專利名稱：人工水蛭蛋白酶抑素及其編碼基因與該基因的高效表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中人工水蛭蛋白酶抑素及其編碼基因與該基因的高效表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
彈性蛋白酶是一種降解膠原、軟骨等組織內(nèi)彈性蛋白的酶，又稱人白細(xì)胞彈性蛋白酶。當(dāng)中性白細(xì)胞在體內(nèi)遇到異物時(shí)，釋放彈性蛋白酶，水解并滅活異物，保護(hù)人體的正常生理功能。但在某些病理狀態(tài)下，中性白細(xì)胞也可向正常組織釋放該蛋白酶，導(dǎo)致正常組織的破壞，如牛皮癬的皮損，肺氣腫的肺泡破裂，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨面損傷。除此之外，彈性蛋白酶也有一部分來自于胰腺，分泌進(jìn)入消化道，幫助食物的消化吸收，當(dāng)急性或慢性胰腺炎時(shí)，彈性蛋白酶可釋放進(jìn)入周圍組織和腹腔，導(dǎo)致急慢性炎癥，因此，尋找一種高效而特異的彈性蛋白酶抑制，對多種疾病的防治意義重大。
Jung H.H.等人于1995年在水蛭體內(nèi)分離出一種彈性蛋白酶抑制劑，命名為水蛭蛋白酶抑素，可高效特異地抑制彈性蛋白酶活性，無論特異性，還是活性均優(yōu)于市售產(chǎn)品，并且在酸堿狀態(tài)下均很穩(wěn)定，因此采用基因工程手段，實(shí)現(xiàn)水蛭蛋白酶抑素的體外高效表達(dá)，對該蛋白的進(jìn)一步開發(fā)并進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，意義重大。
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是用于表達(dá)外源蛋白的最成功的表達(dá)系統(tǒng)之一，近年來發(fā)展非常迅速，目前已有幾百種蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中得以表達(dá)。畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)型酵母菌，其生長迅速，培養(yǎng)條件簡單，可以高密度連續(xù)培養(yǎng)，遺傳操作與釀酒酵母相似，技術(shù)已相當(dāng)成熟，是工業(yè)生產(chǎn)中常用的高表達(dá)菌種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的人工合成的水蛭蛋白酶抑素及其編碼基因。
本發(fā)明提供的水蛭蛋白酶抑素，是具有序列表中序列4氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列4的氨基酸殘基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列4的蛋白質(zhì)由57個(gè)氨基酸殘基組成。
本發(fā)明選用了畢赤酵母菌優(yōu)選密碼子，并用計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算了翻譯起始區(qū)和水蛭蛋白酶抑素基因5’端二級結(jié)構(gòu)最小生成自由能，設(shè)計(jì)并合成了水蛭蛋白酶抑素基因序列。
水蛭蛋白酶抑素的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有93％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由174個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中序列4的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明水蛭蛋白酶抑素基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種高效表達(dá)上述人工合成的水蛭蛋白酶抑素基因的方法。
為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案水蛭蛋白酶抑素基因的高效表達(dá)方法，是將上述人工合成的水蛭蛋白酶抑素基因?qū)氲疆叧嘟湍妇?，表達(dá)獲得水蛭蛋白酶抑素，具體的說包括以下步驟1)合成水蛭蛋白酶抑素基因序列；2)將合成的基因片段與載體pPIC9K連接，得到表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌后獲得表達(dá)工程菌；3)培養(yǎng)工程菌，表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液中，獲得目標(biāo)蛋白。
為了使表達(dá)更加高效，畢赤酵母菌的表達(dá)過程中用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)過程中的甲醇終濃度優(yōu)選為1％-5％。
用本發(fā)明的方法得到的水蛭蛋白酶抑素占培養(yǎng)液總蛋白的94.6％以上，表達(dá)過程操作簡單，產(chǎn)品成本較低，可用于規(guī)?；a(chǎn)。
本發(fā)明的水蛭蛋白酶抑素具有高效特異地抑制彈性蛋白酶活性的作用，在酸堿狀態(tài)下狀態(tài)穩(wěn)定，對于開發(fā)新的具有抑制彈性蛋白酶活性的藥物具有重要意義。


圖1為本發(fā)明水蛭蛋白酶抑素PCR擴(kuò)增后的電泳圖譜。
圖2為載體pGEM-ACP2的圖譜。
圖3為pGEM-ACP2表達(dá)質(zhì)粒的圖譜。
圖4為pGEM-ACP2表達(dá)質(zhì)粒酶切凝膠電泳圖譜。
圖5為誘導(dǎo)前后培養(yǎng)液電泳圖。
圖6為目標(biāo)產(chǎn)物的活性鑒定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、表達(dá)基因的合成1、小片段的人工合成將序列1水蛭蛋白酶抑素基因分為二段，第一段序列為cDNA正鏈，第二段序列為cDNA互補(bǔ)鏈。在第一段的3’端外加8個(gè)與第二段3’互補(bǔ)的堿基，總長105個(gè)堿基，為序列表中的序列2，在第二段的3’端外加8個(gè)與第一段3’端互補(bǔ)的堿基，總長111個(gè)堿基，為序列表中的序列3。在兩片段5’端分別加上NdeI和NotI酶切位點(diǎn)，用DNA合成儀合成。
將DNA合成儀合成的片段，用單一循環(huán)的PCR反應(yīng)連接合成序列1的全序列水蛭蛋白酶抑素基因，如圖1所示，證明得到的序列正確。
實(shí)施例2、水蛭蛋白酶抑素體外表達(dá)1、切取該P(yáng)CR片段，裝入pGEM-T-EASY質(zhì)粒內(nèi)，構(gòu)建pGEM-GUM克隆載體，其結(jié)構(gòu)圖譜如圖2所示。
2、pGEM-GUM表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建采用購自美國Invitrogen公司的高效表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K，用NdeI和NotI分別酶切pGEM-GUM質(zhì)粒和pPIC9K質(zhì)粒，凝膠電泳收集目標(biāo)片段，用T4連接酶16℃過夜連接。經(jīng)常規(guī)方法的轉(zhuǎn)化，挑菌，擴(kuò)增獲得表達(dá)質(zhì)粒pGEM-GUM，其結(jié)構(gòu)圖譜如圖3所示。如圖4所示，酶切鑒定，證明表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)正確。
3、將質(zhì)粒pGEM-GUM用SacI線性化。采用浙江新芝公司電基因?qū)雰x，將線性化的pGEM-GUM導(dǎo)入GS115畢赤酵母菌(購自Invitrogen公司)內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)，挑選，篩選等過程，獲得抗G418mg/ml的單克隆菌。
4、挑選單克隆菌，接種于5ml培養(yǎng)基中，30℃過夜，然后轉(zhuǎn)入250ml培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600＝10-20，收集菌體，用無碳源培養(yǎng)基稀釋至OD600＝50，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，加入甲醇至終濃度為2％誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24小時(shí)加甲醇一次，至96小時(shí)。離心取上清液，進(jìn)行凝膠電泳分析和功能測定。取10ml上清液，用12％SDS-PAGE電泳，并經(jīng)考馬斯亮蘭染色。結(jié)果可見，在6KD的位置，有誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)，并根據(jù)BSA對照，估測表達(dá)量為103mg/L。
在本實(shí)施例中，培養(yǎng)單克隆菌體時(shí)用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)意義很大，在沒有誘導(dǎo)之前，培養(yǎng)液中目標(biāo)蛋白的含量很低，如圖5所示，誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液中有顯著的目標(biāo)蛋白帶，大小與序列4的蛋白相同，而誘導(dǎo)前的培養(yǎng)液中沒有顯著的目標(biāo)蛋白帶。
實(shí)施例3、本發(fā)明水蛭蛋白酶抑素的功能測定取5支試管，分別標(biāo)為磷酸緩沖液、誘導(dǎo)前上清、誘導(dǎo)后上清1、上清2、上清3，依次分別加入40ul 0.2M Tris-HCl，pH8.0，20ul 0.37mg/ml豬胰腺彈性蛋白酶(SIGMA，E-1250)，然后按試管上的標(biāo)簽分別加入40ul磷酸緩沖液、誘導(dǎo)前上清或誘導(dǎo)后上清，混勻，再加入400ul 0.1mM反應(yīng)底物SucA3PNA(SIGMA)，室溫反應(yīng)10分鐘后，在410nm處比色，以磷酸緩沖液作比較，計(jì)算酶活性抑制百分率，計(jì)算公式為OD410測定樣/OD410磷酸緩沖液。結(jié)果如圖6所示，誘導(dǎo)前上清與磷酸緩沖液組無明顯差異，而誘導(dǎo)后上清的酶活性抑制百分率為99％。表明表達(dá)產(chǎn)物即為水蛭蛋白酶抑素，并有良好的彈性蛋白酶抑制作用。
序列表<160>4<210>1<211>174<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gttgacgaaa acgctgaaga cacccatggt ttgtgcggtg aaaaaacctg ctctccagct 60caagtctgtc taaacaacga atgcgcttgc actgcaatca gatgcatgat cttctgtcct120aacggtttca aagttgatga aaacggttgc gaatacccat gtacctgcgc ttga 174<210>2<211>105<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gaagcttacg tagttgacga aaacgctgaa gacacccatg gtttgtgcgg tgaaaaaacc 60tgctctccag ctcaagtctg tctaaacaac gaatgcgctt gcact105<210>3<211>111<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3attcgcggcc gctcaagcgc aggtacatgg gtattcgcaa ccgttttcat caactttgaa 60
accgttagga cagaagatca tgcatctgat tgcagtgcaa gcgcattcgt t 111<210>4<211>57<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Val Asp Glu Asn Ala Glu Asp Thr His Gly Leu Cys Gly Glu Lys1 5 10 15Thr Cys Ser Pro Ala Gln Val Cys Leu Asn Asn Glu Cys Ala Cys20 25 30Thr Ala Ile Arg Cys Met Ile Phe Cys Pro Asn Gly Phe Lys Val35 40 45Asp Glu Asn Gly Cys Glu Tyr Pro Cys Thr Cys Ala50 55 5權(quán)利要求
1.水蛭蛋白酶抑素，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭蛋白酶抑素，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
3.水蛭蛋白酶抑素的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有93％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述水蛭蛋白酶抑素的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求3或4所述基因的細(xì)胞系。
7.水蛭蛋白酶抑素基因的高效表達(dá)方法，是將權(quán)利要求3的基因?qū)氲疆叧嘟湍妇校磉_(dá)獲得水蛭蛋白酶抑素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于包括以下步驟1)合成水蛭蛋白酶抑素基因序列；2)將合成的基因片段與載體pPIC9K連接，得到表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌后獲得表達(dá)工程菌；3)培養(yǎng)工程菌，表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液中，獲得目標(biāo)蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于畢赤酵母菌的表達(dá)過程中用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于誘導(dǎo)過程中的甲醇終濃度為1％-5％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工水蛭蛋白酶抑素及其編碼基因與該基因的高效表達(dá)方法，本發(fā)明提供的水蛭蛋白酶抑素，是具有序列表中序列4氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列4的氨基酸殘基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。水蛭蛋白酶抑素的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有93％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的水蛭蛋白酶抑素具有高效特異地抑制彈性蛋白酶活性的作用，在酸堿狀態(tài)下狀態(tài)穩(wěn)定，對于開發(fā)新的具有抑制彈性蛋白酶活性的藥物具有重要意義。
文檔編號C12N15/63GK1498901SQ02146788
公開日2004年5月26日 申請日期2002年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月8日
發(fā)明者劉鳳鳴 申請人:劉鳳鳴