專利名稱：一段陰道加德納氏桿菌dna序列(3)特異性的確定及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一段陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)DNA序列(3)特異性的確定及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)是一種婦女陰道經(jīng)常感染的病原物，準(zhǔn)確的診斷是進(jìn)行即時而可靠的治療的依據(jù)，目前只能根據(jù)臨床指征進(jìn)行診斷。PCR和基因芯片診斷是一種快速而準(zhǔn)確的檢測方法。而這一類的診斷方法依賴于獲得特異的核酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，確定了一段陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)特異核苷酸序列及其PCR引物。該序列和相應(yīng)的PCR引物可用于建立基因芯片和PCR方法進(jìn)行陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)的診斷。
本發(fā)明的技術(shù)方案為本發(fā)明利用現(xiàn)有的方法確定了長度為198bp的一段陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)特異DNA序列(3)及其PCR引物，用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其序列如下tttcgccaac ttcaggatct gctgcagaaa tagttgcagt agctgcaatc tgatccttcg 60tttcaacatc cttagcagat gcgagaagtt ccttaacaat tgcttctgaa gccttttcaa 120ttccgcgacg aagagcaatc gggttgctac cagcaacaac attctttaag ccttcgtgca 180ccagagattg agccaaca198引物序列為1.5’-tgttggctcaatctctggtg-3’2.5’-tttcgccaacttcaggatct-3’上述的陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)特異DNA序列(3)用于診斷陰道加德納氏桿菌的基因芯片的探針序列，并通過上述的引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，標(biāo)記后進(jìn)行雜交檢測或直接用于PCR診斷。
用本發(fā)明建立的臨床檢測技術(shù)所使用的方法具有快速、準(zhǔn)確、操作簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為臨床標(biāo)本的PCR擴(kuò)增圖譜。
圖2、圖2續(xù)是測序圖。其中圖2是測定的序列、圖2續(xù)是原始測序圖譜。
圖3是用Blast軟件對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果與預(yù)計(jì)序列的比較分析。
圖4、圖4續(xù)是基因數(shù)據(jù)庫中Blast搜索結(jié)果。
圖5為基因芯片雜交結(jié)果。
具體實(shí)施例方式首先以陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)為關(guān)鍵詞，在基因數(shù)據(jù)庫中搜索陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)的核苷酸序列。共獲得數(shù)條關(guān)系較密切的核苷酸序列，將這些核苷酸序列用NCBI網(wǎng)上的Blast在線使用軟件比對基因數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列(nr)，排出非特異性的核苷酸序列，獲得了1Kb特異性的核苷酸序列。以這段序列設(shè)計(jì)了20余對PCR引物，以臨床標(biāo)本提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選到一對適合進(jìn)行PCR擴(kuò)增的序列及引物，PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物與預(yù)計(jì)大小一致(見圖1，圖中序號1為標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA，分子量大小從上至下分別為622，527，404，309，242/238，217，201，190，180，160+160，147+147，123；2.4.5為臨床陰性標(biāo)本，沒有擴(kuò)增產(chǎn)物；3為臨床陽性標(biāo)本，擴(kuò)增產(chǎn)物很純，大小200左右，與預(yù)計(jì)大小一致。圖譜結(jié)果顯示用本發(fā)明中的引物能特異的擴(kuò)增臨床樣品)，然后用T-vector進(jìn)行克隆，并測序(測序報告見圖2、圖2續(xù)，圖中從59位開始，到256位，共198bp為克隆序列，其余序列為克隆載體序列)，序列為198bp，通過Blast軟件比對預(yù)計(jì)序列，顯示與預(yù)計(jì)的序列一致(見圖3，圖中除第59位由c改變成t外，第137位由a改變成外，其余均與預(yù)計(jì)序列一致)，表明該序列可以被特異性的擴(kuò)增，可用于陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)PCR檢測。序列用NCBI網(wǎng)站的Blast搜索基因數(shù)據(jù)庫的DNA(包含cDNA)序列，該序列只與陰道加德納氏桿菌(Gardnerellavaginalis)的序列一致，而與其它的物種序列沒有同源性見圖4、圖4續(xù)，圖中搜尋結(jié)果表明，只有陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)的質(zhì)粒DNA序列與本序列同源，并且是完全配對，有一段約70bp的序列同源，也是陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)的序列。而其它的序列只有40字符左右的短序列，由于這些序列沒有引物與此配對，故在檢測中不會被檢測到。用這一序列標(biāo)記后作為探針與含有9種泌尿生殖道感染病原物的45個基因位點(diǎn)的基因芯片雜交，只有本發(fā)明序列與此有雜交信號，而其它所有序列與此無雜交信號(見圖5，圖中是4個重復(fù)，每個重復(fù)含9種泌尿生殖道感染性疾病病原物共45個不同的位點(diǎn)和4個對照位點(diǎn)。雜交結(jié)果表明只有本序列有特異信號，而其它均無雜交信號)，表明該序列為陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)的特異序列。
本發(fā)明可用于PCR方法或基因芯片方法進(jìn)行陰道加德納氏桿菌(Gardnerellavaginalis)的臨床檢測。用本發(fā)明提供的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR方法獲得產(chǎn)物是否出現(xiàn)和大小判斷是否為陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)感染。也可用本序列為探針，作為基因芯片中的一個檢測位點(diǎn)，然后用本發(fā)明中的PCR引物序列擴(kuò)增臨床標(biāo)本，并標(biāo)記后進(jìn)行雜交檢測。<110>昆明寰基生物芯片開發(fā)有限公司<120>一段陰道加德納氏桿菌DNA序列(3)特異性的確定<140><141><160>1<210>1<211>198<212>DNA<213>陰道加德納氏桿菌(Gardnerella vaginalis)<220><221>gene<222>(1)…(198)<400>1tttcgccaac ttcaggatct gctgcagaaa tagttgcagt agctgcaatc tgatccttcg 60tttcaacatc cttagcagat gcgagaagtt ccttaacaat tgcttctgaa gccttttcaa 120ttccgcgacg aagagcaatc gggttgctac cagcaacaac attctttaag ccttcgtgca 180ccagagattg agccaaca198
權(quán)利要求
1.一段陰道加德納氏桿菌DNA序列(3)特異性的確定，其特征在于該序列的長度為198bp，其序列及PCR引物如下tttcgccaac ttcaggatct gctgcagaaa tagttgcagt agctgcaatc tgatccttcg 60tttcaacatc cttagcagat gcgagaagtt ccttaacaat tgcttctgaa gccttttcaa 120ttccgcgacg aagagcaatc gggttgctac cagcaacaac attctttaag ccttcgtgca 180ccagagattg agccaaca198引物序列為1.5’-tgttggctcaatctctggtg-3’2.5’-tttcgccaacttcaggatct-3’
2.一段陰道加德納氏桿菌DNA序列(3)特異性的應(yīng)用，其特征在于該序列用于診斷陰道加德納氏桿菌的基因芯片的探針序列，并通過上述的引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，標(biāo)記后進(jìn)行雜交檢測或直接用于PCR診斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一段陰道加德納氏桿菌DNA序列(3)特異性的確定及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過基因數(shù)據(jù)庫資料的搜尋和分析，確定了一段陰道加德納氏桿菌DNA序列(3)的特異性及PCR擴(kuò)增引物，該序列長度為198bp。通過對婦女生殖道陰道加德納氏桿菌感染標(biāo)本的PCR擴(kuò)增、克隆，獲得該序列，測序證明與預(yù)計(jì)序列一致。再經(jīng)生物信息學(xué)方法分析，基因芯片雜交分析，結(jié)果證實(shí)了該序列對于陰道加德納氏桿菌的特異性。本發(fā)明作為基因芯片診斷的探針及PCR擴(kuò)增檢測序列，用于陰道加德納氏桿菌的診斷。用本發(fā)明建立的臨床檢測技術(shù)所使用的方法具有快速、準(zhǔn)確、操作簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK1493698SQ0213340
公開日2004年5月5日 申請日期2002年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月2日
發(fā)明者譚德勇, 朱寶生 申請人:昆明寰基生物芯片開發(fā)有限公司