專利名稱：細(xì)胞質(zhì)型1,6-二磷酸果糖酶基因啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中基因的啟動子及其應(yīng)用，特別是涉及細(xì)胞質(zhì)型1，6-二磷酸果糖酶基因啟動子及其應(yīng)用。
背景技本基因工程的最終目的是按人們的意愿在特定組織或器官中特異性地表達(dá)外源基因，利用特異性表達(dá)的啟動子有助于該目的實現(xiàn)。目前，一些具有不同表達(dá)特征與特性的啟動子已從植物中分離出來，一批順式調(diào)控元件，如與光調(diào)節(jié)有關(guān)的元件(Kuhlemeier et al.1989)、器官特異性表達(dá)的元件(Rosahl et al.1987)、組織特異性表達(dá)的元件(Gilmartin et al.1990)、以及與溫度調(diào)節(jié)有關(guān)的元件(Callis et al.1988)已被鑒定。這些特異性表達(dá)啟動子或順式調(diào)控元件與外源基因的結(jié)合，可以使外源基因在特定的器官或組織中表達(dá)(Claes et al.1991)。
高等植物中，由核基因編碼的細(xì)胞質(zhì)型1，6-二磷酸果糖酶(cyFBPase)與磷酸蔗糖合酶是蔗糖合成的限速酶。細(xì)胞質(zhì)型1，6-二磷酸果糖酶催化1，6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸果糖和無機(jī)磷酸，與磷酸果糖激酶及焦磷酸1，6-二磷酸轉(zhuǎn)移酶共同作用，調(diào)控蔗糖合成途徑中的一個必需單糖的生成(An et al.1990)。對水稻中細(xì)胞質(zhì)型1，6-二磷酸果糖酶表達(dá)模式的研究表明，在葉片和葉鞘中均有其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，且葉鞘中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在抽穗后增加，抽穗之前的花序和根中都沒檢測到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Taniguchi et al.2000a)。目前，在水稻中應(yīng)用的組成型啟動子主要為CaMV 35S、Adh1、actin1、ubiquitin啟動子，CaMV 35S啟動子在單子葉植物中的表達(dá)較低，使其利用受到了限制；其它三個啟動子的表達(dá)都需要包含第一個內(nèi)含子，使啟動子區(qū)的序列比較長，且在啟動子區(qū)含有多個基因工程中常用的酶切位點，給亞克隆造成了很大的麻煩。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供細(xì)胞質(zhì)型1，6-二磷酸果糖酶基因的啟動子。
本發(fā)明所提供的細(xì)胞質(zhì)型1，6-二磷酸果糖酶基因啟動子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)序列表中序列1的缺失體DNA序列；3)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
序列表中序列1的DNA由1195個堿基組成。自5’端的第232-237位核苷酸為I盒；自5’端的第624-628位核苷酸為CGTCA盒；自5’端的第984-992位核苷酸為TATA盒；自5’端的第1007-1016位核苷酸為兩個串聯(lián)的CGTCA盒。如果將編碼1，6-二磷酸果糖酶的讀碼框自5’端的第一個核苷酸命名為+1的話，本發(fā)明啟動子自5’端的編號也可以用-1195到-1來表示。
所述缺失體DNA序列為序列表中序列1自5’端分別缺失了93bp、427bp、551bp個核苷酸而形成的缺失體DNA序列。
含有本發(fā)明啟動子及其缺失體部分序列的表達(dá)載體、細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明啟動子的發(fā)現(xiàn)和其表達(dá)模式及功能的闡明，對于植物特別是禾本科單子葉植物，如水稻、玉米、小麥、大麥或谷子等代謝的精細(xì)調(diào)控和生物技術(shù)育種具有重要意義，為今后在植物中特異性表達(dá)外源基因提供了新型有效的啟動子或順式元件。水稻葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動子可以用來研究及改善植物代謝及源庫關(guān)系，最終達(dá)到改善品質(zhì)或者提高產(chǎn)量的目的。對于一些以葉片為主要侵染部位的病蟲害，也可以用葉肉細(xì)胞特異性的啟動子來調(diào)控抗性基因的表達(dá)，增加作物的抗性。
水稻cyFBPase啟動子ATG上游-1102，-768bp及-644bp的序列就可以使報告基因在水稻中有很強(qiáng)的組成性表達(dá)，序列非常短；并且在這段序列中無常用酶切位點，為其在水稻表達(dá)載體的構(gòu)建方面提供了很大的優(yōu)勢，可作為替代CaMV 35S，actin1，Ubiquitin等組成性啟動子用于各種基因操作。
對轉(zhuǎn)基因植株種子的分析表明，cyFBPase啟動子在成熟胚乳中沒有表達(dá)，這種模式可以部分地解決食品安全性的問題。
下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1為Genome walking中第一輪及第二輪擴(kuò)增結(jié)果。
圖2為pA嵌合基因質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖。
圖3為pA轉(zhuǎn)基因植株中的GUS活性檢測結(jié)果。
圖4為轉(zhuǎn)基因水稻不同組織切片，顯示cyFBPase啟動子在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)的組織化學(xué)定位。
圖5為不同器官的GUS活性，顯示cyFBPase啟動子在轉(zhuǎn)基因水稻不同器官中的表達(dá)。
圖6為不同的cyFBPase啟動子5’端缺失的植物表達(dá)載體圖譜。
圖7為不同缺失體轉(zhuǎn)基因水稻成熟葉片的組織化學(xué)定位。
圖8為pB、pC、pD三個缺失體轉(zhuǎn)基因水稻葉鞘、莖、根的組織化學(xué)定位。
圖9為GUS基因在四個缺失體轉(zhuǎn)基因植株根、莖、葉鞘中的活性比較。
圖10為GUS基因在種子中的表達(dá)活性檢測。
圖11為四個缺失體未抽出葉片及花粉的組織化學(xué)定位，顯示GUS基因的表達(dá)。
圖12為GUS基因在其它器官的活性表達(dá)檢測。
具體實施例在本發(fā)明的實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Escherichia coli)株系DH5α；雙元載體pCAMBIA 1391Z(在T-DNA左右邊界區(qū)內(nèi)帶有可供植物選擇用潮霉素抗性基因)；水稻(Oryza sativa L.)品系明恢63(MH63)、8706；煙草(Nicotianatobacum)品系中華大煙草；購自BIOLAB、SIGMA、GIBCO、BOEHRINGER、BIO-RAD、QIAGEN、及華美公司的限制性內(nèi)切酶、修飾酶等試劑。
實施例1、水稻基因組文庫的構(gòu)建水稻品種MH63在無蔗糖的MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，生長兩周后，從葉片中提取DNA。大約2.5μg水稻總DNA分別被產(chǎn)生平端的5種酶(DraI、EcoRV、PvuII、ScaI、StuI)酶解過夜，完全酶解的DNA片段分別用酚/氯仿/異戊醇和氯仿/異戊醇各抽提一次，乙醇沉淀。四種酶消化的片段(DraI、EcoRV、ScaI、StuI)與接頭(adapter)在16℃連接過夜，產(chǎn)生4個文庫，記為DraI、EcoRV、ScaI、StuI。
實施例2、分離啟動子用Genome walking方法分離啟動子，具體按Genome walkerTM(K1807)試劑盒進(jìn)行。首先用基因特異性引物1(GSP1)5’TCT GCT CGT TCA GCA CGT ACC GCG TGATCG3’和接頭引物1(AP1)5’GTA AAT ACG ACT CAC TAT AGG GC3’按下列條件擴(kuò)增94℃ 4min后，94℃ 2sec，72℃ 3min走7個循環(huán)；然后94℃ 2sec，67℃ 3min走35個循環(huán)；最后67℃延伸7min。第一輪擴(kuò)增后，取5μl產(chǎn)物檢測，從DraI、EcoRV、StuI的文庫中分別得到1.8kb、2.5kb和0.8kb的片段。
PCR產(chǎn)物按1∶50稀釋后，取1μl用于第二輪擴(kuò)增。所用引物為基因特異性引物2(GSP2)5’GTC CGG TAC GCG TCC GCC TCG TGA TCC ATC 3’和接頭引物2(AP2)5’ACT ATA GGG CAC GCG TGG T 3’按下列條件擴(kuò)增94℃ 4min后，94℃ 2sec，72℃ 3min走5個循環(huán)；然后94℃ 2sec，65℃ 3min走25個循環(huán)；最后65℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用QIAGEN凝膠回收試劑盒回收后，連接到PCRII載體上。序列分析表明來自不同文庫的產(chǎn)物是同一個片段，但與1，6-二磷酸果糖酶基因的cDNA相比不具同源性。因此，又設(shè)計了兩個基因特異性引物(GSP3)5 CAC GTC CAG CTT CTT CTG CTCCTC TCC3’和(GSP4)5 GAC GAA CTT GCA GCC AAG CAC GAT GTG3’進(jìn)行第二次Genomewalking擴(kuò)增，在第一輪擴(kuò)增后，分別從DraI、EcoRV、StuI中得到1.6kb、2.8kb、0.7kb的擴(kuò)增片段；第二輪擴(kuò)增后，分別從DraI、EcoRV、ScaI中得到1.4kb、2.6kb、2.8kb的擴(kuò)增片段(結(jié)果如圖1所示，圖中A為第一輪擴(kuò)增結(jié)果，B為第二輪擴(kuò)增結(jié)果，1，61kb Marker；2DraI；3EcoRV；4ScaI；5StuI)，其中1.4kb的片段被克隆到PCRII載體中，測序后與1，6-二磷酸果糖酶基因cDNA序列比較，此片段與細(xì)胞質(zhì)型1，6-二磷酸果糖酶基因cDNA重疊的那段序列中沒有發(fā)現(xiàn)任何堿基差異，證明此片段為細(xì)胞質(zhì)型1，6-二磷酸果糖酶基因5’端上游啟動子序列。此克隆記為DraI-1，由1195個核苷酸組成，為序列表中的序列1。對cyFBPase啟動子序列進(jìn)行分析，沒有發(fā)現(xiàn)典型的CCAAT盒，TATA盒在984-992bp處。一個保守CGTCA盒在624-628處有一個拷貝，在1007-1016bp存在兩個串聯(lián)重復(fù)拷貝，此元件在35S啟動子中出現(xiàn)兩次，在小麥組氨酸H3啟動子中出現(xiàn)一次，可能與啟動子的特異性表達(dá)有關(guān)。在232-237bp處存在一與光誘導(dǎo)有關(guān)的I盒(GATAAG)，在這段上游序列中沒有發(fā)現(xiàn)典型的G盒和AT富含區(qū)。
實施例3、水稻啟動子cyFBPase-PromoterGUS植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)特異性分析為了鑒定cyFBPase啟動子的表達(dá)特性，把cyFBPase基因翻譯起始位點上游-1195bp的序列插入雙元表達(dá)載體pCAMBIAP-1391Z中，即用引物1(正向序列)5’-AAG GAT CCG CAC CAC TCT CCT CAG-3’和引物2(反向序列)5’-AAG GAT CCA CAGGAA ACA GCT ATG ACC-3’從DraI-1的克隆中擴(kuò)增出1195bp的cyFBPase啟動子5’端上游序列，因上述兩引物均含有BamHI酶切位點，所以用此酶酶解PCR產(chǎn)物，然后克隆到pCAMBIA1391Z載體中，用EcoRI酶解檢測方向，構(gòu)建成cyFBPase-PromoterGUS植物表達(dá)載體，記為pA。pA嵌合基因質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式如圖2所示，其中35S-pro、FBP-pro指35S CaMV、水稻cyFBPase啟動子；Nos-ter為NOS終止子；Hygromycin為潮霉素篩選抗性基因；GUS為E.coli β-葡萄糖苷酸酶報告基因。
對pA載體的12株不同來源轉(zhuǎn)化株的GUS活性進(jìn)行了熒光定量分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻成熟葉片中GUS活性比在非轉(zhuǎn)化植株中高5-430倍，活性最低的為316.8pmol.min-1.mg-1，最高為30,286.4pmol.min-1.mg-1，平均達(dá)7,031.5pmol.min-1.mg-1(如圖3所示，圖中WT陰性對照；2、4、6、8、9、10、11、16、18、20、21、36為轉(zhuǎn)基因植株。)
將轉(zhuǎn)基因水稻不同組織作切片，對GUS活性進(jìn)行組織化學(xué)檢測，以便在細(xì)胞學(xué)上對GUS基因的表達(dá)進(jìn)行定位。結(jié)果如圖4所示，圖中a成熟葉片；b葉鞘；c莖；d根；e稃片；f穗軸；g穗莖上部，從圖中可以看出，在轉(zhuǎn)pA載體的水稻成熟葉片中，GUS基因僅僅在葉肉細(xì)胞中表達(dá)，而在皮層細(xì)胞、表皮細(xì)胞、泡狀細(xì)胞和維管組織中均無表達(dá)。在葉鞘中的表達(dá)模式與葉片中相似，GUS基因的表達(dá)也僅限于葉肉細(xì)胞，其它組織中沒有表達(dá)。在莖、根中未檢測到GUS活性。在開花期花的稃片中，GUS基因在外層的類葉肉細(xì)胞中有一定量的表達(dá)，在穗軸及穗莖上部，GUS基因的表達(dá)也僅限于類葉肉細(xì)胞中，但在穗莖的下部(被旗葉的葉鞘包裹的部分)，GUS基因則沒有表達(dá)。未轉(zhuǎn)化株在所采用的檢測條件下均無藍(lán)色反應(yīng)，排除了背景的干擾，說明cyFBPase基因啟動子是葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)。
為了進(jìn)一步研究cyFBPase啟動子在不同器官中的調(diào)控，對轉(zhuǎn)基因水稻不同器官的GUS活性進(jìn)行了熒光定量分析。結(jié)果如圖5所示，圖中1幼穗；2稃片；3穗軸；4穗莖上部；5穗莖下部；6莖；7未抽出葉片；8成熟葉片；9葉鞘；10根?？梢钥闯?，在轉(zhuǎn)基因水稻的成熟葉片、葉鞘、穗軸中GUS均有較強(qiáng)的表達(dá)，隨著葉片成熟度的增加，GUS活性也有所提高，但不顯著。在開花期的稃片、穗莖上部也有一定的GUS活性。但在穗莖下部、未抽出的幼葉、幼穗、根、莖中均未檢測到GUS活性，與前面的組織化學(xué)檢測結(jié)果相一致。
在該實施例中，GUS活性定量檢測及組織化學(xué)染色按Jefferson等人的方法進(jìn)行(Jefferson et al.1987)，對轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉等組織進(jìn)行徒手切片，經(jīng)染色后用70％酒精脫色，最后用OLYMPUS顯微鏡進(jìn)行觀察照相。
實施例4、本發(fā)明啟動子的缺失實驗1、cyFBPase啟動子5’端缺失體植物表達(dá)載體的構(gòu)建為了鑒定啟動子區(qū)內(nèi)對特異性表達(dá)有調(diào)控作用的區(qū)段，對1195bp的這段序列進(jìn)行缺失，構(gòu)建了一系列缺失體的植物表達(dá)載體。兩個缺失體分別用引物3(正向序列)5’-TTA AGC TTA ATC CTC GGT TCA AGT TC-3’，引物4(正向序列)5’-TTA AGC TTAACA ACT TCT ACC TTG-3’和實施例3中的引物2從DraI-1的克隆中擴(kuò)增出-1102bp，-644bp 5’端上游序列，并克隆到pCAMBIA1391Z載體中，記為pB與pD。質(zhì)粒pC(-768bp)通過用XhoI和BamHI酶解pA，把所要片段插入pCAMBIA1391Z載體中得到其中載體。用XhoI和BamHI酶切pA，把正確的片段插入pCAMBIA1391Z中，產(chǎn)生-768bp的缺失體pC，如圖6所示，其中pA指最長的啟動子；pB，pC，pD分別代表三個缺失體。所標(biāo)數(shù)字指從cyFBPase翻譯起始位點(ATG)開始的上游序列。
2、cyFBPase啟動子5’端缺失體在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)A、在成熟葉片中的表達(dá)通過基因槍法將所構(gòu)建的缺失體轉(zhuǎn)入水稻。對三個缺失體pB、pC、pD而言，獲得的獨立來源的潮霉素抗性植株分別為35、37、45株，共95株檢測到了GUS活性。
對轉(zhuǎn)基因植株成熟葉片中的GUS活性測定結(jié)果表明，自翻譯起始位點上游-1195bp缺失至-1102bp時，啟動子的活性提高了3倍，進(jìn)一步缺失至-644bp時，啟動子在成熟葉片中的GUS活性與pA的相比提高了近7倍，推測在-1195-1102bp和-1102至-644bp之間分別存在一個對其活性起作用的負(fù)調(diào)控元件。
缺失體轉(zhuǎn)化植株葉片的組織化學(xué)染色結(jié)果如圖7所示，圖中pA、pB、pC、pD為四個缺失體的成熟葉片，從圖中可以看出，在pB轉(zhuǎn)化株成熟葉片上，GUS基因不僅在葉肉細(xì)胞中有表達(dá)，而且在葉片表皮細(xì)胞、泡狀細(xì)胞以及維管組織包括韌皮部、木質(zhì)部、維管束鞘中均有很強(qiáng)的表達(dá)。GUS基因在pC、pD轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)與pB相似，也是在所有的細(xì)胞中都有表達(dá)。這表明，當(dāng)從-1195bp缺失至-1102bp時，啟動子表達(dá)從葉肉細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)變?yōu)榉翘禺愋?，此區(qū)段可能含有對葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)起調(diào)控作用的元件。
B、在根、莖、葉鞘中的表達(dá)將各缺失啟動子報告基因轉(zhuǎn)化植株的根、莖、葉鞘等不同部位進(jìn)行組織化學(xué)檢測，結(jié)果如圖8所示，圖中a、b、c、d分別為pB缺失體的成熟葉片、葉鞘、莖、根；e、f、g、h分別為pC缺失體的成熟葉片、葉鞘、莖、根；i、j、k分別為pD缺失體的成熟葉片、莖、根。從圖中可以看出，pB在葉鞘中的表達(dá)與葉片中相似，GUS基因也是在所有的細(xì)胞中表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因水稻的莖中，GUS活性在維管組織中有較強(qiáng)的表達(dá)，在表皮細(xì)胞中表達(dá)很弱；在根中，GUS基因在內(nèi)皮層的部分細(xì)胞中有很強(qiáng)的表達(dá)，但在表皮、外皮層、韌皮部、木質(zhì)部、髓心細(xì)胞中GUS基因的表達(dá)很弱。其它的缺失體pC、pD的表達(dá)模式與pB相似，GUS基因幾乎在根、莖的所有細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。進(jìn)一步說明pB、pC、pD的表達(dá)已經(jīng)從葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)轉(zhuǎn)變?yōu)榻M成型表達(dá)，pA啟動子-1195-1102bp之間93bp的區(qū)段是該啟動子葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)所必需的。進(jìn)一步缺失至-768bp，GUS基因在各器官中的活性則繼續(xù)升高，對于同一器官而言，pC轉(zhuǎn)化株中的GUS活性均比pB要高許多，但pD與pC的差異不大(如圖9所示，圖中C莖；L成熟葉片；LS葉鞘；R根)。進(jìn)一步證明了從-1195-1102bp的93bp的區(qū)段和-1102-768bp的344bp存在對該基因活性起調(diào)控作用的負(fù)調(diào)控元件。
C、在種子中的表達(dá)對于pA(-1195bp)轉(zhuǎn)化株，GUS基因在種子中的表達(dá)很低，其活性除了在開花后15天超過對照之外，在其它時期都接近本底水平，對于另外三個缺失體pB、pC、pD，開花后5天的種子中能檢測到GUS活性，從5天到20天，其活性一直是升高的，30天后則開始下降，成熟種子中的活性很低或幾乎沒有，與GUS組織化學(xué)染色的結(jié)果一致(結(jié)果如圖10所示)。
D、在其它器官中的表達(dá)對未抽出的葉片以及花粉的GUS染色結(jié)果表明，在pA載體的轉(zhuǎn)化植株中，幼嫩葉片中沒有GUS基因的表達(dá)；在pB、pC、pD缺失體的轉(zhuǎn)化株中，盡管GUS活性比成熟葉片低，但在葉肉細(xì)胞、維管束鞘細(xì)胞中有明顯的蘭色反應(yīng)，在木質(zhì)部、韌皮部的表達(dá)活性非常弱，仍可以看到GUS基因有一定量的表達(dá)。在pA植株的花粉中，沒有GUS基因的表達(dá)；經(jīng)過缺失后，可以看到在三個缺失體的花粉中都有表達(dá)(如圖11所示，圖中a、b、c、d分別為pA、pB、pC、pD四個缺失體的未抽出葉片；e、f、g、h分別為pA、pB、pC、pD四個缺失體的花粉)。
對其它器官如稃片、穗軸、穗莖等的GUS活性也進(jìn)行了檢測，如圖12所示，圖中1幼穗；2稃片；3穗軸；4穗莖上部；5穗莖下部；6未抽出葉片。從圖中可以看出，pA載體轉(zhuǎn)基因植株在未抽出的幼穗、幼葉中未檢測到活性，與組織切片的結(jié)果是一致的；其它三個缺失體的轉(zhuǎn)化株在開花期的稃片、穗軸、穗莖上部的表達(dá)相對都很強(qiáng)，在幼穗及幼葉中也有一定量的表達(dá)。pB載體的轉(zhuǎn)基因植株比pA植株相應(yīng)的器官要強(qiáng)，而pC、pD的又比pB的強(qiáng)，這與在成熟葉片、葉鞘、莖、根等器官中檢測到的結(jié)果是一致的。
本發(fā)明啟動子的缺失實驗表明，翻譯起始位點ATG上游的這1195bp調(diào)控區(qū)已足夠?qū)е禄蛟谒救~肉細(xì)胞中特異性表達(dá)，因此這1195bp的片段含有使該基因特異性表達(dá)的所有順式調(diào)控元件。
實施例5、cyFBPase啟動子在轉(zhuǎn)基因煙草中的特性用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把pA載體轉(zhuǎn)入煙草，再生的植株先用GUS基因特異性的引物作PCR進(jìn)行初步篩選，陽性株移至溫室。
篩選所用的GUS引物為正向序列5’-CAG GAA GTG ATG GAG CAT CAG-3’反向序列5’-TCG TGC ACC ATC AGC ACG TAA-3’結(jié)果表明，cyFBPase啟動子不能指導(dǎo)報告基因在煙草中表達(dá)，暗示在雙子葉煙草中沒有相應(yīng)的反式因子與其結(jié)合，因而此啟動子沒有功能。推測cyFBPase基因在雙子葉植物與單子葉植物的分化過程中，除了其啟動子中的順式元件發(fā)生改變外，與之作用的反式因子也發(fā)生了很大變化，最終導(dǎo)致這些反式因子與順式元件不能交叉識別。
序列表<160>1<210>1<211>1195<212>DNA<213>稻屬水稻(Orysa sativa L.)<400>1aaaggtacac tcgattacat tgccggtaat aggcatatag tagttgcgta ccatgtcgag60ttgatcatga gttcatgacc agccccgtgt gaaatcctcg gttcaagttc tttccgagtt 120gcatatacca tcgctttacc tcagcggaca ataaatgagc agggactttt tactcggatt 180atccgtcgca tatgcttgtc aaaagatacg aaaggcagac gaatccagta ggataagtca 240tatgggggtg tgttttattt ctgaaaaaaa tggtaagttt gaggaaagtt gggagtttgg 300aaaaaaagtt aagtttatgt gtatagtaaa gtttttgatg tattatgatg tgatggaaag 360tcagaaatag gggaagacta aacacagcca tggtaaagca gctcttcccc gagctgaccg 420gaagctcgag cagcctagcg tgaaggtaaa gcgtccagtc gcctgcgagt ccccctcccg 480ccctgtagct ctcactcgaa gtcgaacccg gtgccatatt ccacgcgtaa atgctaggcc 540attaaaggca aacaacttct accttggaga gttggaggct tggagcccat ttgcgagacc 600ccctctccgg ttaaccgttt cgccgtcaca tcgggcgcac agcttaacac gacgtacttg 660gtcataatct cgcaccatcc gcgtcggcgt cggcgtcggc gcctctgctc aacaacaact 720acacccccgc tagcttgctg cgttgccgta gtacgtggcg gtacagggca aagccgtgct 780cgcctctagt agctcgactt agctcgggcc tcgatcacct ggggggcgaa acgcgacgac 840cacagacgca cacggccacc gcgctaccag ccatcgcgga tagaggggat aggcctccgc 900gccgattccg ttggagctcc tcgcccctcg gctcccagcc tcactttctc ccctcgctac 960ctcccaaaac ccctaaaaaa aacgcccaat acgtacaccg cgcccgcgtc acgtcacctc 1020accgggtcag ttcccgcgcc gtgtgaccaa tactcaacac ttaaaccgcg cgctttttag 1080ccgacccgag cagccggaga gtgaggcgag gcgaagcgaa gggaagagcg cgaggcagag 1140taagcagacg agaagaacag cgcgcggcgc ggtagctgag gagagtggtg cggag 119權(quán)利要求
1.細(xì)胞質(zhì)型1，6-二磷酸果糖酶基因啟動子，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)序列表中序列1的缺失體DNA序列；3)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于它具有序列表中序列1的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的啟動子，其特征在于自5’端的第232-237位核苷酸為I盒；自5’端的第624-628位核苷酸為CGTCA盒；自5’端的第984-992位核苷酸為TATA盒；自5’端的第1007-1016位核苷酸為兩個串聯(lián)的CGTCA盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于所述缺失體DNA序列為序列表中序列1自5’端分別缺失了93bp、427bp、551bp個核苷酸而形成的缺失體DNA序列。
5.含有權(quán)利要求1所述啟動子的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求1所述啟動子的細(xì)胞系。
7.權(quán)利要求1所述的啟動子在植物育種中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為禾本科單子葉植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為水稻、玉米、小麥、大麥或谷子。
10.權(quán)利要求1所述的啟動子在植物代謝調(diào)控及分子育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了細(xì)胞質(zhì)型1，6－二磷酸果糖酶基因啟動子及其在植物代謝調(diào)控及分子育種中應(yīng)用。本發(fā)明所提供的細(xì)胞質(zhì)型1，6－二磷酸果糖酶基因啟動子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)序列表中序列1的缺失體DNA序列；3)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。細(xì)胞質(zhì)型1，6－二磷酸果糖酶基因啟動子全長具有葉肉細(xì)胞特異性表達(dá)模式，而其不同的缺失體則表現(xiàn)出組成性表達(dá)模式，本發(fā)明啟動子系列的發(fā)現(xiàn)和其表達(dá)模式及功能的闡明，為植物代謝的精細(xì)調(diào)控和生物工程提供強(qiáng)有力的工具。在植物分子育種中具有重要意義。
文檔編號C12N15/52GK1498966SQ0214679
公開日2004年5月26日 申請日期2002年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月8日
發(fā)明者儲成才, 司麗珍, 宋德林 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所