專利名稱：一種新型植物dna病毒載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型植物DNA病毒載體及其用途，具體地，本發(fā)明涉及中國番茄黃化曲葉病毒DNA-A和DNAβ的侵染性載體及由它衍生的植物基因沉默載體和病毒表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及一種構(gòu)建植物DNA病毒載體的DNAβ衛(wèi)星分子及其全基因組序列。本發(fā)明還涉及一種利用植物DNA病毒載體確定基因組功能、植物基因組功能和表達(dá)外源蛋白的應(yīng)用及方法。
背景技術(shù)：
粉虱傳雙生病毒(whitefly-transmitted geminivirus，WTG)是世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的一類植物單鏈DNA病毒，近年來已在熱帶、亞熱帶地區(qū)多種作物上引起嚴(yán)重危害，給作物生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。WTG在分類上屬于雙生病毒科(Geminiviridae)中的菜豆金黃花葉病毒屬(Begomovirus)病毒，包括100多個獨立種。在自然條件下，WTG均由煙粉虱(Bemisia tabaci)傳播，其病毒粒子形態(tài)為孿生顆粒狀，大小18×30nm，基因組為單鏈環(huán)狀DNA，大小2.5-3.0kb。大多WTG病毒包含2個大小相近的DNA組份，稱DNA-A和DNA-B。DNA-A和DNA-B大部分序列不同，但在非編碼區(qū)中有約200個核苷酸序列幾乎相同(同源性大于95％)，稱為共同區(qū)(common region，CR)，共同區(qū)包含有病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄起始和包裝所需的序列，并可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。DNA-A編碼病毒復(fù)制所必須的復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)、復(fù)制增強蛋白(Ren)、外殼蛋白(CP)和控制晚期基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(TrAP)，這些蛋白與病毒的復(fù)制和介體傳播有關(guān)；DNA-B編碼一個核穿梭蛋白(NSP)和一個運動蛋白(MP)，與病毒在植物體內(nèi)的運輸和病毒的寄主范圍有關(guān)。目前，WTG中少數(shù)病毒，如番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)(泰國的TYLCV除外)、番茄曲葉病毒(TLCV)、棉花曲葉病毒(CLCuV)和勝紅薊黃脈病毒(AYVV)，僅發(fā)現(xiàn)有DNA-A，對TYLCV和TLCV的致病性測定表明，DNA-A能侵染番茄、本氏煙(Nicotiana benthamiana)和普通煙(N.tabacum)，并表現(xiàn)出與田間相近的癥狀，侵染后的植株能被粉虱傳播。而與TYLCV、TLCV不同的是，用勝紅薊黃脈病毒(AYVV)的DNA-A的侵染性克隆雖能系統(tǒng)侵染勝紅薊，卻小形成典型的黃脈癥狀。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AYVV DNA-A需要一種新型的DNA分子共同侵染才能引起典型的癥狀。本發(fā)明在中國番茄黃化曲葉病毒上發(fā)現(xiàn)了這類新型的DNA衛(wèi)星分子。
植物病毒侵染性載體是研究病毒基因組功能的重要的平臺，病毒侵染性載體的構(gòu)建，可以人為地對病毒基因組在分子水平上進(jìn)行操作，獲得野生型分子或者突變型分子的均一群體，進(jìn)而利用DNA重組技術(shù)進(jìn)行突變、缺失、插入、置換以及互補實驗對病毒基因組進(jìn)行功能區(qū)域的定位，從而能在寄主植物表型水平上反映和評價基因功能的表達(dá)。該技術(shù)是深入研究病毒的基因功能以及病毒與寄主植物互作的有效手段，該技術(shù)首先在噬菌體病毒Qβ和脊髓灰質(zhì)炎病毒中獲得成功，植物DNA病毒的侵染性克隆是1982年在番茄金色花葉病毒(TGMV)上通過磨擦接種的方法構(gòu)建成功，植物RNA病毒是1983年在雀麥花葉病毒(BTV)上首次獲得侵染性cDNA克隆。雖然該技術(shù)產(chǎn)生較遲，但是發(fā)展卻是極為迅速，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于病毒的遺傳表達(dá)和復(fù)制分析。本發(fā)明在獲得新型衛(wèi)星分子的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了該衛(wèi)星分子的侵染性載體，以應(yīng)用于病毒的功能基因組研究。
病毒誘導(dǎo)的基因沉默的載體是一種通過正向遺傳學(xué)研究植物基因組功能的非常有效的途徑，它是把植物內(nèi)源基因插入病毒載體，隨著病毒的復(fù)制形成dsRNA的中間體，這些dsRNA被一個稱為Dicer的酶降解成21-23nt的RNA并與RNAase結(jié)合形成復(fù)合體，這個復(fù)合體在21-23nt的RNA指導(dǎo)下特異性地攻擊它的同源序列，從而使植物中的同源基因功能失常，因此可以在植物的表型以及生化特征上研究植物基因組的功能。在當(dāng)前植物基因組大量測定的情況下，越來越多的序列不清楚其功能，分子生物學(xué)下一個工作重心是功能基因組研究，這需要開辟多種途徑來研究植物基因組的功能，而病毒誘導(dǎo)的基因沉默是從基因組到功能的一種非常有效的方法。
將外源基因放入植物細(xì)胞內(nèi)可以生產(chǎn)外源蛋白，因而植物是一種具有廣泛應(yīng)用前景的生物反應(yīng)器。植物具有合成、折疊、翻譯后修飾及裝配蛋白的機(jī)制，外源蛋白在植物體內(nèi)可以大量繁殖，因此可以利用植物進(jìn)行大量、廉價地生產(chǎn)重要藥用蛋白(特別是疫苗)。生長利用植物生產(chǎn)藥物主要有兩種方法(1)外源基因暫時存在于植物細(xì)胞中(如利用植物病毒載體)，植物可表達(dá)由外源基因編碼的蛋白質(zhì)；(2)外源基因長期存在于植物細(xì)胞中，即導(dǎo)入的外源基因?qū)⒊蔀橹参锘蚪M的一部分，然后持續(xù)不斷地產(chǎn)生由外源基因編碼的蛋白質(zhì)。但是轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的表達(dá)量都比較低，一般在可溶性蛋白的1％以下，而且基因轉(zhuǎn)化和植株再生過程費力費時，這在很大程度上影響了利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白的全面產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。植物病毒一般都具有很強的繁殖能力，基于植物病毒的這一特性，從80年代起，世界各地的研究人員就開始探索利用植物病毒載體高效表達(dá)外源基因的可行性，并成功地表達(dá)了多種蛋白。本發(fā)明在構(gòu)建好的植物DNA病毒侵染性克隆的基礎(chǔ)上，建立了一種利用植物DNA病毒表達(dá)外源蛋白的表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新型植物DNA病毒載體，該載體包括植物DNA病毒侵染性載體及由它衍生的植物基因沉默載體和病毒表達(dá)載體；本發(fā)明的一個目的是提供一種新型的構(gòu)建植物DNA病毒載體的衛(wèi)星DNA分子；本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用植物DNA病毒載體研究病毒功能基因組、植物功能基因組和表達(dá)外源蛋白的用途。
本發(fā)明的一個方面，提供了一種新型的衛(wèi)星DNA分子，具體的說是一種粉虱傳雙生病毒中國番茄黃化曲葉病毒DNAβ分子，所述的DNAβ全長核苷酸序列與Seq ID No1-12至少有72％的同源性。DNAβ大小是DNA-A的一半，和DNA-A之間沒有序列同源性。不同的DNAβ比較，具有一段非常保守的區(qū)域，大約115bp，含有高度保守的復(fù)制起始序列TAATATT/AC，DNAβ除了一段共同區(qū)以外，和已知的序列同源性非常低。在已知的DNAβ之間還具有一個在位置上非常保守的開放閱讀框，在基因組中具有一段A富含區(qū)。
本發(fā)明的另一個方面，提供了一個侵染性載體，更具體地說構(gòu)建了中國番茄黃化曲葉病毒DNA-A和新型衛(wèi)星分子DNAβ的侵染性載體，其特征是該系統(tǒng)是一套互補的載體，DNA-A能夠系統(tǒng)侵染植株，但是并不引發(fā)典型的癥狀。單獨的DNAβ不能獨立復(fù)制，它必須依賴與DNA-A，而DNAβ反過來也會作用與DNA-A，只有DNA-A和DNAβ一起存在時，植株才能引發(fā)典型的嚴(yán)重的致病型，并且DNAβ能夠大大促進(jìn)DNA-A的基因組含量。本發(fā)明的侵染性載體可用于病毒功能基因組和病毒與植物互作研究，其方法為a.針對病毒的目的基因設(shè)計突變引物，通過Overlap-PCR對病毒的目的基因進(jìn)行突變，b.構(gòu)建兩個正向copy的突變的重復(fù)，c.把構(gòu)建的兩個正向copy的突變的重復(fù)插入農(nóng)桿菌載體上，d.把c中構(gòu)建的農(nóng)桿菌載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌載體，e.通過農(nóng)桿菌注射法把病毒接種到植物體內(nèi)，f.觀察癥狀及病毒分子水平的檢測。
本發(fā)明還提供了一個由侵染性載體衍生的植物基因沉默的載體，該載體誘導(dǎo)植物基因發(fā)生沉默從而研究植物基因的功能。本發(fā)明提供的植物基因沉默的載體可用于研究植物基因組的功能，其方法為a.對植物進(jìn)行RNA抽提，用植物內(nèi)源基因的引物進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，繼而進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得目的植物基因的cDNA片段，b.對DNAβ的C1基因進(jìn)行缺失，并設(shè)計引物加入多克隆位點，c.把植物目的基因的cDNA片段插入DNAβ的多克隆位點，d.構(gòu)建兩個copy的帶有植物內(nèi)源基因的DNAβ，e.把d中構(gòu)建的兩個copy的β插入農(nóng)桿菌載體，f.把e中構(gòu)建的農(nóng)桿菌載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，e.把f中的農(nóng)桿菌與含有DNA-A侵染性克隆的農(nóng)桿菌一起接種寄主植物，g.觀察植物表型或檢測植物生理生化變化。
本發(fā)明還提供一個由侵染性載體衍生的外源基因表達(dá)載體，該表達(dá)載體可用于表達(dá)外源基因，其表達(dá)構(gòu)建方法包括a.設(shè)計特異性引物拉出準(zhǔn)確缺失C1的β基因組，并構(gòu)建至pGEM-T easyVector，b.用另外一對含有特異性引物拉出的缺失C1的β后插入a中構(gòu)建的載體，拼接以后得到兩個正向重復(fù)的并缺失C1基因的DNAβ，并在C1的位置上引入了多克隆位點，c.通過酶切把b中構(gòu)建的正向重復(fù)的DNAβ引入植物表達(dá)載體，d.在植物表達(dá)載體上就可以直接插入外源基因進(jìn)行表達(dá)。
在本發(fā)明中，術(shù)語“植物DNA病毒載體”，包括中國番茄黃化曲葉病毒DNA-A和DNAβ的侵染性載體及由它衍生的植物基因沉默載體和病毒表達(dá)載體。
本發(fā)明的優(yōu)點1.本發(fā)明構(gòu)建的侵染性載體是一種極有價值的分子工具，能夠方便地獲得自然分子或者突變分子的均一群體，利用這種分子工具，可以進(jìn)行病毒的分子生物學(xué)研究，能夠通過對病毒基因的突變、缺失、插入、重組等技術(shù)來研究病毒基因組結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制，它是研究病毒功能基因組和病毒與植物間互作的一個至關(guān)重要的平臺。本發(fā)明中DNAβ上有一個未知功能的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，本發(fā)明對這個基因進(jìn)行了突變并明確了該基因的功能。對于該侵染性載體功能基因組研究，還可以包括其它編碼區(qū)和非編碼區(qū)的功能研究。
2.本發(fā)明的植物基因沉默載體是一種用正向遺傳學(xué)研究植物功能基因組非常優(yōu)良的工具。傳統(tǒng)的反向遺傳學(xué)的方法篩選突變體包括用T-DNA和轉(zhuǎn)座子插入的方法，這是一種發(fā)現(xiàn)新基因非常有效的方法，但是這些方法也存在一些缺點，傳統(tǒng)的正向遺傳學(xué)不能研究早期發(fā)育過程中突變就發(fā)生致死型的基因，另外也不能研究基因家族中的基因，而病毒誘導(dǎo)的基因沉默是在成株以后進(jìn)行沉默的，所以可以對一些致死型的基因進(jìn)行研究，另外對多基因家族，基因沉默不僅僅攻擊準(zhǔn)確的同源基因，并且也攻擊有10-20％浮動的同源基因，因此也可以對基因家族中的基因進(jìn)行研究。相對于通過轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座子插入這種正向遺傳學(xué)的方法來研究來說，本發(fā)明的工作量小，構(gòu)建簡易，周期性短，可以進(jìn)行大規(guī)模沉默來研究植物基因組的功能。在有些病毒載體中，病毒本身在寄主上造成嚴(yán)重的致病性，從而在表型上干擾沉默以后的癥狀，本發(fā)明中的植物基因沉默載體對致病性起關(guān)鍵作用的基因進(jìn)行了缺失，但仍能夠進(jìn)行復(fù)制轉(zhuǎn)錄，而DNA-A侵染植物沒有任何癥狀，植物內(nèi)源基因片段插入DNAβ后誘導(dǎo)的表型完全是植物基因被沉默以后的表型，病毒侵染對植物的影響在最大限度上得以縮小。
3.構(gòu)建了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的植物DNA病毒表達(dá)載體，可以把外源蛋白基因插入病毒載體，病毒感染植物后，外源基因就可以隨著病毒的繁殖擴(kuò)增而得到表達(dá)。利用轉(zhuǎn)基因的方法表達(dá)的外源基因的量都比較低，一般在可溶性蛋白的1％以下，而且基因轉(zhuǎn)化和植株再生過程費力費時，這在很大程度上影響了利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白的全面產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。病毒的表達(dá)系統(tǒng)復(fù)制量大，構(gòu)建簡易，工作量小，周期性短，本發(fā)明的植物病毒載體一般在15-30dpi就可以在植物體內(nèi)大量擴(kuò)增繁殖。
具體實施例方式
實例1 新型DNA分子的克隆和測序收集中國番茄黃化曲葉病毒樣品，抽提植物總DNA，以此為模板，以beta01(5’-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’，含KpnI位點)與heta02(5’-GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3’，含KpnI位點)為引物，對DNAβ全長基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)QIAquick Gel Extraction Kit純化后克隆至pGEM-T Easy Vector，獲得一個全長copy的克隆pGEM-T-β(New)并進(jìn)行序列測定，獲得DNA-β的全長基因組序列1.3kp，序列如No.1-12。中國番茄黃化曲葉病毒DNAβ之間的同源性在72％-99％，與已報道的其他DNAβ(AYVVβ，CLCuMVβ，CLCuRVβ and BYVMVβ)的同源性只有35-43％。DNAβ大小是DNA-A的一半，與所有的雙生病毒DNA-A之間除了高度保守的復(fù)制起始序列TAATATT/AC之外沒有序列同源性。雖然DNAβ之間同源性非常低，但所有的DNAβ都有一段高度保守的將近115個堿基的序列，該區(qū)域可能包含了復(fù)制酶結(jié)合位點，但沒有TATA box區(qū)，因此可能區(qū)別于DNA-A和DNA-B的雙向轉(zhuǎn)錄啟動子的另外一種獨特的啟動區(qū)域。所有的DNAβ在±760-±1000堿基處都有一段A富含區(qū)(＞56％)。DNAβ具有多個開放閱讀框，但是不同DNAβ之間的ORF在大小和位置上都有很大的變化，只有其中的一個ORF(C1)具有長度、大小以及位置的保守性。實施例2 侵染性載體的構(gòu)建以及病毒功能基因組研究方法的建立1.侵染性載體的構(gòu)建對克隆的中國番茄黃化曲葉病毒全長DNA-A構(gòu)建1.7個copy的基因組插入植物表達(dá)載體pBinPLUS，然后通過三親交配的方法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，同樣方法將DNAβ構(gòu)建2個copy的基因組插入植物表達(dá)載體pBinPLUS，并導(dǎo)入EHA105。重組后的農(nóng)桿菌接種本氏煙(N.benthamiana)，接種時分單DNA-A接種，單DNAβ接種和DNA-A+DNAβ接種。單DNA-A接種能夠系統(tǒng)侵染，但是并不引發(fā)在田間觀察到典型的曲葉癥狀；單DNAβ接種的植株沒有出現(xiàn)癥狀，上部葉片也沒有檢測到病毒DNAβ，說明DNAβ并不能獨立復(fù)制。當(dāng)DNA-A與DNAβ兩個組分一起接種的時候，10dpi后，上部葉片開始出現(xiàn)下卷，25-35dpi癥狀發(fā)展到頂峰，并出現(xiàn)曲莖，葉片皺縮，植株矮化，到后期出現(xiàn)耳突；用SouthernBlot檢測表明有DNAβ的存在，DNA-A基因組的量顯著比單DNA-A接種的DNA量高，因此DNA-A和DNAβ是相互依賴的，DNAβ必須依賴DNA-A復(fù)制，而DNAβ則能大大加強DNA-A的基因組DNA含量，并且DNAβ對于病毒對寄主的致病性是必需的。
2.病毒功能基因組研究方法的建立a.針對病毒的目的基因設(shè)計引物，通過Overlap-PCR及酶切的方法對病毒的目的基因進(jìn)行重組、突變、插入或者缺失，把突變的基因組插入pGEM-T Vector，b.在pGEM-T Vector再插入另外一個全長的突變的病毒基因組，c.把構(gòu)建的兩個正向重復(fù)的突變基因組插入植物表達(dá)載體pBINplus上，d.把c中構(gòu)建的重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，e.通過農(nóng)桿菌注射法把突變型的侵染性克隆接種到植物體內(nèi)，f.觀察癥狀及病毒分子水平的檢測。
DNA-A必須要在DNAβ存在的時候才能致病，而DNAβ只有一個長度和位置上都保守的基因C1，因此對C1基因進(jìn)行突變將能夠明確C1的功能。本發(fā)明在引物上引入突變堿基的方法對Y10 DNAβ的C1基因進(jìn)行了突變，使這個基因不能得以轉(zhuǎn)錄。當(dāng)這個突變體與DNA-A一起接種本氏煙后，不表現(xiàn)典型的曲葉癥狀，進(jìn)一步對植物葉片的DNA進(jìn)行Southern Blot檢測發(fā)現(xiàn)，在沒有癥狀的植株中檢測到了DNAβ，說明C1基因突變以后不再引發(fā)致病性，但是卻仍然能夠復(fù)制，表明該基因在致病中確實發(fā)揮了重要的作用。實施例3 病毒誘導(dǎo)的基因沉默載體的構(gòu)建以及方法的建立DNAβ中的C1基因突變以后DNAβ依然能夠復(fù)制，因此如果用外源片段替換C1基因也能夠復(fù)制，并且外源基因可以利用C1基因的啟動子和終止子來得以轉(zhuǎn)錄，而病毒誘導(dǎo)的基因沉默只要具有少量的dsRNA就可以誘發(fā)植物內(nèi)源基因的沉默。本發(fā)明把植物的八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS)基因cDNA插入DNAβ上，這個基因是植物類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶，如果這個酶的基因被誘導(dǎo)沉默而導(dǎo)致合成途徑受阻，則使植物葉片產(chǎn)生白色效應(yīng)。其方法包括a.對植物進(jìn)行RNA抽提，用植物PDS基因的引物進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，繼而進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得PDS基因的409bp cDNA片段；b.對DNAβ的C1基因進(jìn)行缺失，并換至以多克隆位點設(shè)計引物加入多克隆位點GGATCCAAGCTTGATATCCTGCAGCTCGAGTCTAGA，酶切位點依次為BamHI，HindIII，EcoRV PstI，XhoI，XbaI，用New Bet01與Beta02拉出其全長插入到pGEM-T Easy Vector上；c.把PDS基因的cDNA片段插入DNAβ的多克隆位點；d.在pGEM-T Easy Vector構(gòu)建兩個正向重復(fù)帶有PDS cDNA的DNAβ；e.利用pGEM-T Easy Vector兩邊的EcoRI把兩個正向重復(fù)的帶有PDS的DNAβ插入植物表達(dá)載體pBinPLUS上；f.把構(gòu)建好的載體通過三親交配的方法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105；e.重組農(nóng)桿菌與含有DNA-A的農(nóng)桿菌一起接種寄主植物；f.觀察植物表型。
接種后25-30天，接種植株上部葉片沿著葉脈開始翻白，逐漸擴(kuò)展，以至上部葉片沿葉脈全部發(fā)生白化現(xiàn)象，植株發(fā)生沉默以后，可以持久很長一段時間。接種的病毒由于缺失了C1基因而在植株上并不表現(xiàn)任何癥狀，寄主植物上表現(xiàn)出來的表型就是植物被誘導(dǎo)沉默以后的表型。實施例4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及體系的建立用外源蛋白代替DNAβ的C1基因，在病毒的復(fù)制過程中，借助C1基因的啟動子終止子來啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)?；陔p生病毒的載體需要兩個正向重復(fù)的基因組序列，因此引進(jìn)多克隆位點后仍需進(jìn)行兩次的外源片段的插入，因此在上面的載體構(gòu)建方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行了改造，更加利于外源蛋白的表達(dá)。
a.Y10-beta Substition Sal/F(5’-GTCGACATACATATATATACGTATTC-3’，含SalI位點)和Y10-beta Substition Xba/R(TCTAGAGTTTATTTGTTGTGGATGATACATG，含XbaI位點)準(zhǔn)確缺失C1的DNAβ基因組，PCR產(chǎn)物插入pGEM-T Easy Vector，b.用另外一對含有特異性引物Y10-beta SubstitionXbaSmaBam/F(5’TCTAGACCCGGGGGATCCATACATATATATACGTATTCAAATATATG，含XbaI，SmaI，BamHI)和Y10-beta Substition Xba/R拉出的缺失C1的DNAβ，并通過XbaI位點與a中構(gòu)建的載體進(jìn)行拼接，拼接以后剛好得到兩個正向重復(fù)β，缺失一個C1基因，并在C1的位置上引入了多克隆位點XbaI，SmaI，BamHI.SmaI這個酶切位點可以用于PCR產(chǎn)物的克隆，c.利用SalI和EcoRI位點把b中構(gòu)建的正向重復(fù)序列插入植物表達(dá)載體pBINplus上，d.在植物表達(dá)載體上就可以直接插入外源基因進(jìn)行表達(dá)。
SEQ ID NO.1-12的說明SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度1338堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(ii)分子型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO.1accggtggcg agcggggtct ttgccgttga ggtgggtccc acatgaaaaa agaaagagaa 60aatgggcctt ggtgatgcaa ttgggccttt aatttatggg ctttgagtat tggactttgt 120atattgggcc tacttaaaat aattcaaatg ggcaggaata acaggaattt tatttaattc 180atatatttga atacgtataa atacgtattc atacatctga attcataaat acatcatatt 240catctcctac atctatatct tcaactggtg cttcttccat catgattata tctataactt 300gtaccatatc ttcttgcctg aactctccaa ttgtagcttc tttgtacatt attttgaggc 360agtttttgat gccttcttct aggctgttga agtcgaatgg tgggattatc ccatggtgtc 420tgtatgggat catgaatttc ttcttggcta atgctggtga ctttgttgat gctagttcaa 480tctgtacaag gattgaagtg tcttcttgca acttcacatc tatgatgaac tccataccct 540tcatgttgtt gtatttgatt gtcatgttta cttgttgtgg atcattcatg agactggtct 600tcttaaataa tgctaggatt gatgagttat ggactggaat gatttaacgt ggttcattgt 660tgttcatatg cttagtagtg gagatatgta tgattgatag tgacaatact attaatcata 720agtactttta gtaatgacat aataatccaa attattatgg ttaattataa ttgaaatagg 780aatagaaaag gaaataaaaa gaaaaggaaa ataaaaagaa aaggaaataa gataataaac 840ataaacccaa acaaatattt attaagaaag aaaagggagc gcagcgaaaa aaaaaatcaa 900atttgaaaca accaaaatca aataaacaca aaaagagaaa acaaaagaat aaaataataa 960aattaaagca aaataaaata aaaacagtaa aaacgtcgtc acgattttac tgcgcggtaa1020taaaaaaata ctttcactta ggaggttata aatcgggaca ccaatggtaa atgggacacc1080gatacatcag tgccccctat tagtgtctaa tgtgcaattt ccaaaaatac ccttatccct1140gtgtctgtta ggcgcgtggg agtgcgctga aaaagttaat tttctctctc ctaaactcgt1200cggagaagac gattgaggca cttcccggca tcaatttgcg acacgcgcgg cggtgtgtac1260ccctgggagg gtagaaacca ctacgctacg cagcagcctt agctacgccg gagcttagct1320cgccaccgtt ctaatatt 1338SEQ ID NO.2的信息(iv)序列特征(A)長度1340堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(v)分子型基因組DNA序列描述SEQ ID NO.2accggtggcg agcggggtct ttgccgttga ggtgggtccc acattaaaaa agaaagagaa 60aatgggcctt ggtgatgcaa ttgggccttt aatttatggg ctttgagtat tggactttgt 120atattgggcc tacttaaaat aattcaaatg ggcaggaata acaggaattt tatttaattc 180atatatttga atacgtataa atacgtattc atacatctga attcataaat acatcatatt 240catctcctac atctatatct tcaactggtg cttcttccat catgattata tctataactt 300gtaccatatc ttcttgcctg aattctccaa ttgtagcttc tttgtacatt attttgaggc 360agtttttgat gccttcttct aggctgttga agtcgaatgg tgggattatc ccatggtgtc 420tgtatgggat catgaatttc ttcttggcta atgctggtga ctttgttgat gctagttcaa 480tctggacaag gattgaagtg tcttcttgca acttcacatc tatgatgaac tccataccct 540tcatgttgtt gtatttgatt gtcatgttta cttgttgtgg atcattcatg agactggtct 600tcttaaataa tgctaggatt gatgagttat ggactggaat gatttacgtg gttcattgtt 660gttcatatgc ttagtagtgg agatatgtat gattgatagt gacaatacta ttaatcataa 720gtacttttag taatgacata ataatccaaa ttattatggt taattataat tgaaatagga 780atagaaaagg aaataaaaag aaaaggaaaa taaaaagaaa aggaaataag ataataaaca 840taaacccaaa caaatattta ttaagaaaga aaagggagcg cagcgaaaaa aaaaaactca 900aatttgaaac aagcaaaatc aaataaacac aaaaagagaa aacaaaaaaa taaaataata 960aaattaaagc aaaataaaat aaaaacagta aaaacgtcgt cacgatttta ctgcgcggta1020ataaaaaaat actttcactt aggaggttat aaatcgggac accaatggta aatgggacac1080cgatacatca gtgcccccta ttagtgtcta atgtgcaatt tccaaaaaat acccttatcc1140ctgtgtctgt taggcgcgtg ggagtgcgct gaaaaagtta attttctctc tcctaaactc1200gtcggagaag acgattgagg cacttcccgg catcaatttg cgacacgcgc ggcggtgtgt1260acccctggga gggtaggtac cactacgcta cgcagcagcc ttagctacgc cggagcttag1320ctcgccaccg ttctaatatt1340SEQ ID NO.3的信息(vi)序列特征(A)長度1341堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(vii)分子型基因組DNA序列描述SEQ ID NO.3accggtggcg agcggggtct ttgccgttga ggtgggtccc acatgaaaaa agaaagagaa 60aatgggcctt ggtgatgcaa ttgggccttt aatttatggg ctttgagtat tggactttgt 120atattgggcc tacttaaaat aattcaaatg ggcaggaata acaggaattt tatttaattc 180atatatttga atacgtataa atacgtattc atacatctga attcataaat acatcatatt 240catctcctac atctatatct tcaactggtg cttcttcctt catgattata tctataactt 300gtaccatatc ttcttgcctg aattctccaa ttgtagcttc tttgtacatt attttgaggc 360agtttttgat gccttcttct aggctgttga agtcgaatgg tgggattatc ccatggtgtc 420tgtatgggat catgaatttc ttcttggcta atgctggtga ctttgttgat gctagttcaa 480tctgtacaag attggaagtg tcttcttgca acttcacatc tatgttgaac tccataccct 540tcatgttgtt gtatttgatt gtcatgttta cttgttgtgg atcattcatg agactggtct 600tcttaaataa tgctaggatt gatgagttat ggactggaat gatttacgtg gttcattgtt 660gttcatatgc ttagtagtgg agatatgtat gattgatagt gacaatacta ttaatcataa 720gtacttttag taatgacata ataatccaaa ttattatggt taattataat tgaaatagga 780atagaaaagg aaataaaaag aaaatgaaaa taaaaaagaa aaggaaataa gataataaac 840ataaacccaa acaaatattt attaagaaag aaaagggagc gcagcgaaaa aaaaaactca 900aatttgaaac aagcaaaatc aaataaacac aaaaagagaa aacaaaaaaa taaaataata 960aaattaaagc aaaataaaat aaaaacagta aaaacgtcgt cacgatttta ctgcgcggta1020ataaaaaaat actttcactt aggaggttat aaatcgggac accaatggta aatgggacac1080cgatacatca ggtgccccct attagtgtct aatgtgcaat ttccaaaaat acccttatcc1140ctgtgtctgt taggcgcgtg ggagtgcgct gaaaaaggtt aattttctct ctcctaaact1200cgtcggagaa gacgattgag gcacttcccg gcatcaattt gcgacacgcg cggcggtgtg1260tacccctggg agggtagaaa ccactacgct acgcagcagc cttagctacg ccggagctta1320gctcgccacc gttctaatat t 1341SEQ ID NO.4的信息(viii)序列特征(A)長度1338堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(ix)分子型基因組DNA序列描述SEQ ID NO.4accggtggcg agcggggtct ttgccgttga ggtgggtccc acatgaaaaa agaaagagat 60aatgggcctt ggtgatgcaa ttgggccttt aatttatggg ctttaagtat tggactttgt 120atattgggcc tacttaaaat aattcaaatg ggcaggaata acaggaattt tatttaattc 180atatatttga atacgtataa atacgtattc atacatctga attcataaat acatcatatt 240catctcctac atctatatct tcaactggtg cttcttccat catgattata tctataactt 300gtaccatatc ttcttgcctg aattctccaa ttgtagcttc tttgtacatt attttgaggc 360agtttttgat gccttcttct aggctgttga agtcgaatgg tgggattatc ccatggtgtc 420tgtatgggat catgaatttc ttcttggcta atgctggtga ctttgttgat gctagttcaa 480tctgtacaag gattgaagtg tcttcttgca acttcacatc tatgatgaac tccataccct 540tcatgttgtt gtatttgatt gtcatgttta cttgttgtgg atcattcatg agactggtct 600tcttaaataa tgctaggatt gatgagttat ggactggaat gatttacgtg gttcattgtt 660gttcatatgc ttagtagtgg agatatgtat gattgatagt gacaatacta ttaatcataa 720gtacttttag taatgacata ataatccaaa ttattatggt taattataat tgaaatagta 780atagaaaagg aaataaaaag aaaaggaaaa taaaaagaaa aggaaataag ataataaaca 840taaacccaaa caaatattta ttaagaaaga aaagggagcg cagcgaaaaa aaaaactcaa 900atttgaaaca agcaaaatca aataaaagta aaaagagaaa acaaaaaaat aaaataataa 960aattaaagca aaataaaata aaaacagtaa aaacgtcgtt acgattttac tgcgcggtaa1020taaaaaaata ctttcactta ggaggttata aatcgggaca ccaatggtaa ttgggacacc1080gatacatcag tgccccctat tagtgtctaa tgtgcaattt ccaaaaatac ccttatccct1140gtgtctgtta ggcgcgtggg agtgcgctga aaaagttaat tttctctctc ctaaactcgt1200cggagaagac gattgaggca cttcccggca tcaatttgcg acacgcgcgg cggtgtgtac1260ccctgggagg gtagaaacca ctacgctacg cagcagcctt agctacgccg gagcttagct1320cgccaccgtt ctaatatt 1338SEQ ID NO.5的信息(x)序列特征(A)長度1336堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(xi)分子型基因組DNA序列描述SEQ ID NO.5accggtggcg agcggggtct ttgccgttga ggtgggtccc acataaagaa aagtaaggaa 60aatgggcttt ggtaatgcaa ttgggccgtt aagttatggg cctatattta atggactttg 120tatattgggc ctatttaaaa taaataaatt aggtcagaat aataagaatt ttatttaatt 180catatatttg aatacgtata tatatgtatt catacatctg aatttgtaaa tacatcatac 240tcatccccta catctatatc ttctactggg gcttcttcca tcatgattat gtctataact 300tgtaccatat cttcttgcct aaattcccca attgtagact ccttatacat tattttgagg 360cagtttttga tgccttcttc taaaatgttg aagtcgaatg gtgggataat cccatggtgt 420ctgtatggga tcatgaattt cttcttggct aatgctggtg actttgttga tgctagttca 480atccttacaa ggattgaagt gtcttcctgt aacttgacat caatgatgaa ctccaaaccc 540ttcatgttgt tgtatttgat agtcatgttt atttgttgtg gatgatacat gagtctgttc 600tgcttaaata atgctaggaa ttgtgatata tggactgtaa tgatttacgt gtttcattgt 660tgttcatatg cctactagtg gagatatgta tgtttgatag tgacatgaat attaaccatg 720attactttta ctaatgacat aataatctgg attattatgt gtaaaaagaa atggaaagag 780gagtagaaag aagaagtaaa tatagaataa aataaaaaag aaaaggaaat aagataataa 840acataaaccc aaacaaatat atattaagaa agaaaaggga gcgcagcgga aaaaaaaaaa 900ggtaaatttg aaacaaataa aatcaacaag atagtaaaat aaaaaaataa aaagaataaa 960atcaaaacaa ataaactaaa atagtaaaat cgtcatgatg attttactgc gcggtaataa1020aaaaactact ttcatctcag aggtaaataa ttgggacacc aatggtaatt gggacaccga1080tacatcggtt cccctattag tgccccaatg tgcaatttcc aaaaataccc ttatccctgt1140gtctgagggg cgcgtggtat tgcgctgaaa aagttaagtt tctctctcca aaaactcacc1200ggaactccga ttgagggcct tccggtcatc aatttgcgac acgcgcggca gtgtgtaccc1260ctgggagggt agaaaccact acgctacgca gcagccttag ctacgccgga gcttagctcg1320ccaccgttct aatatt1336SEQ ID NO.6的信息(xii)序列特征(A)長度1350堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(xiii)分子型基因組DNA序列描述SEQ ID NO.6accggtggcg agcggggttt tttgcccaaa tgtgggtccc acattggaga tgaaagagaa 60agatgggttt ggttatgcaa ttgggccttt aatggtgggc cgaattttat ggacctcgta 120ttttgggcct aatgagtata aataaattgg gctgtaatag aaaggaattt tatttaattt 180atatatttga atacgtataa ctacgtattc atacacttga attcaaaaat acatcgtatt 240catctcctac atctatatct tcaactggtg cctcttccat catgagaatg tctacgactt 300gtatcatgtc ttcttgcctg aattcccata tggtagactc tttgtacatt attttgaggc 360agtgtctgat gccttcctct aagctattga agtcaagtgg tggtattatc ccattgtgcc 420tgtatgggat catgaatttc ttcttggcta gtgctggtga ccttgttgat gcgagttcaa 480tctgtactag gattgaagtg tcttcctgca acttcacatc tatgatgaat tctaaaccct 540tgttgttgtt gtatttgata gtcattttaa ctggtgtgga ttatacgtga gtctggtcct 600gttaaataat gtttgggatt gttatatatg gacttaaacg atttacgtgg ttcattgttg 660ttcatgtaac tactagtgga gatatttatg attgatagtg acataactat caatcatgat 720tactttaaca aattacatga taatctagat tatcataggc aaatagaatt ggaaagaaga 780aaagaagaat agaaaagaag aagaaagaaa taaaaaataa aaaatgaaaa taaagaagat 840aataaggata aacagaaaca aatatatatt aagaaagaaa gggagcgcag cgattaaaaa 900aaaattgaaa aaatgaaaac aacaaaagaa taaaataaca aaacaaaaaa aactaaaaag 960aaacaagaaa aaaatataaa tcaaataaaa taaaacagta aaaacgtaga aacggtttta1020ctgcgcggta ataaaaaaag actttgacct aggaggttaa aaattgggac accaatggta1080aatgagaccc cgatacatcg gtgcctctat tgggtccttg aaagttaaat tcccaaaata1140cccttatccc tgtgtctgag aagcgcgtgg tattgcgctg aaaaagttaa gtttctctct1200ccaaaaactt gccggaacgc cgattgaggg tcttccggtc atcaatttgc gacacgcgcg1260gcggtgtgta cccctgggag ggtaggaaac cactacgcta cgcagcagcc ttagctacgc1320cggagcttag ctcgccaccg ttctaatatt 1350SEQ ID NO.7的信息(xiv)序列特征(A)長度1333堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(xv)分子型基因組DNA序列描述SEQ ID NO.7accggtggcg agcggggtct ttgccgtaga cagtgggtcc cacatagaag aatacaagaa 60attgggcctt gggtatgcaa tttgggccta gaattatggg cttcatttaa cggcctttga 120atattgggcc taattaaaat aattaagttg gctttaataa aatgaagttt attcaataca 180tatagttgaa tacgtatagc tacgtattca tacatctgaa tttataaata catcatattc 240atcacctaca tctatatcct caactggtgc ttcttccatc atgagaatat ctattacttg 300taccatgtct tcttgcctga attcccaaat tgtagattct ttgtacatta ttttgagaca 360gtgtttgatg ccttcttcta agctgttaaa gtcgagtggt ggtattatcc cattgtgcct 420gtatgggatc atgaatttct tcttggctaa tgctggtgat cttgttgatg ctagttcgat 480ctgtacaagg attgaagtgt cttcctgcaa tttcacatct atgatgaatt ccaaaccctt 540gttgttgttg tatgtgatag tcattttatt tggtgtggat tatacatgac tctggtcctg 600ttaaataatg ctgggaattg ttatacatgg acctgaatga tttacgtgga tcattattgt 660tcatgtaact tctagtggag atatttatga ttgatagtga cataactagc aagcatgagt 720attttaatta attacataat aatctagatt atcataggta aatagaagtg gaaagaataa 780tagaagagga aattaaacat attaagaaaa gaaaaaatga aaagaaaaaa gacaataaac 840ataaacacaa acaaatatat attaagaaaa aaagggagcg cagcgaaaaa aaaaaaaatt 900gatacaatca aaagcaacta agaaagaaaa aacaaaatag aaaaagaata aaaaaaagaa 960taaaacaaat aaaataaaac agtaaaaacg ttgaaacggt tttactgcgc ggtaataaaa1020aaatactttc atctggcaag ttaaaaattg ggacaccaat ggtaaatgag accccgatac1080atcggtgcct ctattaggtc cttgaaagtc aatttccaaa aataccctta tccctgtgtc1140taagaagcgc gtgttattgc gctgaaaaag ttaagtttct ctctccaaaa actcgccgga1200acggcgattg agggtcttcc ggttatcaat ttgcgacacg cgcggcggtg tgtacccctg1260ggagggtaga aaccactacg ctacgcagca gccttagcta cgccggagct tagctcgcca1320ccgttctaat att 1333SEQ ID NO.8的信息(xvi)序列特征(A)長度1340堿基(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(xvii)分子型基因組DNA序列描述SEQ ID NO.8accggtggcg tgcggggttt tttgccattt tgtgggtccc acatagaaga agaaagagaa 60agtgggcctt ggctatgcaa ttgggccttt aatttatggg cctggagtta ttggactttg 120tatattgggt ttaatcagaa taaataaatt gggttaaaat aatatgaaat ttatttaatg 180tatatgattg aatacgtatg catacgtatt catacacttg agtttataaa tacatcgtat 240tcatccccta catctatatc ctcaactggt ggttcttcca tcatgaggat gtctataact 300tgtaccatat cttcttgcct gaattcccca attgtagact ctttgtacat gattttgagg 360cagtgtttga tgccttcttc taagctgttg aagtctattg gtgggatgat cccctggtgc 420ctgtatggta tcatgaactt cttcttggct aatgctggtg actttgttga tgttagttca 480atctgaacaa ggaatgaagt gtcgtcctgc aacttcacat ctatgatgaa ctccatgccc 540ttcatgttat tgtatgtgat tgtcatgttt tatgctgtgg attatacatg agtcgtgcct 600tcttaaataa tgtctggaat tgtgatatat ggatttgaat caattacgtg gttcattgtt 660gttcatatat atattagtgg agataggtat gtttgatagt gacattacta tgtaacctga 720ttacttttag taatgacata ataatctaga ttattatggc taatagaggt gtaaagagta 780ttatgaaaga aaaatcaaag aataataaaa taaaaaagaa aaaaaataca ataaacataa 840acccaaacaa atatatatta agaaaaaaag ggagcgcagc ggaaaaaaaa aaaaggaaag 900aataattaaa tgtgaaacaa gcaaatgcaa caaaaaagaa agagaaaaga aatagataaa 960aaaatataaa acaaataaaa caacacggta aaatcgttcc aacggtttta ccgcgcggta1020ataaaaaaat actttaacct cataggtaat taattgggac accaaaggta aatgggacac1080cgatacactg gttcccctat taggtgctca atattcaatt tccaaaaata cccttatccc1140tgtgtctgag gggcgcgtgg aaatgcgctg aaaaagttaa gtttctctct ccaaaaactc1200accggacctc cgattgaggg ccttccggtc atcaatttgc gacacgcgcg gcggtgtgta1260cccctgggag ggtaggaaac cactacgcta cgcagcagcc ttagctacgc cggagcttag1320ctcgccaccg ttctaatatt1340SEQ ID NO.9的信息(xviii)序列特征(A)長度1334堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(xix)分子型基因組DNA序列描述SEQ ID NO.9accggtggcg agcggggatt ttccgaactt tgtgggcccc acatactgga agaaagagaa 60agtggactct ggttatgcaa ttgggccttt aatgaatggg ctttatctta atgtaaatgt 120ctattgggct tgagtaaaaa agaatagttg ggctcaaata aaatacaatt ttatttaatt 180atatatctga atacatactt tatacgtatt catacatctg aattcataaa tacatcgtat 240tcatcaccta catctatatc ttcaactggt gcctcttcca tcattagtat gtctataact 300tgtaccatat cttcttgcct gaattcccag atatttgagt gcttgtacat tattttgagg 360cagtgtttta tgccttcttc taggctgttg aagtcgattg gtgggatgag gccttggtgc 420ctgtaaggga tcatgaattt cttcttggct aatgctggtg accgtgttga gcttagttct 480acctgaacga ggaaggaagt gtctgcttcc aatttgacat ctattttgaa ttccagaccc 540ctcttgttgt tgtatttgat agtcattctt atttggtgtg gattgtacat gagtttgatc 600tgcttaaata atgcaagtaa ttttgataca tggacttgat tgatttacgt gtttcattgt 660tgttcatata ggttatagtg gaaatatttg tcattgatag tgacattact atcaatgtta 720agtactttta ctaatgacat tataatctag attataatga ataagtataa gtggaaagaa 780aaataggaaa taaaatttga agaaaataaa ataaaaaaag aaagaagaca attaacatga 840acacaaacaa acatatacta agaaaagaaa agggagcgca gcgaaaaaaa aaaacataga 900ttcaaaacca acagaatcaa ccaaacagaa aaaaagaaaa ataaaataaa caattaattc 960aaaaaaaaaa aaataatcag taaaaacata agcaggtttt tacggcgcgg taaaaaaata1020aattacattc acctcgtagg taaataatta ggaccccaaa ggtaaatgag accccgatac1080atcggggtct ctattaggtc ctcaataatt acattccaaa aataccctta tccctgtgtc1140tgaaaggcgc gtggtattgc tctgaaaaag ttaagtttct ctctccaaaa accccccgga1200gctccgattg agggccttcc ggtcgtcaat ttgcgacacg cgcggcggtg tgtacccctg1260ggagggtagg aaaccactac gctacgcagc agccttagct acgccggagc ttagctcgcc1320accgttataa tatt 1334SEQ ID NO.10的信息(xx)序列特征(A)長度1344堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(xxi)分子型基因組DNA序列描述SEQ ID NO.10accggtggcg agcggggatt ttccgaactt tgtgggcccc acatactgga agaaagagaa 60agtggactct ggttatgcta ttgggccttt aatgaatggg ctttatctta atgtaaattt 120atattgggct tgaataaaaa agaatagttg ggctcagata aaatacaatt ttatttaatt 180atatatctga atacgtataa gtacgtattc atacatctga attcataaat acatcgtatt 240catcacctac atctatatct tcaactggtg cctcttccat cattagtatg tctataactt 300gtaccatatc ttcttgcctg aattcccaaa tatttgagtg cttgtacatt attttgaggc 360agtgttttat gccttcttct aggctgttaa agtcgattgg tgggatgagc ccttggtgcc 420tgtaagggat catgaatttc ttcttggcta atgctggtga tcgtgttgag cttagttcga 480cctgaacaag gaaggaagtg tctgcttcca atttgacatc tattttaaat tccagacccc 540tcttgttgtt gtatttgata gtcattctta tttggtggtg gattgtacat gagtttgatc 600tgcttaaaaa atgcgagtaa tgttgataca tggactggat tgatttacgt gtttcattgt 660tgttcatata gggtatagtg gagatatttg tcattgatag tgacatgact atcaatgtta 720attactttta ctaatgacat tataatctag attataatga ataagtaaaa tttaaaagaa 780aaatagaaaa taaaataaaa aatgtgaaga aaataaaata aaaaaagaaa gaagacaata 840gacataaaca caaacaaaca tatactaaga aaagaaaagg gagcgcagcg gaaaaaaaaa 900acatagattc aaaagcaata gttgcaagaa aacagaaaaa aaagaaaaag acaaataaac 960aattaaaaca aaatgaataa aataaaacag taaaaacctg gccaggtttt taccgcgcgg1020ttaaaaaaat aaattacatt cacctcaaag gtaaataatt aggaccccaa aggtaaatga1080ggcaccgata tatcggtgcc tctatcaggt cctcaataat tacattccaa aaataccctt1140atccctgtgt ctgaaaggcg cgtggtattg cgctgaaaaa gttaagtttc tctctccaaa1200aaccccccgg agctccgatt gagggccttc cggtcatcaa tttgcgacac gcgcggcggt1260gtgtacccct gggagggtag aaaccactac gctacgcagc agccttagct acgccggagc1320ttagctcgcc accgttataa tatt 1344SEQ ID NO.11的信息(xxii)序列特征(A)長度1341堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)洵h(huán)形(xxiii)分子型基因組DNA序列描述SEQ ID NO.11accggtggcg agcggggttt ttccgaactt tgtgggaccc acatactgga agaaagagaa 60agtggactct ggttatgcaa ttgggccttt aataaatggg ctttatctta atggaaatgt 120gtattgggct tgaaaaaaaa aaaatagttg gactcaaata aaatacaatt ttatttaatt 180atatatctga atacgtataa gtacgtattc atacatctga attcataaat acatcatatt 240catcacctac atctatatct tcaactggtg cctcttccat cattagtatg tctataacct 300gtaccatatc ttcttgcctg aattcccaaa tatttgagtg tttgtacatt atcttgaggc 360attgttttat gccttcttct aggctgttga agtcgattgg tgggatgagc ccttggtgcc 420cgtaagggat catgaatttc ttcttggcta gtgctggtga ccgtgttgag cttagttcaa 480cctgaacaag gaaggaagta tctgcttcca atttgacatc tattttgaat tccagacccc 540tcttgttgtt gtatttgata gtcattctta tttggtgtgg attgtacatg agtttgatct 600gcttaaataa tgcaagtagt tttgatacat ggacttgatt gatttacgtg tttcattgtt 660gttcatatag gttatagtgg agatatttgt cattgatagt gacattacta tcaatgttaa 720gtacttttac taatgacata ataatctaga ttattatgaa taagtataag tgaaaggaaa 780aatagaaaaa aatataaaat ttgaagaaaa taaaataaaa aaagaaagaa gacaataaac 840ataaacacaa acaaacatat actaagaaaa gaaaagggag 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aattcccaaa tatttgagtg cttgtacatt attttgaggc 360agtgttttat gccttcttct aggctgttga agtcgattgg tgggatgagc ccttggtgcc 420tgtaagggat catgaatttc ttcttggcta atgctggtga ccgtgttgag cttatttcga 480cctgaacaag gaaggaagtg tctgcttcca acttgacatc tattttgaat tccagacccc 540ttttgttgtt gtatttgata gtcattctta tttggtgtgg attgtacatg agtttgatct 600gcttaaataa tgcaagtaat tttgatacat ggacttgatt gatttacgtg tttcattgtt 660gttcatatag gttatagtgg agatatttgt cattgatagt gacattacta tcaatgttaa 720gtacttttac taatgacata ataatctaga ttattatgaa taagtataat gggaaaaaga 780atagaaaaaa aataaaaaac ttaagataag aaaataaaaa aggaaagaag ataatacatg 840taagcacaaa caaaaatata tttagaaaag aaaaagggag cgcagcgaaa aaaaaaaaat 900aaattcaaaa ccaacagagt caacaaaaca taaaaaataa aaaaataaaa ataaagaatt 960aaagcaaaac aaattaaata aaatagtaaa aacatgagca ggtttttacg gcgttgttaa1020aaaatagtta cattaaccgc ataggtaaat aatcgggaca ccaaaggtaa atgggacacc1080gatacaattg gtgtacctat tagtgtctca aaattgaatt tccaaaaata cccttatccc1140tgtgtctgaa aggcgggtgg tattgcgctg aaaaagttaa gtttttctct ccaaaaactc1200cccggagctc cgattaaggg ccttccggtc atcaatttgc gacacgcgcg gcggtgtgta1260cccctgggag ggtagaaacc actacgctac gcagcagcct tagctacgcc ggagcttagc1320tcgccaccgt tataatatt 1339
權(quán)利要求
1.一種新型植物DNA病毒載體，其特征在于，它包括中國番茄黃化曲葉病毒DNA-A和DNAβ的侵染性載體及由它衍生的植物基因沉默載體和病毒表達(dá)載體。
2.一種新型的構(gòu)建植物DNA病毒載體的衛(wèi)星DNA分子，其特征在于，它包括一種粉虱傳雙生病毒中國番茄黃化曲葉病毒DNAβ分子，所述的核苷酸序列與Seq ID No.1-12至少有72％的同源性。
3.一種新型植物DNA病毒載體的用途，其特征在于，它用于確定病毒基因組功能、植物基因組功能和表達(dá)外源蛋白；
4.如權(quán)利要求3所述一種新型植物DNA病毒載體的用途，其特征在于，其確定病毒基因組功能、植物基因組功能和表達(dá)外源蛋白的方法包括a.將兩個正向重復(fù)的突變或插入植物cDNA或插入外源蛋白的DNAβ構(gòu)建至植物表達(dá)載體；b.把a中構(gòu)建的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌宿主；c.通過注射將b中的農(nóng)桿菌接種寄主植物；d.觀察表型及分子水平的檢測。
5.如權(quán)利要求1所述的一種新型植物DNA病毒載體，其特征在于，它為中國番茄黃化曲葉病毒DNA-A和DNAβ的侵染性載體，該侵染性載體接種寄主植物，DNA-A能夠系統(tǒng)侵染，但只有與DNAβ一起接種時引發(fā)典型的癥狀。
6.如權(quán)利要求3或4所述的一種新型植物DNA病毒載體的用途，其特征在于利用植物DNA侵染性載體明確病毒基因組功能，在引物上引入突變堿基，通過Overlap-PCR對病毒基因組的目的基因?qū)崿F(xiàn)突變。
7.如權(quán)利要求1所述的一種新型植物DNA病毒載體，其特征是，它是侵染性載體衍生的植物基因沉默載體，該載體誘導(dǎo)植物基因發(fā)生沉默從而研究植物基因的功能。
8.如權(quán)利要求3所述的一種新型植物DNA病毒載體的用途，其特征在于，利用植物基因沉默載體明確植物基因組功能，其方法是對DNAβ的一個開放閱讀框進(jìn)行缺失并換之以多克隆位點，在其多克隆位點上插入植物內(nèi)源基因的cDNA片段進(jìn)行誘導(dǎo)沉默。
9.如權(quán)利要求1所述的一種新型植物DNA病毒載體，其特征是，它是侵染性載體衍生的DNA病毒表達(dá)載體，其特征是該表達(dá)載體能夠表達(dá)外源基因。
10.如權(quán)利要求3所述所述的一種新型植物DNA病毒載體的用途，其特征在于，利用病毒載體表達(dá)外源蛋白，其方法是構(gòu)建兩個缺失一個開放閱讀框的DNAβ并只有一組多克隆位點，外源蛋白直接插入多克隆位點進(jìn)行表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型植物DNA病毒載體及其用途。本發(fā)明提供的植物DNA病毒載體包括中國番茄黃化曲葉病毒DNA－A和DNAβ的侵染性載體及由它衍生的植物基因沉默載體和病毒表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了一種新型的構(gòu)建植物DNA病毒載體的衛(wèi)星DNA分子，它與Seq ID No.1－12至少有72％的同源性。本發(fā)明還提供一種利用植物DNA病毒載體進(jìn)行病毒功能基因組研究、植物功能基因組研究和外源蛋白表達(dá)的用途及其方法。本發(fā)明為研究病毒基因組結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及病毒與植物間互作提供了一個至關(guān)重要的平臺，為研究植物功能基因組提供了一種優(yōu)良的工具，并為利用植物作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白建立了技術(shù)平臺。
文檔編號C12N15/83GK1425772SQ0215987
公開日2003年6月25日 申請日期2002年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月24日
發(fā)明者周雪平, 陶小榮, 謝艷, 李正和, 李桂新 申請人:浙江大學(xué)