專利名稱：基于標(biāo)記引物雜交的基因芯片技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因芯片技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種新的基于標(biāo)記引物雜交的基因芯片質(zhì)量控制的方法。
背景技術(shù)：
基因芯片是二十世紀(jì)九十年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)前沿生物技術(shù)。將大量的靶基因片段有序地、高密度地(點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離一般小于500微米)排列在玻璃、硅等載體上，稱之為基因芯片。
基因芯片可以用熒光檢測(cè)和計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的比較和分析，以達(dá)到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。
基因芯片的概念可追溯到Southern印跡雜交技術(shù)，即DNA-DNA之間通過(guò)堿基配對(duì)機(jī)制形成互補(bǔ)鏈。隨后又發(fā)展出Northern印跡雜交和點(diǎn)雜交技術(shù)。這三種技術(shù)都是將核酸樣品固定在濾膜上，樣品容易擴(kuò)散，因此在單位面積上點(diǎn)樣的密度受到限制，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模、高通量的DNA雜交。同時(shí)，由于濾膜面積較大而需較多探針量，檢測(cè)靈敏度較低。為了提高點(diǎn)樣密度和檢測(cè)靈敏度，降低探針用量，以玻璃、硅等材料為載體的基因芯片技術(shù)逐步得到了發(fā)展。
美國(guó)Affymetrix公司于二十世紀(jì)八十年代末至90年代初，率先開展了這方面的研究(Fodor SPA，Read JL，Pirrung MC，et al.Light-directed，spatiallyaddressable parallel chemical synthesis[J].Science，1991，251(4995)767-773；Fodor SPA，Rava RP，Huang XC，et al.Multiplexed biochemical assays withbiological chips[J].Nature，1993，364(6437)555-556.)。1992年，該公司運(yùn)用半導(dǎo)體照相平板技術(shù)，在約1平方厘米的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，誕生了世界上第一塊基因芯片。同時(shí)，探針的熒光標(biāo)記，激光共聚焦掃描和計(jì)算機(jī)分析等技術(shù)也隨之發(fā)展。1995年，第一塊以玻璃為載體的基因芯片(微矩陣)在美國(guó)Stanford大學(xué)誕生(Schena M，Shalon D，Dais R，et al.Quantitative monitoring ofgene expression patterns with a complementary DNA microarray[J].Science，1995，270(5235)467-470；Schena M，Shalon D，Heller R，et al.Parallel human genomeanalysismicroarray-based expression monitoring of 1000 genes[J].PNAS.USA，1996，93(20)10614-10619)，這標(biāo)志著基因芯片技術(shù)步入了廣泛研究和應(yīng)用的時(shí)期。
基因芯片從制作上可分為兩大類原位合成法(DNA chip)和微矩陣法(DNAmircoarray)，原位合成法由Affymetrix公司的Fodor等人發(fā)明，他們將半導(dǎo)體中的光蝕刻技術(shù)運(yùn)用到DNA合成化學(xué)中，用單核苷酸或其它生物大分子為底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，每次循環(huán)都有特定的核苷酸結(jié)合上去，直到設(shè)定的寡核苷酸長(zhǎng)度，每個(gè)寡核苷酸片段代表了一種特定的基因，存在于DNA芯片的特定位置上。微矩陣法最早由Stanford大學(xué)的P.Brown等人發(fā)明，將PCR等方法得到的cDNA用針點(diǎn)或噴點(diǎn)的方法直接排列到玻片等介質(zhì)上，從而制備成芯片。
原位合成的寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等優(yōu)點(diǎn)，適用于DNA序列測(cè)定、SNP分析等。但其缺點(diǎn)是合成寡聚核苷酸長(zhǎng)度有限，因而基因特異性差，而且隨長(zhǎng)度的增加合成錯(cuò)誤率隨之增高，作為基因表達(dá)譜研究遠(yuǎn)不如cDNA芯片。cDNA芯片是將微量cDNA片段在玻璃等載體上按矩陣密集排列并固化，也叫微矩陣(Microarray)。基因點(diǎn)樣密度雖不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用傳統(tǒng)載體，如混合纖維素濾膜或尼龍膜的點(diǎn)樣密度要高得多，可達(dá)到每張載玻片4萬(wàn)個(gè)基因。而cDNA芯片最大的優(yōu)點(diǎn)是靶基因檢測(cè)特異性非常好，用作表達(dá)譜研究結(jié)果可靠。目前許多國(guó)家實(shí)驗(yàn)室和大制藥公司都用此類芯片。
基因芯片最早是由于高通量、大規(guī)模研究基因功能的需求而產(chǎn)生的，但隨著基因芯片技術(shù)的日漸成熟，人們驚喜地發(fā)現(xiàn)基因芯片在傳染性疾病和遺傳病的診斷上有獨(dú)特的應(yīng)用前景和巨大的商業(yè)市場(chǎng)。感染性病原體診斷芯片就是將待測(cè)病原體的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成芯片，將從病人血清中抽提出病原體的DNA或RNA經(jīng)擴(kuò)增標(biāo)記螢光后與芯片進(jìn)行雜交，雜交信號(hào)由掃描儀掃描，再經(jīng)計(jì)算機(jī)分析，判斷陰陽(yáng)性。診斷芯片區(qū)別于其他檢測(cè)手段的優(yōu)越性在于(1)檢測(cè)樣品為各類致病基因片段，提高了檢測(cè)效率；(2)因無(wú)需機(jī)體免疫反應(yīng)，能及早診斷，且待測(cè)樣品用量較少；
(3)診斷芯片技術(shù)是DNA雜交技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的分子診斷方法，有極高的靈敏度、特異性和可靠性；(4)自動(dòng)化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
在疾病診斷方面，已有一些單一疾病基因診斷芯片產(chǎn)品上市，例如美國(guó)的Affymetrix公司已利用基因芯片進(jìn)行愛(ài)滋病病毒(HIV)的研究工作，并有商業(yè)化的GeneChip HIV PRT診斷芯片上市，用于愛(ài)滋病的早期診斷。
目前，基因芯片包括寡核苷酸芯片和cDNA芯片兩類，其技術(shù)中的幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括PCR制備靶基因，點(diǎn)樣及固定，探針制備和共同參照系統(tǒng)，雜交，檢測(cè)與分析。
由于不可能將大量基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行精確定量，加上PCR長(zhǎng)度不同，每個(gè)點(diǎn)的DNA固定率也略有差異，因此就不可能將芯片上的每個(gè)點(diǎn)控制在相同的拷貝數(shù)。另外，通常情況下靶基因的量并未達(dá)到飽和，因此雜交信號(hào)的絕對(duì)值并沒(méi)有意義，只能用于雙色熒光系統(tǒng)，測(cè)定兩種組織的表達(dá)差異(Wang K，Gan l，JefferyE et al.Monitoring gene expression profile changes in ovarian carcinomas usingcDNA microarray，Gene，1999，229(1-2)101～108；Wolf M，El-Rifai W，Tarkkanen M，et al(2000)Novel findings in gene expression detected in humanosteosarcoma by cDNA microarray.Cancer Genet Cytogenet 123(2)128-32)。當(dāng)cDNA芯片用于比較多種組織的表達(dá)譜分析時(shí)，只能采用共同參照的方法，即用多種細(xì)胞或組織的混合mRNA作對(duì)照，或用單種組織或細(xì)胞的mRNA作對(duì)照，將每個(gè)待測(cè)樣品與共同參照進(jìn)行雙色熒光雜交，對(duì)得到的熒光比值進(jìn)行聚類分析(Alizadeh AA，Eisen MB，Davis RE，et al.(2000)Distinct types of diffuse large B-celllymphoma identified by gene expression profiling.Nature，403(6769)503-11；Brown M，Grundy W，Lin D，et al.(2000)Knowledge-based analysis of microarraygene expression data by using support vector machines.PNAS，97(1)262-367.)。這些方法的缺陷是(1)缺乏大量的恒定的組織或細(xì)胞來(lái)源，因此不同次實(shí)驗(yàn)得到的混合mRNA誤差大，影響聚類結(jié)果；(2)即使是混合的mRNA，也有相當(dāng)數(shù)量的基因的mRNA未表達(dá)，因此在計(jì)算熒光比值時(shí)，大量基因的分母為零或分母太小，低于熒光值的線性范圍，使比值無(wú)意義或誤差太大，影響聚類分析；(3)細(xì)胞或組織的成本高，mRNA抽提成本高。
此外，目前的基因芯片技術(shù)中有一個(gè)很大的缺陷，就是沒(méi)有一種有效的方法對(duì)基因芯片的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。目前，常采用mRNA雜交進(jìn)行質(zhì)檢，但由于大量基因未表達(dá)或低表達(dá)而沒(méi)有或弱的雜交信號(hào)，從而影響質(zhì)檢結(jié)果判斷。以表達(dá)譜芯片為例，其質(zhì)量在一定程度上決定了表達(dá)譜試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。目前對(duì)所制造的表達(dá)譜質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控的方法通常都采用直接表達(dá)譜試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。該方法技術(shù)復(fù)雜，而且不能得到關(guān)于基因芯片表面DNA含量的直接信息。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的基因芯片參照系統(tǒng)以及質(zhì)量控制方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供了一種基于標(biāo)記引物雜交的基因芯片參照系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一目的是提供了基于標(biāo)記引物雜交的基因芯片質(zhì)量控制的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種核酸檢測(cè)的方法，包括步驟(a)用第一標(biāo)記物標(biāo)記通用引物；(b)用第二標(biāo)記物標(biāo)記源自樣品的cDNA探針；(c)將帶有第一標(biāo)記物的標(biāo)記的通用引物與帶有第二標(biāo)記物的標(biāo)記的cDNA探針混合，形成混合物；(d)將步驟(c)獲得的混合物與基因芯片雜交；(e)采集第一標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)和第二標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)，并將第一標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)作為共同參照，校正第二標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)，其中，第一標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)不同于第二標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)。
較佳地，步驟(b)中的cDNA探針是從mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄法制備的cDNA單鏈。
在一優(yōu)選例中，所述的可檢測(cè)信號(hào)是熒光。
在另一優(yōu)選例中，第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物中一者是Cy3，另一者是Cy5。
在另一優(yōu)選例中，步驟(d)中還包括用管家基因進(jìn)行數(shù)據(jù)校正(尤其是對(duì)多組數(shù)據(jù)進(jìn)行片間校正)。
在另一優(yōu)選例中中，所述的樣品為一個(gè)以上的樣品，即多樣品。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種基因芯片質(zhì)量檢測(cè)方法，包括步驟(i)用標(biāo)記物標(biāo)記通用引物；(ii)將標(biāo)記的通用引物與基因芯片上點(diǎn)樣的核酸雜交，形成雜交的復(fù)合物；(iii)檢測(cè)芯片上復(fù)合物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)。通過(guò)與一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(如無(wú)效點(diǎn)比例小于5％)比較，就可進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。
在一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)記物選自Cy3、Cy5、Cy3-dUPT，Cy5-dUPT，或其混合物。
在另一優(yōu)選例中中，所述的基因芯片是cDNA芯片。


圖1顯示了基于標(biāo)記引物雜交對(duì)1152點(diǎn)cDNA芯片進(jìn)行質(zhì)檢結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)可將通用的標(biāo)記引物用作雜交探針，提供一種標(biāo)準(zhǔn)的參照信號(hào)。這樣，就可以作為共同的參照系統(tǒng)和用于芯片的質(zhì)量控制。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
由于PCR制備靶基因時(shí)通常采用質(zhì)粒載體上的序列作通用引物進(jìn)行PCR，因此，cDNA芯片上的每一個(gè)點(diǎn)的DNA上都有通用引物序列，而且通用引物的拷貝數(shù)直接代表了cDNA芯片上的每一個(gè)點(diǎn)的DNA的拷貝數(shù)。將PCR通用引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過(guò)利用標(biāo)記引物與固定在基因芯片上的DNA片段雜交，其雜交信號(hào)的熒光強(qiáng)弱直接反應(yīng)了每個(gè)點(diǎn)的DNA的量的差異，從而達(dá)到對(duì)基因芯片表面所固定的DNA進(jìn)行定量的目的。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“通用引物序列”指制備cDNA芯片時(shí)所采用的質(zhì)粒載體上的一段序列。該段序列被設(shè)計(jì)作為通用引物，用于通過(guò)PCR反應(yīng)而擴(kuò)增出cDNA。應(yīng)理解，通用引物序列的具體序列取決于所用的質(zhì)粒載體。對(duì)于不同的質(zhì)粒載體，其通用引物序列可參見(jiàn)其質(zhì)粒圖譜或廠商提供的說(shuō)明書。例如，當(dāng)選用pBS質(zhì)粒時(shí)，通用引物序列可選自T3、T7啟動(dòng)子序列。最常用的通用引物序列包括T3、T7啟動(dòng)子序列、以及M13(+)、M13(-)通用引物序列。通用引物可以是一種引物，也可以多種通用引物的混合物。
本發(fā)明將標(biāo)記引物作為共同參照的核酸檢測(cè)方法，包括步驟(a)用第一標(biāo)記物標(biāo)記通用引物。
可用化學(xué)或酶法使通用引物帶有可檢測(cè)信號(hào)。例如，用化學(xué)方法將熒光分子修飾到通用引物上；或用酶法(如TdT酶)將帶可檢測(cè)信號(hào)(如熒光或同位素)轉(zhuǎn)移到引物上。
用于本發(fā)明的帶有可檢測(cè)信號(hào)的單核苷酸，可以帶有任何帶有可檢測(cè)信號(hào)(如熒光團(tuán)或同位素)。代表性的例子包括(但并不限于)Cy3，Cy5，Cy3-dUPT，Cy5-dUPT，或其混合物。
(b)用第二標(biāo)記物標(biāo)記源自樣品的cDNA探針。
待檢測(cè)的、源自樣品的cDNA探針也可用常規(guī)方法標(biāo)記。然而，第一標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)應(yīng)不同于第二標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)。
至于從樣品制備mRNA以及從mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA等操作，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
(c)形成標(biāo)記的通用引物和標(biāo)記的cDNA探針的混合物。
將帶有第一標(biāo)記物的標(biāo)記的通用引物與帶有第二標(biāo)記物的標(biāo)記的cDNA探針混合，即可形成混合物。
(d)將步驟(c)獲得的混合物與基因芯片雜交。
將基因芯片進(jìn)行變性處理(如熱變性)，然后用混合物與固定在基因芯片表面的DNA之間進(jìn)行雜交。熱變性和雜交的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
此外，在雜交之間，cDNA芯片宜經(jīng)過(guò)預(yù)雜交處理，例如用魚精DNA進(jìn)行預(yù)雜交。
(e)數(shù)據(jù)采集和處理采集第一標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)和第二標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)，并將第一標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)作為共同參照，校正第二標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)。通用引物與芯片上固定的核酸分子所形成的復(fù)合物，該復(fù)合物上的第一標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)不僅可用于校正同一芯片內(nèi)的各數(shù)據(jù)點(diǎn)，還可用于校正不同芯片之間的數(shù)據(jù)。
當(dāng)然，還可與其他方法，例如管家基因法，結(jié)合使用以便更精確地進(jìn)行校正。
與目前國(guó)際上基因芯片技術(shù)相比，本發(fā)明基于標(biāo)記引物雜交的參照系統(tǒng)具有主要以下優(yōu)點(diǎn)1.標(biāo)記引物容易獲得，一次可得到可做上千次的引物，而且重復(fù)性好，避免了cDNA雜交方法過(guò)程復(fù)雜，結(jié)果重復(fù)性差的問(wèn)題；2.引物雜交的熒光信號(hào)只跟靶基因的拷貝數(shù)有關(guān)，能更好地校正由于各種原因引起地靶基因之間量的不同，避免了mRNA雜交時(shí)熒光值太小或?yàn)榱愕那闆r，這對(duì)于質(zhì)檢和聚類分析都很重要。
3.操作簡(jiǎn)單，成功率高，實(shí)驗(yàn)成本大大降低，工作效率大大提高；4.數(shù)據(jù)的可靠性大大提高。
該方法不僅可用于cDNA芯片表達(dá)譜聚類分析的參照系統(tǒng)，還可以用于基因芯片的質(zhì)量監(jiān)控，解決了基因芯片制造過(guò)程中質(zhì)量無(wú)法監(jiān)控的難題，使得基因芯片在制造的標(biāo)準(zhǔn)化方面有了很大提高。
本發(fā)明的基因芯片質(zhì)量監(jiān)控方法包括以下步驟(i).引物標(biāo)記可用化學(xué)或酶法使通用引物帶有可檢測(cè)信號(hào)。例如，用化學(xué)方法將熒光分子修飾到通用引物上；或用酶法(如末端轉(zhuǎn)移酶(TdT酶))將帶可檢測(cè)信號(hào)(如熒光或同位素)轉(zhuǎn)移到引物上。
用于本發(fā)明的帶有可檢測(cè)信號(hào)的單核苷酸，可以帶有任何帶有可檢測(cè)信號(hào)(如熒光團(tuán)或同位素)。代表性的例子包括(但并不限于)Cy3，Cy5，Cy3-dUPT，Cy5-dUPT，或其混合物。
(ii).標(biāo)記的通用引物與基因芯片的雜交。
將cDNA芯片進(jìn)行變性處理(如熱變性)，然后用預(yù)先標(biāo)記熒光的引物與固定在基因芯片表面的DNA之間進(jìn)行雜交。熱變性和雜交的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
此外，在雜交之間，cDNA芯片宜經(jīng)過(guò)預(yù)雜交處理，例如用魚精DNA進(jìn)行預(yù)雜交。
(iii).數(shù)據(jù)采集和處理最后是用本領(lǐng)域熟知的手段進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。例如用芯片掃描儀進(jìn)行掃描，并用數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。并與一定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(如無(wú)效點(diǎn)比例小于5％)進(jìn)行比較。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1cDNA芯片質(zhì)量監(jiān)控(1)制備基因芯片用通用引物(T3或T7啟動(dòng)子序列)進(jìn)行cDNA的PCR反應(yīng)，并用這些PCR產(chǎn)物，通過(guò)常規(guī)基因芯片制造技術(shù)，制成含有1000-14000個(gè)基因的基因芯片。
(2)制備標(biāo)記的通用引物在50ul通用的標(biāo)記引物體系中含有HEPES 10mmol/L，pH 7.2；MgCl28mmol/L；DTT 0.1mmol/L；Cy3-dUTP(或Cy5-dUTP)10mmol/L；TdT酶10U；通用引物20uM。混合后，在PCR儀上設(shè)置反應(yīng)程序37℃，60分鐘。反應(yīng)后，進(jìn)行乙醇沉淀去掉未摻入的單核苷酸。
(3)質(zhì)量監(jiān)控具體試驗(yàn)方法如下將表達(dá)譜芯片放在100℃的反應(yīng)體系中變性2min，取出后放在無(wú)水乙醇中冷卻30s，然后取出在空氣中自然晾干。用含魚精DNA的雜交液進(jìn)行預(yù)雜交。然后將用過(guò)量濃度的cy3或者cy5標(biāo)記引物與預(yù)雜交處理過(guò)的cDNA進(jìn)行雜交，雜交條件為50℃，4小時(shí)(雜交液用量則視雜交面積大小而定)。雜交完成后，清洗基因芯片后即用ScanArray 4000掃描儀在70或75掃描強(qiáng)度下掃描。質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)為點(diǎn)的平均熒光信號(hào)大于3000，無(wú)效點(diǎn)比例小于5％即為合格片。
質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，點(diǎn)的平均信號(hào)大于3000，無(wú)效點(diǎn)比例小于5％，為合格片。此外，各點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度直接反映了該點(diǎn)DNA固定量的多少，如沒(méi)有信號(hào)，則表明該點(diǎn)沒(méi)有DNA，為無(wú)效點(diǎn)。
本實(shí)施例表明，本發(fā)明的標(biāo)記引物法能夠彌補(bǔ)直接進(jìn)行表達(dá)譜試驗(yàn)的不足。它不僅能夠?qū)Ρ磉_(dá)譜芯片點(diǎn)樣矩陣整齊度、大點(diǎn)數(shù)、溶點(diǎn)數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，更重要的是，使用通用引物進(jìn)行雜交時(shí)，還能夠?qū)蛐酒砻娓鼽c(diǎn)所固定的DNA量及均勻程度進(jìn)行度量。
實(shí)施例2作為共同參照體系表達(dá)譜數(shù)據(jù)聚類分析在本實(shí)施例中，將標(biāo)記的通用引物作為共同參照，矯正因靶基因量的差異引起的誤差，使芯片用于多個(gè)樣本之間的相似性比較。方法如下1.cDNA芯片用常規(guī)方法制備及預(yù)雜交，方法同實(shí)施例1；2.標(biāo)記的Cy3(或Cy5)通用引物(M13(+)或M13(-)通用引物序列)的制備在50ul反應(yīng)體系中含有HEPES 10mmol/L(pH 7.2)；MgCl28mmol/L；DTT0.1mmol/L；Cy3-dUTP(或Cy5-dUTP)100umol/L；TdT酶50U，根據(jù)靶基因載體序列設(shè)計(jì)的通用引物10uM。混合后，在PCR儀上設(shè)置反應(yīng)程序37℃，60分鐘。反應(yīng)后，進(jìn)行乙醇沉淀去掉未摻入的單核苷酸，制得3′端被標(biāo)記的通用引物；或者在合成通用引物時(shí)在其5′端直接引入標(biāo)記物Cy3(或Cy5)3.待測(cè)樣本mRNA的制備，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，及CDNA探針標(biāo)記。這些操作按照文獻(xiàn)Schena M，Shalon D，Dais R，et al.Quantitative monitoring of geneexpfession patterns with a complementary DNA microarray[J].Science，1995，270(5235)467-470中所述方法，用Cy5(或Cy3)進(jìn)行標(biāo)記；4.將標(biāo)記通用引物和標(biāo)記cDNA探針混合在一起。按照文獻(xiàn)Schena M，Shalon D，Dais R，et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with acomplementary DNA microarray[J].Science，1995，270(5235)467-470中所述方法進(jìn)行雜交及掃描；5.如果需要，可重復(fù)上述步驟，制備用于多個(gè)待測(cè)樣本的由標(biāo)記通用引物和標(biāo)記cDNA探針構(gòu)成的混合物，并雜交并掃描；6.數(shù)據(jù)處理和聚類分析，利用結(jié)合的通用引物所發(fā)出的熒光信號(hào)(第一信號(hào))來(lái)校正結(jié)合的cDNA探針?biāo)l(fā)出的熒光信號(hào)(第二信號(hào))，同時(shí)用管家基因?qū)Χ嘟M數(shù)據(jù)進(jìn)行片間校正作為對(duì)照，用統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行聚類分析。
結(jié)果表明，本發(fā)明的標(biāo)記的通用引物所發(fā)出的熒光信號(hào)，可用作共同參照系統(tǒng)校正因靶基因量的差異引起的誤差。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種核酸檢測(cè)的方法，其特征在于，包括步驟(a)用第一標(biāo)記物標(biāo)記通用引物；(b)用第二標(biāo)記物標(biāo)記源自樣品的cDNA探針；(c)將帶有第一標(biāo)記物的標(biāo)記的通用引物與帶有第二標(biāo)記物的標(biāo)記的cDNA探針混合，形成混合物；(d)將步驟(c)獲得的混合物與基因芯片雜交；(e)采集第一標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)和第二標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)，并將第一標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)作為共同參照，校正第二標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)，其中，第一標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)不同于第二標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)中的cDNA探針是從mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄法制備的cDNA單鏈。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可檢測(cè)信號(hào)是熒光。
4.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物中一者是Cy3，另一者是Cy5。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(d)中還包括用管家基因進(jìn)行數(shù)據(jù)校正。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的樣品為一個(gè)以上的樣品。
7.一種基因芯片質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于，包括步驟(i)用標(biāo)記物標(biāo)記通用引物；(ii)將標(biāo)記的通用引物與基因芯片上點(diǎn)樣的核酸雜交，形成雜交的復(fù)合物；(iii)檢測(cè)芯片上復(fù)合物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的標(biāo)記物選自Cy3、Cy5、Cy3-dUPT，Cy5-dUPT，或其混合物。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的基因芯片是cDNA芯片。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于標(biāo)記引物的基因芯片信號(hào)參照系統(tǒng)及核酸檢測(cè)的方法，該方法包括步驟(a)用第一標(biāo)記物標(biāo)記通用引物；(b)用第二標(biāo)記物標(biāo)記源自樣品的cDNA探針；(c)將標(biāo)記的通用引物與標(biāo)記的cDNA探針混合，形成混合物；(d)將步驟(c)獲得的混合物與基因芯片雜交；(e)采集第一標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)和第二標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)，并將第一標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)作為共同參照，校正第二標(biāo)記物發(fā)出的可檢測(cè)信號(hào)。該方法不僅可用于基因芯片技術(shù)中的共同參照系統(tǒng)，還可用于芯片的質(zhì)量控制。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1473942SQ02136439
公開日2004年2月11日 申請(qǐng)日期2002年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月9日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅, 李瑤, 裘敏燕 申請(qǐng)人:上海博星基因芯片有限責(zé)任公司