專(zhuān)利名稱(chēng)：給基質(zhì)提供具有現(xiàn)成的均勻分布的細(xì)胞外基質(zhì)的方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明的領(lǐng)域
本發(fā)明涉及提供一種獨(dú)特的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及從細(xì)胞培養(yǎng)裝置中提取液體的方法，所述地裝置包括粘附在基質(zhì)上的均勻分布的胞外基質(zhì)。
2.相關(guān)的
背景技術(shù)：
存在于細(xì)胞間的纖維狀和球形蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀系統(tǒng)稱(chēng)之為胞外基質(zhì)(ECM)。ECM是細(xì)胞環(huán)境的一種重要組成部分。細(xì)胞分泌的各種ECM成分形成基質(zhì)間質(zhì)和基質(zhì)膜，在體內(nèi)細(xì)胞錨定在該構(gòu)架上。這些結(jié)構(gòu)提供了組織特異性組織學(xué)的機(jī)體形成和發(fā)展所需要的空間定位和穩(wěn)定性。然而，ECM并不僅僅是無(wú)活性的支架，而是一種在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化中的必需物。ECM提供了一種環(huán)境，在正常的病理重新成型過(guò)程中(如胚胎發(fā)育，組織修復(fù)，炎癥，腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能時(shí)扮演著重要角色。例如，ECM對(duì)生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)，結(jié)合，儲(chǔ)存和呈遞功能是公知的。
認(rèn)識(shí)到ECM是在細(xì)胞微環(huán)境的重要組成成分這一事實(shí)后，越來(lái)越多的研究者正將細(xì)胞外基質(zhì)摻入到它們的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。ECM的體外應(yīng)用，給細(xì)胞提供盡可能接近于它們?cè)隗w內(nèi)的生理環(huán)境狀態(tài)。ECM為細(xì)胞提供機(jī)械支撐，并通過(guò)提供生物化學(xué)信息(所述信息通過(guò)細(xì)胞表面受體而影響細(xì)胞)，影響細(xì)胞的行為。
基質(zhì)膜是一種特殊類(lèi)型的胞外基質(zhì)，主要由層粘連蛋白和IV型膠原構(gòu)成。從Englelbreth-Holm-Swarm老鼠瘤提取的著名的基質(zhì)膜基質(zhì)，以MATRIGEL的商品名稱(chēng)出售。這種老鼠瘤富含基質(zhì)膜蛋白質(zhì)。這種基質(zhì)的主要成分是層粘連蛋白、IV膠原、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，也含有生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs[膠原酶])，和其他的蛋白酶(血漿酶原活化劑)，以及幾種未界定的化合物，但是并不含有可檢測(cè)水平的金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMPs)。在室溫下，MATRIGEL基質(zhì)凝膠化并形成重構(gòu)的基質(zhì)膜，在結(jié)構(gòu)、成分、物理性能和在體內(nèi)保持功能特性的能力方面與活體基質(zhì)膜相似。
已經(jīng)使用MATRIGEL基質(zhì)開(kāi)發(fā)了一些方法，從而在體外研究腫瘤細(xì)胞侵入基質(zhì)膜基質(zhì)的情況。典型的，這些方法涉及將MATRIGEL基質(zhì)包被在細(xì)胞培養(yǎng)插件(inserts)的微孔膜上。制備含有ECM的細(xì)胞培養(yǎng)體系的常規(guī)技術(shù)包括，首先加熱冰冷的、中性可溶膠原的溶液，以誘導(dǎo)天然的原纖維發(fā)生聚合和沉淀。在升高到4℃以上的溫度下保溫MATRIGEL基質(zhì)，可聚合這種基質(zhì)。
然而，細(xì)胞培養(yǎng)中使用的無(wú)定型、化學(xué)交聯(lián)和堿性改性的膠原質(zhì)膜常常被干燥，以改進(jìn)儲(chǔ)存壽命并且不必每次使用前制備這種細(xì)胞培養(yǎng)基，因而制備含有天然的纖維膠原質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基并僅僅使用天然纖維的固定的、粘著的凝膠的形式。這些凝膠通常按照上述方法生產(chǎn)，即通過(guò)加熱冰冷的、中性的可溶膠原溶液以誘導(dǎo)天然原纖維發(fā)生聚合和沉淀。可是，它們不能干燥儲(chǔ)存，因?yàn)樵缦仁固烊焕w維膠原質(zhì)凝膠收縮和干燥的作法導(dǎo)致了天然結(jié)構(gòu)的喪失，次最佳的纖維形成和差勁的滲透性能。因此，必須在使用之前制備天然纖維膠原質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基。這增加了采用天然纖維膠原質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行研究的勞力和不方便性。于是，存在一種對(duì)于含有天然纖維膠原(如在MATRIGEL基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的天然纖維膠原質(zhì))的細(xì)胞培養(yǎng)基的需求，該培養(yǎng)基能夠在使用之前用制備物進(jìn)行制備。
制備含有天然纖維膠原的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的常規(guī)方法，在使用之前和凝膠聚合后希望清除殘存在基質(zhì)中的液體。從ECM清除液體的常規(guī)方法包括空氣干燥和在提高的溫度下干燥。通常提高溫度的干燥條件包括在提高溫度的情況下采用干燥氣流的快速干燥，該方法可促進(jìn)大的鹽結(jié)晶和更明顯的MATRIGEL基質(zhì)模式。迅速的MATRIGEL基質(zhì)干燥導(dǎo)致侵入細(xì)胞的分布不好。
常規(guī)液體清除技術(shù)也包括將多孔表面的下面放在吸附材料上一段時(shí)間(3分鐘到過(guò)夜)和/或?qū)Χ嗫妆砻媸褂脺睾偷恼婵?。在緩慢的降低溫度和沒(méi)有空氣流的情況下緩慢清除液體，導(dǎo)致最均勻的包被層和侵入的細(xì)胞最均勻的分布。例如，Swiderek等人的美國(guó)專(zhuān)利5,731,417揭示了制造用于細(xì)胞培養(yǎng)的天然膠原干膜的方法，其中包括空氣干燥基質(zhì)。
常規(guī)干燥方法降低了細(xì)胞培養(yǎng)裝置的功能。例如，常規(guī)包被和干燥方法通常導(dǎo)致不均勻或中斷的涂層，從而產(chǎn)生不均勻細(xì)胞的侵入，例如形成諸如侵入細(xì)胞顯著的中心點(diǎn)或環(huán)的等各種模式。因此，在顯微鏡下精確計(jì)算侵入細(xì)胞是十分困難的。另外，區(qū)別侵入和非侵入細(xì)胞的能力明顯降低。侵入細(xì)胞包括HT-1080細(xì)胞，而非侵入細(xì)胞包括NIH3T3細(xì)胞。因此，分布的纖維膠原基質(zhì)例如MATRIGEL基質(zhì)宜為均勻和密實(shí)的。
發(fā)明的概述
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)裝置和方法，它們包括干燥的胞外基質(zhì)和并已被開(kāi)發(fā)用于細(xì)胞的體外生長(zhǎng)。特別是本發(fā)明提出一種方法，該方法提供具有現(xiàn)成的均勻分布的胞外基質(zhì)的基質(zhì)，該方法包括a)將胞外基質(zhì)組分施涂在基質(zhì)區(qū)域；b)保溫胞外基質(zhì)組分，使之聚合；c)凍結(jié)位于基質(zhì)區(qū)域的聚合的胞外基質(zhì)；d)凍干位于基質(zhì)區(qū)域的、冷凍的胞外基質(zhì)；e)讓凍干的胞外基質(zhì)升溫到室溫。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種細(xì)胞培養(yǎng)裝置，它包括用于細(xì)胞生長(zhǎng)的表面，所說(shuō)的表面附著有干燥的均勻分布的胞外基質(zhì)，所說(shuō)的基質(zhì)按照下述步驟形成a)將胞外基質(zhì)組分施涂在基質(zhì)區(qū)域；b)保溫這種胞外基質(zhì)組分使之聚合；c)凍結(jié)位于基質(zhì)區(qū)域的聚合的胞外基質(zhì)；d)凍干冷凍的位于基質(zhì)區(qū)域的胞外基質(zhì)；e)讓凍干的胞外基質(zhì)升溫到室溫。
本發(fā)明也提供一種細(xì)胞培養(yǎng)裝置，它包括適合細(xì)胞生長(zhǎng)的表面；和位于這個(gè)表面上的胞外基質(zhì)包被層，基質(zhì)包被層包括生物活性蛋白溶液的聚合產(chǎn)物，而基質(zhì)內(nèi)殘存的液體通過(guò)凍干法基本被清除。
本發(fā)明試圖提供一種方法，解決以前工藝的不足之處，這種方法提供一種含有胞外基質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，所述胞外基質(zhì)的分布均勻分布，能在更廣的ECM濃度范圍內(nèi)有效，在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)表面獲得高度均勻的腫瘤細(xì)胞遷移，便于細(xì)胞計(jì)數(shù)，可區(qū)分侵入腫瘤細(xì)胞和推測(cè)的非侵入對(duì)照細(xì)胞。另外，本發(fā)明也包括細(xì)胞培養(yǎng)裝置，該裝置包含在使用之前制備好的胞外基質(zhì)。
發(fā)明的詳細(xì)描述
本發(fā)明提供從基質(zhì)的一個(gè)邊緣到另一邊緣的高度均勻的胞外基質(zhì)包被層，并且與常規(guī)液體干燥工藝制備的基質(zhì)相比，能在更廣的胞外基質(zhì)濃度范圍內(nèi)有效。均勻的包被層使得在完整的胞外基質(zhì)表面上提供了高度均勻的腫瘤細(xì)胞的遷移，與之相反，常規(guī)工藝中細(xì)胞的遷移以非常不均勻方式發(fā)生在膜的中心。細(xì)胞的均勻遷移便于用手工方法或圖象分析方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。凍干包被層也有更強(qiáng)的區(qū)分侵入腫瘤細(xì)胞和設(shè)想的非侵入對(duì)照細(xì)胞的能力。
在任何本領(lǐng)域已知的細(xì)胞培養(yǎng)方案和方法中，常規(guī)的膠原細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)可以用具有干的天然纖維膠原的細(xì)胞培養(yǎng)裝置加以替換。在多孔表面上的天然纖維膠原細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，被置于組織培養(yǎng)板的孔中，并且多孔表面與合適的培養(yǎng)基相接觸。這允許培養(yǎng)基流過(guò)多孔表面并與細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)接觸。培養(yǎng)基和其他存在于其中的物質(zhì)可擴(kuò)散通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，與在表面接種的細(xì)胞接觸。為了易于操作，細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)可以在細(xì)胞培養(yǎng)插件的微孔膜上制備。
一旦將冰冷的胞外基質(zhì)施涂在多孔表面，就讓冰冷的、中性膠原溶液的溫度升高到大約15℃到大約40℃，從而引發(fā)形成天然膠原纖維和纖維。對(duì)于本發(fā)明的保溫步驟，溫度宜升高，優(yōu)選大約37℃，并且在潮濕箱中含有5％的二氧化碳。當(dāng)膠原溶液的溫度增加時(shí)，天然的原纖維在多孔表面上開(kāi)始聚合和凝膠化，從而包被在上面。凝膠包括大的、有組織的、并且具有天然膠原的條紋特性的膠原纖維和從膠原溶液中俘獲的液體(纖維間液體)。保溫步驟應(yīng)有足夠的時(shí)間以便使胞外基質(zhì)形成凝膠。一般在37℃大約0.5～3小時(shí)就足以獲得在多孔表面(如細(xì)胞培養(yǎng)插件的膜)上的完全聚合。
在胞外基質(zhì)的膠原聚合后，宜從凝膠中驅(qū)趕掉聚合膠原的纖維間液體。在本發(fā)明的方法中，在開(kāi)始凍干工藝之前，直接將涂有凝膠的插件在不高于-30℃的溫度下冷凍。包被的插件可以在凍干器中冷凍，然后凍干過(guò)夜，在那時(shí)凍干器允許升溫至室溫。這工序使凝膠收縮坍塌在多孔表面并形成天然膠原纖維和原纖維的薄膜。較佳地，獲得粘附在插件的膜上的均勻的糕狀物。
本發(fā)明的天然纖維膠原質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基可以以多孔表面上的干膜形式產(chǎn)生。它們宜以干燥形式保留天然纖維膠原結(jié)構(gòu)，因此具有改進(jìn)的澆注膠原凝膠的滲透性能并具有無(wú)定型或交聯(lián)的膠原膜的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。如果需要，這種干膜可以從多孔表面取下用于細(xì)胞培養(yǎng)，但是通常優(yōu)選使用在多孔表面的這種天然纖維膠原細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，以便增加結(jié)構(gòu)支撐度和便于操作。在細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的上表面的細(xì)胞能暴露于培養(yǎng)基、生長(zhǎng)因子和其他物質(zhì)，這些物質(zhì)可通過(guò)擴(kuò)散而穿過(guò)多孔表面下面和細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，因?yàn)楸景l(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)膜有杰出的擴(kuò)散性能。
大約生理濃度或更高的鹽濃度，優(yōu)選大約為0.15～1摩爾的濃度，可以用于促進(jìn)大的天然膠原纖維的形成。在低于生理濃度的鹽濃度下，膠原纖維形成很少(如果有的話(huà))。但是，鹽增加到接近生理濃度時(shí)，纖維的形成基本完成，并有少量無(wú)定型的膠原存在。另外，當(dāng)鹽增加到生理濃度以上時(shí)，會(huì)形成越來(lái)越大的纖維。然而，當(dāng)鹽的濃度達(dá)到大約1.1摩爾時(shí)，纖維形成再次基本上完全不存在。當(dāng)溶解的膠原是在酸性溶液中時(shí)，pH值可升到約6-8，更適宜的為約7.0-7.4，這可通過(guò)添加緩沖液(如磷酸鹽緩沖液(PBS))中冷的NaOH來(lái)同時(shí)調(diào)整鹽的濃度，使最終鹽濃度為大約0.15-1摩爾，優(yōu)選至少為約0.6摩爾(大約是生理鹽濃度的4倍)。膠原通過(guò)在低溫保存(通常在4℃)而維持在溶液中，直到發(fā)生所期望的膠原纖維和纖維的聚合。膠原濃度對(duì)于天然膠原纖維的形成而言并不重要，但作為細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)使用時(shí)，優(yōu)選為約10到500ug/cm2多孔表面，更優(yōu)選地為約65到85ug/cm2。
各種聚合條件，包括非生理?xiàng)l件，可以用于生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)膜并不必考慮非膠原質(zhì)殘余物如鹽和有機(jī)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞環(huán)境的負(fù)面影響。根據(jù)本發(fā)明方法，使凝膠在多孔表面上收縮并干燥，可形成纖維膠原質(zhì)薄膜，從而提供一種用于均勻分布細(xì)胞的均勻表面和所期望的膠原濃度(大約5-10mg/ml)。天然的纖維膠原結(jié)構(gòu)為粘合細(xì)胞受體提供了體內(nèi)空間定位，這種定位是無(wú)定型膠原細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)所沒(méi)有的。膠原纖維網(wǎng)絡(luò)也提供了有紋理的表面，這使得在每個(gè)膜上的表面積大于其他膠原細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的基本上二維表面的表面積。與現(xiàn)有技術(shù)的膠原基質(zhì)相比，天然的膠原纖維細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)能更牢固和均勻地將細(xì)胞結(jié)合在其表面。這樣，許多不同類(lèi)型的細(xì)胞(如上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和纖維原細(xì)胞)可被施加在其表面并快速和完全地結(jié)合。
組織熵驅(qū)動(dòng)了本發(fā)明的聚合反應(yīng)。由于對(duì)于其他發(fā)生相似類(lèi)型的自裝配的蛋白而言，物理機(jī)理是相同的，因此當(dāng)在前述生產(chǎn)工藝中代替膠原時(shí)，在體外自發(fā)形成的組織化聚合結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)將產(chǎn)生天然結(jié)構(gòu)物。這些包括形成均聚物(例如，纖連蛋白或?qū)诱尺B蛋白)和雜聚物(例如，膠原IV和層粘連蛋白，或蛋白聚糖和層粘連蛋白)的蛋白質(zhì)。含有自裝配蛋白(例如在MATRIGEL(COLLABORATIVE BIOMEDICAL PRODUCTS，INC)發(fā)現(xiàn)的那些蛋白)的胞外基質(zhì)組分，可以按照本發(fā)明方法被聚合和干燥，從而產(chǎn)生天然的結(jié)構(gòu)。當(dāng)纖維間液體被去除時(shí)，雖然并非所有這樣的蛋白質(zhì)都能產(chǎn)生收縮的凝膠體并以膠原質(zhì)凝膠同樣的方式形成一層膜，但是，從聚合基質(zhì)去除纖維間的液體和干燥可使最終的產(chǎn)物獲得天然的結(jié)構(gòu)。
采用本發(fā)明方法時(shí)，任何膜材料可以作為基質(zhì)使用，但是，在某些生物應(yīng)用中所選擇的膜會(huì)有正面的或負(fù)面的作用。移植研究?jī)?yōu)選蝕刻膜，如果所測(cè)試的材料的滲透系數(shù)不超過(guò)這種膜的滲透系數(shù)(也就是膜的滲透系數(shù)不是限制性因素)時(shí)，也可以使用澆注膜。為了方便細(xì)胞培養(yǎng)，優(yōu)選摻入多孔膜的培育板插件(例如，BIOCOAT Control Cell培養(yǎng)插件，CollaborativeBiomedical Products；TRANSWELL，Costar；MILLICELL培養(yǎng)插件，MilliporeCorporation)。用于顯微技術(shù)時(shí)，與高密度聚碳酸酯之類(lèi)的材料相比，優(yōu)選使用PET膜，由于其有更高的透明度。由于這些原因，不同的膜可以?xún)?yōu)選用于不同的應(yīng)用場(chǎng)合，這可由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選擇。
合適的可用作本發(fā)明基質(zhì)的多孔表面，包括天然或合成聚合物，例如纖維素膜、多孔聚碳酸酯、多孔聚四氟乙烯(如MILLIPORE CM公司等生產(chǎn)的TEFLON網(wǎng)膜)，尼龍膜和網(wǎng)，玻璃濾網(wǎng)，多孔聚對(duì)苯二酸乙二酯、聚甲基戊烷、聚丙烯、聚乙烯和各種過(guò)濾器(例如，ANOPORE鋁晶體過(guò)濾器)。多孔表面的孔徑小到足夠防止在聚合之前膠原溶液流過(guò)，而又大到足夠允許諸如培養(yǎng)基和纖維間液體這樣的液體流過(guò)。一般而言，具有大約0.5到30微米的孔徑的膜可提供所期望的性能。包含接近8微米孔徑的膜的表面，可優(yōu)選用于大多數(shù)普通的細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用，例如物質(zhì)轉(zhuǎn)移研究。
在干燥后，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)裝置應(yīng)滅菌，例如通過(guò)輻射滅菌(例如，紫外光，電子束或伽瑪輻射)或暴露在環(huán)氧乙烷氣體中。本發(fā)明的天然的纖維膠原膜與現(xiàn)有技術(shù)的膠原細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)相比，在干燥時(shí)獲得了天然的纖維結(jié)構(gòu)，因此更接近于體內(nèi)的膠原基質(zhì)。
各種不同的材料(包括生物活性蛋白)可以與本發(fā)明的胞外基質(zhì)一起共聚，或通過(guò)膠原質(zhì)吸收而摻入膜中，這在特定的細(xì)胞系統(tǒng)中是所期望的。這些材料包括但不局限于，細(xì)胞、抗體、酶、受體、生長(zhǎng)因子、胞外基質(zhì)的額外成分、細(xì)胞因子、激素和藥物。這些材料可以適當(dāng)?shù)臐舛燃尤氡涞哪z原質(zhì)溶液中，以用于選定的細(xì)胞培養(yǎng)。如上所述的天然膠原纖維的聚合作用，可使材料粘合于膠原質(zhì)纖維，或者使該材料與膠原質(zhì)纖維共聚合。由于細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的開(kāi)放性纖維結(jié)構(gòu)，加入的生物活性材料可輕易地供給所培養(yǎng)的細(xì)胞，從而介導(dǎo)或調(diào)控細(xì)胞的特性或行為。
待培養(yǎng)的細(xì)胞可以以亞匯合或匯合方式接種于基質(zhì)上表面，然后置于適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境條件下。例如，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)是在培養(yǎng)皿孔的插件的膜表面上制備時(shí)，可將少量的生長(zhǎng)培養(yǎng)基置于孔內(nèi)。將插件置于孔內(nèi)，以至于培養(yǎng)基與多孔滲透膜的底部接觸并擴(kuò)散通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，從而與接種在基質(zhì)表面的細(xì)胞接觸。
適用于上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的任何細(xì)胞培養(yǎng)基，都可以用于采用本發(fā)明膠原質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)。這些培養(yǎng)基包括，但不限于Dulbecco′s改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，MEM，M-199和RPMI。本領(lǐng)域內(nèi)公知的添加物，可以加入培養(yǎng)基中，其中包括血清(如，F(xiàn)BS或小牛血清)，含有血清的添加物(NU-SERUM)，無(wú)血清添加物(MITO+)。首選培養(yǎng)腸內(nèi)上皮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基是補(bǔ)加MTTO+血清添加物(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Mass.)的DMEM，從而提供完全確定的無(wú)血清細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境。
在下述例子中要給出本發(fā)明某些具體的說(shuō)明，但附加的權(quán)利要求和其等價(jià)含義定義的本發(fā)明并不局限于此。
實(shí)施例1
具有干燥的均勻分布的胞外基質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的制備
在以下的實(shí)驗(yàn)實(shí)例中描述了，在PET細(xì)胞培養(yǎng)物插件上的1μm的聚乙烯對(duì)苯二酸膜(PET)上的均勻分布的、干燥的天然原纖維膠原細(xì)胞培養(yǎng)基的制備。在本實(shí)施例中，大約200μm的MATRIGEL基質(zhì)被加到膜上。
通過(guò)加入10倍的DPBS/NaOH，調(diào)整MATRIGEL基質(zhì)冷的酸溶液，從而使最后濃度為4倍DPBS(pH7.4)，然后將混合物置于冰中備用。將插件夾具置于組織培養(yǎng)器皿中。細(xì)胞培養(yǎng)插件和無(wú)菌鑷子一起置于放有夾具中，然后將蓋子蓋在培養(yǎng)皿上直到應(yīng)用。MATRIGEL膠原質(zhì)包被凝膠(0.10ml)被分配到每個(gè)膜上，重新放置培養(yǎng)器皿的蓋子，然后培養(yǎng)皿被輕輕的搖動(dòng)，從而使包被溶液均勻分布于膜上。包被的膜在37℃培養(yǎng)，從而使膠原質(zhì)聚合(大約2.0小時(shí))，并將膜保持在潮濕的環(huán)境中以防止提早干燥。
膠原聚合后，包被的插件被置于預(yù)冷的冷凍干燥機(jī)內(nèi)并在開(kāi)始冷凍干燥過(guò)程之前先冷凍(溫度低于-30℃)。插件被冷凍干燥過(guò)夜，在該凍干過(guò)程中使冷凍干燥器的溫度回升至室溫。獲得了粘附在插件膜上的均勻糕狀物。
然后，天然的膠原細(xì)胞培養(yǎng)基在組織培養(yǎng)器皿中，通過(guò)暴露在0.05-0.06焦耳的紫外燈下而滅菌，隨后保存在4℃密封袋中備用。
實(shí)施例2
侵入試驗(yàn)
NIH 3T3(非侵入性)和HT-1080(侵入性)細(xì)胞，在含10％胎牛血清或新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至幾乎匯合。細(xì)胞通過(guò)胰蛋白酶消化而收集，并在沒(méi)有添加血清或蛋白酶抑制劑的DMEM中洗滌。細(xì)胞以1×105/ml懸浮在DMEM中。在制備細(xì)胞懸浮液之前，MATRIGEL基質(zhì)的干燥層用DMEM在室溫下再水化2小時(shí)。該再水化溶液被小心地除去，將0.75ml含5％胎牛血清的DMEM加入到每個(gè)平皿孔中作為化學(xué)引誘物，然后將0.5ml(5×104細(xì)胞)細(xì)胞懸液添加到每個(gè)插件中。平板插件在37℃，含5％CO2空氣的條件下培育插件22小時(shí)。未包被的膜插件也接種細(xì)胞作為對(duì)照。
包被插件的固定和染色
在培育之后，每個(gè)插件的膜的上表面被小心地用棉簽擦拭以除去非侵入的細(xì)胞和MATRIGEL基質(zhì)。在膜的下表面的侵入細(xì)胞被固定，并依次將其轉(zhuǎn)移通過(guò)Diff-Quik(Dade)染色試劑盒的3種溶液，從而染色。過(guò)度的染色通過(guò)將各個(gè)插件浸入蒸餾水中而去除。膜的上表面被第二次擦干以去除剩余的水、細(xì)胞或MATRIGEL基質(zhì)。插件被轉(zhuǎn)移到另一個(gè)24孔平板并在空氣中干燥。已經(jīng)侵入并穿過(guò)膜上MATRIGEL基質(zhì)的細(xì)胞數(shù)量，在用Diff-Quik染色細(xì)胞后，通過(guò)在顯微鏡中直接計(jì)數(shù)而對(duì)位于膜的下側(cè)的細(xì)胞進(jìn)行定量檢測(cè)。
根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量和分布，拍攝放大40或200倍的顯微照片來(lái)計(jì)量細(xì)胞的數(shù)量。照片是在不將膜從插件夾具上取下的情況下拍攝的。每張照片的多個(gè)視野(通常為5個(gè))，在有刻度的柵格幫助下進(jìn)行計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)表示為侵入百分?jǐn)?shù)，即，侵入通過(guò)MATRIGEL基質(zhì)包被的插件的細(xì)胞與未包被的對(duì)照插件的細(xì)胞之比。
包被插件的蛋白染色
為了估計(jì)包被層的分配均勻性，包被的插件被考馬斯藍(lán)染色，以獲得在整個(gè)插件表面上的蛋白質(zhì)含量分布情況。包被的插件用緩沖鹽溶液在室溫再水化2小時(shí)。再水化溶液被小心的去除并用考馬斯染色液(1mg/ml考馬斯亮藍(lán)R-250，在10％醋酸，40％甲醇中)取代。30分鐘后，染色物被小心的去除，插件用蒸餾水清洗兩次然后風(fēng)干。MATRIGEL基質(zhì)沉淀物的質(zhì)量在放大100倍后進(jìn)行評(píng)估。
實(shí)施例3
使用本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)裝置的侵入試驗(yàn)的結(jié)果
該實(shí)例證明，用本發(fā)明方法制備的細(xì)胞培養(yǎng)插件能夠按照需要的性能要求發(fā)揮其性能。這些性能要求在下表1中顯示，其中NIH 3T3(3T3)細(xì)胞代表非侵入腫瘤細(xì)胞，HT-1080細(xì)胞代表惡性轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。
表1
所需的性能要求
對(duì)本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)插件進(jìn)行測(cè)試，以檢測(cè)NIH 3T3細(xì)胞和HT-1080細(xì)胞對(duì)基膜基質(zhì)的侵入能力。固定和染色的插件如上所述進(jìn)行檢測(cè)，以估計(jì)侵入程度和圖案。評(píng)估結(jié)果將在下面詳細(xì)描述。
本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)裝置顯示，基本上沒(méi)有對(duì)照NIH 3T3細(xì)胞(即非侵入細(xì)胞)的侵入。然而，HT1080腫瘤細(xì)胞具有高侵入性。侵入的HT-1080細(xì)胞分布在每個(gè)插件的整個(gè)表面，使腫瘤細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)表面高度均勻地遷移。本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)裝置沒(méi)有諸如侵入細(xì)胞的周密的中央點(diǎn)或環(huán)之類(lèi)的圖案。當(dāng)前實(shí)例的結(jié)果被分別的24孔插件和24個(gè)孔插件所證實(shí)。用本發(fā)明方法制得的、均勻分布在膜上的MATRIGEL基質(zhì)的簿包被層，可以縮短完成腫瘤侵入試驗(yàn)的時(shí)間。
權(quán)利要求
1.一種給基質(zhì)提供現(xiàn)成的均勻分布的胞外基質(zhì)的方法，其特征在于，包括步驟
a)將胞外基質(zhì)組分施涂在基質(zhì)區(qū)域；
b)保溫所述的胞外基質(zhì)組分，使之聚合；
c)冷凍位于所述基質(zhì)區(qū)域冷凍的該聚合的胞外基質(zhì)；
d)凍干位于所述基質(zhì)區(qū)域的、冷凍的胞外基質(zhì)；
e)將凍干的胞外基質(zhì)升溫到室溫。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胞外基質(zhì)組分被保溫足夠時(shí)間以便所述胞外基質(zhì)形成凝膠。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胞外基質(zhì)組分在升高的溫度下保溫。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胞外基質(zhì)組分在37℃的溫度保溫
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胞外基質(zhì)組分在有二氧化碳存在下保溫。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述二氧化碳的濃度為5％。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合的胞外基質(zhì)在凍干器中冷凍
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合的胞外基質(zhì)在溫度低于-30℃的條件下冷凍。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胞外基質(zhì)組分包含天然的膠原纖維。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述胞外基質(zhì)組分還包含的選自下組的組分層粘連蛋白，巢蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白多糖，生長(zhǎng)因子，蛋白酶和它們的混合物。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基質(zhì)是一種膜材料，它選自多孔膜，蝕刻膜，澆注膜及其組合。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的膜上的孔為約0.5-30ug/cm2插件膜表面。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中基質(zhì)包含選自下組的天然的或合成的聚合物纖維素膜，多孔聚碳酸酯，多孔聚四氟乙烯，尼龍膜和網(wǎng)，玻璃濾網(wǎng)，聚對(duì)苯二甲酸乙二酯，聚甲基戊烷，聚丙烯，聚乙烯及其組合。
14.一種細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于，包含用于細(xì)胞生長(zhǎng)的表面，所述的表面包被有胞外基質(zhì)，所述的基質(zhì)由下列步驟形成；
a)將胞外基質(zhì)組分施涂在基質(zhì)區(qū)域；
b)保溫所述的胞外基質(zhì)組分，使之聚合；
c)冷凍位于所述基質(zhì)區(qū)域冷凍的該聚合的胞外基質(zhì)；
d)凍干位于所述基質(zhì)區(qū)域的、冷凍的胞外基質(zhì)；
e)將凍干的胞外基質(zhì)升溫到室溫。
15.如權(quán)利要求14所述的裝置，該裝置包含生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
16.如權(quán)利要求15所述的裝置，所述的培養(yǎng)基是DMEM。
17.如權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述培養(yǎng)裝置還包括選自下組的附加材料細(xì)胞，抗體，酶，受體，生長(zhǎng)因子，胞外基質(zhì)的額外組分，細(xì)胞因子，激素，藥物及其混合物。
18.一種細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于，包括適合細(xì)胞生長(zhǎng)的表面；以及位于該表面上的胞外基質(zhì)包被層，所述的基質(zhì)包被層包含具有生物活性的蛋白溶液的聚合產(chǎn)物，其中所述基質(zhì)中殘留流體基本上通過(guò)凍干除去。
全文摘要
給基質(zhì)提供現(xiàn)成的均勻分布的胞外基質(zhì)的方法。該方法包括將胞外基質(zhì)組分施涂于基質(zhì)區(qū)域；保溫胞外基質(zhì)組分使之聚合；冷凍位于基質(zhì)區(qū)域表面的、聚合的胞外基質(zhì)；凍干位于基質(zhì)區(qū)域的冷凍的胞外基質(zhì)；將凍干的胞外基質(zhì)溫度回升到室溫。還涉及細(xì)胞培育裝置，它具有通過(guò)上述方法形成的干燥的均勻分配胞外基質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N5/02GK1400306SQ0214135
公開(kāi)日2003年3月5日 申請(qǐng)日期2002年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月6日
發(fā)明者A·邁爾斯, S·R·伊爾斯利, F·J·馬努扎 申請(qǐng)人:貝克頓迪肯森公司