專利名稱：在甲醇酵母中高表達(dá)的耐高溫植酸酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，更具體地說是通過基因工程方法改變植酸酶基因，使表達(dá)的蛋白質(zhì)能夠在高溫下保持長時(shí)間活性。
植酸酶能將植酸水解成肌醇和磷酸，在飼料中添加植酸酶不僅可以提高植物性飼料中磷的利用率，減少糞便中排出的磷對(duì)環(huán)境污染(Nelson 1968，畜牧科學(xué))，而且能夠通過降低植酸鹽的抗?fàn)I養(yǎng)作用，增加動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)和一些金屬離子的吸收能力(Wyss 1999，應(yīng)用環(huán)境微生物科學(xué))。
開發(fā)植酸酶的直接原因來源于植酸帶來的磷污染。一方面，植酸中螯合的磷無法吸收利用，另一方面則是必須在飼料和食品中添加大量無機(jī)磷，造成磷源浪費(fèi)和環(huán)境污染。自80年代中期，歐洲就致力于尋找全面解決無機(jī)磷污染的方案。其直接的動(dòng)因來源于原歐共體成員國議會(huì)對(duì)環(huán)境保護(hù)的關(guān)注，在他們實(shí)施的環(huán)保指南(CouncilDirective91/676/EEC)中，著重強(qiáng)調(diào)限制養(yǎng)殖業(yè)的磷排泄量。植酸酶是目前所有使用的添加劑中，具有最直接、最顯著環(huán)保社會(huì)效益的酶制劑。植酸酶也是目前所有飼料酶制劑產(chǎn)品中功能研究最清楚的產(chǎn)品。使用植酸酶最大的好處在于減少飼料中磷酸氫鈣等無機(jī)磷的使用量，幅度至少50％-70％。在中國，很多養(yǎng)殖區(qū)可以將磷酸氫鈣的用量減少70％以上，尤其在雜粕用量較大的蛋雞養(yǎng)殖區(qū)，可以全部替代磷酸氫鈣。使用植酸酶的飼料，向環(huán)境排泄的磷相應(yīng)減少30％以上。據(jù)最保守的估計(jì)，從開始引入植酸酶以來，我國的養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)少向環(huán)境排放了7200噸磷。折合磷酸氫鈣42000噸。加上磷礦開采的污染和費(fèi)用，以及節(jié)約的儲(chǔ)運(yùn)成本。植酸酶創(chuàng)造的綜合效益遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止在養(yǎng)殖和飼料方面估計(jì)的9200多萬元。
事實(shí)上，植酸酶的最大受益者是人類自身。在賴以生存的環(huán)境中，植酸酶能從污染的源頭輕而易舉地消滅磷污染，比常規(guī)使用的后期治理的方法更為經(jīng)濟(jì)有效。可以預(yù)期，植酸酶將以顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益對(duì)整個(gè)行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生巨大促進(jìn)作用。
最新的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)了植酸酶的潛在營養(yǎng)價(jià)值。能夠提高飼料中蛋白質(zhì)的消化利用率。應(yīng)用植酸酶，加大了非常規(guī)原料資源的使用比例，為節(jié)約蛋白質(zhì)飼料提供了方便。使用植酸酶能直接降低了飼料的原料成本，從而提高產(chǎn)品的價(jià)格競(jìng)爭(zhēng)力。在中國，每生產(chǎn)1噸全價(jià)飼料，至少可以因此增加5-10元的凈收益。每生產(chǎn)1噸5％的預(yù)混料，則可以增加收益百元以上。使用植酸酶在減少飼料中無機(jī)磷添加量的同時(shí)，大幅度地減輕甚至完全杜絕了磷酸氫鈣導(dǎo)致的氟和其它重金屬中毒問題。
植酸酶廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中。許多微生物都能產(chǎn)生植酸酶，尤其在曲霉屬中。1968年Shien等從68個(gè)土樣中對(duì)2000個(gè)菌株進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)，在所用的22株黑霉菌中有21株能產(chǎn)生植酸酶。第一個(gè)被分離純化的植酸酶來源于Aspergillus terreusNO.9A-1，它的最適pH為4.5，最適反應(yīng)溫度為70℃，此酶在pH1.2～9.0均能穩(wěn)定維持活性。此后，陸續(xù)從十幾種微生物中分離得到植酸酶，其中來源于A.ficcum NR-RL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶phyA在酸性條件下有較高酶活性，被認(rèn)為是目前最具應(yīng)用前景的飼用植酸梅，其酶學(xué)性質(zhì)的研究也較為深入。植酸酶phyA，是一種糖基化蛋白，分子量為85KD。它的最適pH為2.5和5.5，最適反應(yīng)溫度為55℃。在37℃、pH2.5的條件下，以植酸為底物的Km值為50mmol，Ca2+、Fe2+對(duì)酶活性無影響，Mn2+、Co2+有激活作用，能使酶活性分別提高30％和13％。Cu2+、Zn2+、Fe2+、Cu+對(duì)酶活性有抑制作用，其中前兩種為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，后兩種為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。對(duì)酸性磷酸酶有抑制作用的抑制劑如L(+)-酒石酸對(duì)它卻沒有抑制作用。
目前生產(chǎn)上采用的植酸酶均來自黑曲霉(Aspergillus niger)。黑曲霉中的植酸酶(PhyA)具有比活高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。在植酸酶發(fā)展初期，均采用原始菌株發(fā)酵生產(chǎn)，然而，原始菌株表達(dá)量低，使生產(chǎn)成本較高，通過化學(xué)誘變可以獲得產(chǎn)酶量提高的菌株，然而所需時(shí)間很長，誘變菌株容易退化，利用生物反應(yīng)器高效表達(dá)植酸酶基因，大幅度提高了植酸酶產(chǎn)量，克服了野生型菌株含量低的缺點(diǎn)[6，7]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料所和生物技術(shù)研究所從1996年開始合作，從黑曲酶中克隆了適合在飼料中使用的植酸酶基因，并共同開發(fā)了利用生物反應(yīng)器大規(guī)模、低成本生產(chǎn)飼料添加劑植酸酶的工藝。但是，該植酸酶存在一個(gè)很大的缺陷不能耐受較高的溫度，在加工過程中酶活力單位大量喪失(Kim 1998，酶和微生物技術(shù))。因此，從自然界尋找或者通過隨機(jī)突變篩選熱穩(wěn)定植酸酶成為目前飼料行業(yè)研究的熱點(diǎn)。
從煙熏曲霉(Aspergillus fumigatus)中分離的植酸酶能夠耐受90-100℃高溫，而且能在較寬的pH范圍內(nèi)降解植酸，因此具有很大的市場(chǎng)潛力(van Loon 1998，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué))。然而，在野生型菌株中，植酸酶的表達(dá)量很低，難以在生產(chǎn)上推廣。
本發(fā)明試圖通過改變基因的偏愛密碼，使基因適合在酵母中表達(dá)，通過電擊轉(zhuǎn)化將耐熱的植酸酶基因整合到畢赤酵母中，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。
為了提高植酸酶基因的耐熱性和比活，對(duì)合成的植酸酶基因進(jìn)行DNA改組(DNAShuffling)、在原核表達(dá)質(zhì)粒上構(gòu)建突變植酸酶基因的文庫，通過突變植酸酶活性篩選，最終獲得了高比活的耐高溫植酸酶基因。新的植酸酶Fphy的比活為原先Fphy1的5倍左右。Fphy和Fphy1的氨基酸數(shù)相同，但有9個(gè)氨基酸發(fā)生了改變。其中包括72V＞I，86F＞Y，87A＞T，194Q＞E，200A＞E，236S＞P，292T＞A，338V＞I，396A＞V等。
耐熱性植酸酶基因合成采用重疊延伸PCR方法，結(jié)合高保真的PWO DNA聚合酶，將引物片段按順序連接。合成基因長度為1320 bp。
突變耐熱植酸酶基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列如下，從蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，該植酸酶含有6個(gè)糖激化位點(diǎn)。
本發(fā)明耐熱性植酸酶基因的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列如下TCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTGGGATACCAATGCTCCCCTGCTACCTCCCACCTTTGGGGACAATACS K S C D T V D L G Y Q C S P A T S H L W G Q YTCTCCATTCTTCTCTTTGGAGGACGAACTTTCCGTTTCCTCCAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCACCTTGS P F F S L E D E L S V S S K L P K D C R I T LGTTCAAGTCTTGTCCAGACACGGTGCTAGATACCCAACCTCCTCCAAATCCAAAAAATACAAAAAACTGATCV Q V L S R H G A R Y P T S S K S K K Y K K LIACTGCTATCCAAGCTAACGCTACCGACTTCAAAGGAAAATACACTTTCTTGAAAACCTACAACTACACCTTGT A I Q A A T D F K G KY TF L K T Y Y T LGGAGCTGACGACTTGACCCCATTCGGAGAACAACAACTTGTCAACTCT GAATCAAATTCTACCAAAGATACG A D D L T P F G E Q Q L V N S G I K F Y Q R YAAAGCACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTTCATCAGAGCTTCTGGCTCCGACAGAGTTATCGCTTCTGGAGAAK A L A R S V V P F I R A S G S D R V I A S G EAAATTCATCGAAGGATTCCAACAAGCTAAATTGGCTGACCCTGGAGCTACCAACAGAGCTGCTCCTGCTATCK F I E G F Q Q A K L A D P G A T N R A A P A ITCCGTTATCATCCCAGAATCCGAAACCTTCAACAACACCTTGGACCACGGTGTTTGCACCAAATTCGAGGCTS V I I P E S E T F N T L D H G V C T K F E ATCTGAACTTGGAGACGAGGTCGAGGCTAACTTCACCGCTTTGTTCGCTCCTGACATCAGAGCTAGAGCTGAASEL G DEV E A N F T A L F A P D I R A R A EAAACACTTGCCTGGTGTCACCTTGACCGACGAAGACGTTGTTTCCTTGATGGATATGTGCCCCTTCGACACCK H L P G V T L T D E D V V S L M D M CPF D TGTTGCTAGAACCTCCGACGCTTCCCAACTTTCCCCATTCTGCCAACTTTTCACCCACAACGAATGGAAAAAAV A R T S D A S Q L S P F C Q L F T H N E W K KTACAACTACCTGCAGTCCTTGGGAAAATACTACGGATACGGAGCTGGAAACCCATTGGGACCAGCTCAAGGAY N Y L Q S L G K Y Y G Y G A G N P L G P A Q GATCGGATTCGCCAACGAATTGATCGCTAGATTGACCAGATCCCCAGTTCAAGACCACACCTCCACTAACTCCI G FAN E L I A R L T R S P V Q D H T S T SACCTTGGTTTCCAACCCAGCTACCTTCCCATTGAACGCTACCATGTACGTTGACTTCTCCCACGACAACTCTT L V S N P A T F P L A T M Y V D F S H D N SATGATCTCCATCTTCTTCGCTTTGGGACTTTACAACGGAACTGAACCATTGTCCAGAACTTCCGTTGAATCCMIS I F F A L G L Y G T E P L S R T S V E SGCTAAAGAACTTGACGGATACTCCGCTTCCTGGGTTGTTCCATTCGGTGCTAGAGCTTACTTTGAAACTATGA K E L D G Y S A S W V V P F G A R A Y F E T MCAATGCAAATCCGAAAAAGAACCATTGGTTAGAGTCTTGATTAACGACAGAGTTGTTCCATTGCACGGATGCQ C K S E K E P L V RVL I N D R V V P L H G CGACGTTGACAAATTGGGAAGATGCAAATTGAACGACTTCGTTAAAGGATTGTCTTGGGCTAGATCCGGTGGTD V D K L G R C K L N D F V K G L S W A R S G GAACTGGGGTGAATGCTTCTCCTAAN W G E C F S -突變耐熱植酸酶基因與原始基因相比，352個(gè)核苷酸發(fā)生變化，核苷酸的同源性為73％，核苷酸密碼在合成過程中全部采用酵母偏愛密碼，其中精氨酸采用AGA，賴氨酸采用AAA，半胱氨酸采用TGC，天冬氨酸采用AAC。另外，為了提高表達(dá)量，合成基因切除了5’端26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽編碼序列和信號(hào)肽內(nèi)的內(nèi)含子序列，以便植酸酶基因編碼框能正確插入帶有高表達(dá)的啟動(dòng)子和分泌信號(hào)肽之后，穩(wěn)定高效表達(dá)。新的植酸酶基因Fphy與原植酸酶基因Fphy1相比較FPHY1 -TCCAAGTCCTGCGATACGGTAGACCTCGGGTACCAGTGCTCCCCTGCGAC -50||||| |||||||| || || ||| | || ||||| ||||||||||| ||FPHY -TCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTGGGATACCAATGCTCCCCTGCTAC -50FPHY1 -TTCTCATCTATGGGGCCAGTACTCGCCATTCTTTTCGCTCGAGGACGAGC -100|| || || ||||| || ||||| |||||||| || | |||||||| |FPHY -CTCCCACCTTTGGGGACAATACTCTCCATTCTTCTCTTTGGAGGACGAAC -100FPHY1 -TGTCCGTGTCGAGTAAGCTTCCCAAGGATTGCCGGATCACCTTGGTACAG -150| ||||| |||| | || || |||||| |||||||||||| ||FPHY -TTTCCGTTTCCTCCAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCACCTTGGTTCAA -150FPHY1 -GTGCTATCGCGCCATGGAGCGCGGTACCCAACCAGCTCCAAGAGCAAAAA -200|| | || | || || || | ||||||||| |||||| ||||||FPHY -GTCTTGTCCAGACACGGTGCTAGATACCCAACCTCCTCCAAATCCAAAAA -200FPHY1 -GTATAAGAAGCTTGTGACGGCGATCCAGGCCAATGCCACCGACTTCAAGG -250|| || || || || || || ||||| || || || ||||||||||| |FPHY -ATACAAAAAACTGATCACTGCTATCCAAGCTAACGCTACCGACTTCAAAG -250FPHY1 -GCAAGTTTGCCTTTTTGAAGACGTACAACTATACTCTGGGTGCGGATGAC -300| || || || || ||||| || |||||||| | |||| || || |||FPHY -GAAAATACACTTTCTTGAAAACCTACAACTACAACTTGGGAGCTGACGAC -300FPHY1 -CTCACTCCCTTTGGGGAGCAGCAGCTGGTGAACTCGGGCATCAAGTTCTA -350| | || || || || || || || || ||||| || ||||| |||||FPHY -TTGAACCCATTCGGAGAACAACAACTTGTCAACTCTGGAATCAAATTCTA -350FPHY1-CCAGAGGTACAAGGCTCTGGCGCGCAGTGTGGTGCCGTTTATTCGCGCCT -400||| || ||||| || || || ||| || || || || | || |FPHY -CCAAAGATACAAAGCACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTTCATCAGAGCTT -400FPHY1-CAGGCTCGGACCGGGTTATTGCTTCGGGAGAGAAGTTCATCGAGGGGTTC -450| ||||| ||| | ||||| ||||| ||||| || |||||||| || |||FPHY -CTGGCTCCGACAGAGTTATCGCTTCTGGAGAAAAATTCATCGAAGGATTC -450FPHY1-CAGCAGGCGAAGCTGGCTGATCCTGGCGCGACGAACCGCGCCGCTCCGGC -500|| || || || ||||||| ||||| || || ||| | || ||||| ||FPHY -CAACAAGCTAAATTGGCTGACCCTGGAGCTACCAACAGAGCTGCTCCTGC -500FPHY1-GATTAGTGTGATTATTCCGGAGAGCGAGACGTTCAACAATACGCTGGACC -550|||| || || || || ||| || |||||||| || ||||||FPHY -TATCTCCGTTATCATCCCAGAATCCGAAACCTTCAACAACACCTTGGACC -550FPHY1-ACGGTGTGTGCACGAAGTTTGAGGCGAGTCAGCTGGGAGATGAGGTTGCG -600||||||| ||||| || || ||||| ||| || ||||| ||||| | |FPHY -ACGGTGTTTGCACCAAATTCGAGGCTTCTGAACTTGGAGACGAGGTCGAG -600FPHY1-GCCAATTTCACTGCGCTCTTTGCACCCGACATCCGAGCTCGCGCCGAGAA -650|| || ||||| || | || || || |||||| ||||| | || || ||FPHY -GCTAACTTCACCGCTTTGTTCGCTCCTGACATCAGAGCTAGAGCTGAAAA -650FPHY1-GCATCTTCCTGGCGTGACGCTGACAGACGAGGACGTTGTCAGTCTAATGG -700|| | ||||| || || |||| ||||| |||||||| | ||||FPHY -ACACTTGCCTGGTGTCACCTTGACCGACGAAGACGTTGTTTCCTTGATGG -700FPHY1-ACATGTGTTCGTTTGATACGGTAGCGCGCACCAGCGACGCAAGTCAGCTG -750| ||||| | || || || || || | ||| |||||||| ||FPHY -ATATGTGCCCCTTCGACACCGTTGCTAGAACCTCCGACGCTTCCCAACTT -750FPHY1-TCACCGTTCTGTCAACTCTTCACTCACAATGAGTGGAAGAAGTACAACTA -800|| || ||||| ||||| ||||| ||||| || ||||| || ||||||||FPHY -TCCCCATTCTGCCAACTTTTCACCCACAACGAATGGAAAAAATACAACTA -800FPHY1-CCTTCAGTCCTTGGGCAAGTACTACGGCTACGGCGCAGGCAACCCTCTGG -850||| ||||||||||| || |||||||| ||||| || || ||||| |||FPHY -CCTGCAGTCCTTGGGAAAATACTACGGATACGGAGCTGGAAACCCATTGG -850FPHY1-GACCGGCTCAGGGGATAGGGTTCACCAACGAGCTGATTGCCCGGTTGACT -900|||| ||||| || || || ||| ||||||| |||| || | |||||FPHY -GACCAGCTCAAGGAATCGGATTCGCCAACGAATTGATCGCTAGATTGACC -900FPHY1-CGTTCGCCAGTGCAGGACCACACCAGCACTAACTCGACTCTAGTCTCCAA -950| || ||||| || ||||||||| ||||||||| || | || |||||FPHY -AGATCCCCAGTTCAAGACCACACCTCCACTAACTCCACCTTGGTTTCCAA -950FPHY1 -CCCGGCCACCTTCCCGTTGAACGCTACCATGTACGTCGACTTTTCACACG -1000||| || |||||||| |||||||||||||||||||| ||||| || ||||FPHY-CCCAGCTACCTTCCCATTGAACGCTACCATGTACGTTGACTTCTCCCACG -1000FPHY1 -ACAACAGCATGGTTTCCATCTTCTTTGCATTGGGCCTGTACAACGGCACT -1050||||| ||| | ||||||||||| || ||||| || |||||||| |||FPHY-ACAACTCTATGATCTCCATCTTCTTCGCTTTGGGACTTTACAACGGAACT -1050FPHY1 -GAACCCTTGTCCCGGACCTCGGTGGAAAGCGCCAAGGAATTGGATGGGTA -1100||||| |||||| | || || || ||| ||| || ||| | || || ||FPHY-GAACCATTGTCCAGAACTTCCGTTGAATCCGCTAAAGAACTTGACGGATA -1100FPHY1 -TTCTGCATCCTGGGTGGTGCCTTTCGGCGCGCGAGCCTACTTCGAGACGA -1150
|| || |||||||| || || ||||| || |||| ||||| || || |FPHY-CTCCGCTTCCTGGGTTGTTCCATTCGGTGCTAGAGCTTACTTTGAAACTA -1150FPHY1 -TGCAATGCAAGTCGGAAAAGGAGCCTCTTGTTCGCGCTTTGATTAATGAC -1200|||||||||| || ||||| || || ||| | | | |||||||| |||FPHY-TGCAATGCAAATCCGAAAAAGAACCATTGGTTAGAGTCTTGATTAACGAC -1200FPHY1 -CGGGTTGTGCCACTGCATGGCTGCGATGTGGACAAGCTGGGGCGATGCAA -1250| ||||| ||| || || ||||| || ||||| |||| |||||||FPHY-AGAGTTGTTCCATTGTTGGGATGCGACGTTGACAAATTGGGAAGATGCAA -1250FPHY1 -GCTGAATGACTTTGTCAAGGGATTGAGTTGGGCCAGATCTGGGGGCAACT -1300|||| ||||| || || |||||| |||||| ||||| || || ||||FPHY-ATTGAACGACTTCGTTAAAGGATTGTCTTGGGCTAGATCCGGTGGTAACT -1300FPHY1 -GGGGAGAGTGCTTTAGTTGA -1320|||| || |||||| |FPHY-GGGGTGAATGCTTCTCCTAA -1320植酸酶作為動(dòng)物飼料添加劑，對(duì)動(dòng)物生長的促進(jìn)作用已經(jīng)得到確證，但是目前在飼料工業(yè)中還未全面利用，主要原因是植酸酶的生產(chǎn)菌株表達(dá)量低，難以獲得大量產(chǎn)品。利用畢赤酵母(P.pastoris)表達(dá)植酸酶可以大大提高植酸酶的表達(dá)水平，表達(dá)量由原始菌株的每毫升幾微克提高到1-10毫克，在畢赤酵母中表達(dá)了來源于A.niger NRRL3135的phyA2基因，可以使植酸酶的表達(dá)量提高近3000倍。此外在酵母中能進(jìn)行糖基化修飾等蛋白翻譯后加工，提高酶的生物活性。
本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明的植酸酶具有明顯高的耐熱性，90℃處理80分鐘。酶的活性仍有40％。而一般產(chǎn)品在90℃下處理30分鐘，酶活性破壞80％。
2、本發(fā)明的植酸酶基因更適合在甲醇酵母中轉(zhuǎn)錄表達(dá)，將兩個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)化到酵母中，表達(dá)量是野生型基因的13倍。經(jīng)高密度發(fā)酵，蛋白表達(dá)量為每升5.6g。
3、突變的植酸酶基因在酵母中表達(dá)后，酶活性pH值范圍大，pH2.5-6.5。pH值為5.5-6.5時(shí)，植酸酶活性達(dá)到最高。


圖1是構(gòu)建成的酵母表達(dá)植酸酶載體。
圖2是植酸酶菌株發(fā)酵后，受甲醇誘導(dǎo)不同時(shí)間，植酸酶的分泌表達(dá)。
圖3表示不同PH條件下，植酸酶的相對(duì)活力。
圖4表示在90℃高溫不同時(shí)間處理下，植酸酶的相對(duì)活力。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1耐高溫植酸酶基因的化學(xué)合成1.利用連續(xù)延伸PCR合成耐高溫植酸酶基因。引物長度為70-90bp，合成21個(gè)寡核苷酸引物，引物與引物之間連接通過20-30bp重疊序列，Tm值為60-66。將所有引物加入反應(yīng)體系，中間引物量為10-20ng，兩側(cè)的引物量為100-200ng。PCR反應(yīng)體系為100μL。PCR擴(kuò)增條件為94℃，30s；65℃，30s；72℃，2min。共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。
耐高溫植酸酶基因引物為phy1TCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTGGGATACCAATGCTCCCCTGCTACCTCCCACCTTTGGGGACAATACphy2ACCTCCCACCTTTGGGGACAATACTCTCCATTCTTCTCTTTGGAGGACGAACTTTCCGTTTCCTCCAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCPhy3CAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCACCTTGGTTCAAGTCTTGTCCAGACACGGTGCTAGATACCCAACCTCCTCCAAATCCAAAAAATACPhy4CAACCTCCTCCAAATCCAAAAAATACAAAAAACTGGTCACTGCTATCCAAGCTAACGCTACCGACTTCAAAGGAAAATTCGCTTTCTTGPhy5GACTTCAAAGGAAAATTCGCTTTCTTGAAAACCTACAACTACACCTTGGGAGCTGACGACTTGACCCCATTCGGAGAACAACAACTTGPhy6GACCCCATTCGGAGAACAACAACTTGTCAACTCTGGAATCAAATTCTACCAAAGATACAAAGCACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTCPhy7CACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTTCATCAGAGCTTCTGGCTCCGACAGAGTTATCGCTTCTGGAGAAAAATTCATCGAAGGATTCCAACPhy8CTGGAGAAAAATTCATCGAAGGATTCCAACAAGCTAAATTGGCTGACCCTGGAGCTACCAACAGAGCTGCTCCTGCTATCTCCGPhy9CCAACAGAGCTGCTCCTGCTATCTCCGTTATCATCCCAGAATCCGAAACCTTCAACAACACCTTGGACCACGGTGTTTGCACCAAATTCPhy10GGACCACGGTGTTTGCACCAAATTCGAGGCTTCTCAACTTGGAGACGAGGTCGCTGCTAACTTCACCGCTTTGTTCGCTCCTGACATCPhy11CAAGGAAACAACGTCTTCGTCGGTCAAGGTGACACCAGGCAAGTGTTTTTCAGCTCTAGCTCTGATGTCAGGAGCGAACAAAGCGGTGPhy12GCAGAATGGGGAAAGTTGGGAAGCGTCGGAGGTTCTAGCAACGGTGTCGAAGGAGCACATATCCATCAAGGAAACAACGTCTTCGTCPhy13CCGTAGTATTTTTCCCAAGGACTGCAGGTAGTTGTATTTTTTCCATTCGTTGTGGGTGAAAAGTTGGCAGAATGGGGAAAGTTGGGAAGPhy14CAATCTAGCGATCAATTCGTTGGTGAATCCGATTCCTTGAGCTGGTCCCAATGGGTTTCCAGCTCCGTATCCGTAGTATTTTTCCCAAGGACTGPhy15GTAGCTGGGTTGGAAACCAAGGTGGAGTTAGTGGAGGTGTGGTCTTGAACTGGGGATCTGGTCAATCTAGCGATCAATTCGTTGGTG
Phy16GAAGAAGATGGAGACCATAGAGTTGTCGTGGGAGAAGTCAACGTACTAGGTAGCGTTCAATGGGAAGGTAGCTGGGTTGGAAACCAAGGTGGPhy17GTTCTTTAGCGGATTCAACGGAAGTTCTGGACAATGGTTCAGTTCCGTTGTAAAGTCCCAAAGCGAAGAAGATGGAGACCATAGAGTTGPhy18CATTGCATAGTTTCAAAGTAAGCTGTAGCACCGAATGGAACAACCCAGGAAGCGGAGTATCCGTCAAGTTCTTTAGCGGATTCAACGGAAGTTCPhy19GCATCCGTGCAATGGAACAACTCTGTCGTTAATCAAGGCTCTAACCAATGGTTCTTTTCTTATTTGCATTGCATAGTTTCAAAGTAAGCPhy20ACCACCGGATCTAGCCCAAGACAATCCTTTAACGAAGTCGTTCAATTTGCATCTTCCCAATTTGTCAACGTCGCATCCGTGCAATGGAACAACTCPhy21TTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTACCACCGGATCTAGCCCAAGACAATC實(shí)施例2耐高溫植酸酶基因的DNA分子重排(DNA Shuffling)2.1 PCR擴(kuò)增酸性植酸酶基因及回收以合成植酸酶基因?yàn)槟０澹現(xiàn)phyZ1，F(xiàn)phyF1為引物擴(kuò)增植酸酶基因，F(xiàn)phyZ1(5’-TTGGATCCTCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTG-3’)；FphyF1(5’-CGAGCTCTTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTACCAC-3’)反應(yīng)條件為94℃10min預(yù)變性，94℃變性30s，72℃退火和延伸1.5min，共30個(gè)循環(huán)，1％Agrose電泳，透吸袋法回收1.4kp的基因片段。2.2 DNase I降解DNA及回收小片段回收Fphy 基因片段以DNase I緩沖液(50mmol/L Tris-Cl pH7.4+1mmol/LMgCl2)100μl溶解；加入0.1U DNase I，25℃處理15分鐘。70℃處理10分鐘。10％丙烯酰胺電泳，透吸袋法回收10-50bp的小片段。用10μl10×無引物PCR緩沖液(Primerless PCRBuffer)(50mmol/L KCl+10mmol/L Tris-Cl pH9.0+1％Triton)溶解沉淀。2.3無引物PCR(Primerless PCR)進(jìn)行Primerless PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系5μl小片段DNA+4μl 2.5mmol/L dNTPs+4.5μl25mmol/L MgCl2+Taq2U+ddH2O to 50μl；反應(yīng)程序?yàn)?4℃30s，40℃30s，72℃30s，共45個(gè)循環(huán))，2％Agrose電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。2.4有引物PCR(Primer PCR)進(jìn)行PrimerPCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系5μlPrimerless PCR產(chǎn)物+FphyZ10.2ng+FphyF1 0.2ng+10×PCR Buffer 5μl+2.5mmol/L dNTPs 4μl+Taq2U+ddH2O to 50μl。反應(yīng)程序?yàn)?4℃30s，70℃30s，72℃2.0min，共35個(gè)循環(huán)，1％Agrose電泳檢測(cè)，回收1.4kp基因片段。2.5高活性植酸酶篩選回收1.4kb的重排植酸酶基因片段，經(jīng)BamH I和Sac I雙酶切后，構(gòu)建入原核表達(dá)載體pG251(CN1338515)啟動(dòng)子和t1t2終止子之間，該載體帶有氨芐青霉素抗性基因。電擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α獲得突變體表達(dá)文庫，庫容達(dá)到107，進(jìn)行高比活植酸酶的篩選。
取1μl細(xì)菌稀釋96倍，等量加入96孔細(xì)菌培養(yǎng)板(12×8)，在每一個(gè)孔中加入150μl的LB培養(yǎng)液至OD600＝0.4-0.6，從培養(yǎng)板的孔中取出10μl菌液轉(zhuǎn)移到試管中培養(yǎng)，同一行的12個(gè)孔和同一列的8個(gè)孔中的細(xì)菌放置同一根試管中培養(yǎng)，共20根試管，每管加入帶氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液3mL，培養(yǎng)8-12小時(shí)后，離心回收菌體，超聲破碎細(xì)胞，離心取上清100μl，加入植酸鉀鈉底物，37℃反應(yīng)30分鐘，加入鉬藍(lán)顯色劑(鉬酸胺，硫酸亞鐵，濃硫酸)顯色。
取每行中活性最高和每列中活性最高的交接點(diǎn)，將10μl培養(yǎng)板交接點(diǎn)孔中的細(xì)菌稀釋96倍后，加入另一塊培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔150μl LB培養(yǎng)液，10μl菌液，進(jìn)行新一輪篩選。3-5輪篩選后，取交接點(diǎn)中細(xì)菌稀釋10-100倍涂布在含氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)板上，挑取單菌落進(jìn)行活性比較，獲得高比活的植酸酶基因Fphy。實(shí)施例3酵母表達(dá)植酸酶載體構(gòu)建按合成基因的兩端序列設(shè)計(jì)引物，在基因5’端加入Xho I切點(diǎn)和信號(hào)態(tài)切割序列，引物為FP1Z(5’-AACTC GAGAAAAGAGAGGCTGAGGCTTCCAAATCCTGCGAC ACCGTTGACTTG-3’)，在基因3’端加入Not I切點(diǎn)引物為FP1F(5’-AACGCGGCCGCTTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTAC-3’)。擴(kuò)增片段克隆后，Xho I和Not I雙酶切，定向插入pPIC9載體(Invetrogen company)，構(gòu)建成fphy的酵母表達(dá)載體pPfphy(圖1)。實(shí)施例4植酸酶高表達(dá)重組酵母篩選將活化的酵母菌株P(guān)ichia Pastoris于500ml YPD中30℃培養(yǎng)18hr，至OD600＝1.7，5000r/min離心收集菌體，先后用500，250ml預(yù)冷的無菌水洗菌體，離心去上清液，用20ml預(yù)冷的1mol/L山梨醇懸浮菌體。離心后菌體再用0.5ml預(yù)冷的山梨醇懸浮，用于電擊感受態(tài)。
大量抽提酵母表達(dá)載體pPfphy，BglII酶切回收小片段，取2μg線性化片段加入50μL感受態(tài)細(xì)胞，冰浴5min，用Bio-Red GenePulser電擊儀電擊，參數(shù)為2.5Kv，25μF。電擊結(jié)束后立即加入1.0ml預(yù)冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于固體選擇培養(yǎng)基平板(18.6％山梨醇，2％葡萄糖，1.34％YNB，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％賴氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％異亮氨酸，2％瓊脂糖)，30℃培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。用牙簽將轉(zhuǎn)化子對(duì)應(yīng)點(diǎn)種到MM(1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇，1.5％瓊脂糖)和MD(1.34％YNB，0.00004％Biotin，2％葡萄糖，1.5％瓊脂糖)平板上，30℃培養(yǎng)2d，在MD上生長正常而在MM上生長不正?；虿簧L的轉(zhuǎn)化子為陽性克隆。
將重組酵母接種于20ml BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB 0.000004％Biotin，1％甘油)，30℃培養(yǎng)，離心收集菌體，加入20ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY(用0.5％甲醇代替BMGY中的甘油)，30℃下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)36hr。
以甲醇為唯一碳源的MM培養(yǎng)基和以葡萄糖為碳源的MD培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)應(yīng)培養(yǎng)，進(jìn)一步篩選定點(diǎn)整合的重組轉(zhuǎn)化子68個(gè)，命名為P.pastoris FPHY1、2、3.....68。
將所有的陽性克隆單獨(dú)接種三角瓶中，30℃培養(yǎng)至OD600＝4-5，利用甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)36hr，每個(gè)誘導(dǎo)菌株取5μl上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，另取10μl上清液稀釋100倍，以植酸鉀鈉為底物進(jìn)行酶活性測(cè)定。植酸酶酶活性測(cè)定方法采取鉬黃法(BASF Company)。植酸酶酶活性單位(U)定義為在37℃下，每分鐘分解植酸鹽釋放出1nmol/L無機(jī)磷酸所需要的酶量為1U。結(jié)合電泳條帶和酶活力單位，篩選到3株高效表達(dá)植酸酶基因的重組子P.pastoris FPHY34，P.pastoris FPHY41、P.pastoris FPHY57。實(shí)施例5重組菌株的高密度發(fā)酵挑取植酸酶高表達(dá)重組酵母P.pastoris FPHY34菌株接種200ml YPED培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD600＝3.0，轉(zhuǎn)入B.Braun 5L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵，以YPED培養(yǎng)重組酵母，利用氨水控制pH值為5.5，發(fā)酵過程中氧含量控制在20％，培養(yǎng)90hr，甘油耗盡，加入0.5％甲醇，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。
30℃培養(yǎng)6hr后，重組酵母進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，氧消耗加快，須充入純氧，氧含量控制在20％，在發(fā)酵過程中，持續(xù)加入氨水調(diào)節(jié)pH值恒定在5.5，發(fā)酵90hr后，OD600＝110，加入0.5％甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)不同時(shí)間后取3ul無菌體的誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果(圖2)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，植酸酶的表達(dá)量不斷提高，60h后，上清液中的表達(dá)量保持穩(wěn)定。重組子P.pastoris FPHY34誘導(dǎo)60hr后，植酸酶表達(dá)量高達(dá)5.6mg/ml。表達(dá)的植酸酶分子量大小約為85kD。
在37℃pH5.5的條件下對(duì)含表達(dá)產(chǎn)物的培養(yǎng)液進(jìn)行植酸酶活性測(cè)定，重組酵母P.pastoris FPHY34培養(yǎng)60hr后，酶活力為130,000u/ml，增加誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間，植酸酶的表達(dá)量僅緩慢增加。實(shí)施例6植酸酶性質(zhì)測(cè)定將底物分別配制成pH＝1.5；2.5；3.5；4.5；5.5；6.5，以pH＝5.5時(shí)的酶活單位為100％，以高密度發(fā)酵上清液測(cè)定不同pH條件下植酸酶的相對(duì)活力。結(jié)果表明該植酸酶在pH2.5-6.5之間均有酶活力，pH值為5.5-6.5時(shí)，植酸酶活性達(dá)到最高，往中性范圍偏移酶活性沒有明顯變化(圖3)。
將上清液用90℃處理不同時(shí)間，放置冰上冷卻，加入酶反應(yīng)底物，37℃反應(yīng)30min，以未經(jīng)高溫處理的發(fā)酵液為參比，測(cè)定上清液中的殘存酶活性。經(jīng)過80min處理，植酸酶的活性仍保持40％。90℃高溫處理120min，仍有部分活性。(圖4)
權(quán)利要求
1.一種具有如下編碼的耐高溫植酸酶基因TCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTGGGATACCAATGCTCCCCTGCTACCTCCCACCTTTGGGGACAATACS K S C D T V D L G Y Q C S P A T S H L W G Q YTCTCCATTCTTCTCTTTGGAGGACGAACTTTCCGTTTCCTCCAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCACCTTGS P F F S L E D E L S V S S K L P K D C R I T LGTTCAAGTCTTGTCCAGACACGGTGCTAGATACCCAACCTCCTCCAAATCCAAAAAATACAAAAAACTGATCV Q V L S R H G A R Y P T S S K S K K Y K K LIACTGCTATCCAAGCTAACGCTACCGACTTCAAAGGAAAATACACTTTCTTGAAAACCTACAACTACACCTTGT A I Q A A T D F K G KY TF L K T Y Y T LGGAGCTGACGACTTGACCCCATTCGGAGAACAACAACTTGTCAACTCTGGAATCAAATTCTACCAAAGATACG A D D L T P F G E Q Q L V N S G I K F Y Q R YAAAGCACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTTCATCAGAGCTTCTGGCTCCGACAGAGTTATCGCTTCTGGAGAAK A L A R S V V P F I R A S G S D R V I A S G EAAATTCATCGAAGGATTCCAACAAGCTAAATTGGCTGACCCTGGAGCTACCAACAGAGCTGCTCCTGCTATCK F I E G F Q Q A K L A D P G A T N R A A P A ITCCGTTATCATCCCAGAATCCGAAACCTTCAACAACACCTTGGACCACGGTGTTTGCACCAAATTCGAGGCTS V I I P E S E T F N T L D H G V C T K F E ATCTGAACTTGGAGACGAGGTCGAGGCTAACTTCACCGCTTTGTTCGCTCCTGACATCAGAGCTAGAGCTGAASEL G D E VEA N F T A L F A P D I R A R A EAAACACTTGCCTGGTGTCACCTTGACCGACGAAGACGTTGTTTCCTTGATGGATATGTGCCCCTTCGACACCK H L P G V T L T D E D V V S L M D M CPF D TGTTGCTAGAACCTCCGACGCTTCCCAACTTTCCCCATTCTGCCAACTTTTCACCCACAACGAATGGAAAAAAV A R T S D A S Q L S P F C Q L F T H N E W K KTACAACTACCTGCAGTCCTTGGGAAAATACTACGGATACGGAGCTGGAAACCCATTGGGACCAGCTCAAGGAY N Y L Q S L G K Y Y G Y G A G N P L G P A Q GATCGGATTCGCCAACGAATTGATCGCTAGATTGACCAGATCCCCAGTTCAAGACCACACCTCCACTAACTCCI G FAN E L I A R L T R S P V Q D H T S T SACCTTGGTTTCCAACCCAGCTACCTTCCCATTGAACGCTACCATGTACGTTGACTTCTCCCACGACAACTCTT L V S N P A T F P L A T M Y V D F S H D N SATGATCTCCATCTTCTTCGCTTTGGGACTTTACAACGGAACTGAACCATTGTCCAGAACTTCCGTTGAATCCMIS I F F A L G L Y G T E P L S R T S V E SGCTAAAGAACTTGACGGATACTCCGCTTCCTGGGTTGTTCCATTCGGTGCTAGAGCTTACTTTGAAACTATGA K E L D G Y S A S W V V P F G A R A Y F E T MCAATGCAAATCCGAAAAAGAACCATTGGTTAGAGTCTTGATTAACGACAGAGTTGTTCCATTGCACGGATGCQ C K S E K E P L V RVL I N D R V V P L H G CGACGTTGACAAATTGGGAAGATGCAAATTGAACGACTTCGTTAAAGGATTGTCTTGGGCTAGATCCGGTGGTD V D K L G R C K L N D F V K G L S W A R S G GAACTGGGGTGAATGCTTCTCCTAAN W G E C F S -
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述耐高溫植酸酶基因，其特征在于該植酸酶含有6個(gè)糖激化位點(diǎn)，基因長度為1320bp，核苷酸同源性為73％，核苷酸密碼全部為酵母偏愛密碼。
3.如權(quán)利要求1所述耐高溫植酸酶基因制備方法為如下步驟a、采用連續(xù)延伸PCR合成耐高溫植酸酶基因；b、以上合成的耐高溫植酸酶基因?yàn)槟０?，利用DNA分子重排技術(shù)對(duì)合成基因進(jìn)行體外重組，F(xiàn)phyZ 1、FphyF 1為引物擴(kuò)增重排的植酸酶基因，回收1.4Kb重排的植酸酶基因片段，構(gòu)建到原核表達(dá)載體中，電擊法轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株DH5α，獲得突變體表達(dá)文庫進(jìn)行高比活植酸酶篩選；c、按合成基因的兩端序列設(shè)計(jì)引物，在基因5’端加入Xho I切點(diǎn)和信號(hào)態(tài)切割序列，引物為FP1Z(5’-AACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAGGCTTCCAA ATCCTGCGACACCGTTGAC TTG-3’)，在基因3’端加入Not I切點(diǎn)引物為FP1F(5’-AACGCGGCCGCTTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTAC-3’)。擴(kuò)增片段克隆后，Xho I和Not I雙酶切，定向插入pPIC9載體，構(gòu)建成耐高溫植酸酶基因的酵母表達(dá)載體pPfphy。d、植酸酶高表達(dá)重組酵母篩選；e、將重組酵母菌菌株高密度發(fā)酵。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述具有酵母表達(dá)耐高溫植酸酶基因的制備方法，其特征在于構(gòu)建的酵母表達(dá)載體pPfphy含有權(quán)利要求1所述耐高溫植酸酶基因序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有表達(dá)耐高溫植酸酶基因的制備方法，其特征在于合成植酸酶基因通過體外分子重排后，采用引物為FphyZ 1和FphyF 1，擴(kuò)增片段，BamHI和SacI雙酶切定向插入啟動(dòng)子和t1+2終止子之間，構(gòu)建成植酸酶基因原核表達(dá)載體庫。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在甲醇酵母中高表達(dá)的耐高溫植酸酶基因以及它的制備方法，本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增技術(shù)合成耐高溫植酸酶基因，并對(duì)其進(jìn)行DNA改組，在原核表達(dá)質(zhì)粒上構(gòu)建突變植酸酶基因文庫，通過突變植酸酶篩選獲得耐高溫植酸酶基因，通過改變基因的偏愛密碼，使基因適合在酵母中表達(dá)，通過電擊轉(zhuǎn)化將耐高溫的植酸酶基因整合到畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)高表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N1/19GK1475572SQ0213653
公開日2004年2月18日 申請(qǐng)日期2002年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月16日
發(fā)明者姚泉洪, 彭日荷, 熊愛生, 吳偉, 劉承訓(xùn) 申請(qǐng)人:上海永業(yè)農(nóng)科生物工程有限公司