專利名稱：一種從發(fā)酵液中提取d-核糖結(jié)晶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從發(fā)酵液中直接提取D-核糖結(jié)晶的方法。
背景技術(shù)：
D-核糖是生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)-核酸的重要組成成分，又是生物體內(nèi)能量代謝的重要參與者，在核苷類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪代謝中處于樞紐位置，具有重要的生理功能。
在工業(yè)上，D-核糖既是維生素B2的合成原料，又可用于抗病毒、抗腫瘤藥物的合成。近年來，隨著D-核糖在醫(yī)療保健領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，特別是其在治療心肌局部缺血和防治因運動而引起的肌肉僵硬、肌肉酸痛等方面醫(yī)療保健新用途的開發(fā)，D-核糖越來越引起人們的重視，各國科學(xué)家都爭先恐后地致力于建立適合規(guī)?；笊a(chǎn)的D-核糖的制備方法。
D-核糖的制備方法包括從天然物質(zhì)中提取分離、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵等方法。從天然物中提取分離D-核糖，提取過程繁雜、制造成本高，不適合規(guī)?；a(chǎn)。就合成法而言，人們先后嘗試了從D-阿拉伯糖(Gehrke and Aichner，1927)、D-葡萄糖酸(Steiger，1936)、D-葡萄糖(Korczynski A et al.1979)、L-谷氨酸和D-木糖(Lacourt Gadras，et al.1992)合成D-核糖，20世紀(jì)八十年代以前，國內(nèi)外主要采用由葡萄糖化學(xué)合成法進(jìn)行D-核糖的工業(yè)化生產(chǎn)，即由葡萄糖經(jīng)氧化、置換、轉(zhuǎn)化、再置換、酸化、內(nèi)酯化、還原等七步反應(yīng)制得D-核糖，該法不僅步驟復(fù)雜、所用設(shè)備多、收率低、制造成本高，而且其所涉及的貢電極還原反應(yīng)還會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。進(jìn)入20世紀(jì)九十年代后，人們開始使用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖，發(fā)酵法在常溫常壓下進(jìn)行，原材料來源廣泛，又避免了化學(xué)合成法的環(huán)境污染，被稱為生產(chǎn)D-核糖的最適當(dāng)?shù)募逊椒?。發(fā)酵法生產(chǎn)中廣泛采用的是芽孢桿菌屬的微生物。
發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖包括發(fā)酵和提取結(jié)晶兩個階段，提取結(jié)晶階段對于最終產(chǎn)品收率、產(chǎn)品品質(zhì)和生產(chǎn)成本至關(guān)重要。目前工業(yè)上從D-核糖發(fā)酵液中提取分離核糖結(jié)晶的方法主要有兩種，一種是通過化學(xué)合成反應(yīng)先形成核糖甙，比如形成α-苯胺-N-D-吡喃或呋喃核糖甙，然后經(jīng)水解，再進(jìn)行結(jié)晶的方法；另一種是直接從發(fā)酵液中提取D-核糖結(jié)晶的方法。前一種方法，不僅工藝步驟復(fù)雜、收率低、成本高，而且制造過程中使用有毒性的有機物質(zhì)，不可避免地會造成環(huán)境污染。而第二種直接從發(fā)酵液中提取D-核糖結(jié)晶的方法，無疑具有前一種方法無法比擬的優(yōu)點。
日本公開特許公報昭51-91388及美國專利4,904,587(1990)公開了一種從發(fā)酵液中直接提取D-核糖結(jié)晶的方法，該方法首先經(jīng)離心過濾去除發(fā)酵液中的菌體，然后濃縮發(fā)酵濾液至原體積的1/2，并經(jīng)一定量乙醇沉淀發(fā)酵液中的部分蛋白及雜質(zhì)后，將清液通過陽、陰離子交換樹脂脫鹽、活性炭柱脫色后，濃縮、結(jié)晶，獲得D-核糖產(chǎn)品。采用上述方法制備D-核糖結(jié)晶時，發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體及固體雜質(zhì)后，還含有大量可溶性蛋白、有機無機雜質(zhì)以及各種離子，其中鈣離子含量極高；接著將發(fā)酵濾液濃縮至原體積的一半，并加入一定量的乙醇，沉淀除掉其中的部分蛋白及其它醇不溶性雜質(zhì)。由于發(fā)酵液中含有大量的鈣離子，在濃縮過程中不僅會形成很厚的一層鈣化層，附著于濃縮設(shè)備表面，難以去除，而且會產(chǎn)生大量的糠醛類物質(zhì)及其它色素，均會增加后處理的難度和影響核糖結(jié)晶的質(zhì)量，另外，在大規(guī)模生產(chǎn)中使用乙醇沉降蛋白及其它雜質(zhì)，使用大量的乙醇，卻無法回收。
中國專利CN 1122833A(1996)中公開了利用一株枯草芽孢桿菌的D-核糖發(fā)酵及其發(fā)酵液的凈化方法，但發(fā)酵液的凈化只做到D-核糖糖漿為止。另一份中國專利CN 1234404A(1999)公開說明書中，公開了一種利用離子交換樹脂從發(fā)酵液中分離D-核糖的方法，但只涉及到利用離子交換樹脂對已經(jīng)經(jīng)過離心去除菌體后的發(fā)酵液，進(jìn)行除雜純化的方法，重點強調(diào)的是將三種類型的樹脂包括強酸性陽離子交換樹脂、弱堿性陰離子交換樹脂、弱酸性陽離子交換樹脂聯(lián)合使用，其經(jīng)過離交柱的過柱液中折純的D-核糖對上柱前的去除菌體后的發(fā)酵液而言，收率可高達(dá)95％以上，并且只提及將經(jīng)過離子交換樹脂柱的過柱液經(jīng)過濃縮后，可以獲得純度98％以上的結(jié)晶，但對D-核糖的結(jié)晶方法和結(jié)晶收率等問題均未提及。由于發(fā)酵液在上離交柱前，只是經(jīng)過離心去除菌體，還含有大量的可溶性蛋白、有機或無機雜質(zhì)等，盡管離子交換樹脂尤其是弱堿性陰離子交換樹脂，除了具有吸附離子的作用外，還具有吸附其它雜質(zhì)的能力，但對于含有大量可溶性蛋白成分復(fù)雜的發(fā)酵液來講，僅僅通過離子交換樹脂，是難以將發(fā)酵液中的雜質(zhì)去除徹底的。比如說其離交液中還會含有大量醇不溶性雜質(zhì)，這將會給后續(xù)結(jié)晶的提純，造成很大的困難。
因此，工業(yè)上目前急需建立一種從發(fā)酵液中直接提取D-核糖結(jié)晶、工藝簡單合理、適宜于大規(guī)模廉價地制造D-核糖結(jié)晶的方法。

發(fā)明內(nèi)容要解決的問題本發(fā)明的目的提供一種從核糖發(fā)酵液中直接提取D-核糖結(jié)晶的新方法。
技術(shù)方案發(fā)明人通過深入研究，發(fā)明了一種新的從發(fā)酵液中直接提取D-核糖結(jié)晶的方法。該方法包括以下步驟1)用絮凝劑或者吸附劑處理發(fā)酵液；2)分離絮狀物沉淀或吸附劑；3)對濾清液進(jìn)行柱層析；
4)濃縮樹脂柱過流液；5)使D-核糖結(jié)晶；6)分離并干燥結(jié)晶。
以上方法的第1)和2)步事實上是對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，目的是去除發(fā)酵液中的菌體細(xì)胞、蛋白、有機大分子及其它殘留的固體雜質(zhì)。其中絮凝劑可以是有機絮凝劑，如甲殼素、脫乙酰甲殼素，也可用無機絮凝劑，如聚氯化鋁，絮凝劑可以單獨使用，但它們與助凝劑(如水解聚丙烯酰胺)配合使用效果更佳。
在以上方法中，用絮凝劑處理發(fā)酵液是由以下過程實現(xiàn)的調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸堿度至弱酸性、中性或弱堿性，即調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值在一定的范圍內(nèi)，將新配制的絮凝劑在攪拌下，緩緩加入發(fā)酵液中，攪拌均勻后，靜置，待懸浮液凝聚形成大量絮狀物并開始沉降時，再次攪拌，將助凝劑緩緩加入，攪拌均勻后，靜置。
吸附劑可以是具有協(xié)同作用的黃血鹽和硫酸鋅，或者是氯化鈣和磷酸氫二鈉。酸化可用草酸、也可用硫酸。用吸附劑處理發(fā)酵液是由以下過程實現(xiàn)的用蒸汽加熱發(fā)酵液，加入草酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸堿度至強酸性，即調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值在1.5至3.5范圍內(nèi)，依次加入黃血鹽和硫酸鋅，或者氯化鈣和磷酸氫二鈉，升溫至60～85℃保溫10到30分鐘。
在以上方法中，其中所說的分離絮狀物沉淀的方法包括虹吸、壓濾和離心中的一種或多種。
在以上方法中，其中所說的對濾清液進(jìn)行柱層析包括對濾清液依次進(jìn)行陽離子交換樹脂柱層析、陰離子交換樹脂柱層析、大孔吸附樹脂層析和脫色樹脂柱層析；或者對濾清液依次進(jìn)行陽離子交換樹脂柱層析、陰離子交換樹脂柱層析、兩性樹脂柱層析和脫色樹脂柱層析。能夠吸附蛋白及色素的吸附樹脂、能夠去除陰陽離子的離子交換樹脂、能夠脫色的活性炭脫色樹脂等都可以用于本發(fā)明的方法。離子交換樹脂既可使用弱酸性陽離子交換樹脂、弱堿性陰離子交換樹脂，也可以使用強酸性陽離子交換樹脂和強堿性陰離子交換樹脂，其中優(yōu)選的是強酸性陽離子交換樹脂和弱堿性陰離子交換樹脂；大孔樹脂吸附可以是非極性大孔吸附樹脂，也可以是中等極性的大孔吸附樹脂。它們的配合使用效果更好，優(yōu)選的方式是強酸性陽離子交換樹脂、弱堿性陰離子交換樹脂，中等極性大孔吸附樹脂、活性炭脫色樹脂配合使用，或強酸性陽離子交換樹脂、弱堿性陰離子交換樹脂、兩性樹脂、脫色樹脂配合使用?？梢杂糜诒景l(fā)明方法的樹脂，例如，陽離子交換樹脂有732、001×7、001×8、AmberliteIR-120陽離子交換樹脂；陰離子交換樹脂有D315、D330、D335、AmberliteIR-63陰離子交換樹脂；大孔吸附樹脂有HZ-803、SD300、SD301、SD302；兩性樹脂有TP-1樹脂；脫色樹脂有D730、D750、D314、顆?；钚蕴棵撋珮渲?。
在以上方法中，其中所說的濃縮樹脂柱過流液的方法指真空減壓濃縮法，真空濃縮的溫度在35～40℃之間。
在以上方法中，其中所說的使D-核糖結(jié)晶的方法由以下過程實現(xiàn)的按濃縮糖漿2～4倍的體積，加入無水乙醇，略微加熱充分混溶，加入少量晶種并降溫。結(jié)晶溫度通常為5～30℃，10～18小時會出現(xiàn)大量結(jié)晶。
在以上方法中，分離并干燥結(jié)晶的方法包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何能夠使晶體和母液分離和能夠使晶體干燥的方法。可以使用的方法例如，用離心分離或真空抽濾的方法，獲得濕結(jié)晶后，可用雙錐真空干燥器將濕結(jié)晶在-0.095Mpa、55℃條件下烘3～4小時，即可得到D-核糖成品。
以上所述的步驟可以單獨進(jìn)行，也可以結(jié)合進(jìn)行，還可以顛倒進(jìn)行或者重復(fù)進(jìn)行。
本發(fā)明的方法可以用于所有能夠產(chǎn)生D-核糖的微生物的發(fā)酵液，優(yōu)選的是用于芽孢桿菌屬微生物的發(fā)酵液，例如，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)發(fā)酵液。
按照中國專利法和其實施細(xì)則的規(guī)定，本發(fā)明的短小芽孢桿菌P8069和枯草芽孢桿菌S6023已于2002年12月5日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號分別為CGMCC0845和CGMCC0846。
有益效果本發(fā)明將絮凝或酸化后吸附沉降等方法運用于核糖發(fā)酵液的預(yù)處理中，較徹底地去除了發(fā)酵液中的大量蛋白及其它雜質(zhì)，省去了現(xiàn)有技術(shù)中未經(jīng)徹底純化的發(fā)酵濾液的濃縮、醇降及除雜等工序，大大簡化了從發(fā)酵培養(yǎng)基中直接提取D-核糖結(jié)晶的方法，并提高了產(chǎn)品質(zhì)量。利用本發(fā)明的方法從發(fā)酵液直接提取的D-核糖結(jié)晶，一步總收率可達(dá)60％以上，母液回收重新結(jié)晶收率可達(dá)10％以上，這樣利用該工藝提純D-核糖結(jié)晶的總收率可達(dá)70％以上。經(jīng)高壓液相色譜檢測，所獲得的D-核糖結(jié)晶的純度達(dá)到99％以上。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1從短小芽孢桿菌CGMCC0845發(fā)酵液提取D-核糖結(jié)晶以葡萄糖1.0％(重量體積含量w/v，下同)，牛肉膏1.4％，蛋白胨0.7％，酵母膏0.4％，瓊脂2.0％為茄瓶斜面培養(yǎng)基(pH7.0)，按微生物常規(guī)操作法制成斜面，于36℃恒溫培養(yǎng)48小時，觀察無雜菌生長時，接種短小芽孢桿菌CGMCC0845(轉(zhuǎn)酮醇酶活性為0的短小芽孢桿菌突變株)，于36℃培養(yǎng)24～36小時，待菌苔長好后，即為斜面菌種。將長好的茄瓶斜面菌種用無菌生理鹽水制成菌懸液，接種于由山梨醇2.0％，玉米漿2.0％，酵母膏0.1％，磷酸氫二鉀0.3％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.05％組成的10L種子培養(yǎng)基(pH7.0)中，36℃培養(yǎng)18小時后，接入由葡萄糖20.0％(w/v)，玉米漿2.6％，硫酸銨0.7％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％(pH7.0)組成的100L發(fā)酵培養(yǎng)基中?？刂茢嚢柁D(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36℃，罐壓0.50kg/cm2，在發(fā)酵前期0～18小時，控制pH6.5～7.0、溶氧20～25％；發(fā)酵中后期控制pH6.3～6.5、溶氧25～30％，通氣攪拌培養(yǎng)46小時，積累D-核糖83.20g/L。
發(fā)酵液的絮凝利用甲殼素作為絮凝劑，加量按發(fā)酵液總量的350ppm，用水解聚丙烯酰胺作為助凝劑，加量按發(fā)酵液總量的50ppm。絮凝劑的配制方法將甲殼素片狀或粉狀物，以0.5～1.0％的比例溶解于0.1～1.0mol的稀酸溶液中；助凝劑的配制方法將助凝劑顆粒壯物以0.1～0.2％的比例加入到水中、攪拌、再加入一倍水，待此助凝劑物質(zhì)全部浸入水溶液中，即停止攪拌，靜置2～3小時后，溶液變得粘稠，輕輕攪拌該溶液到上下均勻透明即可。絮凝過程發(fā)酵液100L，調(diào)pH至7.0～7.8，將新鮮配制的絮凝劑在攪拌條件下，緩緩加入發(fā)酵液中，加完后，繼續(xù)攪拌5分鐘，靜置15分鐘，待懸浮液凝聚形成大量絮狀物并開始沉降時，再次攪拌，將助凝劑緩緩加入，繼續(xù)攪拌5分鐘，靜置2小時。此時發(fā)酵液中的菌體、大分子物質(zhì)及其它雜質(zhì)分子，凝結(jié)成絮狀物并沉降至發(fā)酵液底部，上層濾液澄清。用虹吸法將上層清液吸出，下層料液用壓濾或離心的方式除去雜質(zhì)，得到濾清液。將濾清液依次通過732陽離子交換樹脂、D335陰離子交換樹脂、HZ-803非極性大孔吸附樹脂、顆?；钚蕴棵撋珮渲?。柱床規(guī)格20×150(cm×cm)裝柱量為30L。收集樹脂柱過流液，在-0.095Mpa真空度條件下，35～40℃，減壓濃縮至糖漿狀，加入糖漿體積2～4倍量的乙醇，略微加熱混溶均勻后，加入少量晶種，降溫至5℃，10～18小時，D-核糖結(jié)晶大量形成，離心甩濾、減壓干燥得D-核糖結(jié)晶51.15kg。結(jié)晶母液通過減壓濃縮后，乙醇可經(jīng)乙醇精流塔回收重復(fù)使用，母液中的D-核糖，可通過上述純化分離過程重新獲D-核糖結(jié)晶8.37kg。這樣共得D-核糖結(jié)晶59.52kg。經(jīng)高壓液相色譜測定D-核糖結(jié)晶純度為99.68，比旋度為-20.76(4％的水溶液中，20℃)。
實施例2從枯草芽孢桿菌CGMCC0846發(fā)酵液提取D-核糖結(jié)晶以葡萄糖1.0％，牛肉膏1.4％，蛋白胨0.7％，酵母膏0.4％，瓊脂2.0％為茄瓶斜面培養(yǎng)基(pH7.0)，按微生物常規(guī)操作法制成斜面，于36℃恒溫培養(yǎng)48小時，觀察無雜菌生長時，接種枯草芽孢桿菌CGMCC0846(轉(zhuǎn)酮醇酶活性為0的枯草芽孢桿菌突變株)，于36℃培養(yǎng)24～36小時，待菌苔長好后，即為茄瓶斜面菌種。將長好的茄瓶斜面菌種用無菌生理鹽水制成菌懸液，接種于由葡萄糖2.0％，酵母膏0.3％，玉米漿0.05％，磷酸氫二鉀0.3％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.05％(pH7.0) 組成的10L種子培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)18小時后，接入由葡萄糖20.0％，玉米漿2.6％，硫酸銨0.7％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％組成的100L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中。控制攪拌轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36℃?？刂茢嚢柁D(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36℃。在發(fā)酵前期0～18小時，控制pH6.5～7.0、溶氧18～22％；發(fā)酵中后期控制pH6.0～6.2、溶氧20～25％；在36℃，0.60kg/cm2的條件下，通氣攪拌培養(yǎng)42小時，積累D-核糖83.60g/L。
發(fā)酵液的絮凝利用聚氯化鋁和水解聚丙烯酰胺，加量分別為發(fā)酵液總量的300ppm和100ppm，聚氯化鋁配成20％的溶液，水解聚丙烯酰胺0.2％的濃度，按與實例1相同的配制方法配制而成。絮凝過程發(fā)酵液100L，調(diào)pH至6.7～7.5，將新鮮配制聚氯化鋁和水解聚丙烯酰胺溶液依次在攪拌條件下，緩緩加入發(fā)酵液中，加完后，繼續(xù)攪拌5分鐘，靜置2小時，此時發(fā)酵液中的菌體、大分子物質(zhì)及其它雜質(zhì)分子，凝結(jié)成絮狀物并沉降至發(fā)酵液底部，上層濾液澄清。用虹吸法將上層清液吸出，下層料液用壓濾或離心的方式除去雜質(zhì)，得到濾清液。將濾清液依次通過732陽離子交換樹脂、D335陰離子交換樹脂、TP-1兩性樹脂、顆粒活性炭脫色樹脂。柱床規(guī)格20×150cm，裝柱量為30L。收集樹脂柱過流液，在-0.095Mpa真空度條件下，35～40℃，減壓濃縮至糖漿狀，加入糖漿體積的2～4倍量的乙醇，略微加熱混溶均勻后，加入少量晶種，降溫至5℃，10～18小時，D-核糖結(jié)晶大量形成，離心甩濾、減壓干燥獲得D-核糖結(jié)晶51.25kg。結(jié)晶母液通過減壓濃縮后，乙醇可經(jīng)乙醇精流塔回收重復(fù)使用，母液中的D-核糖，可通過上述的純化分離過程重新獲得結(jié)晶8.39kg。這樣共得D-核糖結(jié)晶59.64kg。經(jīng)高壓液相色譜測定D-核糖結(jié)晶純度為99.66％，比旋度為-20.60(4％的水溶液中，20℃)。
實施例3從枯草芽孢桿菌CGMCC0846發(fā)酵液提取D-核糖結(jié)晶以葡萄糖1.0％，牛肉膏1.4％，蛋白胨0.7％，酵母膏0.4％，瓊脂2.0％為茄瓶斜面培養(yǎng)基(pH7.0)，按微生物常規(guī)操作法制成斜面，于36℃恒溫培養(yǎng)48小時，觀察無雜菌生長時，接種枯草芽孢桿菌ATCC0846，于36℃培養(yǎng)24～36小時，待菌苔長好后，即為斜面菌種。將長好的茄瓶斜面菌種用無菌生理鹽水制成菌懸液，接種于與實例2組成相同的10L種子培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)16小時后，接入由葡萄糖20.0％，玉米漿2.6，硫酸銨0.7，硫酸錳0.005，碳酸鈣2.2％，組成的100L發(fā)酵培養(yǎng)基中?？刂茢嚢柁D(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36℃。在發(fā)酵前期0～18小時，控制pH6.5～7.0、溶氧25～30％；發(fā)酵中后期控制pH6.0～6.2、溶氧30～35％；在36℃、0.7kg/cm2的條件下，通氣攪拌培養(yǎng)45小時，積累D-核糖80.5g/L。
發(fā)酵液100L，用蒸汽加熱至45～50℃，緩慢加入草酸，調(diào)pH至1.5～3.5，然后依次按發(fā)酵液體積的0.1～0.2％的量加入黃血鹽、按0.05～0.1％的量加入硫酸鋅，升溫至70～75℃保溫20分鐘，用壓濾或離心的方式除去雜質(zhì)，得到濾清液。將濾清液依次通過732陽離子交換樹脂、D314陰離子交換樹脂、HZ-803非極性大孔吸附樹脂、顆粒活性炭樹脂。柱床規(guī)格20×150(cm×cm)，裝柱量為30L。收集樹脂柱過流液，在-0.095Mpa真空度條件下，35～40℃，減壓濃縮至糖漿狀，加入糖漿體積的2～4倍量的乙醇，略微加熱混溶均勻后，加入少量晶種，降溫至5℃，10～18小時，D-核糖結(jié)晶大量形成，離心甩濾、減壓干燥獲得D-核糖結(jié)晶49.80kg。結(jié)晶母液通過減壓濃縮后，乙醇可經(jīng)乙醇精流塔回收重復(fù)使用，母液中的D-核糖，可通過上述的純化分離過程重新獲得結(jié)晶8.70kg。這樣共得結(jié)晶58.50kg。經(jīng)高壓液相色譜測定D-核糖結(jié)晶純度為99.80％，比旋度為-20.57(4％的水溶液中，20℃)。
實施例4從短小芽孢桿菌ATCC31093發(fā)酵液提取D-核糖結(jié)晶以葡萄糖1.0％，牛肉膏1.4％，蛋白胨0.7％，酵母膏0.4％，瓊脂2.0％為茄瓶斜面培養(yǎng)基(pH7.0)，按微生物常規(guī)操作法制成斜面，于36℃恒溫培養(yǎng)48小時，觀察無雜菌生長時，接種短小芽孢桿菌ATCC31093，于36℃培養(yǎng)24～36小時，待菌苔長好后，即為斜面菌種。將長好的茄瓶斜面菌種用無菌生理鹽水制成菌懸液，接種于由山梨醇2.0％，玉米漿2.0％，磷酸氫二鉀0.3％，磷酸二氫鉀0.1％，酪氨酸和苯丙氨酸各100ug/ml(pH)組成的10L種子培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)16小時后，接入由葡萄糖20.0％，干酵母1.2％，硫酸銨0.6％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml組成的100L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中?？刂茢嚢柁D(zhuǎn)速260轉(zhuǎn)/分，在發(fā)酵前期0～16小時，控制pH6.5～7.0、溶氧20～25％、空氣流量1∶0.15～1∶0.25；發(fā)酵中后期控制pH6.3～6.5、溶氧25～30％、空氣流量1∶0.25～1∶0.70；在37℃，0.50kg/cm2的條件下，通氣攪拌培養(yǎng)46小時，積累D-核糖81.70g/L。
按實例1的提取純化方法，直接從發(fā)酵液中獲得D-核糖結(jié)晶50.27kg，從母液中回收純化獲得D-核糖結(jié)晶8.26kg，共得D-核糖結(jié)晶58.53kg。經(jīng)高壓液相色譜測定D-核糖結(jié)晶純度為99.35％，比旋度為-20.25(4％的水溶液中，20℃)。
實施例5從枯草芽孢桿菌IFO13621發(fā)酵液提取D-核糖結(jié)晶以葡萄糖1.0％，牛肉膏1.4％，蛋白胨0.7％，酵母膏0.4％，瓊脂2.0％為茄瓶斜面培養(yǎng)基(pH7.0)，按微生物常規(guī)操作法制成斜面，于36℃恒溫培養(yǎng)48小時，觀察無雜菌生長時，接種枯草芽孢桿菌IFO13621，于36℃培養(yǎng)24～36小時，待菌苔長好后，即為斜面菌種。將長好的茄瓶斜面菌種用無菌生理鹽水制成菌懸液，接種于由山梨醇2.0％，玉米漿2.0％，磷酸氫二鉀0.3％，磷酸二氫鉀0.1％，酪氨酸和苯丙氨酸各100ug/ml(pH)(pH7.0)組成的10L種子培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)18小時后，接入由葡萄糖20.0％，干酵母1.0％，硫酸銨0.6％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml組成的100L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中?？刂茢嚢柁D(zhuǎn)速280轉(zhuǎn)/分，按在發(fā)酵前期0～18小時，控制pH6.5～7.0、溶氧20～25％；發(fā)酵中后期控制pH6.1～6.3、溶氧25～30％；在36℃、0.50kg/cm2的條件下，通氣攪拌培養(yǎng)46小時，積累D-核糖81.50g/L。
按實例2的提取純化方法，直接從發(fā)酵液中獲得D-核糖結(jié)晶49.10kg從母液中回收純化獲得D-核糖結(jié)晶8.27kg，共得D-核糖結(jié)晶57.37kg。經(jīng)高壓液相色譜測定D-核糖結(jié)晶純度為99.27％，比旋度為-20.48(4％的水溶液中，20℃)。
實施例6從枯草芽孢桿菌S1907發(fā)酵液提取D-核糖結(jié)晶以葡萄糖1.0％，牛肉膏1.4％，蛋白胨0.7％，酵母膏0.4％，瓊脂2.0％為茄瓶斜面培養(yǎng)基(pH7.0)，按微生物常規(guī)操作法制成斜面，于36℃恒溫培養(yǎng)48小時，觀察無雜菌生長時，接種變異株S1907(轉(zhuǎn)酮醇酶活性為0的枯草芽孢桿菌突變株)，于36℃培養(yǎng)24～36小時，待菌苔長好后，即為斜面菌種。將長好的茄瓶斜面菌種用無菌生理鹽水制成菌懸液，接種于由山梨醇2.0％，玉米漿2.0％，酵母膏0.1％，磷酸氫二鉀0.3％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，pH7.0(pH7.0)組成的10L種子培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)18小時后，接入由葡萄糖20.0％，玉米漿2.6％，干酵母0.10％，硫酸銨0.7％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％(pH7.0)組成的100L發(fā)酵培養(yǎng)基中。控制攪拌轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分，在發(fā)酵前期0～18小時，控制pH6.5～7.0、溶氧20～25％；發(fā)酵中后期控制pH6.2～6.4、溶氧25～30％；在37℃、0.50kg/cm2的條件下，通氣攪拌培養(yǎng)46小時，積累D-核糖80.2g/L。
按實施例3的提取純化方法，直接從發(fā)酵液中獲得D-核糖結(jié)晶49.65kg，從母液中回收純化獲得D-核糖結(jié)晶8.57kg，共得D-核糖結(jié)晶58.22kg。經(jīng)高壓液相色譜法測定D-核糖結(jié)晶純度為99.95％，比旋度為-20.80(4％的水溶液中，20℃)。
實施例7從短小芽孢桿菌P8009發(fā)酵液提取D-核糖結(jié)晶以葡萄糖1.0％，牛肉膏1.4％，蛋白胨0.7％，酵母膏0.4％，瓊脂2.0％為茄瓶斜面培養(yǎng)基(pH7.0)，按微生物常規(guī)操作法制成斜面，于36℃恒溫培養(yǎng)48小時，觀察無雜菌生長時，接種短小芽孢桿菌P8009(轉(zhuǎn)酮醇酶活性為0的短小芽孢桿菌突變株)，于36℃培養(yǎng)24～36小時，待菌苔長好后，即為斜面菌種。將長好的茄瓶斜面菌種用無菌生理鹽水制成菌懸液，接種于由葡萄糖2.0％，玉米漿2.0％，酵母膏0.05％，磷酸氫二鉀0.3％，磷酸二氫鉀0.1％、硫酸鎂0.05％(pH7.0)組成的10L種子培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)16小時后，接入由葡萄糖20.0％，玉米漿2.5％，硫酸銨0.6％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％組成的100L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中?？刂茢嚢柁D(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵前期0～18小時，控制pH6.5～7.0、溶氧20～25％；發(fā)酵中后期控制pH6.1～6.3、溶氧25～30％；在36℃、0.50kg/cm2的條件下，通氣攪拌培養(yǎng)46小時，積累D-核糖79.60g/L。
按實施例1的提取純化方法，直接從發(fā)酵液中獲得D-核糖結(jié)晶48.10kg，從母液中回收純化獲得D-核糖結(jié)晶8.25kg，共得D-核糖結(jié)晶56.35kg。經(jīng)高壓液相色譜測定D-核糖結(jié)晶純度為99.65％，比旋度為-20.17(4％的水溶液中，20℃)。
實施例8從枯草芽孢桿菌S6057發(fā)酵液提取D-核糖結(jié)晶以葡萄糖1.0％，牛肉膏1.4％，蛋白胨0.7％，酵母膏0.4％，瓊脂2.0％為茄瓶斜面培養(yǎng)基(pH7.0)，按微生物常規(guī)操作法制成斜面，于36℃恒溫培養(yǎng)48小時，觀察無雜菌生長時，接種枯草芽孢桿菌S6057，于36℃培養(yǎng)24～36小時，待菌苔長好后，即為斜面菌種。將長好的茄瓶斜面菌種用無菌生理鹽水制成菌懸液，接種于由葡萄糖2.0％，酵母膏0.3％，玉米漿0.05％，磷酸氫二鉀0.3％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.05％(pH7.0)組成的10L種子培養(yǎng)基(pH7.0)中，36℃培養(yǎng)18小時后，接入由葡萄糖20.0％，玉米漿2.6％，硫酸銨0.7％，硫酸錳0.005％，碳酸鈣2.2％組成的100L發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)中?？刂茢嚢柁D(zhuǎn)速260轉(zhuǎn)/分，在發(fā)酵前期0～18小時，控制pH6.5～7.0、溶氧20～25％；發(fā)酵中后期控制pH6.0～6.2、溶氧25～30％；在37℃、0.50kg/cm2的條件下，通氣攪拌培養(yǎng)46小時，積累D-核糖81.5g/L。
按實施例1的提取純化方法，直接從發(fā)酵液中獲得D-核糖結(jié)晶48.95kg，從母液中回收純化獲得D-核糖結(jié)晶8.39kg，共得D-核糖結(jié)晶57.34kg。經(jīng)高壓液相色譜測定D-核糖結(jié)晶純度為99.75％，比旋度為-20.32(4％的水溶液中，20℃)。
權(quán)利要求
1.一種從發(fā)酵液中提取D-核糖結(jié)晶的方法，該方法包括以下步驟1)用絮凝劑或者吸附劑處理發(fā)酵液；2)分離絮狀物沉淀或吸附劑；3)對濾清液進(jìn)行柱層析；4)濃縮樹脂柱過流液；5)使D-核糖結(jié)晶；6)分離并干燥結(jié)晶。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的絮凝劑是有機絮凝劑甲殼素、脫乙酰甲殼素、無機絮凝劑聚氯化鋁中的一種或多種，或者是它們與助凝劑水解聚丙烯酰胺的混合物。
3.按照權(quán)利要求1或2的方法，其中所說的用絮凝劑處理發(fā)酵液是由以下過程實現(xiàn)的調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸堿度至弱酸性、中性或弱堿性，將新配制的絮凝劑在攪拌下，緩緩加入發(fā)酵液中，攪拌，靜置，使懸浮液凝聚，形成大量絮狀物，經(jīng)沉降與清液分層；若與助凝劑聯(lián)合使用，在絮狀物開始大量形成時，再次攪拌，將助凝劑緩緩加入，攪拌，靜置。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的用吸附劑處理發(fā)酵液是由以下過程實現(xiàn)的用蒸汽加熱發(fā)酵液，緩慢加酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸堿度至強酸性，依次加入吸附劑，升溫至60～85℃保溫10到30分鐘。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中所說的吸附劑是黃血鹽和硫酸鋅，或者是氯化鈣和磷酸氫二鈉。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的分離絮狀物沉淀或吸附劑的方法包括虹吸、壓濾和離心中的一種或多種。
7.按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的對濾清液進(jìn)行柱層析包括對濾清液依次進(jìn)行陽離子交換樹脂層析、陰離子交換樹脂層析、大孔吸附樹脂層析和活性炭脫色樹脂層析；或者對濾清液依次進(jìn)行陽離子交換樹脂層析、陰離子交換樹脂層析、兩性樹脂層析和脫色樹脂層析。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其中所說的陽離子交換樹脂包括732、001×7、001×8、AmberliteIR-120陽離子交換樹脂；陰離子交換樹脂包括D315、D330、D335、AmberliteIR-63陰離子交換樹脂；大孔吸附樹脂包括HZ-803、SD300、SD301、SD302；兩性樹脂TP-1樹脂；脫色樹脂包括D730、D750、D314、顆粒活性炭脫色樹脂。
9.按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的濃縮樹脂柱過流液的方法是在35-40℃條件下減壓濃縮。
10.按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的使D-核糖結(jié)晶的方法由以下過程實現(xiàn)的加入乙醇，略微加熱，加入少量晶種并降溫。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從發(fā)酵液中直接提取D－核糖結(jié)晶的方法，該方法包括用絮凝劑或者吸附劑處理發(fā)酵液、分離絮狀物沉淀或吸附劑、對濾清液進(jìn)行柱層析、濃縮樹脂柱過流液、使D－核糖結(jié)晶以及分離并干燥結(jié)晶。本發(fā)明將絮凝或酸化后吸附沉降等方法運用于核糖發(fā)酵液的預(yù)處理中，強化了發(fā)酵液的預(yù)處理工序，徹底去除了發(fā)酵液中的菌體蛋白及其它雜質(zhì)，省去了現(xiàn)有技術(shù)中未經(jīng)徹底純化的發(fā)酵濾液的濃縮、醇降及除雜等工序，大大簡化了提取過程，并提高了產(chǎn)品質(zhì)量。
文檔編號C12P19/00GK1508138SQ0215649
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月18日
發(fā)明者高潤香, 王威, 黎慧華 申請人:誠志生命科技有限公司