專利名稱：兩真菌與一細(xì)菌原生質(zhì)體融合的特效菌株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特效菌株及其構(gòu)建方法，尤其是一種用于降解有機(jī)污染物的微生物新菌種的生物構(gòu)建和應(yīng)用技術(shù)，更具體而言是兩真菌與一細(xì)菌原生質(zhì)體融合的特效菌株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
就原生質(zhì)體融合生物技術(shù)而言，國(guó)際上已有種種原生質(zhì)體融合專利，但是沒(méi)有兩界三親菌株的融合技術(shù)專利。如用于選擇抗生素的菌種，如Imada C，Isolationand characterization of the interspecific fusants from Streptomycetes obtained using aliquor regeneration method，F(xiàn)ISHERIES SCI，68(2)395-402，2002；和Baltz RH，Genetic methods and strategies for secondary metabolite yield improvement inantinomycetes，ANTON TEEUW INT J G 79(3-4)251-259，2001。未見(jiàn)有專用于處理廢水的三種微生物原生質(zhì)體融合菌種和構(gòu)建專利，尤其是未見(jiàn)真核原核兩界菌株原生質(zhì)體融合的構(gòu)建菌種技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是用兩界微生物菌株原生質(zhì)體融合的菌種構(gòu)建新菌株，將三個(gè)菌株的基因和優(yōu)勢(shì)，通過(guò)體內(nèi)重組與整合，構(gòu)建在一個(gè)菌株細(xì)胞內(nèi)，用于廢水處理。
一種特效菌株及其構(gòu)建方法，親株1白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)真核細(xì)胞，親株2土著細(xì)菌YZ1(Pseudomonas)原核細(xì)胞，親株3釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核細(xì)胞中，2個(gè)真菌親株的真核細(xì)胞原生質(zhì)體制備是用蝸牛酶脫去細(xì)胞壁及1個(gè)細(xì)菌親株的原核細(xì)胞原生質(zhì)體是用溶菌酶脫去細(xì)胞壁，制備生成的原生質(zhì)體經(jīng)離心收集、緩沖液清洗后獲得，然后進(jìn)行二次融合。第一次融合等量的親株1白腐真菌(或親株3釀酒酵母)細(xì)胞和親株2土著細(xì)菌YZ1細(xì)胞的原生質(zhì)體混合、并在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的誘導(dǎo)液中融合，經(jīng)離心后收集融合產(chǎn)物、高滲緩沖液離心清洗后分別涂布于SIM1、SIM2、SIM3三種固體鑒別培養(yǎng)基上、30℃培養(yǎng)7天，同時(shí)能在三種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落，為第一次雙親跨界融合的產(chǎn)物Fhh；而親株1白腐真菌細(xì)胞(或親株3釀酒酵母)細(xì)胞和親株2土著細(xì)菌YZ1細(xì)胞，只能分別在SIM1和SIM2上生長(zhǎng)；第二次融合上次得到的等量的Fhh和親株3釀酒酵母(或親株1白腐真菌)細(xì)胞的原生質(zhì)體混合、在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的誘導(dǎo)液中融合，經(jīng)離心后收集融合產(chǎn)物、含蔗糖高滲緩沖液離心清洗后、分別涂布于SIM1、SIM2、SIM3三種固體鑒別培養(yǎng)基上，同時(shí)能在三種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落為三親跨界融合的產(chǎn)物NJU-Fhhh1或Fhh。
所述固體鑒別培養(yǎng)基(SIM)為單一抗細(xì)菌的抗生素[SIM1＝SM+100u鏈霉素/ml(streptomycin，Sm)]和單一抗真菌的抗生素[SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)]以及二種抗生菌同時(shí)存在的組合[SIM3＝SM+100u鏈霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)]發(fā)明的有益效果(1)融合構(gòu)建NJU-Fhhh1特效菌的成本，低于分子克隆，費(fèi)用在10萬(wàn)元人民幣以內(nèi)；(2)原生質(zhì)體融合菌株的遺傳性能穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，同時(shí)含有三親株DNA的功能優(yōu)勢(shì)；(3)原生質(zhì)體融合技術(shù)操作較分子克隆簡(jiǎn)便，可以省去建立基因圖譜等操作；(4)原生質(zhì)體融合是自然基因在細(xì)胞內(nèi)重組，沒(méi)有創(chuàng)造新基因，不存在基因污染問(wèn)題。
總之，本發(fā)明是兩界三個(gè)親株微生物原生質(zhì)體融合的原創(chuàng)性的生物技術(shù)。是應(yīng)用兩界三親菌株原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建特效菌處理廢水的首例。本發(fā)明親株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)具有高降解性，親株2土著細(xì)菌YZ1(Pseudomonas)具有高適應(yīng)性，親株3釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有高絮凝性。融合三親菌株，通過(guò)基因在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的重組整合，獲得了特效菌NJU-Fhhh1，集中了三個(gè)親株的高降解性、高適應(yīng)性、高絮凝性的三高優(yōu)勢(shì)，利于高效處理有機(jī)廢水。使用效果NJU-Fhhh1降解PTA石化廢水的比降解率為0.263h-1，是土著菌的12倍。
四

圖1為本發(fā)明親株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)電子顯微鏡照片圖2為本發(fā)明親株2土著細(xì)菌YZ1(Pseudomonas)，電子顯微鏡照片圖3為本發(fā)明親株3釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)電子顯微鏡照片圖4為本發(fā)明三株融合后得到的NJU-Fhhh1菌株電子顯微鏡照片圖五具體實(shí)施方式
本發(fā)明一般由白腐真菌和親株2土著細(xì)菌YZ1細(xì)胞的原生質(zhì)體先行融合后再與釀酒酵母細(xì)胞融合較優(yōu)，即白腐真菌+土著細(xì)菌YZ1＝Fhh(第一次融合)，F(xiàn)hh+釀酒酵母細(xì)胞＝Fhhh(第二次融合)。以下為實(shí)施例A.試劑來(lái)源蝸牛酶和溶菌酶為上海華美公司產(chǎn)品；聚乙二醇(MW＝6000)為日本進(jìn)口；Giemsa染色劑為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑B.基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(MM)1000ml中K2HPO43g；KH2PO41g；NH4NO30.5g；Na2SO40.1g；MgSO4·7H2O 10mg；MnSO4·4H2O 1mg；CaCl20.5mg；FeSO4·7H2O 1mg；CH3COONa 5g；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；葡萄糖10g；200g馬鈴薯浸出汁，調(diào)pH至7.0；121℃、103kPa、濕熱滅菌20min。最適培養(yǎng)溫度35℃；最適pH7.0。C.固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SM)SM＝液體培養(yǎng)基(MM)+2％瓊脂；D.固體鑒別培養(yǎng)基(SIM)SIM1＝SM+100u鏈霉素/ml(streptomycin，Sm)，SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)，SIM3＝SM+100u鏈霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)E.真核細(xì)胞(親株1白腐真菌、親株3釀酒酵母)原生質(zhì)體制備10,000rpm離心收集每毫升108個(gè)細(xì)胞的菌體、0.5％蝸牛酶、30℃反應(yīng)40分鐘脫去細(xì)胞壁、生成原生質(zhì)體。10,000rpm離心10分鐘收集原生質(zhì)體、pH7.0緩沖液清洗2遍。E.原核細(xì)胞(親株2土著細(xì)菌YZ1)原生質(zhì)體制備土著細(xì)菌YZ1(Pseudomonas)假單胞菌屬，是廢水處理現(xiàn)場(chǎng)的能與廢水共生的假單胞菌屬的菌種，如圖3中所給出的外形。10,000rpm離心收集每毫升108個(gè)細(xì)胞的菌體、0.5％溶菌酶、30℃反應(yīng)40分鐘脫去細(xì)胞壁、生成原生質(zhì)體。10,000rpm離心10分鐘收集原生質(zhì)體、pH7.0緩沖液清洗2遍。F.第一次融合等量的親株1白腐真菌細(xì)胞和親株2土著細(xì)菌YZ1細(xì)胞的原生質(zhì)體混合、35％的聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、20mmol的CaCl2、蔗糖17％、30℃誘導(dǎo)融合30分鐘，10,000rpm離心10分鐘收集融合產(chǎn)物、pH7.0的17％蔗糖高滲緩沖液離心清洗2遍、分別涂布于SIM1、SIM2、SIM3三種固體鑒別培養(yǎng)基上、30℃培養(yǎng)7天，同時(shí)能在三種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落，為第一次雙親跨界融合的產(chǎn)物Fhh；而親株1白腐真菌細(xì)胞和親株2土著細(xì)菌YZ1細(xì)胞，只能分別在SIM1和SIM2上生長(zhǎng)。G.第二次融合等量的Fhh和親株3釀酒酵母細(xì)胞的原生質(zhì)體混合、35％的聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、20mmol的CaCl2、蔗糖17％、30℃誘導(dǎo)融合30分鐘，10,000rpm離心10分鐘收集融合產(chǎn)物、pH7.0的17％蔗糖高滲緩沖液離心清洗2遍、分別涂布于SIM1、SIM2、SIM3三種固體鑒別培養(yǎng)基上、30℃培養(yǎng)7天，同時(shí)能在三種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落為三親跨界融合的產(chǎn)物NJU-Fhhh1或Fhh。H.電子掃描顯微鏡(SEM)形態(tài)鑒定14天連續(xù)分離純化Fhhh和Fhh、及親株1白腐真菌、親株2土著細(xì)菌YZ1、親株3釀酒酵母的單菌落，對(duì)該5菌株的純化單菌落細(xì)胞，用SEM放大10萬(wàn)倍攝像，確定NJU-Fhhh1菌株的形態(tài)特征既不同于Fhh，也不同于任一親株菌。如圖所示。I.分子遺傳學(xué)鑒定由上海生物工程公司合成親株1白腐真菌的mnp1、mnp2、lip1、lip2基因引物、親株2土著細(xì)菌YZ1的16SrDNA引物、親株3釀酒酵母的FLO1基因引物，應(yīng)用該6對(duì)引物，同時(shí)對(duì)Fhhh、Fhh、親株1、親株2、親株3的5個(gè)菌株的染色體DNA模板，進(jìn)行DNA擴(kuò)增(PCR)反應(yīng)，鑒定出只有NJU-Fhhh1同時(shí)含有三個(gè)親株的基因DNA片斷，F(xiàn)hh只含有兩個(gè)親株的基因DNA片斷，三親株只含有各自的基因DNA片斷。如圖所示。NJU-Fhhh1特效菌株構(gòu)建方法的流程(1)親株1白腐真菌細(xì)胞原生質(zhì)體制備(2)親株2土著細(xì)菌YZ1細(xì)胞原生質(zhì)體制備(3)等量混合親株1真核細(xì)胞與親株2原核細(xì)胞的原生質(zhì)體(4)聚乙二醇和Ca2+誘導(dǎo)親株1與親株2原生質(zhì)體的首次兩界細(xì)胞(雙親株)融合(5)SIM3雙抗培養(yǎng)基，初篩獲得首次兩界細(xì)胞的融合產(chǎn)物Fhh(6)制備兩界細(xì)胞融合產(chǎn)物Fhh的原生質(zhì)體(7)制備親株3釀酒酵母原生質(zhì)體(方法同親株1白腐真菌細(xì)胞原生質(zhì)體制備)(8)等量混合Fhh與親株3釀酒酵母的原生質(zhì)體(9)聚乙二醇和Ca2+誘導(dǎo)Fhh與親株3原生質(zhì)體的第二次兩界細(xì)胞(三親株)融合(10)SIM3雙抗培養(yǎng)基初篩獲得第二次兩界細(xì)胞(三親株)融合產(chǎn)物NJU-Fhhh1或Fhh(11)純化分離培養(yǎng)14天，SEM電子掃描顯微鏡鑒定出NJU-Fhhh1細(xì)胞形態(tài)不同于Fhh(12)PCR鑒定NJU-Fhhh1細(xì)胞，同時(shí)含有親株1白腐真菌的mnp1、mnp2、lip1、lip2基因、親株2土著細(xì)菌YZ1的16SrDNA、親株3釀酒酵母的FLO1基因的6個(gè)基因DNA片段(13)純化、篩選出性能穩(wěn)定的高效處理廢水的NJU-Fhhh1特效菌(14)進(jìn)入NJU-Fhhh1特效菌處理廢水的應(yīng)用應(yīng)用實(shí)例名稱三親株跨界融合構(gòu)建工程菌Fhhh降解精對(duì)苯二甲酸PTA石化廢水三親株名稱白腐真菌PC[真核細(xì)胞]、土著菌YZ1[原核細(xì)胞]、釀酒酵母SC[真核細(xì)胞](1)白腐真菌PC真核細(xì)胞原生質(zhì)體制備及條件10,000rpm離心108細(xì)胞菌液10分鐘，收集菌體、0.5％蝸牛酶、30℃反應(yīng)40分鐘、10,000rpm離心收集原生質(zhì)體、PH7.0緩沖液離心清洗2遍。
(2)PTA石化廢水土著細(xì)菌YZ1原生質(zhì)體制備及條件10,000rpm離心108細(xì)胞菌液10分鐘，收集菌體細(xì)胞、0.5％溶菌酶、30℃反應(yīng)40分鐘、10,000rpm離心收集原生質(zhì)體、PH7.0緩沖液離心清洗2遍。
(3)等量混合PC與YZ1的原生質(zhì)體，(4)聚乙二醇和Ca2+誘導(dǎo)PC與YZ1雙親跨界融合35％的聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、20mmol的CaCl2、蔗糖17％、30℃誘導(dǎo)融合30分鐘，(5)雙親首次跨界融合產(chǎn)物Fhh初篩10,000rpm離心10分鐘收融合產(chǎn)物Fhh、PH7.0、蔗糖17％高滲緩沖液、離心清洗2遍、分別涂布于SIM1、SIM2、SIM3三種固體鑒別培養(yǎng)基上、30℃培養(yǎng)7天，同時(shí)能在三種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落為Fhh。
(6)Fhh原生質(zhì)體制備[操作同于(1)PC](7)SC原生質(zhì)體制備[操作同于(1)PC](8)聚乙二醇和Ca2+誘導(dǎo)Fhh與SC的三親株跨界融合[操作同于(3)的雙親跨界融合](9)等量混合Fhh與SC原生質(zhì)體(10)第二次跨界融合(三親)產(chǎn)物Fhhh初篩[操作同于(4)]。能在SIM3雙抗培養(yǎng)基的有三親跨界融合的Fhhh和雙親跨界融合的Fhh。
(11)連續(xù)純化分離培養(yǎng)14天Fhhh、Fhh、PC、SC、YZ1，SEM電子掃描顯微鏡，放大10萬(wàn)倍，掃描攝像鑒定出Fhhh形態(tài)不同于Fhh，初獲Fhhh純菌株。
(12)分子遺傳學(xué)鑒定Fhhh700代以上的Fhhh純化物，用PCR-DNA擴(kuò)增技術(shù)，鑒定出只有同時(shí)含有PC的mnp基因、SC的FLO1基因和YZ1的16SrDNA片斷的才是真正的Fhhh，表明Fhhh有遺傳穩(wěn)定性(13)獲得純化穩(wěn)定的Fhhh遺傳工程菌(14)進(jìn)入廢水處理應(yīng)用階段的技術(shù)開(kāi)發(fā)三親株跨界融合構(gòu)建工程菌技術(shù)的實(shí)例總結(jié)1.PC、YZ1、SC兩界三親株跨界融合構(gòu)建獲得的工程菌為Fhhh.
2.Fhhh能在同時(shí)含有100u制霉菌素/ml和100u鏈霉素/ml培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，三親菌株各自不能。
3.Fhhh細(xì)胞長(zhǎng)軸1.407±0.016μm、短軸1.278±0.017μm、體積1.206±0.030μm3，不同于任一親株。
4.Fhhh同時(shí)含有三親株基因DNA片段，綜合了三親株的高降解性、高絮凝性、高適應(yīng)性，具有遺傳穩(wěn)定性5.Fhhh降解精對(duì)苯二甲酸PTA石化廢水的比降解率q為0.263h-1，是土著菌YZ1的12倍。
特效菌株Fhhh原生質(zhì)體跨界融合的雙抗生化鑒定及生成、再生、融合率跨界融合過(guò)程序第一次跨界融合 第二次跨界融合號(hào)親株及跨界融合親株一次親株二次融子 融合 合子子菌株簡(jiǎn)稱 PC or SC YZ1Fhh Fhh SC or PC Fhhh鏈霉素Sm培養(yǎng) 生長(zhǎng) 不生長(zhǎng) -生長(zhǎng)生長(zhǎng) -基，100u/ml制霉菌素Nt培養(yǎng) 不生長(zhǎng)生長(zhǎng)-生長(zhǎng)不生長(zhǎng) -基，100u/mlSm+Nt的雙抗培養(yǎng) 不生長(zhǎng)不生長(zhǎng) 生長(zhǎng) 生長(zhǎng)不生長(zhǎng) 生長(zhǎng)基，100u/ml原生質(zhì)體生成 90.7/86.8 82.6/87.2 -83.4/85.4 87.6/86.3 -率，％原生質(zhì)體再生 5.8/7.1 3.4/2.3 -3.4/3.5 3.3/3.5-率，％原生質(zhì)體跨界融 0.62/0.39 - 1.25/0.57-合率，×10-6特效菌株Fhhh及其三親菌株細(xì)胞電子掃描顯微鏡(SEM)形態(tài)學(xué)鑒定1.細(xì)胞前處理菌體細(xì)胞樣品，經(jīng)0.2μm聚碳酸酯膜過(guò)濾(Gelman Science，AnnArbor.MI USA)，無(wú)菌水 沖洗，3％戊二醛-0.2M鈉鉀鈷素緩沖液浸泡過(guò)夜，OsO4固定。鈉鉀鈷素及不同濃度乙醇過(guò)洗脫水，液態(tài)CO2干燥。噴鍍鈀合金。
2.電子顯微鏡掃描測(cè)定電子掃描顯微鏡，AMR 1000 Scanning ElectronMicroscope，USA。條件EHT＝12.00KV，WD＝16mm，Mag＝5.00kx，Detector＝SE1。
3.特效菌株Fhhh及其三親株SEM的細(xì)胞尺寸菌株簡(jiǎn)稱PC YZ1SC FhhFhhh長(zhǎng)(μm) 3.567±0.196 3.310±0.223 3.500±0.242 2.944±0.106 1.407±0.016直徑(μm) 0.589±0.017 0.989±0.026 2.926±0.074 0.711±0.018 1.278±0.017體積(μm3) 0.971±0.181 2.542±0.171 15.682±1.085 1.168±0.042 1.206±0.030本發(fā)明特效菌株Fhhh含有三親菌株基因DNA片段分子遺傳學(xué)鑒定1.儀器設(shè)備(1)Incubation shakerG25-KLC，New Brunswick Scientific.Co，USA
(2)Gel imaging systemTSTC GIS-7000，TSTC Shanghai，China(3)Electrophoresis instrumentDY-602V，Nanda company，NJU，China(4)PCRAuthorized Thermal CyclerMastercycler Personal.Eppendorf，Germany2.DNA marker(標(biāo)準(zhǔn)分子量)26-501bp，pUC19 DNA/Msp1(Hpa II)，MBIFermentas，USA；100-3000bp，GeneRulerTM100bp DNA Ladder Plus，MBIFermentas，USA。
3.PCR kit上海生工。
4.PCR模板The cell walls of SC，PC and Fhhh were fractured with snail enzyme，and YZ1 with lysozyme at 37℃ for 1h.Releasing the Ch-DNA with SDS wasconducted at 60℃ for 0.5h，，then kept on blue ice for 0.5h，centrifuged at10000rpm for 10min.CH3CONH4was used to remove the protein，95％ of coldalcohol was used to set down Ch-DNA as the PCR template.
5.PCR 6對(duì)引物的設(shè)計(jì)與合成DNA菌株序號(hào) 合成引物的DNA序列 參考文獻(xiàn) 合成單位5’-ATG GGA GTA GCG GAA Godfrey，199 上海植生所1mnp1 GCA-3’ 0(PC) 3’-CGA GTG CGG TGA AGA Godfrey，199 上海植生所2GTA-5’ 05’-ATG TAG GCA GAC TGC Godfrey，199 上海植生所3mnp2 AAG-3’ 0(PC) 3’-GAG GTG CTG CTC AAG Godfrey，1994 上海植生所GTA-5’ 05’-ATG TCG TCG AGA AGC Naidou，19925 上海植生所lip1 GTC-3’(PC) 3’-ACA TCG GTC TCG ACG Naidou，19926 上海植生所GTA-5’5’-ATG AAG CGA CCA CGA Naidou，19927 上海植生所lip2 CAG-3’(PC) 3’-CGA CTC TCA CCA CTC Naidou，19928 上海植生所GTA-5’5’-CGG AAT TCC TCC AAC TAC Teunissen，1999 上海生工公司FLO1 TG-3’ 3(SC) 3’-CAG AAG CGC AGG CTT AAG Teunissen，19910 上海生工公司GC-5’ 3
5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT Griffiths，20011上海生工公司16SrDNA T-3’ 0(YZ1) 12 3’-GAC TCG GTC CTA GTT TGG Griffiths，200上海生工公司AG-5’ 06.特效菌Fhhh同時(shí)含有三親株細(xì)胞中基因DNA片段的PCR測(cè)定結(jié)果基因DNA Fhhh與PC Fhhh與SC Fhhh與YZ1mnp1 2個(gè)片段相同無(wú)無(wú)mnp2 1個(gè)片段相同無(wú)無(wú)lip1 2個(gè)片段相同無(wú)無(wú)lip2 1個(gè)片段相同無(wú)無(wú)FLO1 無(wú)1個(gè)片段相同 無(wú)16SrDNA無(wú)無(wú) 2個(gè)片段相同本發(fā)明的微生物保藏資料2002年7月26日保藏，保藏編號(hào)是CGMCCNo.0783三親株跨界融合特效菌是白腐真菌(phanerochaete chrysoporium)釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、土著細(xì)菌(YZ1)三者原生質(zhì)體融合產(chǎn)物。中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，地址北京海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
權(quán)利要求
1.一種由兩真菌與一細(xì)菌原生質(zhì)體融合的特效菌株，其特征是以親株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)，親株2土著細(xì)菌YZ1(Pseudomonas)，親株3釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核細(xì)胞原生質(zhì)體和原核細(xì)胞原生質(zhì)體制備后融合。先制備原生質(zhì)體，并經(jīng)離心后收集、緩沖液清洗后獲得，然后進(jìn)行二次融合。第一次融合等量的親株1白腐真菌或親株3釀酒酵母細(xì)胞的原生質(zhì)體與親株2土著細(xì)菌YZ1細(xì)胞的原生質(zhì)體混合、并在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的誘導(dǎo)液中融合，經(jīng)離心后收集融合產(chǎn)物；第二次融合上次得到的等量的Fhh與親株3釀酒酵母或白腐真菌細(xì)胞的原生質(zhì)體混合、在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的誘導(dǎo)液中融合，經(jīng)離心后收集融合產(chǎn)物、含蔗糖高滲緩沖液離心清洗后、分別涂布于SIM1、SIM2、SIM3三種固體鑒別培養(yǎng)基上，同時(shí)能在三種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落為三親跨界融合的產(chǎn)物NJU-Fhhh1或Fhh。
2.一種由兩真菌與一細(xì)菌原生質(zhì)體融合的特效菌株構(gòu)建方法，其特征是由親株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)，親株2土著細(xì)菌YZ1(Pseudomonas)，親株3釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核細(xì)胞和原核細(xì)胞先進(jìn)行原生質(zhì)體的制備用蝸牛酶和溶菌酶分別脫去真菌和細(xì)菌細(xì)胞壁、生成原生質(zhì)體并經(jīng)離心收集、緩沖液清洗后獲得，然后進(jìn)行二次融合，第一次融合等量的親株1白腐真菌PC或釀酒酵母細(xì)胞SC和親株2土著細(xì)菌YZ1細(xì)胞的原生質(zhì)體混合、并在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的誘導(dǎo)液中融合，經(jīng)離心后收集融合產(chǎn)物、高滲緩沖液離心清洗后；第二次融合上次得到的等量的Fhh和親株3釀酒酵母SC或白腐真菌PC細(xì)胞的原生質(zhì)體混合、在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的誘導(dǎo)液中融合，經(jīng)離心后收集融合產(chǎn)物、含蔗糖高滲緩沖液離心清洗后、分別涂布于SIM1、SIM2、SIM3三種固體鑒別培養(yǎng)基上，同時(shí)能在三種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落為三親跨界融合的產(chǎn)物NJU-Fhhh1或Fhh。
3.由權(quán)利要求2所述的特效菌株構(gòu)建方法，其特征是第一次融合原生質(zhì)體分別涂布于SIM1、SIM2、SIM3三種固體鑒別培養(yǎng)基上，以30℃培養(yǎng)7天，同時(shí)能在三種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落，為第一次雙親跨界融合的產(chǎn)物Fhh；第一次雙親跨界融合的產(chǎn)物Fhh再進(jìn)行第二次融合。
4.由權(quán)利要求2所述的特效菌株構(gòu)建方法，其特征是所述固體鑒別培養(yǎng)基(SIM)為抗細(xì)菌的抗生素和抗真菌的抗生素以及二種抗生菌的組合。
5.由權(quán)利要求4所述的特效菌株構(gòu)建方法，其特征是所述抗生素為抗細(xì)菌的抗生素和抗真菌的抗生素，即抗細(xì)菌的鏈霉素和抗真菌的制霉菌素。SIM1＝SM+100u鏈霉素/ml(streptomycin，Sm)，SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)，SIM3＝SM+100u鏈霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)。
6.由權(quán)利要求2所述的特效菌株構(gòu)建方法，其特征是白腐真菌PC真核細(xì)胞原生質(zhì)體制備及條件10,000rpm離心108細(xì)胞菌液10分鐘，收集菌體、0.5％蝸牛酶、30℃反應(yīng)40分鐘、10,000rpm離心收集原生質(zhì)體、PH7.0緩沖液離心清洗2遍。
7.由權(quán)利要求2所述的特效菌株構(gòu)建方法，其特征是以PTA石化廢水土著細(xì)菌YZ1(Pseudomonas)屬于假單胞菌屬，土著細(xì)菌YZ1原生質(zhì)體制備及條件10,000rpm離心108細(xì)胞菌液10分鐘，收集菌體細(xì)胞、0.5％溶菌酶、30℃反應(yīng)40分鐘、10,000rpm離心收集原生質(zhì)體、PH7.0緩沖液離心清洗2遍。
8.由權(quán)利要求2所述的特效菌株構(gòu)建方法，其特征是聚乙二醇和Ca2+誘導(dǎo)PC或SC與YZ1雙親跨界融合35％的聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、20mmol的CaCl2、蔗糖17％、30℃誘導(dǎo)融合30分鐘，并經(jīng)雙親首次跨界融合產(chǎn)物Fhh初篩10,000rpm離心10分鐘收融合產(chǎn)物Fhh、PH7.0、蔗糖17％高滲緩沖液、離心清洗2遍、分別涂布于SIM1、SIM2、SIM3三種固體鑒別培養(yǎng)基上、30℃培養(yǎng)7天，同時(shí)能在三種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落為Fhh。
9.由權(quán)利要求8所述的特效菌株構(gòu)建方法，其特征是先制備Fhh原生質(zhì)體和SC或PC原生質(zhì)體，經(jīng)聚乙二醇和Ca2+誘導(dǎo)Fhh與SC或PC的三親株跨界融合等量混合Fhh與SC或PC原生質(zhì)體，第二次跨界融合(三親)產(chǎn)物Fhhh初篩，能在SIM3雙抗培養(yǎng)基的有三親跨界融合的Fhhh和雙親跨界融合的Fhh。
全文摘要
兩真菌與一細(xì)菌原生質(zhì)體融合的特效菌株及其構(gòu)建方法，是將白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)真核細(xì)胞、土著細(xì)菌YZ1原核細(xì)胞(Pseudomonas)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核細(xì)胞，共三個(gè)親株菌的兩界細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，三親基因在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)重組整合，構(gòu)建出基因工程特效菌。該技術(shù)由雙親跨界融合和三親跨界融合兩部分組成。特效菌株同時(shí)含有三親的基因DNA片段，綜合了三親株優(yōu)勢(shì)，利于處理廢水。原生質(zhì)體融合不產(chǎn)生新基因，不存在基因污染問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N15/08GK1405307SQ0213817
公開(kāi)日2003年3月26日 申請(qǐng)日期2002年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月26日
發(fā)明者程樹(shù)培, 郝春博, 闕子龍, 陳俊, 顧繼東, 李維新, 黃秋明, 于紅霞, 孫成, 嚴(yán)俊, 張徐祥, 石磊 申請(qǐng)人:南京大學(xué)