專利名稱：一個(gè)超強(qiáng)融合啟動(dòng)子及其融合方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)超強(qiáng)啟動(dòng)子及其融合方法與應(yīng)用，屬于真核基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)研究領(lǐng)域。將該啟動(dòng)子構(gòu)建入植物表達(dá)載體可以驅(qū)動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中高效表達(dá)。
本發(fā)明的超強(qiáng)融合啟動(dòng)子是由以下方法獲得的
利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法將農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上mas核心啟動(dòng)子(-189至+65)擴(kuò)增克隆，在克隆載體中的mas啟動(dòng)子片段用Hind III、Xba I雙酶切，電泳回收目的片段。同時(shí)將pBI121質(zhì)粒同樣用Hind III、Xba I進(jìn)行雙酶切，電泳回收剩余的載體片段。將pBI121質(zhì)粒酶切剩余的載體片段與克隆載體中的mas啟動(dòng)子片段用Hind III、Xba I雙酶切后的回收片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過酶切鑒定篩選出重組子，重組子命名為pMAS。同樣利用PCR方法將農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上ocs增強(qiáng)子(-294至-116)擴(kuò)增克隆，將在克隆載體中的ocs增強(qiáng)子片段用Hind III單酶切，電泳回收目的片段。同時(shí)將pBIMAS質(zhì)粒同樣用Hind III進(jìn)行單酶切，電泳回收剩余的載體片段。將pMAS質(zhì)粒酶切剩余的載體片段與克隆載體中的ocs增強(qiáng)子片段用Hind III單酶切后的回收片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過酶切鑒定篩選出重組子并測(cè)序，得到的不同拷貝數(shù)ocs增強(qiáng)元件以不同方向和mas核心啟動(dòng)子融合的啟動(dòng)子。
通過凍融法將含有融合啟動(dòng)子的pOMS系列表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，在含有羧芐和卡那霉素的MS培養(yǎng)基上篩選抗性植株，然后將其移到生根培養(yǎng)基上生根，最后移栽到基質(zhì)中在溫室中長大。取轉(zhuǎn)基因煙草底部第五片葉片150mg進(jìn)行GUS酶活檢測(cè)。檢測(cè)表明pOMS4融合啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)活性比CaMV 35S啟動(dòng)子顯著提高，在葉片組織中其活性比CaMV35S啟動(dòng)子高47倍，在根組織中高23倍，增強(qiáng)效果顯著。說明我們構(gòu)建成功了一個(gè)效果優(yōu)良的通用融合啟動(dòng)子及其植物表達(dá)載體。
本發(fā)明的超強(qiáng)融合啟動(dòng)子pOMS4是由4個(gè)ocs增強(qiáng)子片段順向與mas核心啟動(dòng)子連接而成，具有SEQ ID NO.1的所示的序列序列表(1)SEQ ID NO.1的信息(a)序列特征*長度970堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈型*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性*ocs增強(qiáng)子(-294至-116)數(shù)目4個(gè)*ocs增強(qiáng)子(-294至-116)方向正向*mas核心啟動(dòng)子(-189至+65)數(shù)目1個(gè)*mas核心啟動(dòng)子(-189至+65)方向正向(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(f)序列描述SEQ ID NO.1AAGCTTGGATCCCTGAAAGCGACGTTGGATGTTAACATCTACAAATTGCCTTTTCTTATC 60GACCATGTACGTAAGCGCTTACGTTTTTGGTGGACCCTTGAGGAAACTGGTAGCTGTTGT 120GGGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTACGATGGGGGCATCGC 180ACCGAAGCTTGGATCCCTGAAAGCGACGTTGGATGTTAACATCTACAAATTGCCTTTTCT 240TATCGACCATGTACGTAAGCGCTTACGTTTTTGGTGGACCCTTGAGGAAACTGGTAGCTG 300TTGTGGGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTACGATGGGGGCA 360TCGCACCGAAGCTTGGATCCCTGAAAGCGACGTTGGATGTTAACATCTACAAATTGCCTT 420TTCTTATCGACCATGTACGTAAGCGCTTACGTTTTTGGTGGACCCTTGAGGAAACTGGTA 480GCTGTTGTGGGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTACGATGGG 540GGCATCGCACCGAAGCTTGGATCCCTGAAAGCGACGTTGGATGTTAACATCTACAAATTG 600CCTTTTCTTATCGACCATGTACGTAAGCGCTTACGTTTTTGGTGGACCCTTGAGGAAACT 660GGGTAGCCTGTTGTGGGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTAC 720GATGGGGGCATCGCACCGAAGCTTCCAACTTTTTCTTGATCCGCAGCCATTAACGACTTT 780TGAATAGATACGCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTCAAAAGTGTACCAAACAACGCTTTA 840CAGCAAGAACGGAATGCGCGTGACGCTCGCGGTGACGCCATTTCGCCTTTTCAGAAATGG 900ATAAATAGCCTTGCTTCCTATTATATCTTCCCAAATTACCAATACATTACACTAGCATCT 960GAATTTCATAACCAATCTCGATACACCAAATCGATGAGATCT 1002將該超強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建入植物表達(dá)載體可以驅(qū)動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)。當(dāng)用oms4替換植物表達(dá)載體pBI121中的35S啟動(dòng)子，可以使外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的平均表達(dá)水平在葉和根中分別提高47倍和23倍。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用一種簡便高效的方法融合得到的啟動(dòng)子能高效驅(qū)動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)，適合構(gòu)建高效植物表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)基因研究和產(chǎn)業(yè)化，能顯著提高轉(zhuǎn)基因效果和植物基因工程產(chǎn)品的產(chǎn)量。
序列表<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一個(gè)超強(qiáng)融合啟動(dòng)子及其融合方法與應(yīng)用<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1002<212>DNA<213>Agrobacterium tumefaciens<221>ocs<222>(1)..(744)<221>mas<222>(745)..(1002)<400>1aagcttggat ccctgaaagc gacgttggat gttaacatct acaaattgcc ttttcttatc 60gaccatgtac gtaagcgctt acgtttttgg tggacccttg aggaaactgg tagctgttgt120gggcctgtgg tctcaagatg gatcattaat ttccaccttc acctacgatg ggggcatcgc180accgaagctt ggatccctga aagcgacgtt ggatgttaac atctacaaat tgccttttct240tatcgaccat gtacgtaagc gcttacgttt ttggtggacc cttgaggaaa ctggtagctg300ttgtgggcct gtggtctcaa gatggatcat taatttccac cttcacctac gatgggggca360tcgcaccgaa gcttggatcc ctgaaagcga cgttggatgt taacatctac aaattgcctt420ttcttatcga ccatgtacgt aagcgcttac gtttttggtg gacccttgag gaaactggta480gctgttgtgg gcctgtggtc tcaagatgga tcattaattt ccaccttcac ctacgatggg540ggcatcgcac cgaagcttgg atccctgaaa gcgacgttgg atgttaacat ctacaaattg600ccttttctta tcgaccatgt acgtaagcgc ttacgttttt ggtggaccct tgaggaaact660gggtagcctg ttgtgggcct gtggtctcaa gatggatcat taatttccac cttcacctac720gatgggggca tcgcaccgaa gcttccaact ttttcttgat ccgcagccat taacgacttt780tgaatagata cgctgacacg ccaagcctcg ctagtcaaaa gtgtaccaaa caacgcttta840cagcaagaac ggaatgcgcg tgacgctcgc ggtgacgcca tttcgccttt tcagaaatgg900ataaatagcc ttgcttccta ttatatcttc ccaaattacc aatacattac actagcatct960gaatttcata accaatctcg atacaccaaa tcgatgagat ct 100權(quán)利要求
1.一個(gè)超強(qiáng)融合啟動(dòng)子oms4，其特征在于具有SEQ ID NO 1所示的序列(1)SEQ ID NO.1的信息(a)序列特征*長度1002堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈型*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性*ocs增強(qiáng)子(-294至-116)數(shù)目4個(gè)*ocs增強(qiáng)子(-294至-116)方向正向*mas核心啟動(dòng)子(-189至+65)數(shù)目1個(gè)*mas核心啟動(dòng)子(189至+65)方向正向(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(f)序列描述SEQ ID NO.1AAGCTTGGATCCCTGAAAGCGACGTTGGATGTTAACATCTACAAATTGCCTTTTCTTATC 60GACCATGTACGTAAGCGCTTACGTTTTTGGTGGACCCTTGAGGAAACTGGTAGCTGTTGT 120GGGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTACGATGGGGGCATCGC 180ACCGAAGCTTGGATCCCTGAAAGCGACGTTGGATGTTAACATCTACAAATTGCCTTTTCT 240TATCGACCATGTACGTAAGCGCTTACGTTTTTGGTGGACCCTTGAGGAAACTGGTAGCTG 300TTGTGGGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTACGATGGGGGCA 360TCGCACCGAAGCTTGGATCCCTGAAAGCGACGTTGGATGTTAACATCTACAAATTGCCTT 420TTCTTATCGACCATGTACGTAAGCGCTTACGTTTTTGGTGGACCCTTGAGGAAACTGGTA 480GCTGTTGTGGGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTACGATGGG 540GGCATCGCACCGAAGCTTGGATCCCTGAAAGCGACGTTGGATGTTAACATCTACAAATTG 600CCTTTTCTTATCGACCATGTACGTAAGCGCTTACGTTTTTGGTGGACCCTTGAGGAAACT 660GGGTAGCCTGTTGTGGGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTAC 720GATGGGGGCATCGCACCGAAGCTTCCAACTTTTTCTTGATCCGCAGCCATTAACGACTTT 780TGAATAGATACGCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTCAAAAGTGTACCAAACAACGCTTTA 840CAGCAAGAACGGAATGCGCGTGACGCTCGCGGTGACGCCATTTCGCCTTTTCAGAAATGG 900ATAAATAGCCTTGCTTCCTATTATATCTTCCCAAATTACCAATACATTACACTAGCATCT 960GAATTTCATAACCAATCTCGATACACCAAATCGATGAGATCT 1002
2.如權(quán)利要求1所述的強(qiáng)融合啟動(dòng)子的融合方法，其特征在于選用mas核心啟動(dòng)子(-189至+65)和ocs增強(qiáng)子(-294至-116)融合，得到一系列含有不同拷貝數(shù)不同插入方向的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草，檢測(cè)外源基因的表達(dá)強(qiáng)度，從中篩選到一個(gè)超強(qiáng)啟動(dòng)子。
3.如權(quán)利要求1所述的強(qiáng)融合啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于將該超強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建入植物表達(dá)載體可以驅(qū)動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)，當(dāng)用oms4替換植物表達(dá)載體pBI121中的35S啟動(dòng)子，可使外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的平均表達(dá)水平在葉和根中分別提高47倍和23倍，適用于高效表達(dá)載體的構(gòu)建。
全文摘要
一個(gè)超強(qiáng)融合啟動(dòng)子及其融合方法與應(yīng)用，屬于真核基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)超強(qiáng)啟動(dòng)子及其表達(dá)載體的研制及其應(yīng)用，利用四個(gè)拷貝的ocs增強(qiáng)子元件正向重復(fù)連接到mas啟動(dòng)子核心片段上構(gòu)成新的超強(qiáng)啟動(dòng)子oms4啟動(dòng)子。將該超強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建入植物表達(dá)載體，即用oms4啟動(dòng)子替換掉植物表達(dá)載體pBI121中的35S啟動(dòng)子構(gòu)建成pOMS4(附

圖1)，以pBI121作為對(duì)照，轉(zhuǎn)化煙草。經(jīng)GUS酶活檢測(cè)該啟動(dòng)子可使外源基因gus基因的平均表達(dá)水平比對(duì)照在葉中提高47倍，在根中提高23倍，證明oms4啟動(dòng)子是一個(gè)超強(qiáng)啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)，可以代替35S啟動(dòng)子應(yīng)用于植物基因工程的研究和產(chǎn)業(yè)化。
文檔編號(hào)C12N15/67GK1401775SQ0213553
公開日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2002年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月13日
發(fā)明者鄭成超, 劉石娟, 楊國棟 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)