引物序列GCAACCAACCAAGGGTATC。
所述的試劑盒組成為核酸提取試劑核酸擴(kuò)增試劑PatPCR反應(yīng)液(定性)18s-rRNA PCR反應(yīng)液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)純化水對(duì)照品Pat陽(yáng)性對(duì)照品18s-rRNA陽(yáng)性對(duì)照品基因組全序列見(jiàn)附錄二本發(fā)明的具體原理是利用一對(duì)靶核苷酸序列的特異性引物、一個(gè)特異性熒光探針，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTP)等成分，并應(yīng)用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)靶核苷酸序列的核酸片段擴(kuò)增。同時(shí)結(jié)合熒光探針檢測(cè)技術(shù)，該探針能與引物擴(kuò)增區(qū)域中間的一段模板發(fā)生特異性結(jié)合，隨著PCR過(guò)程的進(jìn)行，熒光信號(hào)發(fā)生相應(yīng)的變化，使用在線監(jiān)測(cè)的熒光PCR檢測(cè)儀，即可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核苷酸序列的擴(kuò)增及自動(dòng)檢測(cè)，根據(jù)收集記錄的熒光信號(hào)，判定待測(cè)樣本中靶核苷酸序列的存在。為排除假陰性的出現(xiàn)，本試劑盒系列還包括植物共有的18s-rRNA基因檢測(cè)系統(tǒng)，用于檢測(cè)樣本DNA的提取和PCR反應(yīng)過(guò)程。


圖1一種熒光PCR定性檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物擴(kuò)增1中，陽(yáng)性樣品為油菜種子1，陰性樣品為0.1％Fluka大豆標(biāo)準(zhǔn)品，阿根廷大豆，0％大豆，Mon810大豆，0％玉米馬鈴薯，番茄，棉花。
具體實(shí)施例方式
引物、探針設(shè)計(jì)對(duì)GMO中選用的多種Pat基因序列(包括Pat基因的天然序列以及人工改建序列)進(jìn)行比較，選擇其中缺乏二級(jí)結(jié)構(gòu)且保守的基因區(qū)設(shè)計(jì)多對(duì)引物。引物長(zhǎng)度一般為20個(gè)堿基左右，GC含量為50％-60％，引物內(nèi)無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5℃。探針的長(zhǎng)度在25個(gè)堿基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。根據(jù)上述原則設(shè)計(jì)出的引物、探針如下上游PAT 1u，PAT 14，PAT 43，PAT 161，PAT 173，PAT 189，PAT 202，PAT 353，PAT 358，PAT 413，Patn33u下游PAT 173r，PAT 216，PAT 239，PAT 243，PAT 277，PAT 461，PAT 463，PAT 510，PAT512探針PAT65tdB，81-433FB，218FB最優(yōu)引物、探針序列如下引物上游引物PAT luGTCGACATGTCTCCGGAGAG下游引物PAT 173rGCAACCAACCAAGGGTATC探針序列PAT65tdBFam-TGGCCGCGGTtTGTGATATCGttaa-TAMRA反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化中所采用的靶區(qū)域模板以如下方法獲得用已確證的轉(zhuǎn)入該基因的轉(zhuǎn)基因油菜籽為材料，以Promega Purification kit提取基因組核酸，再分別用上述檢測(cè)序列區(qū)域中的最長(zhǎng)的擴(kuò)增片段的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1×TE進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共5個(gè)稀釋度為系列陽(yáng)性模板，并取其中Ct值23至27之間者作為以后反應(yīng)體系優(yōu)化時(shí)的模板。
引物、探針的篩選引物篩選實(shí)驗(yàn)中將上述上游引物和下游引物結(jié)合特異的探針，任意配對(duì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。熒光PCR儀采用PE7700熒光PCR儀。所采用的PCR反應(yīng)體系如下表所示。
PCR反應(yīng)體系組分 終濃度10×PCR反應(yīng)液 1×dNTP(含dUTP) 0.2mmol/LTaq酶 2UnitMg2+濃度 2.5mmol/L引物(上游)0.2umol/L引物(下游)0.2umol/L探針 0.1umol/L模板DNA 2ul補(bǔ)DEPC水至40ul
PCR條件的選擇依據(jù)本公司以往的經(jīng)驗(yàn)，PCR條件的選擇如下94℃3min；

在同樣的模板量、同樣的反應(yīng)條件下，以Pat基因序列的特異熒光探針信號(hào)所獲得的Ct值和Rn值為指標(biāo)(這兩者能反映擴(kuò)增片斷的量和質(zhì))，比較不同引物對(duì)組合的擴(kuò)增情況。選擇Ct值和Rn值高者，做為待選的DNA/PCR檢測(cè)的引物對(duì)。
從多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中選定下述最佳引物/探針組合為最佳組合上游引物PAT lu；下游引物PAT 173r；探針PAT65tdB。
用選出的最佳上下游引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。
引物和探針濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中將引物濃度從0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L遞增，探針濃度從0.025umol/L至0.2umol/L以0.025umol/L遞增。對(duì)引物和探針不同濃度的配比進(jìn)行了比較。最佳引物和探針終濃度結(jié)果如下

探針名稱PAT65tdB 最佳終濃度0.1μM。
鎂離子濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中將鎂離子濃度從1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L遞增。
從多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中選定2.5mmol/L MgCl2為試劑盒反應(yīng)體系鎂離子濃度。
Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化Taq酶用量(以單位U計(jì))的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定2U Taq酶作為試劑盒中使用Taq酶量。
dNTPs濃度的優(yōu)化dNTPs濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中選定0.2mmol/L作為試劑盒dNTPs的終濃度。
綜合以上反應(yīng)體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系見(jiàn)下表。
優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系

DNA提取方法的建立推薦使用傳統(tǒng)的植物DNA提取方法CTAB法。也可根據(jù)樣品特性選用方法。
18s-rRNA基因檢測(cè)18s-rRNA基因是存在于所有植物中的一種基因，所以本試劑盒選用它作為內(nèi)標(biāo)基因，用于監(jiān)測(cè)DNA提取及熒光PCR整個(gè)過(guò)程，18s-rRNA體系的建立同上，引物、探針序列如下上游引物序列18s-rRNAl403ucctgagaaacggctaccat下游引物序列18s-rRNA1449rcgtgtcaggattgggtaat探針序列18s-rRNA1423fbFAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-TAMRA核酸提取試劑與方法有關(guān)，可使用傳統(tǒng)的植物DNA提取方法，例如CTAB法，也可采用Promega公司的Wizard Magnetic DNA Purification System for Food試劑盒(CatFF3750，200tests)。
Pat試劑盒組成

試劑盒中各組分配方PatPCR反應(yīng)液取合格25mmol/L MgCl2、100mmol/L dATP、100mmol/L dUTP、100mmol/L dGTP、100mmol/L dCTP、50umol/L Pat上游引物、50umol/L Pat下游引物、50umol/L Pat探針、10×PCR緩沖液、1U/ul UNG和純化水，按以下配方配制PCR反應(yīng)液。


CTAB法樣本處理試劑配方

18s-rRNA PCR反應(yīng)液取合格25mmol/L MgCl2、100mmol/L dATP、100mmol/L dUTP、100mmol/L dGTP、100mmol/L dCTP、50umol/L 18s-rRNA上游引物、50umol/L 18s-rRNA下游引物、50umol/L 18s-rRNA探針、10×PCR緩沖液、1U/ul UNG和純化水，按以下配方配制PCR反應(yīng)液。

其中，UNG是UNG酶(尿嘧啶-N-糖苷酶)Uracil-N-glycosylase純化水的制備用自來(lái)水一次蒸餾，經(jīng)過(guò)Millipore MILLI-Q PF PLUS純水儀純化，收取電阻率≥18.0MΩ.cm的水，貯于無(wú)菌瓶中。
陽(yáng)性對(duì)照品的制備取相應(yīng)的陽(yáng)性樣品，CTAB法樣本處理試劑提取DNA，將上述制備好的DNA，用比檢測(cè)反應(yīng)擴(kuò)增片段更長(zhǎng)的引物擴(kuò)增(用dTTP而非dUTP)，采用Promega公司的Wizard PCRPreps DNA Purification System試劑盒純化上述PCR產(chǎn)物中的目的核酸片段，再用1.5％瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行粗略定量，然后用Promega公司的PGEM-TEasy Vector System II試劑盒將目的片段與T載體相連接；再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細(xì)胞，然后用X-Gal和IPTG瓊脂平板篩選克隆目的菌落，PCR反應(yīng)鑒定之。用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)粒的擴(kuò)增。最后用Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNAPurification System試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的提純，仍以1.5％瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)提純的質(zhì)粒進(jìn)行純度檢測(cè)，合格者為陽(yáng)性對(duì)照品母液。用1X TE進(jìn)行大量稀釋。
稀釋的質(zhì)粒，用合格試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，取Ct值在28～30者，留置大量，用做配試劑盒，也用做暫定的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品。
自備設(shè)備及試劑水浴鍋，離心機(jī)；氯仿、異丙醇(-20℃預(yù)冷)、70％乙醇(-20℃預(yù)冷)適用儀器PE Gene Amp7700熒光PCR檢測(cè)儀或其次她合適的熒光PCR儀保存與有效期測(cè)試樣本處理試劑置室溫保存，其他試劑置-20℃保存，避免反復(fù)凍融。自檢定合格之日起有效期為12個(gè)月。連續(xù)生產(chǎn)的三批試劑盒檢定合格之日起在試劑盒要求的儲(chǔ)存溫度下保存，每個(gè)月按成品檢定規(guī)程檢測(cè)一次，一直到14個(gè)月時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)均合格，因此確定試劑盒有效期為12個(gè)月。
使用方法樣本核酸提取1.1 CTAB法提取DNA1.1.1 稱取100mg充分粉碎后的植物樣品放入2ml離心管中，加800ul CTAB緩沖液，混勻后于65℃溫育30分鐘；1.1.2 15500g離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上層液至含400ul氯仿的管中，混勻30秒，再以15500g離心10分鐘直至液相分層，吸取上層液至干凈離心管中；1.1.3 加入2V CTAB沉淀緩沖液，室溫下溫育60分鐘；1.1.4 混合液以15500g離心5分鐘，棄上清；1.1.5 加入500ul沉淀溶解液溶解沉淀，并加入500ul氯仿，混勻30秒后以15500g離心10分鐘；1.1.6 轉(zhuǎn)移上清至另一新管中，加入0.6倍體積異丙醇，充分混勻后15500g離心10分鐘，棄上清液；1.1.7 加入70％乙醇500ul于含有沉淀的小管中，小心混勻洗滌管壁后離心10分鐘(15500g)，棄上清；1.1.8 室溫干燥，然后將DNA溶解在100ul無(wú)菌去離子水中(如果樣本DNA當(dāng)天不使用，請(qǐng)于-20℃保存)。
1.2 Promega法提取DNA的步驟(備選)原方法樣本稱取量為200mg。根據(jù)本公司的經(jīng)驗(yàn)，此量極難混勻，故將樣本稱取量改為100mg，其后的試劑用量和操作步驟則完全按原方法進(jìn)行。
2. 試劑配制(PCR前準(zhǔn)備區(qū))
從試劑盒中取出各管試劑，室溫融化，2000rpm離心5秒。
a)設(shè)Pat PCR所需要的管數(shù)為n(n＝樣本數(shù)×2+1管空白對(duì)照+1管Pat陽(yáng)性對(duì)照品)；b)設(shè)18s-rRNA PCR所需要的管數(shù)為m(m＝樣本數(shù)×2+1管空白對(duì)照+1管18s-rRNA陽(yáng)性對(duì)照品)；每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表PatPCR反應(yīng)體系 PatPCR反應(yīng)液34.6ul Taq酶0.4ul UNG 0.06ul18s-rRNA反應(yīng)體系18s-rRNA PCR反應(yīng)液34.6ul Taq酶0.4ul UNG 0.06ul計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向設(shè)定的n個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入Pat PCR反應(yīng)液各35ul；向設(shè)定的m個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入18s-rRNA PCR反應(yīng)液反應(yīng)液各35ul，一同轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
2.1 加樣(樣本處理區(qū))若樣本DNA保存在-20℃，先置室溫解凍。
在各設(shè)定的PCR反應(yīng)管中，分別加入上述樣本DNA溶液、純化水(空白對(duì)照)和相應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照品各5ul，蓋好PCR反應(yīng)管蓋，轉(zhuǎn)移至檢測(cè)區(qū)，置于定量PCR檢測(cè)儀上并記錄樣本擺放順序。
2.2. PCR擴(kuò)增(檢測(cè)區(qū))2.2.1 循環(huán)條件設(shè)置37℃5min；95℃3min；95℃15sec，60℃1min 40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系設(shè)為40ul。
(不同的熒光PCR儀循環(huán)條件可能略有調(diào)整)2.2.2 儀器檢測(cè)通道選擇所有PCR反應(yīng)管熒光信號(hào)收集設(shè)為Fam熒光通道。
具體設(shè)置方法請(qǐng)參照儀器使用說(shuō)明書(shū)。
3. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)Pat空白對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性；Pat陽(yáng)性對(duì)照品的Ct值≤32.0；18s-rRNA空白對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性；18s-rRNA陽(yáng)性對(duì)照品的Ct值≤30.0；上述指標(biāo)有一項(xiàng)不符合者，應(yīng)重做PCR擴(kuò)增。
4. 結(jié)果判斷4.1. 閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，使陰性對(duì)照品成陰性結(jié)果為準(zhǔn)。
4.2. 待測(cè)樣本18s-rRNA Ct值應(yīng)該≤17.0，如果不在此范圍，則需重新提取樣本DNA，重做PCR擴(kuò)增。
4.3. 將同一樣品兩個(gè)平行管的Ct值取平均值，做為判斷用的待測(cè)樣品Ct值。
4.4. 待測(cè)樣本Pat測(cè)定Ct值等于40.0者，報(bào)Pat基因序列陰性(其他熒光PCR儀對(duì)陰性的表示也可能為0.0或空白無(wú)數(shù)值)。
4.5. 待測(cè)樣本Pat測(cè)定Ct值≤34.0，報(bào)Pat基因序列陽(yáng)性。
4.6. 如果34.0＜待測(cè)樣本Pat基因測(cè)定Ct值＜40.0，需重新做PCR擴(kuò)增。
如再次擴(kuò)增結(jié)果Pat基因測(cè)定Ct值仍＜40.0，報(bào)Pat基因序列陽(yáng)性。
如再次擴(kuò)增結(jié)果Pat基因測(cè)定Ct值等于40.0，則報(bào)Pat基因序列陰性。
試劑盒使用注意事項(xiàng)有關(guān)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范請(qǐng)嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門(mén)頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。
實(shí)施例1選取轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因的農(nóng)產(chǎn)品如大豆、玉米、油菜、番茄、土豆，以Promega磁珠法提取基因組DNA，具體為稱重100mg植物材料，置于2ml離心管中；加入500ul LysisBuffer A和5ul RNase A，與材料混勻；加入250ul Lysis Buffer B，混勻，室溫放置10分鐘；加入750ul沉淀緩沖液，混勻后高速離心(13000×g)10分鐘；吸取上清于干凈的2ml離心管中，加入50ul磁粉液，混勻；混合液中加入0.8體積異丙醇，混勻，室溫放置5分鐘；將離心管置于磁架上1分鐘，去澄清液；取出離心管，再加入250ul Lysis Buffer B，混勻后置于磁架上1分鐘，去澄清液；用1ml 70％乙醇清洗磁粉，置于磁架上1分鐘，去澄清液；步驟重復(fù)2次；取出離心管，于65℃干浴鍋中干燥5分鐘或室溫下干燥15-30分鐘；離心管中加入100ul去離子水，混勻后于65℃干浴鍋中孵育5分鐘，再移至磁架上1分鐘，吸取澄清液于0.5ml干凈離心管中，做為DNA模板備用。
用該試劑盒做熒光PCR檢測(cè)，具體為40ul反應(yīng)體系中，加入植物基因組DNA 5ul，進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，具體反應(yīng)條件同前。經(jīng)檢測(cè)，上述轉(zhuǎn)入Pat基因轉(zhuǎn)基因作物均呈陽(yáng)性擴(kuò)增，其檢測(cè)靈敏度均可達(dá)到0.1％；而非轉(zhuǎn)基因的農(nóng)產(chǎn)品如普通玉米、白玉米等均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，提示該引物對(duì)具有良好的靈敏度和特異性(具體見(jiàn)圖一)。
試劑盒靈敏度為0.1％GMO，將0.1％的標(biāo)準(zhǔn)品做5倍稀釋后，仍可檢測(cè)到目標(biāo)片段。
試劑盒精密性測(cè)試公司中3位技術(shù)熟練的操作人員在3個(gè)不同時(shí)間，各做3次精密性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(總計(jì)9次)，每次平行處理10份精密性參比品。對(duì)每10次所得的Ct值用Microsoft Excel分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，得出平均值和10個(gè)Ct值的CV值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ct值的CV值在5.0％以下，表明該試劑盒有良好的精密性。
試劑盒特異性測(cè)試該試劑盒對(duì)陰性大豆、玉米、油菜、馬鈴薯標(biāo)本均無(wú)非特異性擴(kuò)增，表明該試劑盒具有良好的特異性。
對(duì)于所有植物DNA均應(yīng)該擴(kuò)增。按本試劑盒的方法提取DNA，其Ct值在9至25之間。
發(fā)明效果經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選，得到最佳組合為上游引物PAT1u；下游引物PAT173r；探針PAT65tdB。
以0.1％轉(zhuǎn)基因油菜籽提取的DNA做模板，得到的Ct值在29.0-33.0之間，這是目前不同熒光測(cè)定儀器的可靠檢測(cè)下限；而0.1％的檢測(cè)靈敏度已經(jīng)達(dá)到了目前國(guó)際同類產(chǎn)品的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。
該試劑盒中的引物探針還可以用作雜交探針檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物。
PCR-ELISA的方法學(xué)原理簡(jiǎn)介該實(shí)驗(yàn)要設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物和一條探針，它們均與模板DNA鏈互補(bǔ)，且探針的結(jié)合部位在引物結(jié)合部位之間。將PCR的一條引物5’端標(biāo)記上熒光素(Fluorescein)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物帶有熒光素標(biāo)記。同時(shí)將探針的5’端標(biāo)記上生物素(Biotin)，酶聯(lián)板上包被有親和素(Avidin)，通過(guò)生物素與親和素的親和作用，將探針包被在酶聯(lián)板上。檢測(cè)時(shí)，將擴(kuò)增產(chǎn)物變性成單鏈，在酶聯(lián)板上與探針進(jìn)行特異的結(jié)合，洗板，再加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的熒光素抗體，通過(guò)顯色劑顯色，在酶標(biāo)板上讀取OD值，根據(jù)OD值判斷樣品的陰陽(yáng)性。
實(shí)施例2將上述探針PAT65tdB的5’端標(biāo)記生物素，3’端不做標(biāo)記；將引物PAT173r的5’端標(biāo)記上熒光素。預(yù)先將探針包被在有親和素的酶聯(lián)板上。
按常規(guī)方法(CTAB法或磁珠法)提取樣本中的DNA。由10×PCR緩沖液、dNTPs、Mg2+、Taq酶、上下游引物、H2O，以及DNA模板組成PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增。
擴(kuò)增結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物變性成單鏈，加到包被了探針的酶聯(lián)板上，如果有特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中的一條鏈與探針雜交，洗板，加入酶聯(lián)熒光素抗體，洗板，加入顯色劑，顯色10分鐘，停止顯色，在酶標(biāo)儀上讀取OD值，根據(jù)OD值判斷樣本的陰陽(yáng)性。下表


實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明只要含有PAT基因序列的轉(zhuǎn)基因作物經(jīng)該系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而不含有PAT基因序列的作物經(jīng)該系統(tǒng)檢測(cè)均為陰性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.本試劑盒對(duì)于轉(zhuǎn)入Pat基因的轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1％，說(shuō)明本試劑盒具有良好的靈敏度。
2.本試劑盒對(duì)于非轉(zhuǎn)基因的農(nóng)產(chǎn)品如大豆、玉米等均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，說(shuō)明本試劑盒具有良好的特異性。
3.由于本試劑盒采用了熒光PCR作為檢測(cè)方法，整個(gè)反應(yīng)均閉管進(jìn)行，避免了其他核酸檢測(cè)方法如PCR-電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽(yáng)性。
4.由于本試劑盒采用了植物內(nèi)源基因18S-rRNA作為內(nèi)標(biāo)，避免了假陰性的產(chǎn)生。
5.由于本方法對(duì)PCR產(chǎn)物實(shí)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，節(jié)約了人力物力。
備注英文字母表示的引物探針的名稱、引物探針的序列、基因的名稱等大小寫(xiě)通用；“Ct值”的英文全稱為“Threshold Cycles”，意指熒光值超過(guò)閾值時(shí)所處的循環(huán)數(shù)。在不同熒光PCR儀上有不同的名稱，但含義是一樣的。
附錄一


附錄二GTCGACATGTCTCCGGAGAGGAGACCAGTTGAGATTAGGCCAGCTACAGCAGCTGATATGGCCGCGGTTPAT 1uPAT65tdB CCATTACATTGAGACGTCTACAGTGAACTTTAGGACAGAGCCACAAACACCACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGTTGCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTTPAT 173rGTGGCTGGTATTGCTTACGCTGGGCCCTGGAAGGCTAGGAACGCTTACGATTGGACAGTTGAGAGTACTGTTTACGTGTCACATAGGCATCAAAGGTTGGGCCTAGGATCCACATTGTACACACATTTGCTTAAGTCTATGGAGGCGCAAGGTTTTAAGTCTGTGGTTGCTGTTATAGGCCTTCCAAACGATCCATCTGTTAGGTTGCATGAGGCTTTGGGATACACAGCCCGGGGTACATTGCGCGCAGCTGGATACAAGCATGGTGGATGGCATGATGTTGGTTTTTGGCAAAGGGATTTTGAGTTGCCAGCTCCTCCAAGGCCAGTTAGGCCAGTTACCCAGATCTGA
序列表<110>國(guó)家出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)所深圳市匹基生物工程股份有限公司<120>熒光PCR定性檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物探針序列及試劑盒<130><160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>1tggccgcggt ttgtgatatc gttaa25<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2gtcgacatgt ctccggagag 20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>3gcaaccaacc aagggtatc 19<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>4tgcgcgcctg ctgccttcct 20<210>5<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>5cctgagaaac ggctaccat 19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>6cgtgtcagga ttgggtaat 19
權(quán)利要求
1.一種熒光PCR定性檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物探針序列，其特征在于所述的探針序列包括序列TGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA向上游延伸5個(gè)堿基、向下游延伸5個(gè)堿基的區(qū)域內(nèi)形成的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光PCR定性檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物探針序列，其特征在于所述的探針序列為T(mén)GGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒光PCR定性檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物探針序列做成的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒的組成為核酸提取試劑核酸擴(kuò)增試劑Pat PCR反應(yīng)液(定性)18s-rRNA PCR反應(yīng)液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)純化水對(duì)照品Pat陽(yáng)性對(duì)照品18s-rRNA陽(yáng)性對(duì)照品其中，PatPCR反應(yīng)液的上游引物序列為GTCGACATGTCTCCGGAGAG，下游引物序列GCAACCAACCAAGGGTATC其中18s-rRNA上游引物序列cctgagaaacggctaccat，下游引物序列cgtgtcaggattgggtaat，探針序列TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種熒光PCR定性檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物探針序列做成的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒的組成為組成成份(48tests/盒)體積CTAB法核酸提取試劑CTAB緩沖液 40ml×1管CTAB沉淀緩沖液 40ml×1管沉淀溶解液 24ml×1管核酸擴(kuò)增試劑PatPCR反應(yīng)液(定性) 1ml×2管18s-rRNA PCR反應(yīng)液 1ml×2管Taq酶(5U/ul) 40ul×1管UNG(1U/ul) 10ul×1管純化水 100ul×1管對(duì)照品Pat陽(yáng)性對(duì)照品 30ul×1管18s-rRNA陽(yáng)性對(duì)照品 30ul×1管試劑盒中各組分配方PatPCR反應(yīng)液為10×buffer 1×MgCl22.5mMdNTPs(u) 200uMTaq酶(檢測(cè)時(shí)另加) (2U)Pat上游引物0.2uMPat下游引物0.2uMPat探針0.1uM模板(檢測(cè)時(shí)另加) (5ul)水終體積(ul) 40ul18s-rRNA PCR反應(yīng)液試劑成份 終濃度10×buffer 1×MgCl22.5mMdNTPs(u) 200uMTaq酶(檢測(cè)時(shí)另加)(2U)18s-rRNA上游引物 0.2uM18s-rRNA下游引物 0.2uM18s-rRNA探針 0.1uM模板(檢測(cè)時(shí)另加) (5ul)水終體積(ul)40ulCTAB法樣本處理試劑配方為CTAB緩沖液20g CTAB/L，1.4M NaCl，0.1M Tris/HCl，20mM EDTA(ph＝8.0)CTAB沉淀緩5g CTAB/L，0.04M NaCl沖液沉淀溶解液 1.2M NaCl
5.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒光PCR定性檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物探針序列，其特征在于所述的探針用作雜交探針檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物。
全文摘要
一種熒光PCR定性檢測(cè)含有Pat基因轉(zhuǎn)基因作物探針序列及試基盒，所述的探針序列包括序列TGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA向上游延伸5個(gè)堿基、向下游延伸5個(gè)堿基的區(qū)域內(nèi)形成的序列。所述的試劑盒組成為核酸提取試劑；核酸擴(kuò)增試劑，所述的核酸擴(kuò)增試劑包括PatPCR反應(yīng)液、18s－rRNAPCR反應(yīng)液、Taq酶(5U/ul)、UNG(1U/ul)；對(duì)照品等。本試劑盒對(duì)于轉(zhuǎn)入Pat基因轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1％，本試劑盒還具有良好的特異性。由于本試劑盒采用了植物內(nèi)源基因18S－rRNA作為內(nèi)標(biāo)，避免了假陰性的產(chǎn)生，由于本方法對(duì)PCR產(chǎn)物實(shí)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，節(jié)約了人力物力。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1485439SQ0213129
公開(kāi)日2004年3月31日 申請(qǐng)日期2002年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月24日
發(fā)明者朱文斯, 朱水芳, 黃茜華 申請(qǐng)人:深圳市匹基生物工程股份有限公司, 國(guó)家出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)所