專利名稱：用于檢測結(jié)核分枝桿菌的寡核苷酸和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在臨床檢查中檢測結(jié)核分枝桿菌的寡核苷酸和方法。本發(fā)明提供的寡核苷酸可以作為遺傳診斷的試劑(此診斷包括例如切割、擴(kuò)增和檢測RNA或DNA等步驟)，也可以作為抑制RNA反轉(zhuǎn)錄或翻譯的試劑。尤其是，本發(fā)明提供的寡核苷酸序列可以作為定量測定和檢測結(jié)核分枝桿菌的試劑或類似物。
近來，商業(yè)上可獲得檢測結(jié)核桿菌的遺傳檢測試劑盒。其中包括實(shí)施DNA擴(kuò)增的試劑盒，它通過PCR擴(kuò)增編碼16S rRNA的基因組DNA，之后用特異的DNA探針進(jìn)行雜交來檢測；和通過EIA實(shí)施檢測的試劑盒，其中用連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR方法)擴(kuò)增編碼蛋白抗原b(此后，稱作‘pab’)的基因，此蛋白是一個(gè)序列已知的結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白(Inf.and Immun.第57卷，第2481-2488頁，1989)。詳細(xì)內(nèi)容見USP No.5,631,130。盡管這些檢測是自動或半自動的，但由于它們的檢測時(shí)間需要大約4到6小時(shí)，在需要緊急處理的情況下這些方法是不合適的。另外，由于DNA擴(kuò)增方法不能區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌，所以這在一定情況下，例如，當(dāng)進(jìn)行抗生素的效果觀察時(shí)是不合適的。
反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)是擴(kuò)增特異RNA序列的方法。此方法通過由如下步驟組成的程序擴(kuò)增特異DNA序列在反轉(zhuǎn)錄步驟中從靶RNA合成cDNA，然后在有與所述cDNA特異序列的兩端互補(bǔ)和同源的一對引物(反義引物可與反轉(zhuǎn)錄步驟中使用的引物相同)和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶存在的條件下，通過重復(fù)包括熱變性、引物退火和延伸反應(yīng)的循環(huán)來擴(kuò)增所述cDNA特異序列。然而，RT-PCR方法需要兩步操作(反轉(zhuǎn)錄步驟和PCR步驟)和涉及快速升溫和降溫的操作，這就阻止了它的自動化。
因此，當(dāng)需要快速檢測結(jié)核病菌或快速驗(yàn)證治療方案時(shí)，目前使用的檢查方法均不能滿足臨床實(shí)踐的需要。因此，希望得到只檢測活細(xì)菌的更快速和高度靈敏的檢測方法。另外，為了簡化檢查，還希望得到能自動進(jìn)行檢測的檢查儀器。
通過使用擴(kuò)增目的核酸的程序，可以提供高度靈敏的檢測方法。作為擴(kuò)增特定RNA序列的方法，NASBA和3SR方法是已知的，使用這些方法在反轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶的協(xié)同作用下可擴(kuò)增特異RNA序列。在這些方法中，進(jìn)行如下步驟用目的RNA作為模板，用含有啟動子序列的引物、反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H合成含有啟動子序列的雙鏈DNA；將此雙鏈DNA用作模板，使用RNA聚合酶合成含有目的RNA特異序列的RNA，之后，這個(gè)RNA在鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中為合成含有啟動子序列的雙鏈DNA提供了模板。
NASBA、3SR和類似的方法允許在恒定的溫度下實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，故被認(rèn)為適合于自動化。
然而，因?yàn)檫@些擴(kuò)增方法涉及相對低的溫度反應(yīng)(例如，41℃)，故目的RNA可以形成抑制引物結(jié)合的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)，從而可能降低反應(yīng)效能。因此，在擴(kuò)增反應(yīng)之前，需要對目的RNA熱變性以破壞其分子內(nèi)結(jié)構(gòu)來提高引物結(jié)合效能。另外，當(dāng)在低溫下進(jìn)行RNA檢測時(shí)，也期望有能與已經(jīng)形成以上提到的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)合的寡核苷酸。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供能切割和擴(kuò)增編碼結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白pab的pab基因或者來自此基因的RNA，并可以用于所述基因或RNA的高靈敏檢測和鑒定的寡核苷酸。本發(fā)明還提供可以用作抑制RNA反轉(zhuǎn)錄或翻譯的試劑的寡核苷酸。另外，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供優(yōu)選的寡核苷酸組合，所述組合能在相對低的溫度下(例如，41℃)特異地?cái)U(kuò)增來自所述pab基因的RNA，并且可用于進(jìn)行所述RNA的高度靈敏檢測和鑒定。
已經(jīng)成功完成的、用于實(shí)現(xiàn)以上提到的第一個(gè)目的的本發(fā)明第二個(gè)實(shí)施方案涉及按照所述第一個(gè)實(shí)施方案的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是用于DNA延伸反應(yīng)的寡核苷酸引物。
已經(jīng)成功完成的、用于實(shí)現(xiàn)以上提到的第一個(gè)目的的本發(fā)明第三個(gè)實(shí)施方案涉及按照所述第一個(gè)實(shí)施方案的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是其中一部分被可檢測標(biāo)記物修飾或標(biāo)記的寡核苷酸探針。
已經(jīng)成功完成的、用于實(shí)現(xiàn)以上提到的第一個(gè)目的的本發(fā)明第四個(gè)實(shí)施方案涉及按照所述第一個(gè)實(shí)施方案的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是其部分堿基被修飾但沒有損失作為寡核苷酸探針的功能的合成寡核苷酸。
已經(jīng)成功完成的、用于實(shí)現(xiàn)以上提到的第二個(gè)目的的本發(fā)明第一個(gè)實(shí)施方案涉及RNA擴(kuò)增方法，包括以下步驟以來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA特異序列為模板，用RNA依賴的DNA聚合酶、與所述特異序列有同源序列的第一引物、與所述特異序列有互補(bǔ)序列的第二引物來形成cDNA，其中所述第一或第二引物的5’區(qū)域添加了含有RNA聚合酶啟動子序列的序列，由此產(chǎn)生RNA-DNA雙鏈；用核糖核酸酶H消化所述RNA-DNA雙鏈中的RNA以形成單鏈DNA；然后以所述單鏈DNA為模板，用DNA依賴的DNA聚合酶形成含有啟動子序列的雙鏈DNA，其中所述啟動子序列可允許所述特異序列或者含有與所述特異序列互補(bǔ)的序列的RNA實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄，在RNA聚合酶存在的條件下所述雙鏈DNA產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，接著所述RNA依賴的DNA聚合酶以所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板合成cDNA；所述方法的特征在于，將含有SEQ.ID.No.28到No.33中任一序列的至少10個(gè)連續(xù)堿基的寡核苷酸用作第一引物，將含有SEQ.ID.No.34到No.41所列序列(具有與待擴(kuò)增的結(jié)核分枝桿菌pab基因的一部分RNA序列互補(bǔ)的序列)中任一序列的至少10個(gè)連續(xù)堿基的寡核苷酸用作第二引物，其中第一或第二引物在其5’區(qū)域含有RNA聚合酶啟動子序列。
已經(jīng)成功完成的、用于實(shí)現(xiàn)以上提到的第二個(gè)目的的本發(fā)明第二個(gè)實(shí)施方案涉及按照所述第一個(gè)實(shí)施方案的方法，其中在有能與所述擴(kuò)增產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特異結(jié)合并標(biāo)有嵌入熒光染料的寡核苷酸存在的情況下，實(shí)施所述擴(kuò)增方法，并測量反應(yīng)溶液中熒光性質(zhì)的變化，條件是標(biāo)記的寡核苷酸有與第一或第二引物所不同的序列。
已經(jīng)成功完成的、用于實(shí)現(xiàn)以上提到的第二個(gè)目的的本發(fā)明第三個(gè)實(shí)施方案涉及按照所述第二個(gè)實(shí)施方案的方法，其特征在于，所述寡核苷酸被設(shè)計(jì)為可以和所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的至少一部分序列互補(bǔ)地結(jié)合，而且與復(fù)合物沒有形成時(shí)相比，熒光性質(zhì)發(fā)生改變。
已經(jīng)成功完成的、用于實(shí)現(xiàn)以上提到的第二個(gè)目的的本發(fā)明第四個(gè)實(shí)施方案涉及按照所述第三個(gè)實(shí)施方案的方法，其特征在于，所述寡核苷酸含有SEQ.ID.No.42到No.44中任一序列的至少10個(gè)連續(xù)堿基，或者其互補(bǔ)序列。
圖2是來自實(shí)施例2中RNA擴(kuò)增反應(yīng)的電泳圖，所述反應(yīng)使用了寡核苷酸組合(a)到(m)(顯示于表2)。在這個(gè)圖中，P是使用初始RNA數(shù)量為103個(gè)拷貝/試驗(yàn)的RNA樣品得到的結(jié)果，而N是陰性對照試驗(yàn)的結(jié)果(用稀釋劑代替RNA樣品)。Φx174/HaeIII消化物(標(biāo)準(zhǔn)參照物4)用作分子量標(biāo)記(泳道M)。
圖3顯示來自實(shí)施例3的結(jié)果，其中使用的初始RNA數(shù)量為101個(gè)拷貝/試驗(yàn)到105個(gè)拷貝/試驗(yàn)。圖(A)是熒光分布圖，顯示了隨著RNA在反應(yīng)時(shí)程中的形成增加，熒光增加比率也增加。圖(B)是從熒光增長時(shí)間與初始RNA數(shù)量對數(shù)值之間的關(guān)系得到的校準(zhǔn)曲線。它顯示了初始拷貝為102個(gè)拷貝/試驗(yàn)的RNA可以通過大約15分鐘的反應(yīng)檢測到，并顯示了增長時(shí)間與初始RNA數(shù)量間存在相關(guān)性。
本發(fā)明的寡核苷酸是在上述RNA擴(kuò)增中能以特異方式與目的RNA的無分子內(nèi)結(jié)構(gòu)區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸，并且它們能夠在沒有實(shí)施上述熱變性的情況下與目的RNA特異地結(jié)合。由此，本發(fā)明提供在相對低的恒定溫度下(35-50℃，優(yōu)選41℃)能與結(jié)核分枝桿菌RNA的無分子內(nèi)結(jié)構(gòu)區(qū)域結(jié)合，并且可用于結(jié)核分枝桿菌RNA的特異切割、擴(kuò)增或檢測等的寡核苷酸。更特別地，本發(fā)明涉及在特異位點(diǎn)切割所述目的RNA的寡核苷酸探針、通過PCR擴(kuò)增所述目的DNA的寡核苷酸引物、通過NASBA或類似方法擴(kuò)增所述目的RNA的寡核苷酸引物和在不使用這些擴(kuò)增的情況下或在進(jìn)行擴(kuò)增之后作為檢測目的核酸的寡核苷酸探針來完成快速和高度靈敏檢測的寡核苷酸。
SEQ.ID.No.1到No.20顯示了本發(fā)明的寡核苷酸，它們可用于對來自結(jié)核分枝桿菌的RNA進(jìn)行切割、擴(kuò)增、檢測或類似的操作。關(guān)于這一點(diǎn)，來自結(jié)核分枝桿菌的RNA也包括使用這個(gè)基因作為模板產(chǎn)生的RNA。盡管本發(fā)明的每一個(gè)寡核苷酸都可以包括SEQ.ID.No.1到No.20之任一個(gè)的全部堿基序列，但由于約10個(gè)堿基就足于實(shí)現(xiàn)和來自結(jié)核分枝桿菌的RNA的特異結(jié)合，所以這些寡核苷酸可以是含有上述序列的至少10個(gè)連續(xù)堿基的寡核苷酸。
本發(fā)明的寡核苷酸可以用作，例如，切割RNA的探針。對于在特定位點(diǎn)切割目的RNA，這可以通過僅僅用本發(fā)明的寡核苷酸和單鏈目的RNA雜交，然后用只消化RNA-DNA雙鏈中的RNA部分的酶進(jìn)行處理來實(shí)現(xiàn)。至于這個(gè)酶，通?？梢允褂靡阎哂泻颂呛怂崦窰活性的酶。
本發(fā)明的寡核苷酸均可以用作，例如，核酸擴(kuò)增的寡核苷酸引物。如果使用本發(fā)明的寡核苷酸為引物來實(shí)施核酸擴(kuò)增方法，則可以只擴(kuò)增目的核酸，即結(jié)核分枝桿菌的核酸。盡管擴(kuò)增方法的例子包括PCR、LCR、NASBA和3SR，但在恒定溫度下能實(shí)施的核酸擴(kuò)增方法例如LCR、NASBA和3SR是特別優(yōu)選的。可以通過使用各種方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，以檢測結(jié)核分枝桿菌。在這種情況下，非擴(kuò)增中使用的寡核苷酸的以上任何一個(gè)寡核苷酸都可用作探針，而且可以通過電泳或者類似的方法對擴(kuò)增的特異序列片段進(jìn)行驗(yàn)證。
通過，例如，用可檢測標(biāo)記物對其部分進(jìn)行修飾或?qū)ζ溥M(jìn)行標(biāo)記，本發(fā)明的任何一個(gè)寡核苷酸都可以用作探針。當(dāng)檢測目的核酸時(shí)，可以使標(biāo)有可檢測標(biāo)記物的本發(fā)明寡核苷酸與單鏈目的核酸雜交，之后可以通過所述標(biāo)記物檢測雜交的探針?？梢允褂眠m合于具體標(biāo)記物的方法來進(jìn)行標(biāo)記檢測，例如，當(dāng)用嵌入熒光染料標(biāo)記寡核苷酸時(shí)，為了容易地僅檢出雜交探針而又不用除去沒有與目的核酸雜交的探針，可以使用具有在嵌入含有目的核酸和寡核苷酸探針的雙鏈核酸中時(shí)顯示出增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度的特性的染料。當(dāng)使用普通熒光染料作為標(biāo)記物時(shí)，可以在除去沒有和目的核酸雜交的探針后檢測標(biāo)記物。為了實(shí)現(xiàn)檢測，優(yōu)選使用核酸擴(kuò)增方法例如PCR、NASBA或3SR方法把樣品中的目的核酸擴(kuò)增到可檢測的數(shù)量，其中最優(yōu)選恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)例如NASBA和3SR方法。或者，當(dāng)在擴(kuò)增過程中把標(biāo)記的寡核苷酸探針加入反應(yīng)溶液中時(shí)，特別優(yōu)選使用例如在3’端添加乙醇酸的方法來修飾探針，以使探針不具有充當(dāng)核苷酸引物的功能。
如上面提到的，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供優(yōu)選的寡核苷酸組合，所述組合能在相對低溫度下(例如，41℃)特異地?cái)U(kuò)增來自所述pab基因的RNA，并且可以用于進(jìn)行所述RNA的高度靈敏檢測和鑒定。
涉及這第二個(gè)目的的本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA的核酸擴(kuò)增方法，和用于檢測由此核酸擴(kuò)增方法產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法。此核酸擴(kuò)增方法包括PCR、NASBA或3SR方法；其中恒溫核酸擴(kuò)增方法例如NASBA和3SR方法是最優(yōu)選的，這些方法利用反轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶的協(xié)同作用(通過在能提供協(xié)同作用的條件下使反轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng))來擴(kuò)增來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA。
例如，在NASBA方法的擴(kuò)增程序中，將樣品中存在的來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA用作模板，并使用RNA依賴的DNA聚合酶來合成DNA，用核糖核酸酶H消化雙鏈RNA/DNA中的RNA以產(chǎn)生單鏈DNA，然后使用DNA依賴的DNA聚合酶，并用此單鏈DNA作模板以產(chǎn)生含有啟動子序列的雙鏈DNA，所述啟動子能轉(zhuǎn)錄包含特異序列或所述特異序列的互補(bǔ)序列的RNA，在RNA聚合酶存在的條件下雙鏈DNA產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，然后使用RNA依賴的DNA聚合酶以此RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板來合成cDNA。本發(fā)明的特征在于，將含有SEQ.ID.No.28到No.33所列序列中任一序列的至少10個(gè)連續(xù)堿基的寡核苷酸用作第一引物，其中所述序列具有與待擴(kuò)增的結(jié)核分枝桿菌pab基因的一部分RNA序列同源的序列；而將含有SEQ.IDs.No.34到No.41所列序列中任一序列的至少10個(gè)連續(xù)堿基的寡核苷酸用作第二引物，其中所述序列具有與結(jié)核分枝桿菌pab基因的一部分RNA序列互補(bǔ)的序列；其中第一或第二引物在其5’區(qū)域有RNA聚合酶啟動子序列。
盡管本發(fā)明中使用的RNA依賴的DNA聚合酶、DNA依賴的DNA聚合酶和核糖核酸酶H沒有特殊限制，但是優(yōu)選使用具有所有這三類活性的AMV反轉(zhuǎn)錄酶。另外，盡管本發(fā)明中使用的RNA聚合酶沒有特殊限制，但優(yōu)選使用T7噬菌體RNA聚合酶或SP6噬菌體RNA聚合酶。
在本發(fā)明的此擴(kuò)增方法中，加入與來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA的5’端區(qū)域特異序列(1-10個(gè)堿基)的相鄰重疊區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸，并用核糖核酸酶H在此5’端區(qū)域特異序列處切割來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA以產(chǎn)生核酸擴(kuò)增的初始模板，因此使得來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA即使在其5’端沒有此特異序列時(shí)也可得以擴(kuò)增。用于此切割的寡核苷酸可以是，例如，SEQ.ID.No.22到No.27中的任一個(gè)序列，前提是它與在擴(kuò)增過程中用作第二引物的寡核苷酸不同。另外，切割中使用的寡核苷酸優(yōu)選在3’羥基被化學(xué)修飾(例如氨基化)以防止從3’端開始延伸反應(yīng)。
盡管通過以上擴(kuò)增方法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物可以用任何本身已知的方法檢測，但優(yōu)選在標(biāo)有嵌入熒光染料的寡核苷酸探針存在的情況下，通過測量反應(yīng)溶液的熒光性質(zhì)變化進(jìn)行檢測。此寡核苷酸可以是嵌入熒光染料通過接頭與寡核苷酸中磷原子結(jié)合的寡核苷酸。此寡核苷酸的特征在于，當(dāng)它與目的核酸形成雙鏈后，因?yàn)榍度雱┎糠智度腚p鏈部分中改變了熒光的特性，故不需要分離分析(Ishiguro，T等(1996)，Nucleic Acids Res.第24卷(24)第4992-4997頁)。
寡核苷酸的序列不是關(guān)鍵的，只要它有與擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一部分互補(bǔ)的序列即可。然而，寡核苷酸序列優(yōu)選是含有SEQ.IDs.No.42到No.44中任一序列的至少10個(gè)連續(xù)堿基的寡核苷酸或其互補(bǔ)序列。另外，優(yōu)選在寡核苷酸的3’羥基進(jìn)行化學(xué)修飾(例如，加上乙醇酸)以抑制基于此寡核苷酸用作引物的延伸反應(yīng)。
因此，在一個(gè)試管中、在恒溫下、只需一個(gè)步驟就可以擴(kuò)增和檢測具有與來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA特異序列相同的序列的RNA，因此，該擴(kuò)增方法容易自動化。
現(xiàn)在通過實(shí)施例對本發(fā)明作更加詳細(xì)的闡釋，但應(yīng)明白本發(fā)明并不受限于這些實(shí)施例。
(1)通過260nm的紫外吸收確定標(biāo)準(zhǔn)RNA(SEQ.ID.No.21)樣品的量，此標(biāo)準(zhǔn)RNA含有來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的pab-RNA的第111到1436位堿基(RNA堿基序列的編號是根據(jù)Inf.and Immun.第57卷，第2481-2488頁(1989)進(jìn)行的)，然后用RNA稀釋劑(10mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5U/μL RNase抑制劑(TakaraShuzo.Co.Ltd))將其稀釋到1.53pmol/μL。
(2)接下來，把具有以下組分的14μL反應(yīng)溶液加到0.5mL體積PCR管中(GeneAmp薄壁反應(yīng)管TM；Perkin-Elmer Co，Ltd)。
反應(yīng)溶液組分(每個(gè)濃度都表示在15μL終反應(yīng)溶液中的濃度)60mM Tris-HCl緩沖液(pH8.6)17mM 氯化鎂90mM 氯化鉀39U RNase抑制劑(Takara Shuzo.Co.Ltd)1mM DTT0.066μM 標(biāo)準(zhǔn)RNA調(diào)整體積用的蒸餾水
0.2μM寡核苷酸溶液(使用以下寡核苷酸中的一個(gè))MP-1R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第216到第236位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.1)MP-2R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第268到第288位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.2)MP-3R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第319到第339位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.3)MP-4R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第455到第476位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.4)MP-5R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第484到第504位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.5)MP-6R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第498到第517位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.6)MP-7R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第535到第554位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.7)MP-8R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第675到第697位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.8)MP-9R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第712到第731位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.9)MP-10R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第724到第743位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.10)MP-11R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第757到第778位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.11)MP-12R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第790到第809位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.12)MP-13R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第937到第956位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.13)MP-14R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第961到第982位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.14)MP-15R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第1011到第1030位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.15)MP-16R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第1071到第1093位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.16)MP-17R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第1103到第1123位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.17)MP-18R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第1166到第1185位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.N0.18)MP-19R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第1256到第1278位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.19)MP-20R(與結(jié)核分枝桿菌Pab基因的第1270到第1290位堿基互補(bǔ)的寡核苷酸，SEQ.ID.No.20)(3)然后反應(yīng)溶液在41℃溫育5分鐘，之后加入1μL的8U/μ LAMV-反轉(zhuǎn)錄酶(Takara Shuzo.Co.Ltd；可切割DNA/RNA雙鏈中的RNA的酶)。
(4)之后，在41℃溫育PCR管10分鐘(5)在反應(yīng)后進(jìn)行尿素-聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺濃度6％，尿素7M)電泳以確證切割的片段。電泳后用SYBR GreenIITM(TakaraShuzo.Co.Ltd)進(jìn)行染色。因?yàn)楣押塑账崤c目的RNA特異位點(diǎn)的結(jié)合，DNA/RNA雙鏈中的RNA被AMV轉(zhuǎn)錄酶的核糖核酸酶H活性切割。結(jié)果是可以觀察到特征條帶。
電泳結(jié)果見

圖1(黑白色反轉(zhuǎn))。當(dāng)寡核苷酸與標(biāo)準(zhǔn)RNA特異結(jié)合時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)RNA將在這個(gè)結(jié)合區(qū)域被消化，產(chǎn)生有特征性鏈長度的消化產(chǎn)物。表1顯示寡核苷酸與標(biāo)準(zhǔn)RNA特異結(jié)合時(shí)的位置和預(yù)期的條帶鏈長度。對于MP-1R、MP-2R、MP-4R、MP-6R、MP-7R、MP-8R、MP-9R、MP-12R、MP-13R、MP-14R、MP-15R、MP-17R和MP-18R，驗(yàn)證到特異條帶。這顯示了41℃在恒定狀態(tài)下，這些寡核苷酸與結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA有很強(qiáng)的結(jié)合。表1中顯示的堿基編號是結(jié)核分枝桿菌pab基因的堿基序列中的堿基編號。另外，表中的圓圈表示只觀察到特異條帶，表中的叉號表示既觀察到特異條帶也觀察到了非特異條帶。
表1
如上面所闡釋的，本發(fā)明的寡核苷酸是即使在易于引起RNA分子內(nèi)結(jié)構(gòu)和防止引物和探針與RNA結(jié)合的相對低而恒定的溫度下(35-50℃，優(yōu)選41℃)也能與pab基因(結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)遺傳元件)的RNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸。因此，在沒有熱變性目的RNA的條件下，這些寡核苷酸的特異結(jié)合也是可以的。所以本發(fā)明的寡核苷酸可以用于對來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA進(jìn)行切割、擴(kuò)增、檢測或類似操作，即，作為在RNA擴(kuò)增方法中使用的寡核苷酸引物或寡核苷酸探針。
另外，本發(fā)明的寡核苷酸在結(jié)核分枝桿菌pab基因的擴(kuò)增和檢測中顯然也是有用的。與上面提到的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸還可以用于通過PCR方法擴(kuò)增雙鏈DNA，或用于檢測來自RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA。
本發(fā)明的寡核苷酸并不限于本文具體列出的堿基序列(20到30聚體(mer))，它們也可以是含有這些序列中的至少10個(gè)或更多個(gè)連續(xù)堿基的寡核苷酸。從如下事實(shí)來看這是顯而易見，即，10mer堿基序列足于保證在相對低溫度條件下(優(yōu)選在41℃)引物或探針對目的核酸具有充分特異性。
實(shí)施例2使用與來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA特異結(jié)合的寡核苷酸探針，進(jìn)行RNA擴(kuò)增反應(yīng)。
(1)用RNA稀釋劑(10mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，1mM EDTA，0.5U/μL RNase抑制劑(Takara Shuzo.Co.Ltd)；5mM DTT)把含有來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的pab-RNA第111到第1436位堿基的標(biāo)準(zhǔn)RNA(1326mer)(SEQ.ID.No.21)稀釋到103個(gè)拷貝/5μL的濃度。在對照試驗(yàn)部分只使用稀釋劑(陰性對照)。
(2)把具有以下組成的20μL反應(yīng)溶液加到0.5ml體積PCR管中(GeneAmp薄壁反應(yīng)管；Perkin-Elmer Co，Ltd)。然后，加入5μL的上述RNA樣品。
反應(yīng)溶液組成(每個(gè)濃度都是在30μL終反應(yīng)溶液中的濃度)60mM Tris-HCl緩沖液(pH8.6)17mM 氯化鎂90mM 氯化鉀39U RNase抑制劑1mM DTTdATP、dCTP、dGTP和dTTP各0.25mM3.6mM ITPATP、CTP、GTP和UTP各3.0mM0.16μM 第一寡核苷酸1.0μM第二寡核苷酸1.0μM第三寡核苷酸13％ DMSO用蒸餾水調(diào)整體積
(3)使用具有表2中作為第一、第二、第三寡核苷酸列出的序列的寡核苷酸，進(jìn)行RNA擴(kuò)增反應(yīng)。制備溶液，以便，如表2中所列，把第一、第二、第三寡核苷酸混合為一。
(4)41℃溫育上述反應(yīng)溶液5分鐘后，加入具有下列組分的5μL酶溶液酶溶液組成(每個(gè)濃度都是在30μL終反應(yīng)溶液中的濃度)1.7％山梨糖醇3μg 牛血清清蛋白142U T7 RNA聚合酶(Gibco)8U AMV反轉(zhuǎn)錄酶(Takara Shuzo.Co.Ltd)用蒸餾水調(diào)整體積(5)之后，41℃溫育PCR管30分鐘。
(6)反應(yīng)之后為了鑒定RNA的擴(kuò)增部分，進(jìn)行瓊脂糖凝膠(4％瓊脂糖凝膠)電泳，電泳后用SYBR GreenIITM(Takara Shuzo.Co.Ltd)進(jìn)行染色。當(dāng)寡核苷酸與目的RNA的特異部分結(jié)合時(shí)，被第二和第三寡核苷酸夾在中間的RNA部分得以擴(kuò)增，因此可觀察到特征條帶。
電泳的結(jié)果見于圖2。反應(yīng)中被擴(kuò)增的特異條帶的鏈長度見于表2。在使用如表2所示的寡核苷酸組合的RNA擴(kuò)增反應(yīng)中，組合(c)、(h)和(m)中能驗(yàn)證到特異條帶。因此，這顯示了這些組合在檢測結(jié)核分枝桿菌時(shí)是有效的。表2
表2顯示了本實(shí)施例中使用的第一、第二、第三寡核苷酸的組合，也顯示了使用這些組合進(jìn)行RNA擴(kuò)增反應(yīng)得到的特異擴(kuò)增條帶的鏈長度。每個(gè)第一寡核苷酸堿基序列的3’端羥基均被氨基化。每個(gè)第二寡核苷酸堿基序列在它的第1個(gè)“A”到第28個(gè)“A”(從5’端算起)的區(qū)域中包含有T7啟動子區(qū)域。堿基的編號是結(jié)核分枝桿菌pab基因的堿基序列中的編號。
第一寡核苷酸MP-1S(SEQ.ID.No.22；第213到第236位堿基)MP-4S(SEQ.ID.No.23；第453到第476位堿基)MP-6S(SEQ.ID.No.24；第494到第517位堿基)MP-9S(SEQ.ID.No.25；第708到第731位堿基)MP-12S(SEQ.ID.No.26；第786到第809位堿基)MP-13S(SEQ.ID.No.27；第933到第956位堿基)第二寡核苷酸MP-1F(SEQ.ID.No.28；第228到第250位堿基)MP-4F(SEQ.ID.No.29；第468到第490位堿基)MP-6F(SEQ.ID.No.30；第509到第531位堿基)MP-9F(SEQ.ID.No.31；第723到第745位堿基)MP-12F(SEQ.ID.No.32；第800到第823位堿基)
MP-13F(SEQ.ID.No.33；第948到第970位堿基)第三寡核苷酸MP-3R(SEQ.ID.No.34；第319到第339位堿基)MP-9R(SEQ.ID.No.35；第712到第731位堿基)MP-10R(SEQ.ID.No.36；第724到第743位堿基)MP-11R(SEQ.ID.No.37；第757到第778位堿基)MP-12R(SEQ.ID.No.38；第790到第809位堿基)MP-16R(SEQ.ID.No.39；第1071到第1093位堿基)MP-17R(SEQ.ID.No.40；第1103到第1123位堿基)MP-20R(SEQ.ID.No.41；第1270到第1290位堿基)實(shí)施例3使用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸組合，在來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA具有不同拷貝數(shù)的情況下，進(jìn)行檢測。
(1)用RNA稀釋劑(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，0.5U/μL RNase抑制劑(Takara Shuzo.Co.Ltd)；5mM DTT)，將如實(shí)施例2中所描述的來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的pab-RNA的標(biāo)準(zhǔn)RNA稀釋到101拷貝/5μL到105拷貝/5μL的濃度。在對照試驗(yàn)部分只使用稀釋劑(陰性對照)。
(2)把具有以下組成的20μL反應(yīng)溶液加到PCR管中(0.5ml體積；GeneAmp薄壁反應(yīng)管；Perkin-Elmer Co，Ltd)。然后，加入5μL的上述RNA樣品。
反應(yīng)溶液組成(每個(gè)濃度都是在30μL終反應(yīng)溶液中的濃度)60mM Tris-HCl緩沖液(pH8.6)17mM 氯化鎂150mM氯化鉀39U RNase抑制劑1mM DTTdATP、dCTP、dGTP和dTTP各0.25mM3.6mMITP
ATP、CTP、GTP和UTP各3.0mM0.16μM第一寡核苷酸(MP-13S；SED.ID.No.27；其3’端羥基被氨基化)1.0μM第二寡核苷酸(MP-13F；SED.ID.No.33)1.0μM第三寡核苷酸(MP-17R；SED.ID.No.40)25nM嵌入熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸(YO-Pab1076-S-G；SED.ID.No.42；在其第10個(gè)“A”和第11個(gè)“T”(從5’端算起)之間的磷原子上標(biāo)記有嵌入熒光染料，且其3’端羥基用乙二醇基團(tuán)修飾)13％ DMSO用蒸餾水調(diào)整體積(3)41℃溫育上述反應(yīng)溶液5分鐘后，加入具有下列組成的、在41℃預(yù)溫育2分鐘的5μL酶溶液酶溶液組成(每個(gè)濃度都是在30μL終反應(yīng)溶液中的濃度)1.7％ 山梨糖醇3μg 牛血清清蛋白142U T7 RNA聚合酶(Gibco)8UAMV反轉(zhuǎn)錄酶(Takara Shuzo.Co.Ltd)用蒸餾水調(diào)整體積(4)然后使用帶有溫度控制器的可直接測量的熒光分光光度計(jì)，在41℃溫育PCR管，在激發(fā)波長470nm和熒光波長510nm下周期性地測量反應(yīng)溶液。
圖3(A)顯示樣品的熒光增加比率(預(yù)設(shè)時(shí)間的熒光強(qiáng)度/背景熒光強(qiáng)度)的時(shí)程變化，其中在0分鐘時(shí)加入酶。圖3(B)顯示初始RNA量的對數(shù)與增長時(shí)間(相對熒光達(dá)到陰性對照樣品的平均值加上3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的時(shí)間，也就是，達(dá)到1.2的時(shí)間)的關(guān)系。初始RNA量在101個(gè)拷貝/試驗(yàn)到105個(gè)拷貝/試驗(yàn)之間。
圖3(A)顯示在大約15分鐘檢測到102個(gè)拷貝。獲得均以標(biāo)記RNA的初始濃度為基礎(chǔ)的熒光分布圖和校準(zhǔn)曲線，這表明可以對未知樣品中存在的目的RNA進(jìn)行定量。這證實(shí)，此方法允許對結(jié)核分枝桿菌實(shí)施快速、高度靈敏的檢測。
如上面闡釋的，本發(fā)明提供了有用的寡核苷酸引物或寡核苷酸探針組合，所述這些引物和探針組合能特異地與來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA結(jié)合，并且即使在相對低的恒定溫度(35-50℃，優(yōu)選41℃)下(這時(shí)樣品中的RNA將形成抑制引物和探針結(jié)合的分子內(nèi)結(jié)構(gòu))也能快速擴(kuò)增和檢測目的RNA。
本發(fā)明組合中的寡核苷酸的堿基長度并不只限于具體描述的長度，而是包括了含有這些序列中的至少10個(gè)連續(xù)堿基的寡核苷酸。從如下事實(shí)來看這是顯而易見的，即，大約10mer的堿基序列對于保證引物或探針在相對低溫度(優(yōu)選41℃)下對目的核酸的特異性是足夠的。
序列表<110>東曹株式會社(Tosoh corporation)<120>用于檢測結(jié)核分枝桿菌的寡核苷酸和方法<130>TYS-K851<160>44<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>MP-1R<400>1gtggtttcga gccacagccc g 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>MP-2R<400>2ggggtagtcg cgacagtacc g 21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>MP-3R<400>3gggtagagca gcgtgctacc g 21<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>MP-4R<400>4gataggcgtc ggaggcccca at 22<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>MP-5R<400>5ttgtgcgcgg ccatatcacc t 21<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>MP-6R<400>6gttcatcagc cccttgtgcg20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>MP-7R<400>7tgtagttgac ctgctgagcg 20<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>MP-8R<400>8cggaactacc gcggtgccgg gca 23<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>MP-9R<400>9agaaggtgtc accggacccg 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>MP-10R<400>10actgggtgaa caagaaggtg 20<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>MP-11R<400>11cttgccccag ccctcgggat ct 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權(quán)利要求
1.用于對pab基因，即結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)基因元件，或來自所述基因的RNA進(jìn)行切割、檢測或擴(kuò)增的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能與所述pab基因或來自其的RNA特異地結(jié)合并且含有SEQ.ID.No.1到No.20中任一序列的至少10個(gè)連續(xù)的堿基；或者與所述寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是用于DNA延伸反應(yīng)的寡核苷酸引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是其中一部分被可檢測標(biāo)記物修飾或者標(biāo)記的寡核苷酸探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是其中一部分堿基被修飾但沒有損失所述寡核苷酸作為寡核苷酸探針的功能的合成寡核苷酸。
5.使用RNA擴(kuò)增程序擴(kuò)增pab基因，即結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)基因元件的方法，包括以下步驟以來自樣品中的所述pab基因的RNA特異序列為模板，用RNA依賴的DNA聚合酶、與所述特異序列有同源序列的第一引物、與所述特異序列有互補(bǔ)序列的第二引物來形成cDNA，其中第一或第二引物的5’區(qū)域添加了具有RNA聚合酶啟動子序列的序列，由此產(chǎn)生RNA-DNA雙鏈；用核糖核酸酶H消化所述RNA-DNA雙鏈中的RNA以形成單鏈DNA；然后以所述單鏈DNA為模板，用DNA依賴的DNA聚合酶形成含有啟動子序列的雙鏈DNA，其中所述啟動子序列可允許所述特異序列或者含有所述特異序列的互補(bǔ)序列的RNA實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄，在RNA聚合酶存在的條件下所述雙鏈DNA產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，接著所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被用作模板通過所述RNA依賴的DNA聚合酶合成cDNA；所述方法的特征在于，包含SEQ.IDs.No.28到No.33所列序列中任一序列的至少10個(gè)連續(xù)堿基的寡核苷酸被用作第一引物，其中所述序列具有與待擴(kuò)增的結(jié)核分枝桿菌pab基因的部分RNA序列同源的序列；包含SEQ.IDs.No.34到No.41所列序列中任一序列的至少10個(gè)連續(xù)堿基的寡核苷酸被用作第二引物，其中所述序列具有與結(jié)核分枝桿菌pab基因的部分RNA序列互補(bǔ)的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中在有能與所述擴(kuò)增產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特異結(jié)合并標(biāo)有嵌入熒光染料的寡核苷酸探針存在的情況下，實(shí)施所述的RNA擴(kuò)增程序，并測量反應(yīng)溶液中熒光性質(zhì)的變化，條件是所述帶標(biāo)記的寡核苷酸有與所述第一和第二引物所不同的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述探針被設(shè)計(jì)為能與所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的至少一部分序列互補(bǔ)地結(jié)合，而且與復(fù)合物沒有形成時(shí)的情況相比，熒光性質(zhì)發(fā)生改變。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于，所述探針具有包含SEQ.ID.No.42到No.44中任一序列的至少10個(gè)連續(xù)堿基的序列，或者其互補(bǔ)序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了可用于對編碼pab(結(jié)核分枝桿菌來源的抗原蛋白)的pab基因或來自該基因的RNA進(jìn)行特異切割、擴(kuò)增、及高靈敏檢測和鑒定的寡核苷酸。另外，本發(fā)明還提供了可有效地對來自結(jié)核分枝桿菌pab基因的RNA進(jìn)行特異擴(kuò)增、高度靈敏檢測和鑒定的寡核苷酸組合，以及使用其檢測結(jié)核分枝桿菌的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1464906SQ02802506
公開日2003年12月31日 申請日期2002年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月25日
發(fā)明者土屋滋夫, 益田升佳, 丸山高廣, 松葉隆雄, 石黑敬彥 申請人:東曹株式會社