專利名稱：大鼠淋巴細(xì)胞cd4基因定量表達(dá)測(cè)試用引物、探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大鼠淋巴細(xì)胞CD4基因定量表達(dá)測(cè)試用引物、探針技術(shù)背景器官移植是20世紀(jì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展最快的醫(yī)學(xué)技術(shù)之一。許多病人晚期往往伴有心臟、肺臟、胰腺、肝臟、腎臟等大器官功能的衰竭，通過(guò)器官移植將正常器官代替這些病變或功能衰竭的器官，已成為最有效的治療手段。
CD4分子是一個(gè)糖蛋白，其在T細(xì)胞的活化中主要有以下兩種功能充當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞的黏附分子，和在與II類MHC分子結(jié)合時(shí)可能傳遞信號(hào)或促進(jìn)TCR復(fù)合物介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。由于CD4分子在T淋巴細(xì)胞的活化中起重要作用，因此，對(duì)免疫系統(tǒng)疾病及器官移植后CD4分子及基因表達(dá)水平的檢測(cè)是監(jiān)測(cè)免疫排斥反應(yīng)和診斷某些疾病的理想手段。
有報(bào)道指出，移植心臟的慢性排斥反應(yīng)與CD4+淋巴細(xì)胞有關(guān)，并依賴于CD8+淋巴細(xì)胞。
已有的免疫分子基因表達(dá)的測(cè)定方法包括基因差異顯示灰度掃描方法、原位雜交(sorthen blot)技術(shù)，但上述方法較復(fù)雜、精確性和重復(fù)性差、且有同位素污染等問(wèn)題，因此有必要提供一種適應(yīng)快速精確定量測(cè)定的引物和探針。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大鼠淋巴細(xì)胞CD4基因定量表達(dá)測(cè)試用引物及探針，利用該引物及探針可對(duì)大鼠淋巴細(xì)胞CD4基因作熒光PCR實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，由于本引物、探針具有與待測(cè)基因同源的高特異性和高親合性，可獲得高靈敏度、高精確性的結(jié)果。
為達(dá)到上述目的本發(fā)明采用以下技術(shù)方案本發(fā)明提供的引物和探針序列為cDNA探針140-FT5’CCCCTTCCTTCCCCAGCACCACG 3’引物123U5’GTCACCCAAGGAAAGACCGT 3’213L5’TTTTGGTCAGAGGACTTCCACGC 3’CD4基因全序及其探針、引物位置見(jiàn)附件一其中123U為上游引物，是正鏈140-FT為探針，是反鏈213L為下游引物，是反鏈


圖1實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定的5個(gè)不同樣本的CD4和β-actin的擴(kuò)增曲線(實(shí)驗(yàn)中某一時(shí)間點(diǎn))圖2為大鼠心臟移植術(shù)前后不同時(shí)間移植心肌組織中CD4+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、外周血淋巴細(xì)胞免疫分子CD4表達(dá)及其基因定量表達(dá)曲線的比較
圖3同一樣本的不同模板濃度的擴(kuò)增曲線比較4CD4特異性引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳5PCR反應(yīng)中CD4特異性引物工作原理6CD4特異性探針示意圖大鼠CD4基因特異性引物及探針的基本工作原理PCR反應(yīng)中CD4特異性引物工作原理(見(jiàn)圖5)。
CD4基因特異性引物在PCR反應(yīng)中的退火溫度時(shí)與逆轉(zhuǎn)錄后開(kāi)鏈CD4的cDNA核苷酸鏈的特定區(qū)域完全互補(bǔ)結(jié)合，并在延伸溫度時(shí)引導(dǎo)相應(yīng)CD4核苷酸鏈的復(fù)制擴(kuò)增。過(guò)程如圖示。其特點(diǎn)由于引物的特異性，實(shí)現(xiàn)了PCR反應(yīng)時(shí)只進(jìn)行CD4基因cDNA的復(fù)制與擴(kuò)增，沒(méi)有非特異性基因的擴(kuò)增。CD4基因的特異性探針(見(jiàn)圖6)。
本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的探針為Taqman探針，探針5’連接一個(gè)Fam熒光基團(tuán)(此熒光基團(tuán)在520-740um波長(zhǎng)范圍內(nèi)均能檢測(cè)到)，3’端連接1個(gè)Tamra淬滅基團(tuán)，此兩基團(tuán)均為DNA合成儀自動(dòng)標(biāo)記。PCR反應(yīng)時(shí)特異探針首先與前次逆轉(zhuǎn)錄生成的CD4 cDNA特定區(qū)域核苷酸序列實(shí)現(xiàn)完全互補(bǔ)結(jié)合，但由于此時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)被淬滅基團(tuán)所控制不發(fā)熒光。在下一次循環(huán)擴(kuò)增時(shí)，Taq酶在特異性引物引導(dǎo)下與模板結(jié)合延伸至特異性探針與模板結(jié)合的位置時(shí)，其中的Taq酶在60℃時(shí)將特異性探針切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開(kāi)，致使熒光基團(tuán)發(fā)光，同時(shí)定量PCR儀記錄熒光強(qiáng)度，用于定量此次擴(kuò)增前cDNA的模板數(shù)。
本發(fā)明中采用了以β-actin作為參照物的起始拷貝數(shù)的相對(duì)定量方法。
由于淋巴細(xì)胞β-actin mRNA的表達(dá)水平只與細(xì)胞數(shù)有關(guān)，且其在細(xì)胞中含量恒定，所以本實(shí)驗(yàn)以β-actin作為參照物。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)同一樣本總RNA中的β-actin和CD4基因表達(dá)水平同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。設(shè)每個(gè)基因在40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中，熒光強(qiáng)度從基線開(kāi)始增加的循環(huán)數(shù)為Ct。即Ct值表示基因開(kāi)始擴(kuò)增時(shí)的起始循環(huán)數(shù)，(反映模板基數(shù))。因?yàn)閏DNA的模板基數(shù)每增加10倍，開(kāi)始擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)(Ct值)減少3.33，故不同樣本模板基數(shù)的差可由公式10(CtA-CtB)/3.33計(jì)算。CD4相對(duì)于β-actin模板數(shù)的倍數(shù)為10(CD4-β-actin)/3.33.，倍數(shù)越大，說(shuō)明CD4基因的起始模板數(shù)越低，即數(shù)字增加表示負(fù)調(diào)表達(dá)。圖1中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定的CD4與β-actin(見(jiàn)圖1)的反應(yīng)曲線，下箭頭為β-actin，上箭頭為CD4。其中以大鼠心臟移植術(shù)前某一時(shí)間點(diǎn)為例，見(jiàn)表1表1編號(hào) CD4(Ct值) β-actin(Ct值) 10(CD4-β-actin)/3.331 12.87 8.124 26.6212 12.93 8.295 24.6543 13.33 8.640 25.6104 13.72 8.983 26.4565 18.55 14.57 15.675均值 23.8±4.61上述表中，均值23.8±4.61表示五例外周血淋巴細(xì)胞CD4基因?qū)Ζ?actin編碼基因的相對(duì)起始模板倍數(shù)，數(shù)字增加表示負(fù)調(diào)表達(dá)。外周血淋巴細(xì)胞CD4免疫分子表達(dá)、CD4基因表達(dá)和移植心肌組織中CD4+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等三者比較結(jié)果見(jiàn)表2和圖2。
作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)的外周血淋巴細(xì)胞CD4免疫分子表達(dá)測(cè)定1.單克隆抗體(mAb)標(biāo)記取200μL抗凝血，根據(jù)Immunotech公司的說(shuō)明書，加入熒光標(biāo)記的抗RAT CD4 mAb 10μL，混勻，于4℃暗箱孵育30min。標(biāo)記后，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞(室溫放置4min)，離心1500rpm/min 3min，棄上清，在相同離心條件下，用含2％小牛血清的0.01mol/L PBS滌洗白細(xì)胞2遍，加PBS至0.5mL，制成白細(xì)胞懸液。
2，流式細(xì)胞分析白細(xì)胞懸液過(guò)濾后，用XL A27153型流式細(xì)胞儀，測(cè)定被抗CD4單抗標(biāo)記的淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(％)。
作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)的移植心肌組織中免疫熒光細(xì)胞染色分別取移植前SD大鼠的原位心臟和移植后各時(shí)間組的移植心臟，冰凍后于中遠(yuǎn)1/3處橫段面切片，95％乙醇固定30min，PBS洗滌3次，每次5min，用熒光標(biāo)記的抗CD4單克隆抗體標(biāo)記，37℃恒溫孵育30min，PBS洗滌3次，每次5min，甘油封片后4℃避光保存，熒光顯微鏡下進(jìn)行CD4+淋巴細(xì)胞記數(shù)。
外周血淋巴細(xì)胞CD4基因表達(dá)水平與外周血淋巴細(xì)胞CD4免疫分子表達(dá)水平、免疫組化方法測(cè)定移植心肌中CD4+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)的比較(見(jiàn)表2和圖2)。表2大鼠心臟移植前后移植心肌組織中CD4+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)、外周血淋巴細(xì)胞CD4分子表達(dá)與CD4基因表達(dá)的比較。
術(shù)前術(shù)后24h 72h 7d 10d12dCD4+浸潤(rùn)15.54.8 5.3 11.89.211.8CD4分子 65.443.7 49.850.451.7 46.5CD4基因 46.16 31.6658.49 56 45.7 57.1表中CD4基因表達(dá)的數(shù)字為外周血淋巴細(xì)胞CD4基因?qū)Ζ?actin編碼基因的模板倍數(shù)，數(shù)字增加表示負(fù)調(diào)表達(dá)。
圖2中，有三條曲線，1為CD4+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)曲線，曲線上的A點(diǎn)表示浸潤(rùn)量出現(xiàn)峰值的時(shí)間為7天；2為CD4免疫分子表達(dá)，曲線上的B點(diǎn)表示表達(dá)量出現(xiàn)峰值的時(shí)間為72小時(shí)；3為CD4基因定量表達(dá)，曲線上的C點(diǎn)表示表達(dá)量出現(xiàn)峰值的時(shí)間為術(shù)后72小時(shí)。
從圖2可以看到，以大鼠心臟移植術(shù)前后不同時(shí)間移植心肌組織中CD4+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)、外周血淋巴細(xì)胞CD4免疫分子表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞CD4基因表達(dá)水平的比較為例于心臟移植后第7天，移植心肌中CD4+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)達(dá)術(shù)后峰值，外周血淋巴細(xì)胞CD4免疫分子在移植術(shù)后第72小時(shí)，其表達(dá)水平升至峰值，比心肌中CD4+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)峰值時(shí)間提前了4天。CD4基因相對(duì)表達(dá)量于術(shù)后第72小時(shí)時(shí)亦上升達(dá)到移植后峰值，與免疫分子表達(dá)峰值時(shí)間相一致，但其上升幅度較大，比移植心肌中CD4+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)峰值早4天。
從圖3、圖4可以看到本發(fā)明的特異性和敏感性。圖3中，1表示模板濃度為3.288ug/ml，2表示模板濃度為3.288×10-1ug/ml，3表示模板濃度為3.288×10-2ug/ml，4表示模板濃度為3.288×10-3ug/ml，5表示模板濃度為3.288×10-4ug/ml。在圖3中，當(dāng)模板濃度稀釋到3.288×10-4ug/ml時(shí)同樣能得到很好的Ct和擴(kuò)增反應(yīng)曲線。圖4中，是CD4特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果，具有單一擴(kuò)增帶，其中1、2、3、4、5表示五個(gè)樣品。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本基因的探針和引物的靈敏度和特異性好，實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量分析，準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)單，只需一步，所需樣本量小。采用實(shí)時(shí)相對(duì)定量分析方法檢測(cè)到CD4基因表達(dá)水平峰值與流式細(xì)胞儀檢測(cè)到CD4免疫分子表達(dá)峰值時(shí)間相一致，較移植心肌中CD4+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)峰值。
附件一1 agaagaaagg actggccaga gactcagatc cccatccgct caagcaggcc accatgtgcc61 gaggcttctc tttcaggcac ttgctgccgc tgctgctcct gcagctgtca aaactcctag 241 ttctgggata taagaacaag ttattgatta aaggttcact tgagctgtat agtcgttttg301 attccagaaa aaatgcatgg gagagaggat catttcccct catcatcaat aaacttagga361 tggaggactc tcagtcttat gtctgcgagc tggagaacaa gaaagaggag gtggagttgt421 gggtcttcag agtgaccttc aatccgggta ccagactgtt gcaggggcag agcctgaccc481 tgatcttgga tagcaaccct aaggtctctg accccccgat agagtgcaaa cacaaaagca541 graacattgt caaggactcc aaagctttct ccacgcacag cctaaggatt caggacagtg601 gcatctggaa ctgcaccgtg accctgaacc agaagaagca ctcatttgac atgaaactct661 cagtgctggg ctttgcgagc acatccatca cggcctataa gagtgagggg gagtcagcgg721 agttctcctt cccactcaac cttggagagg aaagcctgca gggagagttg agatggaagg781 cagagaaggc tccttcttcc cagtcctgga tcaccttctc cctaaagaac caaaaggtgt841 ctgtgcagaa gtctactagc aaccccaagt tccagctgtc cgaaacgctc ccactcaccc901 ttcagatacc ccaggtctcc cttcagtttg ctggttctgg caacctgacc ctgactctgg961 acagagggat actgtatcag gaagtgaacc tggtggtgat gaaagtgact cagcccgaca1021 gcoacacttt gacctgtgag gtgatgggac ccacctcacc caagatgaga ctgatcttga1081 agcaggagaa tcaggaggcc agggtctcca ggcaggagaa agtgattcaa gtgccggccc1141 ctgaagcagg ggtgtggcaa tgtctactga gtgaaggtga agaggtcaag atggactcca1201 agatccaggt tttatccaaa gggttgaacc agacaatgtt cctggctgtc gtgctgggga1261 gcgccttcag ctttctggtt ttcacggggc tctgcatcct attctgtgtc aggtgccggc1321 accaacagcg ccaggcagca cggatgtctc agatcaagag gcttctcagt gagaagaaga1381 cttgccagtg ctcccaccgg atgcagaaaa gccacaatct catatgaggc ctgggcccca1441 cctgcagccc tgcctgtgtc ctgtcgctga cccaggcctg tggaccagat gaatgtagcc1501 cacacagtgc ctctggcctc ctgcttttct cttccacaac tggccacggt ttctctgcct1561 cigttcccaa gcccgttggc tgagcttgcg ctcggctgtg tttcagacac tcaagcacac1621 ccagccaggt tattgatcct ccgtagctgc ctttacgcca gagcccagcc cttctctgac1681 taacatcctg gatcktcttt ccagctgtct gcttggatct aagggcacct gacctggatg1741 gtgggactg
序列表<110>北京市心肺血管疾病研究所<120>大鼠淋巴細(xì)胞CD4基因定量表達(dá)測(cè)試用引物、探針<130><160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>1ccccttcctt ccccagcacc acg23<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2gtcacccaag gaaagaccgt20<210>3<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>3ttttggtcag aggacttcca cgc2權(quán)利要求
1.一種大鼠淋巴細(xì)胞CD4基因定量表達(dá)測(cè)試用引物、探針，其特征在于所述的引物序列中，上游引物123U的序列為5’GTCACCCAAGGAAAGACCGT 3’，下游引物213L的序列為5’TTTTGGTCAGAGGACTTCCACGC 3’；探針140-FT的序列為5’CCCCTTCCTTCCCCAGCACCACG 3’。
全文摘要
一種大鼠淋巴細(xì)胞CD4基因定量表達(dá)測(cè)試用引物、探針，其特征在于所述的引物序列中，上游引物123U的序列為5’GTCACCCAAGGAAAGACCGT 3’，下游引物213L的序列為5’TTTTGGTCAGAGGACTTCCACGC 3’；探針140－FT的序列為5’CCCCTTCCTTCCCCAGCACCACG 3’。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本基因、探針和引物的靈敏度和特異性好，實(shí)時(shí)相對(duì)定量分析，準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)單，只需一步，所需樣本量小。采用實(shí)時(shí)相對(duì)定量分析方法檢測(cè)到外周血淋巴細(xì)胞CD4基因表達(dá)水平峰值與流式細(xì)胞儀檢測(cè)到CD4免疫分子表達(dá)峰值時(shí)間一致，比免疫組化測(cè)定到移植心肌組織中CD4+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)峰值提前4天。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1475579SQ0214613
公開(kāi)日2004年2月18日 申請(qǐng)日期2002年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月16日
發(fā)明者黃益民, 顧云, 張穎, 朱文斯 申請(qǐng)人:北京市心肺血管疾病研究所