專利名稱：一種高效純化基因工程菌重組表達(dá)產(chǎn)物的工藝及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程領(lǐng)域，涉及一種高效純化基因工程重組表達(dá)產(chǎn)物的工藝，主要是通過添加表面活性物質(zhì)等助溶劑克服重組表達(dá)產(chǎn)物的聚合問題。
干擾素是一種細(xì)胞因子，它是細(xì)胞對(duì)病毒感染應(yīng)答中產(chǎn)生的一種具有抗病毒活性的蛋白質(zhì)。按其來源不同，干擾素可以分為α干擾素(主要由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生)、β干擾素(由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生)、γ干擾素(主要由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生)。人α干擾素還有各種亞型，至今已發(fā)現(xiàn)了20多種，α2干擾素是其中最主要的一種亞型。
人α干擾素具有抗病毒，抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，是臨床上療效確切，應(yīng)用面廣和市場(chǎng)需求量大的基因工程產(chǎn)品。人們最早采用細(xì)胞工程的方法生產(chǎn)人α干擾素，采用仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)一種淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。用這種方法生產(chǎn)干擾素產(chǎn)量低、成本高，很難大量供應(yīng)?；蚬こ碳夹g(shù)的出現(xiàn)為大量制備廉價(jià)的人α干擾素創(chuàng)造了條件，最先建成的人α干擾素基因工程表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌系統(tǒng)(Nagata，S.et al.Nature284，361-320，1980；Goeddel，D.V.et al.，Nature 287411-416，1980)，用大腸桿菌表達(dá)的人α2a干擾素和人α2b干擾素都已在1986年上市。但是，大腸桿菌表達(dá)的人α干擾素均為細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)以包含體形式存在，為了取得活性好的干擾素，需要經(jīng)過復(fù)雜的變性和復(fù)性過程。另外，由于大腸桿菌會(huì)產(chǎn)生對(duì)人體有害的內(nèi)毒素，在用大腸桿菌生產(chǎn)人α干擾素時(shí)，必須作很大的努力去清除內(nèi)毒素。這些都給大規(guī)模生產(chǎn)帶來困難。一些用大腸桿菌生產(chǎn)的干擾素常常會(huì)發(fā)生副作用，在大劑量使用時(shí)問題更為嚴(yán)重。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因工程表達(dá)系統(tǒng)與大腸桿菌系統(tǒng)相比雖然晚了近十年，但是，由于酵母菌是單細(xì)胞的真核生物，它在操作上與大腸桿菌一樣簡單，但它具有真核生物的基本特性。另外，幾個(gè)世紀(jì)來，酵母一直被用來進(jìn)行食品發(fā)酵，證明其不產(chǎn)生任何對(duì)人體有害的物質(zhì)。1982年英國Tuite等首先用PGK1啟動(dòng)子在釀酒酵母中表達(dá)了人α2a干擾素(Tuite，M.F.et al.，EMBO Journal，1603-608，1982.)。他們采用的是胞內(nèi)表達(dá)方式，分離純化步驟極其復(fù)雜。1983年美國Hitzeman等用干擾素基因的信號(hào)序列來指導(dǎo)其在酵母菌中的分泌表達(dá)，他們發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽加工不均一，所以表達(dá)的干擾素N端不均一(Hitzeman，Ronald A et al.，Science，219420-425，1983)。1984年美國Singh等改用酵母α因子基因的信號(hào)序列指導(dǎo)了人α干擾素的分泌表達(dá)，但是表達(dá)量僅達(dá)108IU/L(Singh，A.et al.，Nucleic Acids Research 12(23)8927-8938，1984)。1986年美國Zsebo等用酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)了IFN-Con基因，結(jié)果表明僅有不足5％表達(dá)的干擾素在培養(yǎng)液中，95％以上的干擾素仍留在菌體內(nèi)(Zsebo，K.M.et al.，J.Biological Chemistry，2815858-5895，1986.)。發(fā)明人等曾在1990年成功地構(gòu)建了一個(gè)穩(wěn)定性高的酵母載體pHC11，并利用PGK1啟動(dòng)子-α因子前導(dǎo)順序和ADH1終止子建成了高效分泌表達(dá)人α2a干擾素的工程菌DC04/pHC11-IFN2a，表達(dá)量可達(dá)到1.02×1010IU/L(霍克克等，中國科學(xué)B輯，1992年，922-929，1992)。但是，將表達(dá)人α2a干擾素的酵母工程菌DC04/pHC11-IFN2a在豐富培養(yǎng)基YEPD中發(fā)酵，將發(fā)酵液通過截留分子量為10萬的超濾膜過濾、濃縮、透析。然后將發(fā)酵液、濾出液和透析后的濃縮液進(jìn)行凝膠電泳分析。分析結(jié)果表明濾出液只有很少量的干擾素，而在透析后的濃縮液中且含有大量的干擾素(

圖1)，說明極大部分的干擾素以分子量大于10萬的聚合體存在。這種聚合體可能是由干擾素自身聚合而成，也可能是由干擾素與雜蛋白聚合而成。
將上述發(fā)酵液進(jìn)行各種柱層析技術(shù)分離，再對(duì)洗脫液各個(gè)組分進(jìn)行凝膠電泳分析，可以發(fā)現(xiàn)在洗脫的各個(gè)峰中均有人α2a干擾素存在，人α2a干擾素的純化得率非常低。因此，要提高得率首先要解決干擾素的解聚問題。
本發(fā)明提出的純化基因工程菌重組表達(dá)產(chǎn)物的方法，是在培養(yǎng)發(fā)酵階段通過添加表面活性物質(zhì)助溶劑，以解決重組表達(dá)產(chǎn)物的聚合問題。并相應(yīng)建立了一條操作簡單、收得率高的純化重組表達(dá)產(chǎn)物的工藝路線。通過該方法，重組表達(dá)產(chǎn)物的純化得率可達(dá)44％左右。
本發(fā)明中所述的基因工程菌包括基因工程菌包括基因工程修飾過的細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞等。
本發(fā)明中所述的基因工程菌重組表達(dá)產(chǎn)物包括任何用途的蛋白質(zhì)和多肽，包括但不限于蛋白質(zhì)藥物、疫苗、工業(yè)和農(nóng)業(yè)用蛋白質(zhì)等。
本發(fā)明中，所述的助溶劑包括但不限于Tween(吐溫)系列的表面活性劑。
本發(fā)明中，所述的聚合包括重組表達(dá)產(chǎn)物自身聚合以及與其他物質(zhì)的聚合。
本發(fā)明中，所述的基因工程菌是酵母，表達(dá)產(chǎn)物是人α干擾素。
上述酵母通常用釀酒酵母，其表達(dá)產(chǎn)物是分泌表達(dá)的人α干擾素。
上述助溶劑通常用Tween-20，濃度范圍為培養(yǎng)基的萬分之五到千分之六。
本發(fā)明對(duì)由酶母分泌表達(dá)的人α2a干擾素進(jìn)行高效分離純化。其方法步驟如下1、工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)將表達(dá)人α2a干擾素的釀酒酵母工程菌DC04/pHC11-IFN2a接種在20ml補(bǔ)加腺嘌呤的基本培養(yǎng)液中，30℃左右下培養(yǎng)16-18小時(shí)后，作為種子液轉(zhuǎn)接到的YEPD培養(yǎng)液(每升培養(yǎng)液含有蛋白胨20g，酵母抽提物10g、葡萄糖20g、腺嘌呤20mg和吐溫-201ml)中，30℃下培養(yǎng)48小時(shí)。此時(shí)發(fā)酵液的細(xì)胞密度約為OD60020-24。在培養(yǎng)液中添加吐溫后，吐溫在培養(yǎng)液中的濃度一般為千分之六到萬分之五，幾乎所有分泌表達(dá)的人α2a干擾素都可以通過截留分子量為10萬的超濾膜。
2、人α2a干擾素的分離純化a、離心除菌，收集上清液；b、CM-SepharoseFF陽離子交換柱層析I將離心收集所得的上清液用HAc調(diào)pH至3.4-5.4，然后上樣至已用50mM pH4.4醋酸緩沖液平衡好的陽離子交換柱上(CM-SepharoseFF 2.6/10cm)，用同樣緩沖液將未結(jié)合到介質(zhì)上的蛋白質(zhì)洗去，直至280nm吸收降到最低，用200mM醋酸緩沖液洗脫結(jié)合在介質(zhì)上的部分雜蛋白，當(dāng)吸收峰再次下降到最低時(shí)，再用400mM醋酸緩沖液進(jìn)一步洗脫，收集到的各個(gè)分部用15％濃度的SDS-PAGE分析確定含目標(biāo)蛋白質(zhì)人α2a干擾素的組分，然后將它們合并；c、CM-SepharoseFF陽離子交換柱層析II將前面所得的含有人α2a干擾素的收集液上樣到用100mM醋酸緩沖液平衡好的CM-SepharoseFF(1.6/4cm)柱上，用同樣緩沖液洗去沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)，直至280nm吸收降至最低時(shí)，再用300mM醋酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集的各個(gè)分部通過15％濃度的SDS-PAGE分析確定含目標(biāo)蛋白質(zhì)人α2a干擾素的組分，然后將它們合并；d、Sephadex75凝膠過濾層析首先將Sephadex75凝膠柱(2.0/60cm)用含有150mMNaCl的磷酸緩沖液平衡，然后將前面所得的含有人α2a干擾素的收集液分批上樣，用同樣的緩沖液洗脫，收集的各個(gè)分部通過15％濃度的SDS-PAGE分析確定含目標(biāo)蛋白質(zhì)人α2a干擾素的組分，然后將它們合并。
圖2在培養(yǎng)液中添加0.1％吐溫后，幾乎所有分泌表達(dá)的人α2a干擾素都可以通過截留分子量為10萬的超濾膜。
圖3陽離子交換柱CM-SepharoseFF層析(I)圖譜。圖中箭頭I上樣；箭頭II洗滌；箭頭III洗脫1；箭頭IV洗脫2數(shù)字為管號(hào)。
圖4陽離子交換柱CM-SepharoseFF層析(I)干擾素各組分的電泳分析。圖中128號(hào)管；230號(hào)管；333號(hào)管；435號(hào)管；537號(hào)管；639號(hào)管；741號(hào)管；843號(hào)管；945號(hào)管；1047號(hào)管。
圖5陽離子交換柱CM-SepharoseFF層析(II)圖譜。圖中箭頭I上樣；箭頭II洗滌；箭頭III洗脫；數(shù)字為管號(hào)。
圖6陽離子交換柱CM-SepharoseFF層析(II)干擾素各組分的電泳分析。圖中m分子量標(biāo)準(zhǔn)；11號(hào)管；22號(hào)管；33號(hào)管；44號(hào)管；55號(hào)管；66號(hào)管；77號(hào)管；88號(hào)管；910號(hào)管。
圖7凝膠過濾柱Sephadex75層析圖譜。圖中箭頭上樣；數(shù)字為管號(hào)。
圖8凝膠過濾柱Sephadex75層析干擾素各組分的電泳分析。圖中112號(hào)管；213號(hào)管；314號(hào)管；415號(hào)管；516號(hào)管；617號(hào)管；718號(hào)管；820號(hào)管；922號(hào)管；1024號(hào)管。
圖9純化人α2a干擾素HPLC純度分析。
圖10純化人α2a干擾素的分子量測(cè)定。圖中A電泳圖譜B標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖11純化人α2a干擾素的等電聚焦分析。圖中，1等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)；2-5樣品。
圖12純化人α2a干擾素的紫外吸收光譜分析。
圖13純化人α2a干擾素的免疫印跡分析。圖中，1凝膠(柯馬斯亮蘭染色)；2轉(zhuǎn)移至PVDF膜；3TFN抗體反應(yīng)；4正常小鼠血清。
實(shí)施例酵母分泌表達(dá)的人α2a干擾素高效純化方法。
1、工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)將表達(dá)人α2a干擾素的釀酒酵母工程菌DCO4/pHC11-IFN2a接種在20ml補(bǔ)加腺嘌呤的基本培養(yǎng)液(每升培養(yǎng)液含有無氨基酸的酵母氮源6.7g、腺嘌呤20mg和葡萄糖20g)中，30℃下培養(yǎng)16-18小時(shí)后，作為種子液轉(zhuǎn)接到400ml的YEPD培養(yǎng)液(每升培養(yǎng)液含有蛋白胨20g，酵母抽提物10g、葡萄糖20g、腺嘌呤20mg和吐溫-201ml)中，30℃下培養(yǎng)48小時(shí)。此時(shí)發(fā)酵液的細(xì)胞密度約為OD60020-24。在培養(yǎng)液中添加0.1％吐溫后，幾乎所有分泌表達(dá)的人α2a干擾素都可以通過截留分子量為10萬的超濾膜。(圖2)2、人α2a干擾素的分離純化①離心除菌將發(fā)酵液以5,000rpm的速度，離心15分鐘，棄菌體，收集上清液。
②CM-SepharoseFF陽離子交換柱層析I將離心收集所得的上清液用37％HAc調(diào)pH至4.4。然后上樣至已用50mM pH4.4醋酸緩沖液平衡好的陽離子交換柱上(CM-SepharoseFF 2.6/10cm)，用同樣緩沖液將末結(jié)合到介質(zhì)上的蛋白質(zhì)洗去，直至280nm吸收降到最低，用200mM醋酸緩沖液洗脫結(jié)合在介質(zhì)上的部分雜蛋白。當(dāng)吸收峰再次下降到最低時(shí)，再用400mM醋酸緩沖液進(jìn)一步洗脫。收集到的各個(gè)分部用15％濃度的SDS-PAGE分析確定含目標(biāo)蛋白質(zhì)人α2a干擾素的組分，然后將它們合并。CM-SepharoseFF陽離子交換柱層析I的層析圖譜見圖3，樣品的SDS-PAGE圖譜見圖4。
③CM-SepharoseFF陽離子交換柱層析II將前面所得的含有人α2a干擾素的收集液上樣到用100mM醋酸緩沖液平衡好的CM-SepharoseFF(1.6/4cm)柱上，用同樣緩沖液洗去沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)，直至280nm吸收降至最低時(shí)，再用300mM醋酸緩沖液進(jìn)行洗脫。收集的各個(gè)分部通過15％濃度的SDS-PAGE分析確定含目標(biāo)蛋白質(zhì)人α2a干擾素的組分，然后將它們合并。CM-SepharoseFF陽離子交換柱層析II的層析圖譜見圖5，樣品的SDS-PAGE圖譜見圖6。
④Sephadex75凝膠過濾層析首先將Sephadex75凝膠柱(2.0/60cm)用含有150mM NaCl的磷酸緩沖液平衡，然后將前面所得的含有人α2a干擾素的收集液分批上樣，用同樣的緩沖液洗脫。收集的各個(gè)分部通過15％濃度的SDS-PAGE分析確定含目標(biāo)蛋白質(zhì)人α2a干擾素的組分，然后將它們合并。Sephadex75凝膠過濾層析的層析圖譜見圖7，樣品的SDS-PAGE圖譜見圖8。
采用上述純化工藝得到的人α2a干擾素的純度可達(dá)到99.6％左右，純化得率可達(dá)44％左右，干擾素的活性可達(dá)2.2×108IU/mg左右。表1是其中一次試驗(yàn)的結(jié)果。表1人α2a干擾素分離純化各步結(jié)果匯總
1.純化人α2a干擾素的鑒定①人α2a干擾素的抗病毒活性的測(cè)定采用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定，以Wish細(xì)胞/VSV為基本檢測(cè)系統(tǒng)，以中國藥品生物制品檢定所提供的參考品校準(zhǔn)為國際單位(IU)。
②純度分析(采用HPLC法)采用C18反相柱進(jìn)行分析。層析柱先用0.1％的三氟乙酸平衡，上樣后以1ml/min的流速，在40分鐘內(nèi)完成從0-100％乙晴的剃度洗脫，得到一個(gè)單峰(圖9)。
③分子量測(cè)定(采用SDS-PAGE法)用15％的SDS-PAGE將純化得到的人α2a干擾素樣品與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)電泳，顯色后測(cè)定各條蛋白質(zhì)帶的Rf值，經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理計(jì)算出人α2a干擾素的分子量為19.14kDa(圖10)。與理論值一致。
④等電點(diǎn)測(cè)定等電點(diǎn)的測(cè)定采用BioRad公司的微型等電聚焦儀(BioRadModel III Mini IEF Cell)進(jìn)行，所用pH5-7的兩性介質(zhì)系由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所試劑廠生產(chǎn)。測(cè)得的等電點(diǎn)為6.2(圖11)。
⑤紫外吸收光譜分析用UV260紫外吸收光譜儀在200-300nm范圍內(nèi)掃描。樣品的紫外吸收峰在279.2nm(圖12)。
⑥□免疫印跡分析人α2a干擾素樣品先進(jìn)行15％的SDS-PAGE電泳，然后采用BioRad公司的半干電泳轉(zhuǎn)移儀(BioRad Trans-Blot SD Semi-DryElectrophoretic Transfer Cell)將蛋白質(zhì)帶從電泳膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。免疫顯色所用的第一抗體為鼠抗人α2a干擾素單抗，第二抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG，顯色劑為二氨基聯(lián)苯胺(DAB)。通過免疫印跡證明樣品可以與人α2a干擾素單抗反應(yīng)(圖13)。
⑦□N端氨基酸序列分析采用BECKMAN公司LF3200蛋白/多肽氨基酸序列儀分析。分析表明人α2a干擾素的N端20個(gè)氨基酸的序列為CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQ。與天然的人α2a干擾素的N端序列一致。
權(quán)利要求
1.一種使基因工程菌重組表達(dá)產(chǎn)物高效純化的方法，其特征是在培養(yǎng)發(fā)酵階段通過添加助溶劑，使重組表達(dá)產(chǎn)物解聚合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說的基因工程菌包括基因工程修飾過的細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說的基因工程菌重組表達(dá)產(chǎn)物包括任何用途的蛋白質(zhì)和多肽，包括但不限于蛋白質(zhì)藥物、疫苗、工業(yè)和農(nóng)業(yè)用蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說的助溶劑包括但不限于Tween系列的表面活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說的聚合包括重組表達(dá)產(chǎn)物自身聚合以及與其他物質(zhì)的聚合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說的基因工程菌是酵母，其表達(dá)產(chǎn)物是人α干擾素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是所說的酵母是釀酒酵母，表達(dá)產(chǎn)物是分泌表達(dá)的人α干擾素。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所說的助溶劑為Tween-20，濃度范圍為培養(yǎng)基的萬分之五到千分之六。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是分離純化人α2a干擾素的工藝步驟如下(1)工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)將表達(dá)人α2a干擾素的釀酒酵母工程菌DC04/pHC11-IFN2a接種在20ml補(bǔ)加腺嘌呤的基本培養(yǎng)液中，30℃下培養(yǎng)16-18小時(shí)后，作為種子液轉(zhuǎn)接到Y(jié)EPD培養(yǎng)液中，30℃下培養(yǎng)48小時(shí)；在該培養(yǎng)液中添加有吐溫，其濃度為千分之六到萬分之五。(2)人α2a干擾素的分離純化a、離心除菌，收集上清液；b、CM-SepharoseFF陽離子交換柱層析I將離心收集所得的上清液用HAc調(diào)pH至3.4-5.4，然后上樣至已用50mM pH4.4醋酸緩沖液平衡好的陽離子交換柱上(CM-Sepharose FF2.6/10cm)，用同樣緩沖液將未結(jié)合到介質(zhì)上的蛋白質(zhì)洗去，直至280nm吸收降到最低，用200mM醋酸緩沖液洗脫結(jié)合在介質(zhì)上的部分雜蛋白，當(dāng)吸收峰再次下降到最低時(shí)，再用400mM醋酸緩沖液進(jìn)一步洗脫，收集到的各個(gè)分部用15％濃度的SDS-PAGE分析確定含目標(biāo)蛋白質(zhì)人α2a干擾素的組分，然后將它們合并；c、CM-SepharoseFF陽離子交換柱層析II將前面所得的含有人α2a干擾素的收集液上樣到用100mM醋酸緩沖液平衡好的CM-SepharoseFF(1.6/4cm)柱上，用同樣緩沖液洗去沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)，直至280nm吸收降至最低時(shí)，再用300mM醋酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集的各個(gè)分部通過15％濃度的SDS-PAGE分析確定含目標(biāo)蛋白質(zhì)人α2a干擾素的組分，然后將它們合并；d、Sephadex75凝膠過濾層析首先將Sephadex75凝膠柱(2.0/60cm)用含有150mMNaCl的磷酸緩沖液平衡，然后將前面所得的含有人α2a干擾素的收集液分批上樣，用同樣的緩沖液洗脫，收集的各個(gè)分部通過15％濃度的SDS-PAGE分析確定含目標(biāo)蛋白質(zhì)人α2a干擾素的組分，然后將它們合并。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效純化基因工程重組表達(dá)產(chǎn)物的方法及其試劑。使用表面活性劑等助溶劑克服重組表達(dá)產(chǎn)物的聚合問題，提高純化效率。使用層析系統(tǒng)和適當(dāng)?shù)姆蛛x純化條件提高了基因工程重組表達(dá)產(chǎn)物的分離效率。
文檔編號(hào)C12N1/19GK1408873SQ0213629
公開日2003年4月9日 申請(qǐng)日期2002年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月30日
發(fā)明者李育陽, 高卜渝 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)