專(zhuān)利名稱(chēng)：用以制造樟芝培養(yǎng)物的方法以及由所述方法獲得的產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及建立一種適于從一樟芝(Antrodia camphorata)培養(yǎng)物中大規(guī)模地制造出具藥理活性之濾出物的培養(yǎng)條件，具體地，該培養(yǎng)條件是藉由令培養(yǎng)期間的振蕩速率及/或pH值最佳化來(lái)建立。本發(fā)明亦涉及一種經(jīng)由一系列部分分離過(guò)程而從一樟芝培養(yǎng)物中獲得具藥理活性之組合物的方法。本發(fā)明亦涉及利用前述組合物來(lái)制備藥學(xué)組合物。
在臺(tái)灣民俗醫(yī)學(xué)上，樟芝的子實(shí)體被認(rèn)為對(duì)于中毒、腹瀉、腹痛、高血壓、皮膚搔癢及肝癌所引起的癥狀具有某種醫(yī)藥功效。然而，由于嚴(yán)苛的宿主專(zhuān)一性(host specificity)與在自然界中的稀有性，以及在人工栽培上的失敗，所以「牛樟芝」在市面上極為昂貴。無(wú)疑地，發(fā)展出大規(guī)模人工培養(yǎng)此種真菌的低成本制法是極具產(chǎn)業(yè)價(jià)值的。
目前，本案發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)樟芝于浸沒(méi)式發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)可展現(xiàn)出所希望的藥理活性，特別是抗腫瘤活性。如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)案第09/566,834號(hào)所揭露者，樟芝已被成功地小規(guī)模培養(yǎng)于諸如馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)液(PDB)以及含有果糖作為主要碳源的合成培養(yǎng)基內(nèi)。利用杭特氏座標(biāo)系(Hunter′s coordinate system)進(jìn)行測(cè)量，所得培養(yǎng)物顯現(xiàn)出紅色度指標(biāo)為a≥3的暗紅色外觀，而此色澤與對(duì)于某些腫瘤細(xì)胞品是之生長(zhǎng)的顯著抑制效應(yīng)相關(guān)。更重要的是，作用于腫瘤細(xì)胞的活性成份雖然仍未被鑒定出，但已被發(fā)現(xiàn)能從真菌菌絲體分泌至培養(yǎng)物之液相中，使得從培養(yǎng)物中能輕易地獲取具藥理活性之組合物，以供產(chǎn)業(yè)利用。
因此，若此一有利之方法能被最佳化以供用于大量制造真菌培養(yǎng)物，當(dāng)是極為希望的。更優(yōu)選為針對(duì)一希望藥理活性來(lái)部分分離粗制濾出物，以獲得富含所希望活性的有用組合物。
因此，本發(fā)明之第一實(shí)施方案是提供一種用以制造具有藥理活性之樟芝培養(yǎng)物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，以獲得第一培養(yǎng)物；(b)令從步驟(a)培養(yǎng)而得之第一培養(yǎng)物接受被設(shè)定在第一預(yù)定速率下的第一振蕩階段，歷時(shí)一段可令被接種之分離株進(jìn)一步生長(zhǎng)的時(shí)間，以獲得一增殖有菌絲體的第二培養(yǎng)物；以及
(c)令得自于步驟(b)之第二培養(yǎng)物接受被設(shè)定在不同于第一預(yù)定速率之第二預(yù)定速率下的第二振蕩階段，令該分離株處于生理壓力下。
依據(jù)本發(fā)明之第二實(shí)施方案，其是提供一種用以制造具有藥理活性之樟芝培養(yǎng)物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中；以及(b)將得自于步驟(a)之培養(yǎng)物予以培養(yǎng)，藉由在整個(gè)步驟(b)期間將培養(yǎng)物之pH值調(diào)整至pH4.5至5.4的范圍內(nèi)。
優(yōu)選地，樟芝培養(yǎng)物的pH值在整個(gè)步驟(b)期間被調(diào)整至pH4.6至5.3之范圍內(nèi)，且更優(yōu)選為pH4.7至5.2之范圍內(nèi)。
本發(fā)明亦提供一種用以獲得一系列液態(tài)分離部分的方法，該等分離部分是針對(duì)一諸如抗腫瘤活性的希望藥理活性而從樟芝培養(yǎng)物中分離出。因此，本發(fā)明之第三實(shí)施方案是提供一種用以從樟芝培養(yǎng)物獲得一具有藥理活性之組合物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中；(b)將步驟(a)所得之培養(yǎng)物予以培養(yǎng)；以及(c)從該培養(yǎng)物中移除大部分的不溶性物質(zhì)，從而獲取一具有藥理活性的溶液；以及(d)將步驟(c)所得之溶液予以處理，以獲得含有分子量不超過(guò)約10kDa之真菌分子的藥理活性組合物。
優(yōu)選地，所獲得之組合物含有具分子量不超過(guò)約3kDa且更優(yōu)選為不超過(guò)約1kDa之真菌分子。
本發(fā)明之第四實(shí)施方案是提供一種用以從樟芝培養(yǎng)物獲得具有藥理活性之組合物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中；(b)將步驟(a)所得之培養(yǎng)物予以培養(yǎng)；(c)從該培養(yǎng)物中移除大部分的不溶性物質(zhì)，從而獲取一具有藥理活性的溶液；(d)將步驟(c)所得之溶液予以處理，以獲得含有分子量不超過(guò)約1kDa之真菌分子的分離部分；以及(e)令步驟(d)所得之分離部分通過(guò)一水不混溶相，并從該水不混溶相獲得該具藥理活性的組合物。
前述步驟(e)中之水不混溶相是優(yōu)選為一含有有效量之吸附劑的固定相，該吸附劑能選擇性地吸附疏水性真菌分子。將該固定相予以洗脫，以獲得具有藥理活性的分離部分。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，令步驟(e)所得之洗脫物進(jìn)一步接受逆相分配層析，如在LichrosorbR RP-18柱(Merck)中進(jìn)行，以獲得數(shù)個(gè)具有藥理活性的分離部分。
本發(fā)明更提供數(shù)種藥學(xué)組合物，以供治療癌癥或腫瘤疾病，該等藥學(xué)組合物含有依據(jù)本發(fā)明之任一方法所得的產(chǎn)物。
本發(fā)明更提供一種用以在需治療之病人體內(nèi)治療癌癥或腫瘤疾病的方法，該方法是藉由將一個(gè)含有依據(jù)本發(fā)明之任一方法所得之產(chǎn)物的組合物處方給該病人。
圖4顯示出源自于放大規(guī)模樟芝培養(yǎng)物之濾出物的抗腫瘤活性；圖5為一流程圖，其顯示出一樟芝濾出物針對(duì)分子量進(jìn)行純化的流程；圖6為一柱狀圖，其顯示依據(jù)圖5所分離出之培養(yǎng)物濾出物的抗腫瘤活性，其中受測(cè)細(xì)胞株包括有MRC-5、HeLa、AGS、Hep G2以及MCF-7；圖7為一柱狀圖，其將以AmberliteR XAD-4從一濾出物分離部分所分離出之分離部分的抗腫瘤活性予以比較，該濾出物分離部分含有分子量不超過(guò)約1kDa之真菌分子，其中受測(cè)細(xì)胞株包括有MRC-5、HeLa、AGS、Hep G2以及MCF-7；圖8為圖7之乙酸乙酯洗脫物在一個(gè)LichrosorbR RP-18柱中進(jìn)行部分分離的光譜曲線；以及圖9-11顯示圖8中所分離出數(shù)個(gè)分離部分的抗腫瘤活性。
在本說(shuō)明書(shū)中，「適合之培養(yǎng)基」此用語(yǔ)意指任何可以提供適于樟芝生長(zhǎng)之人工環(huán)境并維持其藥理活性的培養(yǎng)基。優(yōu)選地，本發(fā)明所使用之培養(yǎng)基適于促使菌絲體中生成具藥理活性之物質(zhì)，并促使該(等)物質(zhì)分泌至胞外。
適用于本發(fā)明之培養(yǎng)基包括被稱(chēng)為「馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)液(potatodextrose broth)」的天然培養(yǎng)基，以及任何含有果糖作為主要碳源的合成培養(yǎng)基。馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)液可藉由諸如將一由300.0克切成丁狀之馬鈴薯、20.0克右旋糖與1.0升蒸餾水所構(gòu)成的混合物予以濕熱滅菌，而在實(shí)驗(yàn)室中制備，抑或是購(gòu)自于諸如DIFCO等商業(yè)來(lái)源。
最佳之培養(yǎng)基為任何含有果糖作為主要碳源的合成培養(yǎng)基。若有需要，葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、玉米淀粉及麥芽萃出物等其他碳源以及此等之組合亦可被囊括于合成培養(yǎng)基中，以作為助劑。優(yōu)選地，以該合成培養(yǎng)基之總體積為基準(zhǔn)，該碳源優(yōu)選在1.5至2.5重量％之范圍內(nèi)，且更優(yōu)選為呈1.5至2重量％之含量。
除了碳源以外，合成培養(yǎng)基可包含有氮源、微量元素(諸如無(wú)機(jī)鹽)，以及任選之維生素或其他生長(zhǎng)因子。氮源包括但不限于硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、酪蛋白氨基酸(casamino acid)、酵母膏、蛋白胨(peptone)及胰胨(tryptone)以及此等之組合。優(yōu)選地，依據(jù)本發(fā)明，該合成培養(yǎng)基是含有酵母膏作為氮源。以該合成培養(yǎng)基之總體積為基準(zhǔn)，該氮源優(yōu)選在0.2至2.0重量％之范圍內(nèi)，且更優(yōu)選為呈0.5重量％之含量。
依據(jù)本發(fā)明，任何可得之樟芝分離株均可供用于培養(yǎng)方法中，只要所使用之微生物具有生成可檢測(cè)量之具藥理活性代謝物的能力?？晒┦褂弥林シ蛛x株包括有但不限于CCRC 35396(1994年12月1日被寄存于食品工業(yè)發(fā)展研究所(臺(tái)灣新竹市)之菌種保存及研究中心(CCRC)、35398(1994年12月1日)、35716(2000年5月3日)、36401(2000年1月27日)、36795(2000年1月27日)以及930032(2000年1月27日)。依據(jù)本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施方案，樟芝CCRC930032被用以制備培養(yǎng)物濾出物，該分離株亦以寄存編號(hào)PTA-1233被寄存在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，以作為專(zhuān)利程序之用。
為評(píng)估對(duì)于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制能力，令樟芝之粗制濾出物及其分離部分接受MTT比色分析。
使用于本說(shuō)明書(shū)之用語(yǔ)「MTT比色分析(MTT colorimetric assay)」或「MTT-四氮唑分析(MTT-tetrazolium assay)」是指在1980年代，由美國(guó)國(guó)家癌癥研究所癌癥治療部門(mén)之發(fā)展性治療計(jì)劃所構(gòu)建的一個(gè)抗癌藥劑篩選流程(請(qǐng)參見(jiàn)諸如Alley，M.C.，et al.，F(xiàn)easibility of drugscreening with panels of human tumor cell lines using a microculturetetrazolium assay.Cancer Res.48589-601，1988；Scudiero，D.A.，et al.，Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth anddrug sensitivity in culture using human and other tumor celllines.CancerRes.484827-4833，1988；Vistica，D.T.，et al.，tetrazolium-based assaysfor cellular viabilitya critical examination of selected parametersaffecting formazan.Cancer Res.512515-2520，1991；Monks，A.，et al.，F(xiàn)easibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel ofcultured human tumor cell lines.J.Nat.Cancer Inst.83757-766，1991)。
在此分析中，具潛力之抗癌藥劑抑或源自于植物或微生物的天然產(chǎn)物(在此例中，即為源自于該五個(gè)樟芝分離株)被測(cè)試其對(duì)抗數(shù)組細(xì)胞株的能力，各組細(xì)胞株是代表人類(lèi)惡性腫瘤的一種主要臨床分類(lèi)。每個(gè)孔的活細(xì)胞數(shù)目是與甲(formazan)的生成量成正比，甲經(jīng)由溶解化而被光譜儀所測(cè)量。原則上，生物活性物質(zhì)或含有此等物質(zhì)的天然產(chǎn)物可以抑制或甚至停止細(xì)胞生長(zhǎng)，因而僅形成少量的甲利用MTT比色分析，可檢視諸如振蕩速率及pH值等在真菌培養(yǎng)上之重要參數(shù)，以評(píng)估此等參數(shù)在培養(yǎng)期間對(duì)于樟芝之藥理活性的效應(yīng)。
在第一組實(shí)驗(yàn)中，將一樟芝培養(yǎng)物分成兩份，并令之分別經(jīng)歷二個(gè)不同的振蕩流程，其中一流程是被實(shí)行來(lái)將一恒定且劇烈的振蕩施加至真菌，而另一流程則為從溫和至劇烈的兩階段振蕩。經(jīng)比較后，依據(jù)本發(fā)明之兩階段振蕩可致使藥理活性的早期產(chǎn)生。提供第一階段的溫和振蕩是為獲致被接種之真菌的營(yíng)養(yǎng)生殖，以獲得培養(yǎng)生殖之菌絲體。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)所獲取之菌絲體沉淀(mycelial pellets)的增大尺寸可用以指出溫和振蕩階段的成功與否。將振蕩速率從溫和轉(zhuǎn)換為劇烈的適當(dāng)時(shí)機(jī)會(huì)依據(jù)選定之真菌分離株而定，而在廣泛之范圍變化。一般而言，當(dāng)依據(jù)培養(yǎng)物之最終體積為基準(zhǔn)而以10％v/v之量來(lái)接種一真菌分離株時(shí)，溫和振蕩可持續(xù)進(jìn)行約3天(或約72小時(shí))，隨后再升高振蕩速率。提供后續(xù)階段的劇烈振蕩是令真菌處于生理壓力下。在此一壓力下，會(huì)迫使樟芝加以因應(yīng)而進(jìn)行數(shù)個(gè)生理變化，包括促進(jìn)不以恒定方式表現(xiàn)之二次代謝物的生成。據(jù)信，某些具有生理活性之真菌分子可藉由此種方法被「壓迫而產(chǎn)出」。可將生理壓力施加至樟芝的其他培養(yǎng)參數(shù)，諸如通氣速率、營(yíng)養(yǎng)調(diào)整及熱壓力等，亦可單獨(dú)地運(yùn)用或與本發(fā)明之振蕩速率此參數(shù)合并運(yùn)用。適當(dāng)?shù)恼袷幩俾士蓞⒄涨笆鰞?nèi)容進(jìn)行實(shí)驗(yàn)而測(cè)得，抑或是基于后述數(shù)據(jù)而依據(jù)諸如1995年由Pauline M.Doran所編纂并由Academic Press Ltd.出版之BioprocessEngineering Principles此書(shū)第150至151頁(yè)中所述方程式來(lái)進(jìn)行估計(jì)。在某些情形下，當(dāng)妥適地施加兩階段振蕩時(shí)，真菌培養(yǎng)物會(huì)在第6天時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。
在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施方案中，兩階段振蕩是在一具預(yù)置有3升培養(yǎng)基的5升發(fā)酵槽(B.Braun)中進(jìn)行，其中振蕩于開(kāi)始時(shí)是被設(shè)定在一為不超過(guò)約300rpm且優(yōu)選為約200rpm之速率下，隨后升高至一為不超過(guò)約400rpm且優(yōu)選為約500rpm之速率下。在本發(fā)明之另一優(yōu)選實(shí)施方案，兩階段振蕩是在一具預(yù)置有160升培養(yǎng)基之250升發(fā)酵槽(Bio-Top)中進(jìn)行，其中該振蕩速率于開(kāi)始時(shí)被設(shè)定在約40rpm下，隨后升高至約150rpm。
在第二組實(shí)驗(yàn)中，將一樟芝培養(yǎng)物分成三份，并于整個(gè)培養(yǎng)期間分別培養(yǎng)在被控制于三個(gè)不同區(qū)段內(nèi)的pH值下。經(jīng)比較后，發(fā)現(xiàn)于pH4.5至5.4下所進(jìn)行之培養(yǎng)可致使藥理活性的早期產(chǎn)生。優(yōu)選地，樟芝培養(yǎng)物的pH值是在整個(gè)培養(yǎng)期間內(nèi)被調(diào)整為pH4.6至5.3且優(yōu)選為pH4.7至5.2之范圍內(nèi)。
藉由前述關(guān)于振蕩及pH值等有用參數(shù)，依據(jù)本發(fā)明之樟芝培養(yǎng)法可成功地被擴(kuò)大規(guī)模至160升之體積，并同時(shí)維持由該真菌所衍生出之希望藥理活性。
依據(jù)本發(fā)明之方法，一可供各種產(chǎn)業(yè)用途之具藥理活性濾出物能以一經(jīng)濟(jì)、有效率且省時(shí)之方式從樟芝獲得。
本發(fā)明亦涉及建立一種可操作的純化方法，藉此，可獲得數(shù)種被增富有具藥理活性物質(zhì)的新組合物，以供各種醫(yī)藥用途。依據(jù)本發(fā)明，該純化方法是藉由將一樟芝之粗制濾出物選擇性地加以分離來(lái)進(jìn)行，以獲得一含有分子量不超過(guò)約10kDa、優(yōu)選為不超過(guò)約3kDa且更優(yōu)選為不超過(guò)約1kDa之真菌分子的分離部分。該分離方法可藉由以分子量為基礎(chǔ)來(lái)分離分子(即分子篩)的任何常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行，該種方法的例子包括凝膠過(guò)濾法、密度梯度純化法、超過(guò)濾法、超高速離心法以及其他類(lèi)似的常規(guī)方法。
依據(jù)本發(fā)明，含有分子量不超過(guò)約1kDa之分子的分離部分是以極性為基礎(chǔ)而被進(jìn)一步部分分離，以獲得一水不混溶相，并從之獲得具藥理活性之分離部分。該水不混溶相可為一不溶性固相或一不與水混溶之有機(jī)相。在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施方案中，令該≤1kDa分離部分通過(guò)一含有有效量之吸附劑的固定相，該吸附劑能選擇性地吸附疏水性真菌分子。隨后，將該固定相予以洗脫，以獲得一具有希望藥理活性之分離部分。簡(jiǎn)言之，該固定相從該≤1kDa分離部分中選擇性地獲取并濃縮據(jù)信含有希望之具藥理活性物質(zhì)的疏水性溶質(zhì)，以使得位于流經(jīng)液(flow through)內(nèi)的不具活性物質(zhì)能被移除。適于含納于固定相中之吸附劑可為帶有適于從一流動(dòng)相中捕集疏水性物質(zhì)之官能團(tuán)的任何吸附劑。該種吸附劑之例子為AmberliteR XAD-4(Sigma)與其等效物。該部分分離可藉由任何習(xí)用方式來(lái)運(yùn)作，諸如將該≤1kDa分離部分與一批料之吸附劑共同培育，抑或是令該≤1kDa分離部分流經(jīng)一填充有吸附劑的層析柱，只要具藥理活性物質(zhì)被留置于吸附劑表面之含量是令人滿(mǎn)意的。用以從固定相中洗脫出被結(jié)合物質(zhì)的適當(dāng)洗脫劑(eluent)是為本領(lǐng)域所熟悉的，因而可被本領(lǐng)域技術(shù)人員所容易地選定。優(yōu)選地，該洗脫劑為一具有低于水之極性的有機(jī)溶劑，且更優(yōu)選為具有一低于甲醇之極性的有機(jī)溶劑。最佳之洗脫劑包括乙酸乙酯及乙醇。
可令展現(xiàn)出希望藥理活性之洗脫物(eluate)接受以其他物理、化學(xué)或生物特性為基礎(chǔ)的額外純化程序。在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施方案中，洗脫物以疏水性程度為基礎(chǔ)被進(jìn)一步分離，更優(yōu)選為該分離是實(shí)施于一諸如LichrosorbR RP-18柱(Merck)及其等效物中。所得之?dāng)?shù)個(gè)分離部分被發(fā)現(xiàn)具有藥理活性。
前述發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈地暗示著，樟芝之藥理活性主要源自于具有分子量不超過(guò)1kDa之疏水性化合物。此發(fā)現(xiàn)恰與先前的一個(gè)假說(shuō)相反，在該假說(shuō)中，具有一為500至2,000kDa之平均分子量的多糖被認(rèn)定為蕈類(lèi)所擁有之抗腫瘤活性的主要來(lái)源(Mizuno，et.al.，Anttitumor-activesubstances from mushrooms.Food Rev.Intl.11(1)23-61)。雖然樟芝經(jīng)報(bào)導(dǎo)為富含有諸如三萜、類(lèi)黃酮(flavinoids)、類(lèi)固醇、倍半萜內(nèi)酯(sesquiterpene lactones)以及苯基與二苯基化合物等低分子量物質(zhì)(Chang，supra；Chemg，et al.，Triterpenoids from Antrodia cinnamomea.Pytochem.41(1)263-267(1996)；Chiang，et al.，A sesquiterpene lactone，phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea.Pytochem.39(1)613-616(1995)；以及Yang，et.al.，Steroids and Triterpenoids ofAntrodia cinnamomea a fungus parasitic on Cinnamomum Micranthum.Pytochem.41(5)1389-1392(1996))，但是，沒(méi)有任何經(jīng)報(bào)導(dǎo)之教示內(nèi)容資以將此等物質(zhì)與該真菌之藥理活性相聯(lián)系。
依據(jù)本發(fā)明之純化方法提供數(shù)種組合物，其中活性物質(zhì)被濃縮且不具活性之物質(zhì)被進(jìn)一步移除。該等組合物顯然對(duì)于人類(lèi)或動(dòng)物個(gè)體具有增進(jìn)之藥理有效性，因而適供用于諸如制造藥學(xué)組合物或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品等各種產(chǎn)業(yè)用途。是以，本發(fā)明亦涉及利用所述新組合物作為在需要接受治療之人類(lèi)或動(dòng)物個(gè)體中治療疾病(特別是癌癥或腫瘤疾病)的藥物，抑或是作為一種被配制成諸如食品、飲料及/或動(dòng)物飼料等形式之營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品。
下列實(shí)例僅供用于例示本發(fā)明，而非意欲限制本發(fā)明之范圍。
實(shí)施例1樟芝液體培養(yǎng)物之制備樟芝分離株CCRC 930032之原始培養(yǎng)物是被維持在-80℃下，從該原始培養(yǎng)物移出少量真菌，置入馬鈴薯右旋糖瓊脂平盤(pán)培養(yǎng)基(PDA，購(gòu)自于Difco)上。待真菌恢復(fù)活力后，將培養(yǎng)物移至馬鈴薯右旋糖瓊脂斜面培養(yǎng)基。將斜面培養(yǎng)基培育在25℃下，并每二個(gè)月進(jìn)行繼代培養(yǎng)一次。該等斜面培養(yǎng)基是供用作為操作用培養(yǎng)物(working cultures)。為制備菌絲體接種源，將源自于PDA斜面培養(yǎng)基之培養(yǎng)物接種于PDA平板上，并在28℃下培育15至20天。
菌絲體接種源之制備將真菌予以培養(yǎng)，直至觀察到菌絲群落具有一為15至30毫米之直徑為止。在一光學(xué)顯微鏡下檢驗(yàn)樟芝的菌絲體特征，以確保其未被污染。將整個(gè)菌絲體切成小塊，隨后在無(wú)菌狀態(tài)下，于均質(zhì)機(jī)(Osterizer)中，利用50ml之無(wú)菌水將菌絲體予以均質(zhì)化，歷時(shí)30秒。菌絲體懸浮液之分量可供用作為浸沒(méi)式搖瓶培養(yǎng)的接種源。在500ml之厄氏錐瓶(Erlenmeyer flasks)內(nèi)中預(yù)先置入一合成培養(yǎng)基(2％果糖、0.5％(w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及0.05％(w/v)之MgSO4·7H2O(Merck))，再將該接種源以1∶9之體積比加入該合成培基內(nèi)。在30℃下，將該浸沒(méi)培養(yǎng)物予以培育5天，并施以恒定振蕩(在一得自于Hotech之旋轉(zhuǎn)式振蕩機(jī)上以50rpm之速率進(jìn)行振蕩)。所得之培養(yǎng)物用作為后續(xù)大規(guī)模培養(yǎng)的接種源。
實(shí)施例2振蕩速率對(duì)于真菌濾出物之藥理活性的影響在5升發(fā)酵槽(B.Braun)內(nèi)中預(yù)先置入2.7升合成培養(yǎng)基(2％果糖、0.5％(w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及0.05％(w/v)之MgSO4·7H2O(Merck))，再將實(shí)施例1中所制得之樟芝CCRC 930032接種源以1∶9之體積比加入該合成培養(yǎng)基中。在30℃以及0.6升/分鐘通氣速率下培育該培養(yǎng)物。培養(yǎng)物振蕩速率于開(kāi)始時(shí)被設(shè)定在約200rpm下，經(jīng)培育74小時(shí)后，再升高至約500rpm。在接種菌絲體后的第48、113、170、217及259小時(shí)，從培養(yǎng)物取樣獲得數(shù)個(gè)樣品，隨后令該等樣品通過(guò)一由過(guò)濾漏斗、錐瓶與抽氣裝置所構(gòu)成的簡(jiǎn)易過(guò)濾器裝置，以移除大部分之不溶性物質(zhì)。以氨水(NH4OH)將所獲得之濾出物的pH值調(diào)整至7，并進(jìn)行濕熱滅菌。將所得樣品保存于4℃下，以供后續(xù)MTT比色分析之用。
利用未經(jīng)接種之培養(yǎng)基來(lái)作為MTT分析之負(fù)對(duì)照組。
選定Hep G2腫瘤細(xì)胞來(lái)進(jìn)行MTT比色分析。進(jìn)行分析之前，將細(xì)胞維持在補(bǔ)充有10％小牛血清(Hyclone)之α-MEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)，以作為原始培養(yǎng)物。該腫瘤細(xì)胞株是利用胰蛋白酶-EDTA(GIBCO BRL)使細(xì)胞由細(xì)胞培養(yǎng)錐瓶上脫離，而每周被繼代一或二次。獲取腫瘤細(xì)胞，經(jīng)計(jì)數(shù)后，再以3,000個(gè)細(xì)胞/孔之濃度接種在一個(gè)96-孔微滴定板中。將各孔中之細(xì)胞培養(yǎng)基總體積補(bǔ)充至180μl，并于37℃下，在一充有5％CO2之培育箱中予以培育至隔日。
將三組各20μl分量之樣品加入培養(yǎng)孔內(nèi)，并在前述培育條件下將培養(yǎng)物予以培育72小時(shí)。隨后，將20μl以5mg/ml之濃度預(yù)先制備在PBS溶液(GIBCO BRL)中之MTT(Merck)原液添加至各孔內(nèi)。
在37℃下，于CO2培育箱中另行培育4小時(shí)后，移除各孔中之上清液，并添加100μl之100％DMSO(二甲亞砜，可得自于Sigma)，以溶解MTT-甲產(chǎn)物。以一機(jī)械式平板混合器充分混合后，利用ELISA閱讀器(MRX，Dynex)來(lái)測(cè)量540nm下之吸光值。因此，受測(cè)濾出物的腫瘤細(xì)胞相對(duì)存活率可藉由將各個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣品之吸光值除以對(duì)應(yīng)未經(jīng)接種對(duì)照組之吸光值而得出。
比較例1重復(fù)實(shí)施例2，除了該真菌培養(yǎng)物是于整個(gè)培養(yǎng)期間被培育在一為約500rpm之恒定速率下以外。
經(jīng)實(shí)施例2與比較例1所得之濾出物處理后的腫瘤細(xì)胞相對(duì)存活率，在表1及

圖1中加以比較。
表1

在表1中，針對(duì)在指定時(shí)間點(diǎn)取樣的濾出物對(duì)于Hep G2腫瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)進(jìn)行比較。對(duì)于在菌絲體接種后的第170小時(shí)所取得的濾出物而言，可見(jiàn)歷經(jīng)200rpm至500rpm之兩階段振蕩的樟芝CCRC930032能于MTT分析中獲得16％之相對(duì)存活率，此數(shù)值遠(yuǎn)較在500rpm之恒定速率下所培養(yǎng)的培養(yǎng)物更為有效，因?yàn)楹笳邇H觀察到35％之較高相對(duì)存活率。在后續(xù)的時(shí)間點(diǎn)(即第217與259小時(shí))，實(shí)施例2與比較例1的抗腫瘤活性會(huì)漸趨靠近，此暗示著由初始低速振蕩與后續(xù)階段的高速振蕩所構(gòu)成之組合，將可致使培養(yǎng)物中之具藥理活性物質(zhì)的早期生成。
利用AGS、HeLa及MCF-7等腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)，可在MTT分析中觀察到一致性的結(jié)果(結(jié)果未示出)。
實(shí)施例3pH值對(duì)于真菌濾出物之藥理活性的效應(yīng)制備三個(gè)具有分別為約4.5(試驗(yàn)A)、5.0(試驗(yàn)B)及5.5(試驗(yàn)C)之初始pH值的合成培養(yǎng)基批料(1.5％果糖、0.5％(w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及0.05％(w/v)之MgSO4·7H2O(Merck))，并將實(shí)施例1所制得之接種源以1∶9之體積比加入該等合成培養(yǎng)基中。將所得培養(yǎng)物依實(shí)施例2所述方法進(jìn)行培養(yǎng)，但是在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)監(jiān)控各個(gè)培養(yǎng)物之pH值，并藉由添加NaOH溶液謹(jǐn)慎地將之調(diào)整至初始pH值附近(表2)。培養(yǎng)程序持續(xù)336小時(shí)。添加NaOH溶液的時(shí)機(jī)是依選定之pH值而定。例如，試驗(yàn)B與試驗(yàn)C是分別從第192與168小時(shí)起添加NaOH溶液，以將pH值維持于約4.9至5.1與約5.4至5.6，而試驗(yàn)A則遲至第240小時(shí)才加入NaOH溶液。
表2

在接種菌絲體后的第96、144、192、240、288及336小時(shí)，從培養(yǎng)物取樣獲得數(shù)個(gè)樣品，隨后令該等樣品通過(guò)一由過(guò)濾漏斗、錐瓶與抽氣裝置所構(gòu)成的簡(jiǎn)易過(guò)濾器裝置，以移除大部分之不溶性物質(zhì)。以氨水(NH4OH)將所獲得之濾出物的pH值調(diào)整至7，并進(jìn)行濕熱滅菌。將所得樣品保存于4℃下，以供后續(xù)MTT比色分析之用。依實(shí)施例2所示，令所得樣品接受MTT比色分析。利用未經(jīng)接種之培養(yǎng)基來(lái)作為MTT分析之陰性對(duì)照組。
表3

如表3所示，在指定時(shí)間點(diǎn)所取樣之樟芝濾出物針對(duì)其對(duì)于HepG2腫瘤細(xì)胞之抑制效應(yīng)來(lái)進(jìn)行比較。對(duì)于在接種菌絲體后的第192小時(shí)所取得之濾出物而言，可見(jiàn)試驗(yàn)A與試驗(yàn)B中培養(yǎng)的樟芝CCRC930032會(huì)獲得較試驗(yàn)C所觀察到的更低的相對(duì)存活率。此種在抗腫瘤效應(yīng)上之差異會(huì)在第240小時(shí)達(dá)到最高，而于后續(xù)的時(shí)間點(diǎn)逐漸降低，此暗示著在pH4.5至5.4下、優(yōu)選為pH4.6至5.3下且更優(yōu)選為在pH4.7至5.2下在所進(jìn)行之培養(yǎng)，將可致使培養(yǎng)物中之具藥理活性物質(zhì)的早期生成。
利用AGS、HeLa及MCF-7等腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)，可在MTT分析中觀察到一致的結(jié)果(結(jié)果未示出)。
實(shí)施例4樟芝在250升發(fā)酵槽中之?dāng)U大規(guī)模培養(yǎng)在一具250升發(fā)酵槽(Bio-Top)內(nèi)中預(yù)先置入160升之合成培養(yǎng)基(1.5％果糖、0.5％(w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及0.05％(w/v)之MgSO4·7H2O(Merck))，再將實(shí)施例1中所制得之樟芝CCRC 930032接種源以1∶9之體積比加入該合成培養(yǎng)基中。在30℃以及0.6升/分鐘之通氣速率下培育該培養(yǎng)物。培養(yǎng)物之振蕩速率于開(kāi)始時(shí)被設(shè)定在約40rpm下，培育70小時(shí)后，再升高至約150rpm。培養(yǎng)物之pH值于整個(gè)培養(yǎng)期間均被調(diào)整在pH4.9至5.1的范圍內(nèi)。
在接種菌絲體后的第96、144、168、186.5、244及284小時(shí)，從培養(yǎng)物取樣獲得數(shù)個(gè)樣品，隨后藉由一常規(guī)方法進(jìn)行過(guò)濾，以移除大部分之不溶性物質(zhì)。以氨水將所獲得之濾出物的pH值調(diào)整至7，并進(jìn)行濕熱滅菌。令所得樣品接受MTT比色分析，其中HeLa、AGS、Hep G2及MCF-7細(xì)胞是在1,000、3,000、3,000及3,000個(gè)細(xì)胞/孔之初始濃度下進(jìn)行測(cè)試。利用未經(jīng)接種之培養(yǎng)基來(lái)作為MTT分析之負(fù)對(duì)照組。結(jié)果示于表4與圖4中。
表4

表4與圖4顯示出，經(jīng)由將振蕩速率及pH值設(shè)定于實(shí)施例2及3中所述之優(yōu)選范圍內(nèi)，可將依據(jù)本發(fā)明之樟芝培養(yǎng)法成功地?cái)U(kuò)大規(guī)模至160升之體積。
實(shí)施例5在合成培養(yǎng)基中制備樟芝培養(yǎng)物之濾出物將被培養(yǎng)在PDA平板培養(yǎng)基上之樟芝CCRC 930032的整個(gè)菌絲體切成小塊，隨后在無(wú)菌狀態(tài)下，于一均質(zhì)機(jī)(Osterizer)中，利用50ml之無(wú)菌水將菌絲體予以均質(zhì)化，歷時(shí)30秒，以便獲得一菌絲懸浮液。在1升厄氏錐瓶?jī)?nèi)中預(yù)先置入200ml之合成培養(yǎng)基(2％果糖、0.5％(w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及0.05％(w/v)之MgSO4·7H2O(Merck))，再添加20ml之菌絲懸浮液。在30℃下，將該沈浸培養(yǎng)物予以培育14天，并施以恒定振蕩(在一具可得自于Hotech之旋轉(zhuǎn)式振蕩機(jī)上以75rpm之速率進(jìn)行振蕩)。培育結(jié)束后，令真菌培養(yǎng)物通過(guò)一由過(guò)濾漏斗、錐瓶與抽氣裝置所構(gòu)成的簡(jiǎn)易過(guò)濾器裝置。所得粗制濾出物供后續(xù)分析之用。
實(shí)施例6源自于樟芝濾出物之活性分離部分的制備與分析依據(jù)制造商所提供的指南，藉由低速離心，令實(shí)施例5所得之粗制濾出物(F0)通過(guò)一個(gè)CertriprepR Concentrator 10(一種購(gòu)自于Amicon的商用微型柱，其具有10kDa的分子量截留值)。初次流經(jīng)液被稱(chēng)作為分離部分F1。隨后以去離子再次充填柱并再次離心，以收集二次流經(jīng)液F2。獲取仍留置于柱內(nèi)之真菌分子，并命名為F3。
藉由一具有3kDa之分子量截留值的CertriprepR Concentrator 3微型柱(Amicon)，依前述方法將F1進(jìn)行部分分離，以便獲得初次流經(jīng)液(F4)、二次流經(jīng)液(F5)以及仍留置于該柱內(nèi)的分離部分(F6)。此純化流程示出于圖5中。
將所得之分離部分進(jìn)行MTT比色分析，以評(píng)估抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。在此例中，HeLa細(xì)胞以1500個(gè)細(xì)胞/孔之初始濃度進(jìn)行測(cè)試，而MRC-5、AGS、Hep G2及MCF-7細(xì)胞則具有3,000個(gè)細(xì)胞/孔的初始載入量。圖6中清楚地顯示出，F(xiàn)1與F4此二者所展現(xiàn)出之抗腫瘤活性相當(dāng)于粗制濾出物(F0)所展現(xiàn)出的活性。此結(jié)果暗示著，濾出物中所存有的大部分(若非為全部)藥理活性物質(zhì)具有低分子量，特別是具有不超過(guò)約3kDa的分子量。
另外，經(jīng)由一系列膜組，將實(shí)施例5所得之粗制濾出物(F0)予以部分分離，以獲得一含有分子量不超過(guò)1kDa之真菌分子的分離部分(F7)?？鼓[瘤活性與F7共存于相同分離部分(圖7中之最左圖)此一事實(shí)指出，具藥理活性物質(zhì)的表觀分子量可能降至不超過(guò)約1kDa。
前述MTT分析中，于經(jīng)濾出物處理之MRC-5細(xì)胞(正常肺纖維細(xì)胞)中會(huì)觀察到降低的存活率，此指出真菌濾出物以及其活性分離部分可能會(huì)對(duì)于正常細(xì)胞展現(xiàn)出抑制效應(yīng)。然而，當(dāng)接種諸如高達(dá)10,000個(gè)細(xì)胞/孔的MRC-5細(xì)胞時(shí)，該抑制效應(yīng)會(huì)大幅降低。經(jīng)比較，真菌濾出物以及其活性分離部分的有效性極不易被增量之腫瘤細(xì)胞所影響(數(shù)據(jù)未示出)。經(jīng)此一活體外之觀察可推測(cè)，當(dāng)投藥至活體內(nèi)時(shí)，依據(jù)本發(fā)明之組合物對(duì)于正常細(xì)胞較為無(wú)害，但會(huì)給予腫瘤嚴(yán)厲的打擊。
實(shí)施例7樟芝濾出物在AmberliteR XAD-4樹(shù)脂上的分離將實(shí)施例6所得之濾出物F7與一批次之AmberliteR XAD-4(Sigma)共同培育，并施予溫和振蕩。培育結(jié)束后，藉由離心來(lái)沉淀樹(shù)脂粒。分別獲取含有未結(jié)合物質(zhì)之上清液以及樹(shù)脂粒。隨后，依序以相同體積之去離子水、甲醇及乙酸乙酯來(lái)洗脫樹(shù)脂粒，并分別收集源自于三個(gè)洗脫流程的洗脫物。于低壓下，將甲醇洗脫物與乙酸乙酯洗脫物蒸發(fā)至干燥，再溶入少量乙醇中。將適量無(wú)菌水加入所得乙醇溶液中，以使得后續(xù)MTT比色分析中之乙醇最終濃度被調(diào)整至不超過(guò)0.5％。MTT比色分析是依實(shí)施例6所述方法來(lái)進(jìn)行，并利用未經(jīng)接種之培養(yǎng)基或0.5％乙醇水溶液作為陰性對(duì)照組。結(jié)果示于圖7。
圖7顯示出，乙酸乙酯洗脫物對(duì)于所有五種細(xì)胞均具有優(yōu)越的抗腫瘤活性，而水及甲醇洗脫物則不會(huì)對(duì)該等細(xì)胞展現(xiàn)出顯著的效應(yīng)。上清液中可觀察到殘余的抗腫瘤活性，推測(cè)此是導(dǎo)因于疏水性物質(zhì)未被樹(shù)脂所完全吸附。此等結(jié)果暗示著，濾出物中所存有的藥理活性主要源自于分子量不超過(guò)約1kDa的疏水性物質(zhì)。
實(shí)施例8樟芝濾出物在Lichrosorb RP 18柱中的分離在一個(gè)LichrosorbR RP-18管柱(Hibar預(yù)充填柱RT250-25；7μm；購(gòu)自于Merck)中進(jìn)一步分離實(shí)施例7所得之乙酸乙酯洗脫物。利用乙腈/水所構(gòu)成之洗脫劑，以200分鐘期間從40％至100％的乙腈百分率以及5.7毫升/分鐘的流速下進(jìn)行梯度洗脫。測(cè)量254nm處之吸光值，并將之繪示于圖8中。將體積各為12-ml之分離部分予以收集，并如表5所示組合成數(shù)個(gè)分離部分。
表5

依實(shí)施例7所述，于低壓下，將該等分離部分蒸發(fā)至干燥并制備成操作溶液。MTT比色分析是依實(shí)施例6所述方法來(lái)進(jìn)行。結(jié)果示于圖9至11。
如圖9至11所顯示，分離部分G、K及L對(duì)于AGS細(xì)胞展現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)，而相鄰分離部分G與H則將Hep G2細(xì)胞的存活率壓抑至一低于50％的位準(zhǔn)。MCF-7細(xì)胞廣泛地被分離部分B、E、F、G、H、K、L及R所抑制。
然而，乙酸乙酯洗脫物中對(duì)于HeLa細(xì)胞的抑制活性，幾乎在利用逆相分配層析進(jìn)行純化期間消失殆盡，此指出樟芝濾出物中之某些藥理活性可能來(lái)自于許多分子的協(xié)同作用，而此一協(xié)同作用相當(dāng)容易受到劇烈純化程序的影響。
雖然本發(fā)明已被描述于前述之特定實(shí)施例中，惟應(yīng)明了，對(duì)于本領(lǐng)域熟熟練技術(shù)人員而言，許多的修改與變化是至為顯明，而可在不偏離本發(fā)明之精神與權(quán)利要求書(shū)范圍下完成。
權(quán)利要求
1.一種用以制造具有藥理活性之樟芝(Antrodia camphorata)培養(yǎng)物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，以獲得第一培養(yǎng)物；(b)令從步驟(a)培養(yǎng)而得之第一培養(yǎng)物接受被設(shè)定在第一預(yù)定速率下的第一振蕩階段，歷時(shí)一段可令被接種之分離株進(jìn)一步生長(zhǎng)的時(shí)間，以獲得一增殖有菌絲體的第二培養(yǎng)物；以及(c)令得自于步驟(b)之第二培養(yǎng)物接受被設(shè)定在不同于第一預(yù)定速率之第二預(yù)定速率下的第二振蕩階段，令該分離株處于生理壓力下。
2.如權(quán)利要求1之方法，其中該第二預(yù)定速率高于該第一預(yù)定速率。
3.如權(quán)利要求1之方法，其中步驟(a)所得之第一培養(yǎng)物以及步驟(b)所得之第二培養(yǎng)物是藉由將pH值調(diào)整至4.5至5.4之范圍內(nèi)，而被培養(yǎng)于步驟(b)以及(c)中。
4.如權(quán)利要求3之方法，其中步驟(a)所得之第一培養(yǎng)物以及步驟(b)所得之第二培養(yǎng)物是藉由將pH值調(diào)整至4.6至5.3之范圍內(nèi)，而被培養(yǎng)于步驟(b)以及(c)中。
5.如權(quán)利要求4之方法，其中步驟(a)所得之第一培養(yǎng)物以及步驟(b)所得之第二培養(yǎng)物是藉由將pH值調(diào)整至4.7至5.2之范圍內(nèi)，而被培養(yǎng)于步驟(b)以及(c)中。
6.如權(quán)利要求1之方法，其中該培養(yǎng)基是選自于由馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)液與含有果糖作為主要碳源的合成培養(yǎng)基所構(gòu)成之組中。
7.如權(quán)利要求6項(xiàng)之方法，其中該培養(yǎng)基為一含有果糖作為主要碳源的合成培養(yǎng)基。
8.如權(quán)利要求1之方法，其中該分離株是選自于由CCRC 930032(ATCC PTA-1233)、CCRC 35396、35398、35716、36401與36795所構(gòu)成之組中。
9.一種用以制造具有藥理活性之樟芝培養(yǎng)物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中；以及(b)將得自于步驟(a)之培養(yǎng)物予以培養(yǎng)，藉由在整個(gè)步驟(b)期間將培養(yǎng)物之pH值調(diào)整至4.5至5.4的范圍內(nèi)。
10.如權(quán)利要求9之方法，其中步驟(a)所得之培養(yǎng)物是藉由在整個(gè)步驟(b)中將pH值調(diào)整至4.6至5.3之范圍內(nèi)而被培養(yǎng)。
11.如權(quán)利要求10之方法，其中步驟(a)所得之培養(yǎng)物是藉由在整個(gè)步驟(b)中將pH值調(diào)整至4.7至5.2之范圍內(nèi)而被培養(yǎng)。
12.如權(quán)利要求9之方法，其中該培養(yǎng)基是選自于由馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)液與含有果糖作為主要碳源的合成培養(yǎng)基所構(gòu)成之組中。
13.如權(quán)利要求12之方法，其中該培養(yǎng)基為一含有果糖作為主要碳源的合成培養(yǎng)基。
14.如權(quán)利要求9之方法，其中步驟(b)是藉由在一預(yù)定速率下進(jìn)行振蕩來(lái)實(shí)施。
15.如權(quán)利要求9之方法，其中該分離株是選自于由CCRC 930032(ATCC PTA-1233)、CCRC 35396、35398、35716、36401與36795所構(gòu)成之組中。
16.一種用以從樟芝培養(yǎng)物獲得一具有藥理活性之組合物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中；(b)將步驟(a)所得之培養(yǎng)物予以培養(yǎng)；(c)從該培養(yǎng)物中移除大部分的不溶性物質(zhì)，從而獲取一具有藥理活性的溶液；以及(d)將步驟(c)所得之溶液予以處理，以獲得一含有分子量不超過(guò)約10kDa之真菌分子的藥理活性組合物。
17.如權(quán)利要求16之方法，其中步驟(d)所獲得之組合物含有分子量不超過(guò)約3kDa之真菌分子。
18.如權(quán)利要求16之方法，其中步驟(d)所獲得之組合物含有分子量不超過(guò)約1kDa之真菌分子。
19.一種用以從樟芝培養(yǎng)物獲得一具有藥理活性之組合物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中；(b)將步驟(a)所得之培養(yǎng)物予以培養(yǎng)；(c)從該培養(yǎng)物中移除大部分的不溶性物質(zhì)，從而獲取一具有藥理活性的溶液；(d)將步驟(c)所得之溶液予以處理，以獲得一含有分子量不超過(guò)約1kDa之真菌分子的分離部分；以及(e)令步驟(d)所得之分離部分通過(guò)一水不混溶相，并從該水不混溶相獲得該具藥理活性的組合物。
20.如權(quán)利要求19之方法，其中步驟(e)中之水不混溶相為一含有效量之吸附劑的固定相，該吸附劑能選擇性地吸附疏水性真菌分子，以及將該固定相予以洗脫，以獲得具有藥理活性的分離部分。
21.如權(quán)利要求20之方法，其中該固定相包含AmberliteR XAD-4樹(shù)脂作為吸附劑。
22.如權(quán)利要求20之方法，其中該固定相是被一洗脫劑所洗脫，該洗脫劑為一具有低于水之極性的有機(jī)溶劑。
23.如權(quán)利要求22之方法，其中該洗脫劑為一具有低于甲醇之極性的有機(jī)溶劑。
24.如權(quán)利要求23之方法，其中該洗脫劑是選自于由乙酸乙酯及乙醇所構(gòu)成之組中。
25.如權(quán)利要求19之方法，其更包含將步驟(e)所得之組合物進(jìn)行逆相分配層析，以獲得具藥理活性之分離部分。
26.如權(quán)利要求1之方法，其中該藥理活性為一針對(duì)腫瘤或癌細(xì)胞的抑制活性。
27.如權(quán)利要求9之方法，其中該藥理活性為一針對(duì)腫瘤或癌細(xì)胞的抑制活性。
28.如權(quán)利要求16之方法，其中該藥理活性為一針對(duì)腫瘤或癌細(xì)胞的抑制活性。
29.如權(quán)利要求19之方法，其中該藥理活性為一針對(duì)腫瘤或癌細(xì)胞的抑制活性。
30.如權(quán)利要求25之方法，其中該藥理活性為一針對(duì)腫瘤或癌細(xì)胞的抑制活性。
31.一種經(jīng)由權(quán)利要求1、9、16、19及25項(xiàng)中任一之方法所獲得的產(chǎn)物。
32.一種藥學(xué)組合物，其包含一經(jīng)由權(quán)利要求1、9、16、19及25項(xiàng)中任一之方法所獲得的產(chǎn)物。
33.如權(quán)利要求32之藥學(xué)組合物，其是用以治療癌癥或腫瘤疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及建立一種適于從一樟芝(Antrodiacamphorata)培養(yǎng)物中大規(guī)模地制造出具藥理活性之濾出物的培養(yǎng)條件，具體地，該培養(yǎng)條件是藉由令培養(yǎng)期間的振蕩速率及/或pH值最佳化來(lái)建立。本發(fā)明亦涉及一種經(jīng)由一系列部分分離過(guò)程而從一樟芝培養(yǎng)物中獲得具藥理活性之組合物的方法。本發(fā)明亦涉及利用前述組合物來(lái)制備藥學(xué)組合物。
文檔編號(hào)C12R1/645GK1448501SQ0215484
公開(kāi)日2003年10月15日 申請(qǐng)日期2002年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月29日
發(fā)明者吳美嬌, 黃仁彰, 林錫杰, 王伯徹 申請(qǐng)人:食品工業(yè)發(fā)展研究所