專利名稱：糖核苷酸的制造方法
本申請是申請日為1997年9月12日，申請?zhí)枮?7191682.9，發(fā)明名稱為“糖核苷酸類及復(fù)合糖類的制造方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。
1)的方法中必需有高價(jià)的尿苷-5’-一磷酸(以下簡稱UMP)的morpholidate衍生物、糖磷酸等；2)的方法中必需有UMP、尿苷-5’-二磷酸(以下簡稱UDP)、尿苷-5’-三磷酸(以下簡稱UTP)、腺苷-5’-三磷酸(以下簡稱ATP)、磷酸烯醇丙酮酸、糖磷酸等高價(jià)的原料和丙酮酸激酶等多種酶；3)的方法中需要進(jìn)行酵母菌體的干燥處理，并且使用高價(jià)的UMP等作為原料。包括4)的方法在內(nèi)，上述所有的方法中均使用高價(jià)的尿苷核苷酸、糖磷酸等作為原料，并在操作上難以大量生產(chǎn)，所以至今尚未確立糖核苷酸的工業(yè)規(guī)模上的制造方法。
已知的復(fù)合糖類的制造方法有，1)化學(xué)合成法[Method inEnzymol.47，193(1994)、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.21，155(1988)、Carbohydr.Res.211，c1(1991)]，2)使用水解酶的方法[Anal.Biochem.202，215(1992)、Trends Biotechnol.6，256(1998)]，以及3)使用糖轉(zhuǎn)移酶的方法(特開平7-79792、特表平7-500248、特公平5-82200、WO94/25614)。
1)的方法中為了立體選擇性合成需要導(dǎo)入保護(hù)基團(tuán)；2)的方法中收率和選擇性不高；而3)的方法中需要高價(jià)的原料；以上方法均未確立復(fù)合糖類的工業(yè)性制造方法。
有報(bào)道講，棒狀桿菌屬的微生物中添加乳清酸而產(chǎn)生UMP[Amino Acid，Nucleic Acid，23，107(1971)]。
發(fā)明人對利用微生物生產(chǎn)糖核苷酸的方法進(jìn)行專門研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)微生物時在培養(yǎng)基中添加糖核苷酸的前體物質(zhì)及糖，從而可生成糖核苷酸，并且發(fā)現(xiàn)利用該糖核苷酸可生成復(fù)合糖類，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供具有以下特征的糖核苷酸的制造方法以具有從核苷酸前體物質(zhì)和糖生成糖核苷酸能力的微生物培養(yǎng)液或該培養(yǎng)液的處理物為酶源，在含有該酶源、核苷酸前體物質(zhì)和糖的水性介質(zhì)中進(jìn)行酶反應(yīng)，在該水性介質(zhì)中產(chǎn)生并蓄積糖核苷酸，并從該水性介質(zhì)中提取糖核苷酸。
同時，本發(fā)明提供具有以下特征的復(fù)合糖類的制造方法以具有從核苷酸前體物質(zhì)和糖生成糖核苷酸能力的微生物培養(yǎng)液或該培養(yǎng)液的處理物、以及具有從糖核苷酸和復(fù)合糖類前體生成復(fù)合糖類能力的微生物或動物細(xì)胞的培養(yǎng)液或該培養(yǎng)液的處理物為酶源，在含有該酶源、核苷酸前體物質(zhì)、糖以及復(fù)合糖類前體的水性介質(zhì)中進(jìn)行酶反應(yīng)，在水性介質(zhì)中產(chǎn)生并蓄積復(fù)合糖類，并從該水性介質(zhì)中提取復(fù)合糖類。
本發(fā)明提供，具有1)不必需使用尿苷核苷酸、糖磷酸等高價(jià)的原料，而可利用乳清酸等廉價(jià)的核苷酸前體物質(zhì)及糖為原料；2)從UDP到UTP的轉(zhuǎn)換中不必添加高價(jià)的磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸激酶；3)無需酶的分離操作等特征的糖核苷酸的新的制造方法和利用該糖核苷酸制造方法的新的復(fù)合糖類的制造方法。
下面詳細(xì)說明本發(fā)明。
在本發(fā)明的糖核苷酸的制造中可使用的微生物，只要是具有從核苷酸前體物質(zhì)和糖生成糖核苷酸能力的微生物，就都可使用。例如可舉出屬于酵母的微生物。具體的可舉例，如屬于酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬、酒香酵母屬的微生物。優(yōu)選的例子可舉，屬于酵母屬的微生物釀酒酵母等；屬于假絲酵母屬的微生物產(chǎn)朊假絲酵母、近平滑假絲酵母、克魯斯氏假絲酵母、易變假絲酵母、解脂假絲酵母、涎沫假絲酵母、吉利蒙氏假絲酵母、白色假絲酵母、土生假絲酵母等；屬于畢赤酵母屬的微生物粉狀畢赤酵母、奧默列氏畢赤酵母等；屬于球擬酵母屬的微生物白色球擬酵母、球面球擬酵母、木醋球擬酵母(Torulopsis xylinus)、無名球擬酵母、易變球擬酵母等；屬于德巴利酵母屬的微生物類球形德巴利酵母、坎塔雷利德巴利酵母(Debaryomyces cantarellii)、球形德巴利酵母、漢遜氏德巴利酵母、日本德巴利酵母等；屬于接合酵母屬的微生物魯氏接合酵母、拜列氏接合酵母等；屬于克魯維酵母屬的微生物馬克斯克魯維酵母；屬于漢遜酵母屬的微生物異常漢遜酵母、杰丁漢遜酵母等；屬于酒香酵母屬的微生物蘭姆啤可酒香酵母、異酒香酵母等。
另外，作為在本發(fā)明的糖核苷酸的制造中所用的微生物，可以使用通過一般的變異處理等手段獲得或提高從核苷酸前體物質(zhì)和糖生成糖核苷酸能力的微生物。
本發(fā)明中微生物的培養(yǎng)可按通常的方法進(jìn)行培養(yǎng)。
作為培養(yǎng)該微生物的培養(yǎng)基，只要含有該微生物可同化的碳源、氮源、無機(jī)鹽類等物質(zhì)，并能有效地培養(yǎng)該微生物，不管是天然培養(yǎng)基還是合成培養(yǎng)基均可使用。
作為碳源，只要可為各種微生物同化就可以，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物；丙酮酸、乳酸、枸櫞酸、延胡索酸等各種有機(jī)酸；谷氨酸、蛋氨酸、賴氨酸等各種氨基酸；乙醇、丙醇、甘油等醇類。
另外也可使用白糠、木薯、甘蔗纖維、玉米漿等天然有機(jī)營養(yǎng)源。
作為氮源，可使用氨、氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、醋酸銨、磷酸銨等各種無機(jī)或有機(jī)銨鹽類；谷氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸等氨基酸；胨、NZ胺、玉米漿、肉浸膏、酵母浸膏、麥芽浸膏、酪蛋白水解物、豆餅、豆餅水解物、魚粉或其消化物等。
作為無機(jī)物可使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鎂、氯化鈉、氯化鈣、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鋅、碳酸鈣等。
必要時可添加維生素、氨基酸、核酸等。
培養(yǎng)在振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等有氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度15～45℃為宜，培養(yǎng)時間通常為5～100小時。培養(yǎng)中pH保持在3～9。必要時培養(yǎng)基pH的調(diào)整可利用無機(jī)或有機(jī)酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨、pH緩沖液等進(jìn)行。
另外培養(yǎng)中必要時培養(yǎng)基中可添加氨芐青霉素、四環(huán)素等抗生素。
通過該培養(yǎng)得到的微生物的培養(yǎng)液以及將該培養(yǎng)液經(jīng)種種處理的培養(yǎng)液的處理物為酶源，可以應(yīng)用在水性介質(zhì)中進(jìn)行糖核苷酸的生成。
培養(yǎng)液的處理物可以是培養(yǎng)液的濃縮物、培養(yǎng)液的干燥物、離心分離培養(yǎng)液得到的細(xì)胞(菌體)、該細(xì)胞的干燥物、該細(xì)胞的凍干物、該細(xì)胞的表面活性劑處理物、該細(xì)胞的超聲波處理物、該細(xì)胞的機(jī)械磨碎處理物、該細(xì)胞的溶劑處理物、該細(xì)胞的酶處理物、該細(xì)胞的蛋白質(zhì)部分、該細(xì)胞的固定化產(chǎn)物或該細(xì)胞中提取的酶制品等。
另外，也可以不進(jìn)行培養(yǎng)而將市售的菌體、干燥處理菌體等作為糖核苷酸生成的酶源使用，該酶源的實(shí)例如市售的面包酵母、啤酒酵母等。
糖核苷酸的生成中使用的酶源的量為按濕菌體100～800g/l，優(yōu)選50～600g/l。
糖核苷酸的生成中使用的水性介質(zhì)，可以舉例如水、磷酸鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、枸櫞酸鹽、Tris等緩沖液、甲醇、乙醇等醇類、乙酸乙酯等酯類、丙酮等酮類、乙酰胺等酰胺類等等。而且可以將作為酶源使用的微生物的培養(yǎng)液作為水性介質(zhì)使用。
糖核苷酸的生成中使用的核苷酸前體物質(zhì)可以舉出乳清酸、尿嘧啶、乳清酸核苷以及尿苷等，優(yōu)選使用乳清酸。該核苷酸前體物質(zhì)可以是純品、前體物質(zhì)的鹽，其中若含有雜質(zhì)，則以不阻礙反應(yīng)進(jìn)行為限，還可使用微生物發(fā)酵產(chǎn)生的含有該前體物質(zhì)的培養(yǎng)液以及來自該培養(yǎng)液的該前體物質(zhì)粗精制物。核苷酸前體物質(zhì)的濃度為0.01～1.0M，優(yōu)選0.01～0.3M。
糖核苷酸的生成中使用的糖可以舉出葡萄糖、半乳糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺等。
該糖可以使用純品，也可使用含有這些糖并且其中所含雜質(zhì)不阻礙反應(yīng)進(jìn)行的物質(zhì)，以0.01～1.0M的濃度使用。
糖核苷酸的生成過程中有必要時可以添加ATP再生所必需的能量供體、磷酸離子、鎂離子、表面活性劑以及有機(jī)溶劑。
能量供體可舉出葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、糖蜜、淀粉水解物等碳水化合物；丙酮酸、乳酸、醋酸等有機(jī)酸；甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸；以0.02～2.0M的濃度使用。
磷酸離子可舉出正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸、四聚磷酸、四聚偏磷酸等多磷酸、多偏磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等無機(jī)磷酸鹽，以0.01～1.0M的濃度使用。
鎂離子可舉出硫酸鎂、硝酸鎂、氯化鎂等無機(jī)鎂鹽；枸櫞酸鎂等有機(jī)鎂鹽，通常以1～20mM的濃度使用。
表面活性劑可使用聚環(huán)氧乙烷十八烷胺(例如Nymeen S-215，日本油脂公司制)等非離子型表面活性劑；十六烷基三甲銨·溴化物或烷基二甲基·芐基銨氯化物(例如Cation F2-40E，日本油脂公司制)等陽離子型表面活性劑；月桂酰·肌氨酸鹽等陰離子型表面活性劑；烷基二甲基胺(例如Tertiary Amine FB，日本油脂公司制)等叔胺類等等，促進(jìn)各種糖核苷酸生成的物質(zhì)均可以使用，可單獨(dú)使用或多種混合使用。表面活性劑通常以0.1～50g/l的濃度使用，優(yōu)選以1～20g/l的濃度使用。
有機(jī)溶劑可舉二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯等，通常以0.1～50ml/l的濃度使用，優(yōu)選以1～20ml/l的濃度使用。
糖核苷酸的生成反應(yīng)是在水性介質(zhì)中，pH5～10，20～50℃條件下反應(yīng)2～48小時，優(yōu)選pH為6～8。
通過該方法可以生成糖核苷酸，該糖核苷酸可舉出尿苷二磷酸化合物等。具體可舉例尿苷-5’-二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)、尿苷-5’-二磷酸半乳糖(UDP-Gal)、尿苷-5’-二磷酸N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)、尿苷-5’-二磷酸N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)等。
水性介質(zhì)中生成的糖核苷酸的定量可按眾所周知的方法進(jìn)行，例如UDP-Glc和UDP-Gal的分離定量可按Anal.Biochem.，216，188-194(1994)所記載的高效液相色譜法(以下簡稱HPLC)進(jìn)行。UDP-GlcNAc的分離定量可按以下條件用HPLC法進(jìn)行。
洗脫液0.1M KH2PO4(利用H3PO4調(diào)pH至3.2)流速1ml/min色譜柱Partisil-10SAX(Whatman公司制)檢測UV262nm定量與標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值比較而計(jì)算得到。
反應(yīng)液中生成的糖核苷酸的精制可按使用活性炭、離子交換樹脂等的通常的方法進(jìn)行(特開平8-23993)，例如，UDP-Gal及UDP-Glc可按J.Org.Chem.，57，152(1992)所記載的方法進(jìn)行；UDP-GlcNAc可按J.Org.Chem.，57，146(1992)所記載的方法進(jìn)行。本發(fā)明的復(fù)合糖類的制造中可使用的微生物或動物細(xì)胞，只要是具有從糖核苷酸和復(fù)合糖類前體生成復(fù)合糖類能力的微生物或動物細(xì)胞就可使用，例如產(chǎn)生β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的人黑素瘤細(xì)胞WM266-4株(ATCC CRL1676)以及含有來自人黑素瘤細(xì)胞WM266-4株的β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的納茂瓦(namalwa)細(xì)胞KJM-1株等的重組株(特開平6-181759)、表達(dá)來自人黑素瘤細(xì)胞SK-Me1-28細(xì)胞的神經(jīng)酰胺葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，4638(1996))、表達(dá)來自人Hela細(xì)胞的β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌(EMBO J.，9，3171(1990))或釀酒酵母〔Biochem.Biophys.Res.Commun.，201，160(1994)〕、表達(dá)來自大鼠的β1，6-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶基因的COS-7細(xì)胞(ATCC，CRL1651)〔J.Biochem.，268，15381(1993)〕等動物細(xì)胞或微生物。
在本發(fā)明的復(fù)合糖類的制造中使用微生物時，該微生物可以在和培養(yǎng)上述具有從核苷酸前體物質(zhì)和糖生成糖核苷酸能力的微生物一樣的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。
在本發(fā)明的復(fù)合糖類的制造中使用動物細(xì)胞時，培養(yǎng)該動物細(xì)胞的培養(yǎng)基可以使用通常使用的RPMI1640培養(yǎng)基、Eagle的MEM培養(yǎng)基或這些培養(yǎng)基中添加小牛血清等的培養(yǎng)基。培養(yǎng)在5％CO2存在等條件下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度以35～37℃為宜，培養(yǎng)時間通常為3～7天。培養(yǎng)中有必要時，在培養(yǎng)基中可添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
以通過該培養(yǎng)得到的微生物或動物細(xì)胞的培養(yǎng)液及該培養(yǎng)液經(jīng)種種處理后的培養(yǎng)液的處理物為酶源，用來在水性介質(zhì)中進(jìn)行復(fù)合糖類的生成。
培養(yǎng)液的處理物可舉出培養(yǎng)液的濃縮物、培養(yǎng)液的干燥物、離心分離培養(yǎng)液得到的細(xì)胞(菌體)、該細(xì)胞的干燥物、該細(xì)胞的凍干物、該細(xì)胞的表面活性劑處理物、該細(xì)胞的有機(jī)溶劑處理物、該細(xì)胞的溶菌酶處理物、該細(xì)胞的固定化產(chǎn)物或由該細(xì)胞中提取的酶制品等。
復(fù)合糖類的生成中使用的酶源的量為0.01U/l～100U/l，優(yōu)選0.1U/l～100U/l，以在37℃下一分鐘形成1μM復(fù)合糖類的酶活性為1單位(U)。
復(fù)合糖類的生成中使用的水性介質(zhì)，可以舉例如水、磷酸鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、枸櫞酸鹽、Tris等緩沖液、甲醇、乙醇等醇類、乙酸乙酯等酯類、丙酮等酮類、乙酰胺等酰胺類等等。而且可以將作為酶源使用的微生物的培養(yǎng)液作為水性介質(zhì)使用。
復(fù)合糖類的生成中使用的糖核苷酸可使用上述糖核苷酸生成中得到的反應(yīng)液或從該反應(yīng)液中精制出的糖核苷酸，以1～100mM的濃度使用，優(yōu)選以5～100mM的濃度使用。
復(fù)合糖類的生成中使用的復(fù)合糖類前體可以使用糖類、寡糖、蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、糖脂或糖肽。具體可舉出N-乙酰葡糖胺、GlcNAc β1-3Gal β1-4Glc等。復(fù)合糖類前體以0.1～100mM的濃度，優(yōu)選以0.5～50mM的濃度使用。
通過該方法可以合成各種復(fù)合糖類，該復(fù)合糖類可舉出含葡萄糖的復(fù)合糖類、含葡糖胺的復(fù)合糖類、含半乳糖的復(fù)合糖類、含半乳糖胺的復(fù)合糖類、含甘露糖的復(fù)合糖類、含巖藻糖的復(fù)合糖類、含神經(jīng)氨酸的復(fù)合糖類等等。具體可舉出乳-N-四糖類、乳-N-新四糖類、N-乙酰乳糖胺等。
復(fù)合糖類的生成中有必要時可以添加MnCl2等無機(jī)鹽、β-巰基乙醇等。
水性介質(zhì)中生成的復(fù)合糖類的定量可依照眾所周知的方法進(jìn)行(特開平6-181759)。
反應(yīng)液中生成的復(fù)合糖類的提取可以按使用活性炭、離子交換樹脂等的通常方法進(jìn)行(特開平8-23993)，例如N-乙酰乳糖胺可按J.Org.Chem.，47，5416(1982)記載的方法提取。
下面說明本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。本發(fā)明最佳實(shí)施方案實(shí)施例1.UDP-Glc的生產(chǎn)裝有2.5L由葡萄糖100g/l、MgSO4·7H2O 1g/l、K2HPO435g/l、乳清酸(鉀鹽)3g/l組成的反應(yīng)液，容積為5L的培養(yǎng)槽中加市售的面包酵母(Dia酵母；協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社制)的干燥處理物懸浮成100g/l(干燥重量換算)，在28℃下，以600rpm攪拌、通氣量為2L/min的條件進(jìn)行6小時的反應(yīng)。
該反應(yīng)中，用4N KOH維持反應(yīng)液的pH值在6.5～7.5。
反應(yīng)結(jié)束后，用Anal.Biochem.，216，188-194(1994)記載的方法對反應(yīng)液上清中的UDP-Glc進(jìn)行定量，結(jié)果生成UDP-Glc7.4g/l(2Na鹽換算)。
利用經(jīng)離心分離該反應(yīng)液去除菌體后得到的上清2L，按特開平8-23993記載的方法精制UDP-Glc，得到含有高純度UDP-Glc的溶出液。
濃縮該溶出液后添加過量的99％乙醇，生成的沉淀物經(jīng)真空干燥后得到6.8g白色粉末。該白色粉末為高純度(純度97％以上)的UDP-Glc。實(shí)施例2.UDP-Gal的生產(chǎn)裝有20ml由葡萄糖50g/l、酵母浸膏2g/l、胨5g/l、(NH4)2HPO42g/l、KH2PO42g/l、MgSO4·7H2O 1g/l(用6N H2SO4調(diào)整pH至6.0)組成的液體培養(yǎng)基，容積為300ml的三角燒瓶中接種馬克斯克魯維酵母保加利亞變種(Kluyveromycesmarxianusvar.bulugaricus)ATCC16045菌株，在28℃，220rpm的條件下振蕩培養(yǎng)24小時。將得到的培養(yǎng)液作為第一次種子培養(yǎng)液。
裝有240ml由乳糖50g/l、酵母浸膏2g/l、胨5g/l、(NH4)2HPO42g/l、KH2PO42g/l、MgSO4·7H2O 1g/l(用6N H2SO4調(diào)整pH至6.0)組成的液體培養(yǎng)基，容積為2L的帶擋板的三角燒瓶中添加20ml上述種子培養(yǎng)液，在28℃，220rpm的條件下振蕩培養(yǎng)24小時。將得到的培養(yǎng)液作為第二次種子培養(yǎng)液。
裝有2.5L由乳糖100g/l、酵母浸膏2g/l、胨5g/l、(NH4)2HPO42g/l、KH2PO42g/l、MgSO4·7H2O 1g/l(用6N H2SO4調(diào)整pH至6.0)組成的液體培養(yǎng)基，容積為5.0L的培養(yǎng)槽中接種250ml第二次種子培養(yǎng)液，在28℃，600rpm，通氣量為2.5L/min的培養(yǎng)條件下進(jìn)行24小時培養(yǎng)。該培養(yǎng)過程中利用28％氨水維持培養(yǎng)液的pH在5.5(±0.1)。
培養(yǎng)結(jié)束后，在該培養(yǎng)液中添加Nymeen S-215 4g/l、乳清酸(鉀鹽)3g/l、硫酸鎂1g/l、KH2PO43g/l、K2HPO44g/l、半乳糖18g/l，在28℃，600rpm，通氣量為2.0L/min的條件下反應(yīng)15分鐘。
該反應(yīng)過程中利用4N KOH維持反應(yīng)液的pH在6.0～7.0。
反應(yīng)結(jié)束后，用Anal.Biochem.，216，188-194(1994)記載的方法對上清中的UDP-Gal進(jìn)行定量，結(jié)果生成UDP-Gal2.3g/l(2Na鹽換算)。
利用經(jīng)離心分離該反應(yīng)液去除菌體后得到的上清2L，按與實(shí)施例1同樣的方法進(jìn)行精制，得到高純度(97％以上)的UDP-Gal白色粉末2.5g。實(shí)施例3.UDP-GlcNAc的生產(chǎn)除了用100g/l麥芽糖代替葡萄糖，在反應(yīng)液中新添加葡糖胺鹽酸鹽3.5g/l以外，在與實(shí)施例1同樣的條件下生產(chǎn)UDP-GlcNAc。
反應(yīng)結(jié)束后按上述的HPLC法對反應(yīng)液上清中的UDP-GlcNAc進(jìn)行定量，結(jié)果生成UDP-GlcNAc 7g/l(2Na鹽換算)利用經(jīng)離心分離該反應(yīng)液去除菌體后得到的上清2L，按與實(shí)施例1同樣的方法進(jìn)行精制，得到高純度(97％以上)的UDP-GlcNAc白色粉末5.7g。實(shí)施例4.β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的制備將由含有編碼蛋白質(zhì)A的IgG結(jié)合區(qū)和β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶之融合蛋白基因的質(zhì)粒pAMoERSAW1(特開平6-181759)轉(zhuǎn)化的namalwa KJM-1株加到含有0.5mg/ml G418(Gibco公司制)的RPMI640·ITPSGF培養(yǎng)基30ml中，使之懸浮成5×104細(xì)胞/ml，并在CO2孵箱中37℃下培養(yǎng)8天。
離心分離該培養(yǎng)液去除細(xì)胞后回收上清。該上清液在有必要時可以保存在-80℃，使用前解凍然后使用。
生成該蛋白質(zhì)A的IgG結(jié)合區(qū)和β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶之融合蛋白的培養(yǎng)液上清中添加疊氮化鈉至最終濃度為0.1％，然后添加按產(chǎn)品說明書預(yù)處理的IgG瓊脂糖(Pharmacia公司制)50μl，并在4℃下緩慢攪拌過夜。
攪拌后經(jīng)離心分離回收結(jié)合β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的IgG瓊脂糖，用RPMI640·ITPSGF培養(yǎng)基1ml洗凈3遍后，將該IgG瓊脂糖作為β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的酶源。實(shí)施例5.乳-N-四糖類的生產(chǎn)乳-N-四糖類(Oxford Glycosystems公司制)按常用法〔Agric.Biol.Chem.，54，2169(1990)〕用氨基吡啶熒光標(biāo)記，然后加100mU的β-半乳糖苷酶(生化學(xué)工業(yè)公司制)在37℃反應(yīng)16個小時，以除去非還原末端的半乳糖。
將該反應(yīng)液在100℃加熱5分鐘，使β-半乳糖苷酶失活。
將該反應(yīng)中得到的GlcNAc β1-3Galβ1-4Glc作為復(fù)合糖類前體使用。
將含有該復(fù)合糖類前體0.5mM、實(shí)施例4中得到的IgG瓊脂糖結(jié)合β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶0.5U、實(shí)施例2中得到的UDP-Gal5mM、Tris-HCl(pH7.9)100mM、MnCl210mM、β巰基乙醇2mM的反應(yīng)液36μl在32℃下放置65小時進(jìn)行反應(yīng)。
反應(yīng)結(jié)束后在下列條件下利用HPLC法定量該反應(yīng)液中蓄積的生成物。
色譜柱TSKgel ODS-80TM柱(4.6mm×30cm，TOSOH公司制)液相0.02M醋酸銨緩沖液(pH4.0)溫度50℃流速1ml/min檢測熒光檢測器(激發(fā)波長320nm，放射波長400nm)生成物的鑒別是通過比較氨基吡啶標(biāo)記的乳-N-四糖類和標(biāo)記的生成物的洗脫時間而進(jìn)行。
通過該反應(yīng)生成0.17mM(0.12g/l)的乳-N-四糖類。實(shí)施例6.乳-N-新四糖類的生產(chǎn)將含有實(shí)施例5中制備的復(fù)合糖類前體GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc 0.5mM、β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(Sigma公司制)0.5U、實(shí)施例2中得到的UDP-Gal 5mM、Tris-HCl(pH7.9)100mM、MnCl210mM、β巰基乙醇2mM、α-乳清蛋白0.2mg/ml的反應(yīng)液36μl在32℃下放置65小時進(jìn)行反應(yīng)。
反應(yīng)結(jié)束后，在與實(shí)施例5相同的條件下利用HPLC定量該反應(yīng)液中蓄積的生成物。生成物的鑒別是通過比較氨基吡啶標(biāo)記的乳-N-新四糖類和生成物的洗脫時間而進(jìn)行。
通過該反應(yīng)生成0.2mM(0.14g/l)的乳-N-新四糖類。
工業(yè)實(shí)用性通過該方法可以在工業(yè)上高效率地由核苷酸前體物質(zhì)和糖生產(chǎn)糖核苷酸，由該糖核苷酸和復(fù)合糖類前體生產(chǎn)復(fù)合糖類。
權(quán)利要求
1.糖核苷酸的制造方法，其特征在于，以具有從核苷酸前體物質(zhì)和糖生成糖核苷酸能力的微生物培養(yǎng)液或該培養(yǎng)液的處理物為酶源，在含有該酶源、核苷酸前體物質(zhì)和糖的水性介質(zhì)中進(jìn)行酶反應(yīng)，在該水性介質(zhì)中產(chǎn)生并蓄積糖核苷酸，并從該水性介質(zhì)中提取糖核苷酸。
2.權(quán)利要求1的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)液的處理物為培養(yǎng)液的濃縮物、培養(yǎng)液的干燥物、離心分離培養(yǎng)液得到的細(xì)胞、該細(xì)胞的干燥物、該細(xì)胞的凍干物、該細(xì)胞的表面活性劑處理物、該細(xì)胞的超聲波處理物、該細(xì)胞的機(jī)械磨碎處理物、該細(xì)胞的溶劑處理物、該細(xì)胞的酶處理物、該細(xì)胞的蛋白質(zhì)部分、該細(xì)胞的固定化產(chǎn)物或由該細(xì)胞中提取的酶制品。
3.權(quán)利要求1的制造方法，其中核苷酸前體物質(zhì)選自乳清酸、尿嘧啶、乳清酸核苷以及尿苷。
4.權(quán)利要求1的制造方法，其中糖核苷酸為尿苷二磷酸糖。
5.權(quán)利要求4的制造方法，其中尿苷二磷酸糖選自尿苷二磷酸葡萄糖、尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺、尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺。
6.權(quán)利要求1的制造方法，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺。
7.權(quán)利要求1的制造方法，其特征在于，具有從核苷酸前體物質(zhì)和糖生成糖核苷酸能力的微生物為酵母。
8.權(quán)利要求7的制造方法，其特征在于，酵母選自酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬和酒香酵母屬的微生物。
9.權(quán)利要求8記載的制造方法，其特征在于，酵母選自釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、近平滑假絲酵母、克魯斯氏假絲酵母、易變假絲酵母、解脂假絲酵母、涎沫假絲酵母、吉利蒙氏假絲酵母、白色假絲酵母、土生假絲酵母、粉狀畢赤酵母、奧默列氏畢赤酵母、白色球擬酵母、球面球擬酵母、木醋球擬酵母、無名球擬酵母、易變球擬酵母、類球形德巴利酵母、坎塔雷利德巴利酵母、球形德巴利酵母、漢遜氏德巴利酵母、日本德巴利酵母、魯氏接合酵母、拜列氏接合酵母、馬克斯克魯維酵母、異常漢遜酵母、杰丁漢遜酵母、蘭姆啤可酒香酵母以及異酒香酵母。
全文摘要
本發(fā)明涉及糖核苷酸的制造方法及復(fù)合糖類的制造方法。糖核苷酸的制造方法，其特征在于，以具有從核苷酸前體物質(zhì)和糖生成糖核苷酸能力的微生物培養(yǎng)液或該培養(yǎng)液的處理物為酶源，在含有該酶源、核苷酸前體物質(zhì)和糖的水性介質(zhì)中進(jìn)行酶反應(yīng)，在該水性介質(zhì)中產(chǎn)生并蓄積糖核苷酸，并從該水性介質(zhì)中提取糖核苷酸。復(fù)合糖類的制造方法，其特征在于，以具有從核苷酸前體物質(zhì)和糖生成糖核苷酸能力的微生物培養(yǎng)液或該培養(yǎng)液的處理物、以及具有從糖核苷酸和復(fù)合糖類前體生成復(fù)合糖類能力的微生物或動物細(xì)胞的培養(yǎng)液或該培養(yǎng)液的處理物為酶源，在含有該酶源、核苷酸前體物質(zhì)、糖以及復(fù)合糖類前體的水性介質(zhì)中進(jìn)行酶反應(yīng)，在該水性介質(zhì)中產(chǎn)生并蓄積復(fù)合糖類，并從該水性介質(zhì)中提取復(fù)合糖類。
文檔編號C12P19/18GK1477204SQ0215061
公開日2004年2月25日 申請日期1997年9月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月13日
發(fā)明者小泉聰司, 河野久治, 木野邦器, 尾崎明夫, 器, 夫, 治 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社