專利名稱：姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法。
姬松茸的主要活性成份是姬松茸多糖，多糖組份中以葡萄糖為主，以具有β-(1→6)側(cè)鏈的β-(1→3)葡聚糖為主要結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明，姬松茸多糖主要通過(guò)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，刺激干擾素的形成，激活機(jī)體內(nèi)自然殺傷細(xì)胞，促進(jìn)免疫球蛋白、白細(xì)胞介素的生成，提高淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率等而發(fā)揮其抗腫瘤作用，在基因水平上有較強(qiáng)的抗化學(xué)誘變作用，可用于慢性乙型肝炎及惡性腫瘤放化療后乏力，白細(xì)胞減少，免疫功能降低的綜合治療。
本發(fā)明提供了一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法。該方法包括下列步驟(1)姬松茸的育種與特征用組織分離法獲得姬松茸純菌株AB103，將其接種在PDA或麥芽汁固定斜面培養(yǎng)基上，于25～28℃恒溫培養(yǎng)7～10天后，置于4℃左右的冰箱中保存?zhèn)溆?。采用紫外誘變法對(duì)菌絲細(xì)胞進(jìn)行誘變，紫外照射距離為20～30cm，照射時(shí)間為5～15秒。初篩誘變株在固體培養(yǎng)基上的菌絲體生長(zhǎng)能力，復(fù)篩誘變株在液體培養(yǎng)基中菌絲體生長(zhǎng)量和多糖肽產(chǎn)量，獲得優(yōu)質(zhì)菌株AB103-51。該菌株分類命名為巴西蘑菇(姬松茸)Agaricus blazei，該菌株已于2002年7月16日保存于中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心的編號(hào)為CGMCCNo.07722001325B。并于2002年7月16日檢測(cè)結(jié)果為存活。
固體培養(yǎng)用40～50％的稻草(或木屑、棉子殼)、1％的蔗糖或葡萄糖、10～20的麩皮或米糠、1％的石膏或碳酸鈣，加水拌勻，含水量60％，PH自然，瓶裝，在1.5kg/m2的壓力下滅菌1小時(shí)，冷卻后，在無(wú)菌操作下?lián)u瓶種子接種于固體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)溫度22～26℃，20～30天菌絲體布滿全瓶。原基萌發(fā)后，降低栽培溫度22～25℃，保持適當(dāng)濕度、光照和通風(fēng)，30～40天后，子實(shí)體成熟；(2)菌株的發(fā)酵工藝流程本發(fā)明采用通氣發(fā)酵法生產(chǎn)姬松茸菌絲體，發(fā)酵培養(yǎng)基成本低廉，發(fā)酵周期短。發(fā)酵工藝流程如下斜面菌種或茄瓶菌種→搖瓶種子→50-100L3種子罐(一級(jí))→500-1000L3種子罐(二級(jí))→5000-10噸發(fā)酵罐。
搖瓶種子的裝量75～150ml/250ml或150～150ml/250ml培養(yǎng)基，往復(fù)式搖床振蕩速度80～150次/分，或旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩速度100～200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度24～28℃。培養(yǎng)時(shí)間2～3天。種子罐和發(fā)酵罐投料量50～70％，接種量8～10％，攪拌速度100～200rpm，通氣量1∶0.5～1∶1v/vmin，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間4～7天。隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)基由混濁逐漸變清。發(fā)酵液中還原糖、氨態(tài)氮、PH都逐漸降低，菌絲體生物量不斷增加，至第5～6天時(shí)多糖肽產(chǎn)量達(dá)最高時(shí)終止發(fā)酵。(3)姬松茸多糖肽的提取本發(fā)明所述姬松茸AB103-51的多糖肽提取工藝是姬松茸發(fā)酵液用沙芯漏斗抽濾，分離發(fā)酵液和菌絲體，工廠可用板框機(jī)分離發(fā)酵液與菌絲體。將濕菌絲體加10～20倍水浸泡過(guò)夜，用90～100℃水浴回流提取2～5小時(shí)，過(guò)濾，將濾液濃縮后加2～5％倍的95％乙醇0～4℃沉淀8～10小時(shí)，干燥得姬松茸多糖肽。
本發(fā)明所述經(jīng)組織分離法得到的AB103菌種，子實(shí)體肉質(zhì)，多數(shù)單個(gè)，個(gè)別叢生。菌蓋半球形至平展，直徑3～10cm，淺褐色至棕褐色，菌蓋表面有纖維狀鱗片，邊緣有菌幕碎片。菌柄近圓柱形生于菌蓋中央，初期為實(shí)心，中后期疏松至空心。菌環(huán)易脫落。擔(dān)孢子淺紅色至棕褐色，光滑，短橢圓形。菌絲分枝，有橫隔，無(wú)鎖狀聯(lián)合。物理誘變所得的菌株AB103-51在固體木屑麩皮培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其子實(shí)體形態(tài)與天然實(shí)體相同。
本發(fā)明所述姬松茸菌株AB103-51的培養(yǎng)性狀是①接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，溫度24～28℃，生長(zhǎng)旺盛，菌絲體純白色、絨狀，接種十天菌落直徑達(dá)15-20mm。②接種在木屑培養(yǎng)基上，其培養(yǎng)特征如上所述。③在搖瓶振蕩培養(yǎng)時(shí)，用往復(fù)式搖床，振蕩速度80～150次/分，或旋轉(zhuǎn)式搖床，振蕩速度100～200轉(zhuǎn)/分，形成菌株，當(dāng)菌大量形成時(shí)，發(fā)酵液由混濁變清，粘度逐漸增加，散發(fā)濃郁果香味。④在發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～6天時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)和多糖肽產(chǎn)量達(dá)到最高，可終止發(fā)酵。
姬松茸菌絲體多糖肽的特征是①多糖肽，多糖含量為20～40％，蛋白質(zhì)含量為15～30％。②灰色至灰褐色粉末。③主要成份都是β-葡聚糖。④紅外吸光譜峰位是883～892cm-1。
上述工藝過(guò)程使用的培養(yǎng)基成分和各種溶劑均無(wú)毒性，發(fā)酵生產(chǎn)的姬松茸菌絲體和姬松茸多糖肽，經(jīng)國(guó)家規(guī)定的急性毒性試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)證明，本發(fā)明的產(chǎn)中品均無(wú)毒性。長(zhǎng)期使用本產(chǎn)品不僅不會(huì)產(chǎn)生任何毒副作用，反而能增加機(jī)體的免疫功能。
從上述發(fā)明方法所獲得的姬松茸菌絲體和多糖肽能明顯促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，能抵抗由環(huán)磷酰胺引起的白血球下降和食欲減退；能提高荷瘤機(jī)體的免疫球蛋白、補(bǔ)體和血清溶血素的含量；能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)?？捎糜谂R床抗腫瘤，減輕腫瘤病人化療和放療所引起的副作用，如惡心嘔吐、食欲不振、白細(xì)胞降低等癥狀，提高生存質(zhì)量。并可作為亞健康人士提高機(jī)體免疫功能的保健品。
本方法發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品菌絲體和多糖肽安全無(wú)毒。從姬松茸菌絲體中提取的多糖肽具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)化療和放療的腫瘤病人的惡心嘔吐、食欲不振、白細(xì)胞降低等癥狀有明顯改善作用，是一種新型的生物免疫調(diào)節(jié)劑。
PDA配方如下馬鈴薯 200g葡萄糖 20g瓊脂20g水 1000ml鈴薯去皮，切塊，加水煮沸20～30分鐘后，4層紗布過(guò)濾，取汁。
將斜面菌種接種在裝有100ml液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，振蕩培養(yǎng)。采用往復(fù)式搖床(振蕩速度80～150次/分)或旋轉(zhuǎn)式搖床(振蕩速度100～200轉(zhuǎn)/分)，振蕩培養(yǎng)度24～28℃。培養(yǎng)第二天出現(xiàn)小菌球，鏡檢菌絲生長(zhǎng)繁茂、多分枝、具橫隔、五色、透明、具鎖狀聯(lián)合，發(fā)酵至第5～7天發(fā)酵液粘稠，此時(shí)菌絲體生長(zhǎng)量最大，多糖肽產(chǎn)量最高，可終止發(fā)酵。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下淀粉 3％麩皮 0.3％蔗糖 1％酵母粉0.2％硫酸鎂0.05％磷酸二氫鉀0.1％發(fā)酵液經(jīng)離心后，得姬松茸菌絲體，加水10倍后，用細(xì)胞搗碎機(jī)打碎細(xì)胞，然后加90℃熱水回流提取3～5小時(shí)，將提取液再經(jīng)真空薄膜濃縮，取1份濃縮加3份95％乙醇，在0～4℃條件下醇析8小時(shí)。經(jīng)真空干燥或冷凍干燥后即可獲得褐色粉末狀的姬松茸多糖肽。取多糖肽加水(1∶100重量比)溶解后，用葡萄糖凝膠(Sdphadex-G75)進(jìn)行層析分離，用紫外吸收法和酚硫酸測(cè)定層析液的多糖和多肽，樣品在收集試管中出現(xiàn)多糖和多肽，證明是姬松茸多糖肽。
綜合PDA配方如下馬鈴薯 200g蔗糖 20g麩皮 100gKH2PO43gMgSO47H2O 1.5g瓊脂 20g水 1000ml馬鈴薯去皮，切塊，加水煮沸20～30分鐘后，4層紗布過(guò)濾，取汁。麩皮加水煮沸20～30分鐘后，4層紗布過(guò)濾，取汁。
將斜面菌種接種在裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，振蕩培養(yǎng)。采用復(fù)式搖床(振蕩速度80～150次/分)或旋轉(zhuǎn)式搖床(振蕩速度100～200轉(zhuǎn)/分)，振蕩培養(yǎng)溫度24～28℃。二天后以壓差法移種入50～100L種子罐內(nèi)，罐裝量70％(v/v)，接種量10％(v/v)，通氣培養(yǎng)2天后移入500～1000L發(fā)酵罐。發(fā)酵罐裝量70％(v/v)，接種量10％(v/v)，罐溫24～30℃，通氣量1∶1(v/v)機(jī)械攪拌速度100～200rpm。發(fā)酵至第5～7天發(fā)酵液粘稠，此時(shí)菌絲體生長(zhǎng)量最大，多糖肽產(chǎn)量最高，可終止發(fā)酵。
種子培養(yǎng)基配方如下玉米粉 3％淀粉 2％磷酸二氫鉀 0.1％硫酸鎂 0.05％發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下淀粉 3％麩皮 0.3％蔗糖 1％酵母粉 0.2％硫酸鎂 0.05％磷酸二氫鉀 0.1％發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾后，得姬松茸菌絲體，加水10倍后，用細(xì)胞搗碎機(jī)打碎細(xì)胞，然后加95℃熱水回流提取4小時(shí)，將提取液真空薄膜濃縮，加水3倍體積的95％乙醇，低溫醇析。醇析物用無(wú)水丙酮和無(wú)水乙醚分別洗滌3次，于50℃下烘干，獲得褐色粉末狀的姬松茸多糖肽。取多糖肽加水(1∶100重量比)溶解后，用兩塊硅膠薄析進(jìn)行TLC層析，分別用茚三酮和茴香醛顯色，兩塊板顯示的Rf值一致，證明所提取的樣品為姬松茸多糖肽。
權(quán)利要求
1.一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)姬松茸的育種與特征用組織分離法獲得姬松茸純菌株AB103，將其接種在PDA或麥芽汁固定斜面培養(yǎng)基上，于25～28℃恒溫培養(yǎng)7～10天后，置于4℃左右的冰箱中保存?zhèn)溆?，采用紫外誘變法對(duì)菌絲細(xì)胞進(jìn)行誘變，紫外照射距離為20～30cm，照射時(shí)間為5～15秒，初篩誘變株在固體培養(yǎng)基上的菌絲體生長(zhǎng)能力，復(fù)篩誘變株在液體培養(yǎng)基中菌絲體生長(zhǎng)量和多糖肽產(chǎn)量，獲得優(yōu)質(zhì)菌株AB103-51；固體培養(yǎng)用40～50％的稻草或木屑、棉子殼，1％的蔗糖或葡萄糖，10～20％麩皮或米糠，1％的石膏或碳酸鈣，加水拌勻，含水量60％，PH自然，瓶裝，在1.5kg/m2的壓力下滅菌1小時(shí)同，冷卻后，在無(wú)菌操作下?lián)u瓶種子接種于固體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)溫度22～26℃，20～30天菌絲體布滿全瓶，原基萌發(fā)后，降低栽培溫度22～25℃，保持適當(dāng)溫度、光照和通風(fēng)，30～40天后，子實(shí)體成熟；(2)菌株的發(fā)酵工藝流程本發(fā)明采用通氣發(fā)酵法生產(chǎn)姬松茸菌絲體，發(fā)酵培養(yǎng)基成本低廉，發(fā)酵周期短，發(fā)酵工藝流程如下斜面菌種或茄瓶菌種→搖瓶種子→50-100L3種子罐，一級(jí)→500-1000L3種子罐，二級(jí)→5000-10噸發(fā)酵罐，搖瓶種子的裝量75～150ml/250ml或150～150ml/250ml培養(yǎng)基，往復(fù)式搖床振蕩速度80～150次/分，或旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩速度100～200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度100～200rpm，通氣量1∶0.5～1∶1v/v min，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間4～7天，隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)基由混濁逐漸變清，發(fā)酵液中還原糖、氨態(tài)氮、PH都逐漸降低，菌絲體生物量不斷增加，至第5～6天時(shí)多糖肽產(chǎn)量；(3)姬松茸多糖肽的提取本發(fā)明所述姬松茸AB103-51的多糖肽提取工藝是姬松茸發(fā)酵液用沙芯漏斗抽濾，分離發(fā)酵液和菌絲體，工廠可用板框機(jī)分離發(fā)酵液與菌絲體，將濕菌絲體加10～20倍水浸泡過(guò)夜，用90～100℃水浴回流提取2～5小時(shí)，過(guò)濾，將濾液濃縮后加2～5％倍的95％乙醇0～4℃沉淀8～10小時(shí)，干燥得姬松茸多糖肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的優(yōu)質(zhì)菌株AB 103-51的分類命名為巴西蘑菇Agaricus blazei，保藏編號(hào)為CGMCC No.07722001325B。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的優(yōu)質(zhì)菌株AB103-51的發(fā)酵工藝，其種子培養(yǎng)基的特征是100ml的培養(yǎng)基玉米粉1～3g、淀粉1～2g、硫酸鎂0.05～0.1g、磷酸二氫鉀0.1～0.2g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的優(yōu)質(zhì)菌株AB103-51的發(fā)酵工藝，其發(fā)酵培養(yǎng)基的特征是100ml的培養(yǎng)基的配比是淀粉1～3g、麩皮0.1～0.6g、葡萄糖或蔗糖0.5～1g、酵母粉0.1～0.5g、硫酸鎂0.05～0.2g、磷酸二氫鉀0.1～0.3g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的發(fā)酵工藝的特征是發(fā)酵罐培養(yǎng)可添加泡敵或豆油適量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的發(fā)酵工藝的特征是培養(yǎng)基中可添加玉米漿，添加量為0.1～1％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的發(fā)酵工藝的特征是搖瓶種的發(fā)酵條件250ml搖瓶裝量75～150ml培養(yǎng)基，500ml搖瓶裝量150～250ml培養(yǎng)基，采用往復(fù)式搖床，振蕩速度80～150次/分，或旋轉(zhuǎn)式搖床，振蕩速度度100～200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度24～28℃，培養(yǎng)時(shí)間2～3天。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的發(fā)酵工藝的特征是發(fā)酵條件接種量8～10％，攪拌速度100～200rpm，通氣量1∶0.5～1∶1v/v min，發(fā)酵溫度為24～28℃，罐壓0.3～0.5kg/cm2，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間2～3天。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的發(fā)酵工藝的特征是發(fā)酵條件接種量8～10％，攪拌速度100～200rpm，通氣量1∶0.5～1∶1v/v min，發(fā)酵溫度為24～28℃，罐壓0.3～0.5kg/cm2，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間4～7天。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中一種姬松茸G菌株AB103-51的固體培養(yǎng)用稻草或木屑、棉子殼、蔗糖或葡萄糖，麩皮或米糠、石膏或碳酸鈣所組成的培養(yǎng)基。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的培養(yǎng)工藝的特征是培養(yǎng)基的百分含量是稻草或木屑、棉子殼40～50％，蔗糖或葡萄糖1％，麩皮或米糠10～20％，石膏或碳酸鈣1％。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的姬松茸培養(yǎng)物過(guò)濾得AB103-51的菌絲體，菌絲細(xì)胞破碎后，溫菌絲體加10-20倍水，在90～100℃熱水中回流提取2～5小時(shí)，得菌絲體提取液。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的菌絲體提取液濃縮后加2～5倍的95％乙醇，在0～4℃沉淀8～10小時(shí)，層析物干燥得灰褐色的姬松茸多糖肽。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的方法是將組織分離的姬松茸AB103菌株純化后，采用物理法對(duì)其菌絲體進(jìn)行誘變，經(jīng)初篩和復(fù)篩后，獲得液體發(fā)酵菌絲體生物量多、多糖肽產(chǎn)量高的優(yōu)質(zhì)菌株AB103－51。用天然玉米粉、麩皮、淀粉、酵母粉、玉米漿、硫酸鎂、磷酸二氫鉀等作為培養(yǎng)基，進(jìn)行從斜面菌種，到搖瓶種子，一級(jí)種子、二級(jí)種子，到發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵工藝流程，獲得含菌絲體及多糖肽較高的姬松茸發(fā)酵液。從AB103－51的菌絲體中，用熱水提取，乙醇沉淀等方法，獲得一種具有生物免疫調(diào)節(jié)劑作用的姬松茸多糖肽。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1398978SQ0213651
公開日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2002年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月16日
發(fā)明者錢秀萍, 藍(lán)德剛, 王強(qiáng) 申請(qǐng)人:維京仲華(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司