專(zhuān)利名稱(chēng)：肌腱組織工程的種子細(xì)胞－真皮成纖維細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，更具體地涉及用成纖維細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化肌腱及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
肌腱是連接骨骼肌肌腹與骨之間的致密膠原纖維結(jié)締組織束，是骨骼肌的組成部分。肌腱的結(jié)構(gòu)可以看成是肌肉的延續(xù)、退化部分。新鮮標(biāo)本的肌腱呈銀白色、索帶狀，質(zhì)地堅(jiān)韌。在松弛狀態(tài)下表面有波紋，如果牽拉超過(guò)松弛狀態(tài)的4％時(shí)，這波紋便消失，張力取消后波紋再現(xiàn)。在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上，肌腱和肌肉有顯著的差異。肌肉是高度特化，有收縮力，血供豐富，代謝旺盛，抗感染能力強(qiáng)的組織；而肌腱則是肌肉的附屬部分，是非特化、彈性小、寡血管、代謝極低的組織，但具有很強(qiáng)的耐壓抗張力和抗摩擦的能力。在肌-腱聯(lián)接處，膠原纖維進(jìn)入肌內(nèi)膜，附著在肌纖維的肌膜上。在腱-骨連接處，腱束直接連續(xù)到骨和骨膜上，其中絕大部分膠原纖維進(jìn)入骨，形成Sharpey穿纖維。肌腱傳導(dǎo)肌腹收縮所產(chǎn)生的力，牽引骨骼，使之產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)。肌腱本身不具有收縮能力，但能抵抗很大的張力。
膠原原纖維(Collagenous fiber)是構(gòu)成肌腱組織的主要成分，呈束狀排列，新鮮狀態(tài)下，大體觀呈銀白色。光鏡觀察，在組織中呈平行波浪狀。長(zhǎng)度難以準(zhǔn)確測(cè)定，橫斷面近似橢圓形。膠原纖維束的粗細(xì)不等(1-20μm)，由直徑約20-200nm的膠原原纖維借少量粘合質(zhì)聯(lián)接成小束，再集合而成。膠原纖維的粗細(xì)以其中的所含膠原原纖維多少而定。粘合質(zhì)主要是蛋白多糖或(和)糖蛋白。
肌腱缺損是目前臨床工作中經(jīng)常遇到的問(wèn)題，對(duì)于肌腱缺損的治療方法主要是1、自體肌腱移植。2、同種異體肌腱移植。3、肌腱假體替代物。但以上方法均存在著某些弊端，自體肌腱移植存在肌腱供區(qū)缺乏的問(wèn)題，而且供區(qū)肌腱多為無(wú)滑膜的肌腱，肌腱缺損嚴(yán)重影響功能的多為有滑膜肌腱。異體肌腱移植若為新鮮的即會(huì)引起嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)，經(jīng)過(guò)凍干處理后的同種異體肌腱保存的僅僅是膠原纖維，將來(lái)仍需要自體肌腱細(xì)胞進(jìn)行替代。人工腱假體雖然近期生物力學(xué)強(qiáng)度較好，但遠(yuǎn)期終會(huì)發(fā)生降解，而且還會(huì)引起感染致假體排出體外。
80年代末期，組織工程學(xué)的興起和蓬勃發(fā)展為解決這一難題提供了可能。曹誼林首先在裸鼠皮下構(gòu)建組織工程化肌腱，獲得了在大體和組織學(xué)結(jié)構(gòu)與正常肌腱相似的組織。但是曹誼林的工作是在裸鼠體內(nèi)完成的，裸鼠沒(méi)有完善的免疫功能，所以不能觀察機(jī)體對(duì)細(xì)胞和生物材料的反應(yīng)，而且皮下構(gòu)建的組織工程化肌腱沒(méi)有受到應(yīng)力的作用，也不符合人體的生理特點(diǎn)。
劉永濤等人在有完善免疫功能的雞趾指屈肌腱原位應(yīng)用自體肌腱細(xì)胞構(gòu)建組織工程化肌腱成功，但是應(yīng)用自體肌腱細(xì)胞作為組織工程化肌腱的種子細(xì)胞仍需切取較大的肌腱組織，造成新的損傷。
采用組織工程技術(shù)構(gòu)建肌腱組織并修復(fù)肌腱組織缺損，關(guān)鍵是獲取大量有正常功能的肌腱細(xì)胞。但是肌腱細(xì)胞經(jīng)多次傳代后喪失分泌基質(zhì)的能力，難以獲得大量有功能活性的肌腱細(xì)胞來(lái)修復(fù)大塊缺損組織。因此探索更廣泛的種子細(xì)胞來(lái)源已成為組織工程研究的焦點(diǎn)。
近年來(lái)，許多學(xué)者作了研究大量工作，試圖拓展肌腱組織工程種子細(xì)胞來(lái)源，并促進(jìn)其增殖。
第一，尋找可替代細(xì)胞，例如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。骨髓中除了造血干細(xì)胞外還有另一類(lèi)干細(xì)胞——間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell MSC)，是一群具有多相分化潛能的細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為多種間充質(zhì)組織細(xì)胞，Awad等分離、培養(yǎng)MSC后與膠原復(fù)合形成細(xì)胞膠原復(fù)合物植入人工缺損髕韌帶處，與對(duì)照組(單純應(yīng)用膠原)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組組織的彈性模量、最大張力、硬度等較對(duì)照組大，而在組織學(xué)和形態(tài)學(xué)方面兩者并沒(méi)有很大差別。然而，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源有限、分離較為復(fù)雜。
第二，促進(jìn)種子細(xì)胞增殖與基質(zhì)合成。生長(zhǎng)因子是通過(guò)細(xì)胞間信號(hào)傳遞影響細(xì)胞活動(dòng)的一類(lèi)多肽因子，在體內(nèi)或體外可促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖。許多學(xué)者直接使用生長(zhǎng)因子研究并證實(shí)其在體內(nèi)體外對(duì)肌腱損傷修復(fù)的促進(jìn)作用。此外，還有人利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將基因材料和信息傳遞給細(xì)胞以此來(lái)改變細(xì)胞功能。利用此種技術(shù)使靶細(xì)胞增加或抑制合成和分泌蛋白質(zhì)(如生長(zhǎng)因子)，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)，參與組織修復(fù)過(guò)程。成功應(yīng)用這一方法可使細(xì)胞、組織按要求合成分泌細(xì)胞因子以調(diào)控其生長(zhǎng)。已有學(xué)者成功地用不同方法將基因轉(zhuǎn)入肌腱中，LacZ標(biāo)記基因被應(yīng)用于髕韌帶后持續(xù)表達(dá)了6周，在雞趾屈肌腱的實(shí)驗(yàn)中，Lou等運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將LacZ標(biāo)記基因轉(zhuǎn)入肌腱中，75天后還可以檢測(cè)到該基因，并提出了減少和阻止肌腱損傷后的粘連形成的一些方法。
雖然經(jīng)過(guò)上述各種研究，仍然沒(méi)有徹底解決肌腱種子細(xì)胞來(lái)源缺乏的難題。
綜上所述，組織工程化肌腱形成的重要條件之一是必須獲得大量有功能和活力的肌腱細(xì)胞。研究表明，肌腱細(xì)胞接種于可生物降解材料須達(dá)到一定的細(xì)胞量，但是肌腱細(xì)胞是肌腱的基本功能單位，分化程度高，增殖相對(duì)緩慢，經(jīng)多次傳代后甚至喪失進(jìn)入增殖期的能力，種子細(xì)胞的缺乏成為肌腱組織工程的難題之一，也限制了其臨床應(yīng)用。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)可用于組織工程化肌腱的新的種子細(xì)胞及相關(guān)的肌腱移植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的用于組織工程化肌腱的新的種子細(xì)胞。
本發(fā)明的另一目的就是提供含有所述新種子細(xì)胞的組織工程化肌腱、及其制法和和用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種組織工程化肌腱移植物，它包括(a)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；(b)種子細(xì)胞，所述的種子細(xì)胞接種于所述的生物可降解材料，且種子細(xì)胞選自下組(i)成纖維細(xì)胞，(ii)1∶10～10000∶1的成纖維細(xì)胞與肌腱細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的混合物；(c)生物膜，所述的生物膜包被在生物可降解材料的外部。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的種子細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，種子細(xì)胞的含量為1×105個(gè)細(xì)胞/ml-5×108個(gè)細(xì)胞/ml。
在另一優(yōu)選例中，所述的生物膜的厚度為5-200微米。
在另一優(yōu)選例中，所述的生物可降解材料為條索狀。
在另一優(yōu)選例中，所述成纖維細(xì)胞來(lái)源于自體成纖維細(xì)胞、同種異體成纖維細(xì)胞、衍生自骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成纖維細(xì)胞，或其混合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸、聚羥基乙酸、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠、脫細(xì)胞基質(zhì)，及其混合物。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備組織工程化肌腱移植物的方法，包括步驟(a)將種子細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合，其中所述的種子細(xì)胞接種于所述的生物可降解材料，且種子細(xì)胞選自下組(i)成纖維細(xì)胞，(ii)1∶10～10000∶1的成纖維細(xì)胞與肌腱細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的混合物；(b)將生物膜包被在生物可降解材料的外部；其中，步驟(a)和(b)的次序可顛倒。
在一優(yōu)選例中，移植物中種子細(xì)胞的含量為1×105個(gè)細(xì)胞/ml-5×108個(gè)細(xì)胞/ml。
在另一優(yōu)選例中，所述的生物膜的厚度為5-200微米，且所述的生物可降解材料為條索狀。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種成纖維細(xì)胞的用途，它被用于制備肌腱移植物。


圖1顯示了用本發(fā)明的組織工程化肌腱修復(fù)的肌腱的力學(xué)強(qiáng)度。
圖2顯示體外培養(yǎng)第2代肌腱細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察(40×)。
圖3顯示體外培養(yǎng)第二代成纖維細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察(40×)。
圖4顯示成纖維細(xì)胞-PGA復(fù)合物體外培養(yǎng)7天，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)良好(40×)。
圖5顯示肌腱細(xì)胞-PGA復(fù)合物體外培養(yǎng)7天，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)良好(40×)。
圖6顯示正常肌腱組織的大體觀察。
圖7顯示第26周，試驗(yàn)組新生組織呈圓條束狀，色白，質(zhì)地堅(jiān)韌，與周?chē)M織稍有粘連，易分離，與正常肌腱組織交界處連接良好且難以分辨。
圖8顯示對(duì)照組1新生組織大體形態(tài)與實(shí)驗(yàn)組相似，色白，質(zhì)地堅(jiān)韌。
圖9顯示對(duì)照組2，26周，新生組織外觀與實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯區(qū)別，但與周?chē)尺B較實(shí)驗(yàn)組重且質(zhì)地硬。
圖10顯示正常肌腱組織組織學(xué)觀察(H&E，100×)。
圖11顯示成纖維細(xì)胞組織工程化肌腱26周，細(xì)胞與膠原纖維束的排列方向與正常肌腱相同，細(xì)胞密度較低，新生組織與正常肌腱組織間的界面已難以分辨(H&E，100×)。
圖12顯示肌腱細(xì)胞組織工程化肌腱26周，細(xì)胞與膠原纖維束的排列方向與正常肌腱相同，新生組織與正常肌腱組織間的界面已難以分辨(H&E，100×)。
圖13顯示對(duì)照組2細(xì)胞與膠原排列較紊亂，組織內(nèi)仍有血管長(zhǎng)入，且與正常肌腱的界面清晰。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)自體或異體來(lái)源的的成纖維細(xì)胞可以作為組織工程化肌腱組織的種子細(xì)胞來(lái)源。將成纖維細(xì)胞(或成纖維細(xì)胞與其他細(xì)胞的混合細(xì)胞)與藥學(xué)上可接受的降解材料和生物膜一起構(gòu)成組織工程化肌腱移植物，可有效地用于修復(fù)肌腱缺損。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
術(shù)語(yǔ)術(shù)語(yǔ)“純化的或分離的”指純化的或分離的物質(zhì)基本上不含有其他細(xì)胞、蛋白質(zhì)或多肽。
術(shù)語(yǔ)“異種移植”指將所需生物材料(如肌腱)從某一物種中取出并再施用于另一物種對(duì)象的方法。
術(shù)語(yǔ)“自體移植”指將所需生物材料(如肌腱)從某病人中取出并再施用于同一病人的方法。
術(shù)語(yǔ)“異體移植”指將所需生物材料(如肌腱)從同一物種的某個(gè)體中取出并再施用于另一不同病人的方法。
種子細(xì)胞可用于本發(fā)明肌腱移植物的種子細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，或成纖維細(xì)胞與其他細(xì)胞(如肌腱細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞等)的混合物。在成纖維細(xì)胞與其他的混合物中，成纖維細(xì)胞與肌腱細(xì)胞和/骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量之比為1∶10-10000∶1，較佳地為1∶5-100∶1，更佳地為1∶2-10∶1。
本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，肌腱細(xì)胞是特殊的成纖維細(xì)胞，兩者形態(tài)相似，都能分泌I型膠原，在肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中成纖維細(xì)胞起重要作用。更出乎意料的是，在應(yīng)力作用下，成纖維細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)化為肌腱細(xì)胞。
本發(fā)明的成纖維細(xì)胞的來(lái)源沒(méi)有特別限制，可以是任何來(lái)源的成纖維細(xì)胞，通常，本發(fā)明的成纖維細(xì)胞是自體的(如真皮、皮下組織以及其他組織中的成纖維細(xì)胞)、或同種異體的成纖維細(xì)胞(如人胎兒來(lái)源的成纖維細(xì)胞)。成纖維細(xì)胞還可以是衍生自骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、或其他干細(xì)胞的成纖維細(xì)胞。
可用于本發(fā)明的成纖維細(xì)胞可以來(lái)自任何脊椎動(dòng)物，較佳地是哺乳動(dòng)物，更佳地是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，尤其是人。
盡管自體的成纖維細(xì)胞是優(yōu)選的，但異體的成纖維細(xì)胞的來(lái)源也可使用。
分離和獲得成纖維細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中已知的。常用的分離方案包括(a)膠原酶消化、分離法。在全麻無(wú)菌條件下取皮膚組織，切成2×2×2mm3大小組織塊，磷酸緩沖液(PBS，含青，鏈霉素各100U/ml)沖洗2遍，加入二倍體積的1mg/mlII型膠原酶(Worthington，F(xiàn)reehold，NJ，USA)，置于37℃恒溫?fù)u床消化4h后用150目尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾離心，沉淀細(xì)胞用PBS洗2次，計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢查成纖維細(xì)胞活力，以1×106/盤(pán)密度(培養(yǎng)皿直徑100mm)培養(yǎng)細(xì)胞。
(b)組織塊培養(yǎng)法。在全麻無(wú)菌條件下取皮膚組織，切成2×2×2mm3大小組織塊，磷酸緩沖液(PBS，含青，鏈霉素各100U/ml)沖洗2遍。將組織塊在培養(yǎng)皿表面均勻擺置，將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱中放置2-4小時(shí)，輕輕加入培養(yǎng)液，讓液體緩慢覆蓋組織小塊，等待細(xì)胞游出。
成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)液是本領(lǐng)域中熟知的。一種優(yōu)選的方法是將成纖維細(xì)胞在飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)液包括(但并不限于)1)DMEM培養(yǎng)基((Gibco公司)+10％胎牛血清；2)DMEM培養(yǎng)基+20％小牛血清；3)DMEM培養(yǎng)基+10-20％自體(異體)人血清。此外，上述培養(yǎng)液中添加各種生長(zhǎng)因子(例如促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子等)、各種轉(zhuǎn)基因成分、各種細(xì)胞成分。
適用于本發(fā)明的成纖維細(xì)胞應(yīng)能在體內(nèi)或體外增殖。一種優(yōu)選的成纖維細(xì)胞是體外培養(yǎng)的原代至第五十代細(xì)胞，且免疫組織化學(xué)染色證明I型膠原表達(dá)，原位雜交檢測(cè)證明I型膠原mRNA表達(dá)成纖維細(xì)胞。
如果必要，可以在種子細(xì)胞中加入一些肌腱細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。分離和獲得肌腱細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中已知的。一種優(yōu)選的方法是通過(guò)胰酶、膠原酶消化進(jìn)行分離，即用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)將胰酶或膠原酶濃度調(diào)整至0.1-5mg/ml(較佳地約為1mg/ml)，37℃±2℃恒溫振蕩器內(nèi)消化約4-20h。
肌腱細(xì)胞的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)液也是本領(lǐng)域中熟知的。一種優(yōu)選的方法是將肌腱細(xì)胞在飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)液包括(但并不限于)1)DMEM培養(yǎng)基((Gibco公司)+10％胎牛血清；2)DMEM培養(yǎng)基+20％小牛血清；3)DMEM培養(yǎng)基+10-20％自體(異體)人血清。此外，上述培養(yǎng)液中添加各種生長(zhǎng)因子(例如促進(jìn)肌腱細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子等)、各種轉(zhuǎn)基因成分、各種細(xì)胞成分。
本發(fā)明中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的來(lái)源沒(méi)有特別限制，一種優(yōu)選的來(lái)源是來(lái)自自體的骨髓。分離獲得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中已知的。一種優(yōu)選的方法是全麻下骨髓穿刺抽取自體骨髓，以密度梯度離心法分離出其中的有核細(xì)胞，加入適合的培養(yǎng)液(如含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，維生素C50ug/ml，青、鏈霉素各100U/ml，地塞米松5nM(Sigma)的DMEM(Gibco，Gland Island，NY，USA)條件培養(yǎng)液)，制成細(xì)胞懸液，以約1×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，于37℃、5％CO2、100％飽和濕度的條件下培養(yǎng)。48小時(shí)后首次換液，加入條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)隔日換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)近匯合后，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，以1×104/cm2的密度接種進(jìn)行細(xì)胞傳代。
生物可降解材料可用于本發(fā)明的組織工程化肌腱的材料是醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羥基酸(如聚乳酸PLA、聚羥基乙酸PGA、聚羥基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠等；各種脫細(xì)胞基質(zhì)；(c)上述材料的混合物或復(fù)合材料，尤其是高分子材料與天然材料的復(fù)合材料。
生物膜適用于本發(fā)明的生物膜沒(méi)有特別限制，可以使用本發(fā)明常用的各種生物膜。優(yōu)選的生物膜具有以下特征1、生物相容性好，不引起異物反應(yīng)。2、孔隙率合適，利于細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲取和代謝廢物的排出。3、生物力學(xué)性能好，可抗一定應(yīng)力，以滿(mǎn)足肌腱修復(fù)后早期功能鍛煉的要求。4、可降解。
至于生物膜的厚度，沒(méi)有特別限制，通常為5-200微米，較佳地為10-50微米，更佳地為10-25微米。
組織工程化肌腱體外培養(yǎng)擴(kuò)增的種子細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)接種到生物相容性良好并可被機(jī)體吸收的可降解生物材料上形成種子細(xì)胞—生物材料復(fù)合物，將這一“種子細(xì)胞—生物材料”復(fù)合物植入到缺損部位，隨著生物材料的逐漸降解吸收，種子細(xì)胞繼續(xù)增殖并分泌基質(zhì)，最終替代生物材料而形成相應(yīng)的肌腱組織，達(dá)到修復(fù)肌腱缺損的目的。
本發(fā)明的組織工程化肌腱的制備方法簡(jiǎn)便，將一定數(shù)量的種子細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合，然后包被生物膜即可，或者種子細(xì)胞接種于被生物膜包被的生物可降解材料中。
本發(fā)明的組織工程化肌腱移植物的形狀沒(méi)有特別限制，可以按照組織缺損的形狀任意塑形。通常，移植物為長(zhǎng)條形。以類(lèi)似于圓柱體的移植物為例，其側(cè)面為膜狀覆蓋物，其兩端可以是覆蓋有膜狀覆蓋物，也可以不覆蓋膜狀覆蓋物。
生物膜通常覆蓋至少60％，較佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％的生物可降解材料的外表面積。
本發(fā)明組織工程化肌腱中的種子細(xì)胞濃度通常約為1×105/ml至5×108/ml或更高，較佳地為1×106/ml至1×108/ml，更佳地為5×106/ml至5×107/ml。通常，以培養(yǎng)液調(diào)整種子細(xì)胞濃度，然后與可降解材料混合?；旌蠒r(shí)，培養(yǎng)液與可降解材料的比例沒(méi)有特別限制，但是以該材料能夠吸附的培養(yǎng)液最大量為宜。
此外，在本發(fā)明的組織工程化肌腱移植物中，還可添加或復(fù)合其他各種細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、各種轉(zhuǎn)基因成分，從而保持肌腱細(xì)胞表型、促進(jìn)肌腱細(xì)胞生長(zhǎng)，以及促進(jìn)組織工程化肌腱在體內(nèi)的血管神經(jīng)化。
除了將組織工程化肌腱移植物植入體內(nèi)之外，還將其置于體外生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，從而進(jìn)行組織工程化肌腱的構(gòu)建，在體外形成具有一定組織學(xué)結(jié)構(gòu)、生化組成與生物力學(xué)強(qiáng)度的組織工程化肌腱。例如，將肌腱移植物的長(zhǎng)度、直徑依照肌腱缺損長(zhǎng)度與直徑確定，然后在應(yīng)力條件(1-200牛頓)下體外培養(yǎng)一周，每一至二天換液一次，以保證細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)，從而形成供移植的肌腱。
用本發(fā)明方法形成的組織工程化肌腱移植物或肌腱，可直接植入體內(nèi)皮下、肌腱缺損處。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)成纖維細(xì)胞分布廣泛，取材容易，解決了肌腱組織工程化構(gòu)建種子細(xì)胞來(lái)源不足的問(wèn)題；(2)可以按照組織缺損的形狀任意塑形，形成的組織可以在生物體內(nèi)終生存活。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)幼年家豬5頭，體重約10kg，由川沙養(yǎng)殖廠提供。
在全麻無(wú)菌條件下取豬側(cè)腹部皮膚組織，切成2×2×2mm3大小組織塊，磷酸緩沖液(PBS，含青，鏈霉素各100U/ml)沖洗2遍，加入二倍體積的1mg/mlII型膠原酶(Worthington，F(xiàn)reehold，NJ，USA)，置于37℃恒溫?fù)u床消化4h后用150目尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾離心沉淀細(xì)胞用PBS洗2次，計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢查成纖維細(xì)胞活力，以1×106/盤(pán)密度(培養(yǎng)皿直徑100mm)培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液為Ham′F-12(Gibco，Gland，Island，NY，USA)含10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，維生素C50ug/ml，青，鏈霉素各100U/ml，成纖維細(xì)胞傳至第二代，經(jīng)0.25％胰酶消化收集細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)(圖3)。
實(shí)施例2
肌腱細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)擴(kuò)增本實(shí)施例中應(yīng)用酶消化技術(shù)分離肌腱組織內(nèi)的肌腱細(xì)胞，并在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
(1)肌腱細(xì)胞的分離無(wú)菌狀態(tài)下切取切取豬左側(cè)趾淺屈肌腱3cm，將肌腱組織剪成1×2×2mm3的組織塊，置入離心管中PBS洗三遍，加入0.25％的II型膠原酶，置37℃搖床震蕩消化，分別于4、5、7小時(shí)收取肌腱細(xì)胞。通過(guò)以下收取步驟獲得分離的肌腱細(xì)胞1、消化液通過(guò)150目的過(guò)濾器去除組織碎塊，過(guò)濾液在離心機(jī)中以1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清液。
2、加入PBS 5ml，震蕩混勻后離心棄上清液，重復(fù)3次。
3、加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液10ml，細(xì)胞懸液(3×105個(gè)細(xì)胞/ml)接種于直徑100mm的培養(yǎng)皿中。
(2)肌腱細(xì)胞的原代培養(yǎng)1、將獲取的肌腱細(xì)胞置入飽和濕度，5％二氧化碳，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)。
2、每2-3天更換培養(yǎng)液一次，每次更換培養(yǎng)液時(shí)更換50-80％。
3、倒置顯微鏡見(jiàn)肌腱細(xì)胞達(dá)80-90％融合時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。
(3)肌腱細(xì)胞的傳代培養(yǎng)1、吸除培養(yǎng)皿中的全部培養(yǎng)液，PBS洗3遍。
2、加入0.25％的胰蛋白酶3ml，置入37℃孵箱中消化2分鐘。
3、倒置顯微鏡下觀察見(jiàn)肌腱細(xì)胞由梭型變成透亮圓球型，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。
4、用帶橡膠管的彎頭吸管搔刮、吹打使培養(yǎng)皿中的肌腱細(xì)胞呈單個(gè)懸浮狀態(tài)。
5、細(xì)胞計(jì)數(shù)，按2×106個(gè)細(xì)胞/ml進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
體外培養(yǎng)第2代肌腱細(xì)胞的倒置相差顯微鏡觀察照片見(jiàn)圖2。
實(shí)施例3生物材料支架的制備及“細(xì)胞—生物材料”復(fù)合物的形成本實(shí)施例采用聚羥基乙酸作為生物材料支架，接種實(shí)施例1中制備的成纖維細(xì)胞形成“細(xì)胞-生物材料”復(fù)合物。同時(shí)以肌腱細(xì)胞-PGA復(fù)合物為對(duì)照。
(1)實(shí)驗(yàn)材料1、聚羥基乙酸(Polyglycolic acid PGA)(Dexon，Davies&Geck)，2、生物膜(上海金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)，厚度13μm-20μm?？v向拉伸強(qiáng)度約33.3MPa；橫向拉伸強(qiáng)度約9.6MPa(2)生物材料支架的制備1、取未編織PGA20mg(直徑100μm)制成條索狀，外面包裹以生物膜，使之成為圓柱狀結(jié)構(gòu)。長(zhǎng)度50mm，直徑與所修復(fù)的肌腱直徑相當(dāng)。復(fù)合物體積約0.2ml。
2、將其放入75％酒精中浸泡消毒1小時(shí)。
3、生物材料支架用PBS洗滌3遍，含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液洗滌三遍，吸干。
4、紫外線(xiàn)下消毒30分鐘。自然干燥。
(3)“細(xì)胞—生物材料”復(fù)合物形成1.體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，制成濃度50×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。
2.生物材料預(yù)置在直徑100mm的培養(yǎng)皿中，成纖維細(xì)胞接種于生物材料支架上，以使成纖維細(xì)胞與生物材料粘附牢固，接種量50×106個(gè)細(xì)胞。置飽和濕度，5％二氧化碳，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。
3.加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在飽和濕度，5％二氧化碳，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7天，每2天換液1次。
4.倒置顯微鏡下拍照觀察成纖維細(xì)胞與PGA粘附情況。
5.掃描電鏡下觀察電鏡標(biāo)本經(jīng)過(guò)前固定，漂洗，后固定，漂洗，脫水，在經(jīng)再經(jīng)HCP-2臨界點(diǎn)干燥、BAL-TEC離子濺射后，用PHILIPS公司XL30-環(huán)境掃描電鏡觀察。
結(jié)果倒置顯微鏡下觀察顯示接種后4小時(shí)成纖維細(xì)胞與聚羥基乙酸開(kāi)始粘附，12小時(shí)成纖維細(xì)胞可牢固的貼附于PGA纖維上，并在體外培養(yǎng)過(guò)程中分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)。PGA纖維基本呈縱向排列，但不規(guī)則。
掃描電鏡觀察顯示成纖維細(xì)胞-PGA復(fù)合物體外培養(yǎng)7天可觀察到成纖維細(xì)胞與PGA纖維粘附牢固，成纖維細(xì)胞呈伸展?fàn)顟B(tài)貼附在PGA纖維上，并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(圖4)。對(duì)照組的肌腱細(xì)胞-PGA復(fù)合物體外培養(yǎng)7天，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)良好(40×)(圖5)。
實(shí)施例4肌腱移植物(成纖維細(xì)胞——生物材料復(fù)合物)回植全麻無(wú)菌條件下切斷豬后肢趾淺屈肌腱，造成缺損長(zhǎng)度3cm，將實(shí)施例3中制備的復(fù)合物移植于缺損處，以改良kessler法行端端吻合，未作外固定。其中，實(shí)驗(yàn)組為移植了本發(fā)明的肌腱移植物，對(duì)照組1為肌腱細(xì)胞-生物材料復(fù)合物，對(duì)照組2為單純生物材料。
6周取材，4％多聚甲醛固定24h，分別行大體觀察，HE，Massom′s三色染色和電鏡檢查評(píng)價(jià)再生組織。Instron生物力學(xué)測(cè)定儀測(cè)定生物力學(xué)強(qiáng)度。
結(jié)果術(shù)后豬可正常行走，傷口愈合良好，6周取材1、大體觀察試驗(yàn)組6周再生組織與周?chē)M織稍有粘連，可分離，色白，柔軟，有韌性，與正常肌腱組織相似(圖6-9)。
2、組織學(xué)觀察1)HE染色 再生組織內(nèi)細(xì)胞分布均勻，但細(xì)胞量較正常肌腱多，膠原束基本呈平行排列，與正常肌腱組織相似。(圖10-13)。
2)Masson′s三色染色在Masson′s三色染色下膠原呈綠色，可顯示再生組織內(nèi)膠原含量豐富，排列平行，整齊，與正常肌腱組織相似。
3)超微結(jié)構(gòu)觀察透射電鏡下觀察再生組織膠原束縱切面膠原排列較一致，橫紋清晰，在其橫切面上其單根膠原纖維粗細(xì)不一，但是比正常肌腱的膠原纖維粗且致密。
4)生物力學(xué)測(cè)定采用INSTRON生物力學(xué)測(cè)定儀(Instron公司，英國(guó))測(cè)定新生組織的抗拉力。新鮮獲取6小時(shí)以?xún)?nèi)的肌腱組織進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試。自行設(shè)計(jì)剖面為鋸齒狀?yuàn)A具。測(cè)定肌腱的最大單軸縱向抗拉伸力。室溫下，拉伸速度2mm/秒，每標(biāo)本測(cè)試前均以1N反復(fù)牽拉10次，使標(biāo)本較原來(lái)長(zhǎng)度延長(zhǎng)0.5mm左右以預(yù)調(diào)。
隨體內(nèi)植入時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組的肌腱生物力學(xué)特性逐漸增加，第26周實(shí)驗(yàn)組為438.0±49.5牛頓。組織工程化肌腱生物力學(xué)強(qiáng)度可達(dá)正常肌腱組織的70％(見(jiàn)圖1)。
實(shí)施例5制備肌腱移植物在本實(shí)施例中，重復(fù)實(shí)施例3和4的過(guò)程，不同之處在于，用成纖維細(xì)胞和肌腱細(xì)胞混合物(成纖維細(xì)胞與肌腱細(xì)胞數(shù)量之比為1∶1)替換成纖維細(xì)胞，接種量為5×106個(gè)細(xì)胞/ml、和50×106個(gè)細(xì)胞/ml。
結(jié)果，同樣形成了生物力學(xué)強(qiáng)度可達(dá)正常肌腱組織的70％的肌腱組織。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種組織工程化肌腱移植物，其特征在于，它包括(a)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；(b)種子細(xì)胞，所述的種子細(xì)胞接種于所述的生物可降解材料，且種子細(xì)胞選自下組(i)成纖維細(xì)胞，(ii)1∶10～10000∶1的成纖維細(xì)胞與肌腱細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的混合物；(c)生物膜，所述的生物膜包被在生物可降解材料的外部。
2.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的種子細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的種子細(xì)胞的含量為1×105個(gè)細(xì)胞/ml-5×108個(gè)細(xì)胞/ml。
4.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的生物膜的厚度為5-200微米。
5.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的生物可降解材料為條索狀。
6.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞來(lái)源于自體成纖維細(xì)胞、同種異體成纖維細(xì)胞、衍生自骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成纖維細(xì)胞，或其混合物。
7.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸、聚羥基乙酸、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠、脫細(xì)胞基質(zhì)，及其混合物。
8.一種制備組織工程化肌腱移植物的方法，其特征在于，包括步驟(a)將種子細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合，其中所述的種子細(xì)胞接種于所述的生物可降解材料，且種子細(xì)胞選自下組(i)成纖維細(xì)胞，(ii)1∶10～10000∶1的成纖維細(xì)胞與肌腱細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的混合物；(b)將生物膜包被在生物可降解材料的外部；其中，步驟(a)和(b)的次序可顛倒。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，移植物中種子細(xì)胞的含量為1×105個(gè)細(xì)胞/ml-5×108個(gè)細(xì)胞/ml。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的生物膜的厚度為5-200微米，且所述的生物可降解材料為條索狀。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種組織工程化肌腱移植物，它包括(a)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；(b)種子細(xì)胞，該種子細(xì)胞接種于所述的生物可降解材料且選自(i)成纖維細(xì)胞，(ii)1∶10～10000∶1的成纖維細(xì)胞與肌腱細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的混合物；(c)生物膜，所述的生物膜包被在生物可降解材料的外部。本發(fā)明的組織工程化肌腱移植物可有效地治療肌腱缺損。本發(fā)明還提供了該組織工程化肌腱移植物的制備方法和用途。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1507926SQ0215509
公開(kāi)日2004年6月30日 申請(qǐng)日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者曹誼林, 劉偉, 崔磊 申請(qǐng)人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院