專利名稱：發(fā)酵生產(chǎn)門冬酰胺酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，更具體地說是關(guān)于一種發(fā)酵生產(chǎn)門冬酰胺酶的方法。
背景技術(shù)：
門冬酰胺酶是治療急性淋巴白血病的重要藥物，在治療小兒急性淋巴細(xì)胞白血病中有著不可替代的作用。國內(nèi)現(xiàn)有的生產(chǎn)門冬酰胺酶技術(shù)存在很多不足，主要是①發(fā)酵效價低(10單位/毫升)，生產(chǎn)成本過高而不適合市場的要求，②發(fā)酵效價高的只局限于基因工程菌，且分離提純技術(shù)達(dá)不到要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種高效表達(dá)生產(chǎn)門冬酰胺酶的方法。
本發(fā)明的方法包括平板培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)，具體工藝過程如下(1)平板培養(yǎng)將凍干的大腸桿菌菌種用水溶解后，涂布至凝固有培養(yǎng)基的平皿上于36-40℃培養(yǎng)10-36小時；(2)種子罐培養(yǎng)將(1)中已長好的平皿菌種接入種子罐中，在36-40℃，轉(zhuǎn)速250-500轉(zhuǎn)/分，風(fēng)量1∶0.3-1∶1.2體積/體積/分的條件下，培養(yǎng)10-16小時；(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)將(2)中已培養(yǎng)好的種子罐菌種接入發(fā)酵罐中，接種量為10-30％，在36-40℃，轉(zhuǎn)速180-350轉(zhuǎn)/分，風(fēng)量1∶0.3-1∶1.2體積/體積/分，pH 6.5-7.5的條件下，培養(yǎng)10-16小時；其中平板培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的組分及重量百分含量為牛肉膏2-6％、無機(jī)鹽0.1-2％、瓊脂0.5-2.5％、pH 6.5-7.5；其中種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)所用的液體培養(yǎng)基的組分及重量百分含量為牛肉膏2-6％、玉米漿0.5-4％、酵母粉0.5-2.5％、味精1-3％、pH 6.5-7.5。
本發(fā)明的方法中，平板培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的組分及重量百分含量的優(yōu)選方案為牛肉膏3-5％、NaCl 0.5-1.5％、瓊脂1-2％、pH6.5-7.5；種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)所用的液體培養(yǎng)基的組分及重量百分含量的優(yōu)選方案為牛肉膏3-5％、玉米漿1-3％、酵母粉1-2％、味精1.5-2.2％，pH 6.5-7.5。
本發(fā)明中對所使用的大腸桿菌菌種可以是野生的大腸桿菌菌種，也可以是經(jīng)過化學(xué)或物理誘變的大腸桿菌菌種，誘變因子為常規(guī)的處理因子，如紫外線(UV)，氯化鋰(LiCl)等。
利用本發(fā)明的方法，門冬酰胺酶的產(chǎn)酶單位達(dá)到50-80單位/毫升，生產(chǎn)門冬酰胺酶針劑原材料成本大大降低。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的方法作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1(1)平板培養(yǎng)準(zhǔn)備10個平皿，牛皮紙包好，滅菌備用。按牛肉膏3.5％，NaCl 1％，瓊脂1.2％，pH 6.8的配方，配300毫升培養(yǎng)基，裝在500毫升三角瓶中，滅菌，冷卻至70℃，倒平皿(30毫升/皿)，凝固，待用。將凍干的大腸桿菌野生菌種用200微升無菌水溶解，取100微升至平皿中涂布，在39℃下，培養(yǎng)14小時。
(2)種子罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)配方牛肉膏3.5％，玉米漿2％，酵母粉1％，味精1.5％，pH 6.8。
種子罐采用100升罐，以裝量為60升計(jì)，則應(yīng)按上述配方配60升培養(yǎng)基(實(shí)際只加水至55升，預(yù)算滅菌后的蒸汽冷凝水為5升)，配好培養(yǎng)基后加入100升罐中，滅菌，待溫度下降至40℃時，接入已長好的3個平皿菌種(用無菌水稍沖洗)，控制溫度39℃，轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分，風(fēng)量1∶1體積/體積/分，培養(yǎng)時間14小時。
(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵采用500升發(fā)酵罐，實(shí)際裝量為300升，減去種子罐菌種60升，實(shí)際配培養(yǎng)基量為300-60＝240升，按步驟(2)中所述配方，配240升培養(yǎng)基裝于500升罐中，滅菌，冷卻至40℃時，把已培養(yǎng)好的種子罐菌種接入500升罐內(nèi)，控制溫度39℃，轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分，風(fēng)量1∶1體積/體積/分，pH 7.0，13小時后離心，收集菌體，即得門冬酰胺酶粗品。發(fā)酵效價為60單位/毫升。
實(shí)施例2(1)平板培養(yǎng)準(zhǔn)備10個平皿，牛皮紙包好，滅菌備用。按牛肉膏4％，NaCl 1％，瓊脂1.5％，pH 7.0的配方，配300毫升培養(yǎng)基，裝在500毫升三角瓶中，滅菌，冷卻至70℃，倒平皿(30毫升/皿)，凝固，待用。將凍干的經(jīng)紫外線(UV)誘變的大腸桿菌菌種用200微升無菌水溶解，取100微升至平皿中涂布，在39℃下，培養(yǎng)14小時。
(2)種子罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)配方牛肉膏4％，玉米漿2％，酵母粉1.5％，味精1.8％，pH 7.0。
種子罐采用100升罐，以裝量為60升計(jì)，則應(yīng)按上述配方配60升培養(yǎng)基(實(shí)際只加水至55升，預(yù)算滅菌后的蒸汽冷凝水為5升)，配好培養(yǎng)基后加入100升罐中，滅菌，待溫度下降至40℃時，接入已長好的3個平皿菌種(用無菌水稍沖洗)，控制溫度39℃，轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分，風(fēng)量1∶1體積/體積/分，培養(yǎng)時間14小時。
(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵采用500升發(fā)酵罐，實(shí)際裝量為300升，減去種子罐菌種60升，實(shí)際配培養(yǎng)基量為300-60＝240升，按本實(shí)施例步驟(2)中所述配方，配240升培養(yǎng)基裝于500升罐中，滅菌，冷卻至40℃時，把已培養(yǎng)好的種子罐菌種接入500升罐內(nèi)，控制溫度39℃，轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分，風(fēng)量1∶1體積/體積/分，pH 7.0，13小時后離心，收集菌體，即得門冬酰胺酶粗品。發(fā)酵效價為78單位/毫升。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)門冬酰胺酶的方法，包括平板培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)，其特征在于(1)平板培養(yǎng)將凍干的大腸桿菌菌種用水溶解后，涂布至凝固有培養(yǎng)基的平皿上于36-40℃培養(yǎng)10-36小時；(2)種子罐培養(yǎng)將(1)中已長好的平皿菌種接入種子罐中，在36-40℃，轉(zhuǎn)速250-500轉(zhuǎn)/分，風(fēng)量1∶0.3-1∶1.2體積/體積/分的條件下，培養(yǎng)10-16小時；(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)將(2)中已培養(yǎng)好的種子罐菌種接入發(fā)酵罐中，接種量為10-30％，在36-40℃，轉(zhuǎn)速180-350轉(zhuǎn)/分，風(fēng)量1∶0.3-1∶1.2體積/體積/分，pH6.5-7.5的條件下，培養(yǎng)10-16小時；其中平板培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的組分及重量百分含量為牛肉膏2-6％、無機(jī)鹽0.1-2％、瓊脂0.5-2.5％、pH 6.5-7.5；其中種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)所用的液體培養(yǎng)基的組分及重量百分含量為牛肉膏2-6％、玉米漿0.5-4％、酵母粉0.5-2.5％、味精1-3％、pH 6.5-7.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)門冬酰胺酶的方法，其特征在于平板培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的組分及重量百分含量為牛肉膏3-5％、NaCl 0.5-1.5％、瓊脂1-2％、pH 6.5-7.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)門冬酰胺酶的方法，其特征在于種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)所用的液體培養(yǎng)基的組分及重量百分含量為牛肉膏3-5％、玉米漿1-3％、酵母粉1-2％、味精1.5-2.2％，pH 6.5-7.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)門冬酰胺酶的方法，其特征在于所述的大腸桿菌菌種可以是野生型的，也可以是經(jīng)過化學(xué)或物理誘變的大腸桿菌菌種。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)門冬酰胺酶的方法。以大腸桿菌為出發(fā)菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，在適合的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，能使門冬酰胺酶獲得高效表達(dá)，產(chǎn)酶單位為50－80單位/毫升。使用本發(fā)明的方法生產(chǎn)門冬酰胺酶針劑，原材料成本大大降低。
文檔編號C12N9/78GK1397645SQ0213457
公開日2003年2月19日 申請日期2002年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月19日
發(fā)明者梁淑娃, 彭中健, 杜少平, 楊冠東 申請人:廣州市微生物研究所