專利名稱：：人類免疫缺陷病毒嵌合蛋白質的重組痘病毒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及免疫學領域，特別涉及開發(fā)預防或治療獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的疫苗。本發(fā)明公開了用于治療和預防AIDS的嵌合基因及表達該基因的鳥痘病毒(FowlpoxViruses)?，F(xiàn)有技術HIV是AIDS的病原(PopovicM，SarngadharanM，ReadG和GalloRC.Science1984，224497-500)。該病毒不僅感染CD4+T細胞(KlatzmanD，BarreSinoussiF，NugeyreMT，DauguetC，VilmerE，GriscelliC，Brun-VezinetF，RouziouxC，Gluckman，JD，ChermannnJC和MontagnierL.Science1984，22559-63)，而且感染其它細胞類型，例如巨噬細胞、樹突狀細胞、小膠質細胞和上皮細胞。盡管在感染全過程中存在高水平抗體，HIV仍可逃脫宿主免疫應答。HIV引起宿主長期的嚴重免疫缺陷，使其對機會感染的侵襲極為敏感。超過3千6百萬人正忍受HIV/AIDS，每天的16000宗感染中，94％發(fā)生在發(fā)展中國家。(UNAIDS.ReportontheglobalHIV/AIDSepidemic，June2000)。由于這些驚人的數(shù)字，并且由于該病缺少有效、可負擔得起的治療，急需開發(fā)HIV疫苗。HIV的若干特性使此項工作很困難，其中最重要的或許是其抗原的高度遺傳變異性，特別是包膜糖蛋白(gp160)，涉及感染過程以及中和抗體所靶向的主要結構域位于其中。基于中和抗體的候選疫苗已經(jīng)能夠保護黑猩猩防止HIV(BermanPW，GregoryTJ，LavonR，NakamuraGR，ChampeMA，PorterJP，WurmFM，HershbergRD，CobbGK和EichbergJW.Nature1990，345622-625；GirardM，KienyMP，PinterA；Barre-SinoussiF，NaraP，KolbeH，KusumiK，ChaputA，RainhartT，MuchmoreE，RoncoJ，KaczorekM，GomardE，GluckmanJC和FultzPN，PNAS1991，88542-546)。然而，這些實驗是在近乎理想的條件下進行的，病毒攻擊的劑量、途徑和計時與自然感染相差懸殊。此外，那些免疫原不能防止趨異的HIV分離物，并且產(chǎn)生的抗體不能中和主要的HIV分離物。各種候選疫苗已經(jīng)進行了I期和II期臨床試驗評價(JohnstonMI.AIDSvaccinedevelopmentstatusandfuturedirections.1999.XIIColloquedesCentGardes.Ed.GirardMandDodetB.161-163)。其中大多基于包膜蛋白質gp160和gp120。只有一種基于重組gp120的疫苗，目前在泰國和美國進行III期效能評價。先前的試驗結果表明，如果有的話，只能期望該疫苗非常有限的保護。這些嚴重限制了可防止各種HIV分離物和亞型的體液應答的產(chǎn)生，最近幾年，研究人員的努力主要轉向開發(fā)能主要刺激免疫系統(tǒng)細胞途徑、特別是針對HIV抗原的細胞毒T細胞的候選疫苗。強烈提示抗HIVCT1臨床相關性的實驗發(fā)現(xiàn)有給予已接種猿-人免疫缺陷病毒(SHIV)的獼猴抗CD8單克隆抗體，可顯著提高病毒血癥的水平(MatanoT，ShibataR，SimeónC，ConnorsM，LaneC，MartínM，AdministrationofanAnti-CD8monoclonalantibodyinterfereswiththeclearanceofchimericSimian/HumanImmunodeficiencyvirusduringprimaryinfectionsofrhesusmacaques，JVirol，1998，72，1164-169)；在HIV感染的個體(Borrow，P.，H.Lewicki，X.Wei，M.S.Horwitz，N.Peffer，H.Meyers，J.A.Nelson，J.E.Gairin，B.H.Hahn，M.B.A.Oldstone，andG.M.Shaw.1997.AntiviralpressureexertedbyHIV-1-specificcytotoxicTlymphocytes(CTLs)duringprimaryinfectiondemonstratedbyrapidselectionofCTLescapevirus.NatureMed.3205-211.)和SIV感染的獼猴中(Allen，T.M.，O.C.DH，P.Jing，J.L.Dzuris，B.R.Mothe，T.U.Vogel，E.Dunphy，M.E.Liebl，C.Emerson，N.Wilson，K.J.Kunstman，X.Wang，D.B.Allison，A.L.Hughes，R.C.Desrosiers，J.D.Altman，S.M.Wolinsky，A.Sette，和D.I.Watkins.2000.Tat-specificcytotoxicTlymphocytesselectforSIVescapevariantsduringresolutionofprimaryviraemia.Nature.407386-90)中，均選擇到能夠逃避CD8+T細胞識別的病毒變體；定居注入HIV-1重組痘苗病毒(VV)的自愿者PBMC的SCID小鼠，可以在沒有中和抗體的情況下防止攻擊(VanKuykR，TorbettB，GuliziaR等人，HumanCTLspecificforthenefproteinofHIVprotecthu-PBL-SCIDmicefromHIVinfection.AIDSResHumRetroviruses，1993；9(suppl1S77)；較高比例的接觸而未感染人員呈現(xiàn)特意性針對HIV蛋白質的細胞免疫應答，非洲的性工作者(Rowland-JonesSL，JSotton，KAriyoshi，TDong，F(xiàn)Gotch，sMcAdams，DWhitby，SSabally，AGallimore，TCorrah，MTakiguchi，TSchltz，AMcMichael，HWhittle.1995.HIV-specificcytotoxicTcellsinHIV-exposedbutuninfectedGambianwomen.NatureMedicine，159-64)以及血清反應陽性的母親所生孩子就是如此(Rowland-JonesSL，DFNixon，MCAldhous，F(xiàn)Gotch，KAroyoshi，NHallam，JSKroll，KFroebel，AMcMichael.HIVspecificcytotoxicT-cellactivityinanHIV-exposedbutuninfectedinfant.Lancet，1993，341860-861).另外長期未發(fā)病者(nonprogressor)顯示出強CTL應答(Cao，Y，QinL，ZhangI，SafritJ和HoDD，NewEnglJMed，1995，332201-208；RiviereY，McChesneyMB，PorrotE等人，AIDSResHumRetroviruses，11903-990)；以及I類HLA與HIV-1感染個體的發(fā)病率有關(Carrington，M.，G.W.Nelson，M.P.Martin，T.Kissner，D.Vlahov，J.J.Goedert，R.Kaslow，S.Buchbinder，K.Hoots和O.B.SJ.1999.HLAandHIV-1heterozygoteadvantageandB*35-Cw*04disadvantage.Science.2831748-52)。在自然感染中，CTL應答先于中和抗體，并與急性感染的病毒血癥的控制有關(KoupRA，SafritJT，CaoY等人，Temporalassociationofcellularimmuneresponseswiththeinitialcontrolofviremiainprimaryhumanimmunodeficiencysyndrome，JVirol，1994；684650-4655)，AIDS發(fā)展與CTL活性的損傷密切相關。(HarrerT，HarrerE，KalamsS，ElbeikT，StapransS，F(xiàn)einbergMB，CaoY，HoDD，YilmaT，CaliendoA，JonsonRP，BuchbinderS和WalkerB.HIV-specificCTL-responseinhealthylong-termasymptomaticHIVinfection.AIDSResHumRetroviruses，1996，12，7585-592)。最后，在HIV感染的SIV模型中，誘導病毒特異性CD8+T細胞應答的疫苗可以有利影響感染結果(Barouch，D.H.，S.Santra，J.E.Schmitz，M.J.Kuroda，T.M.Fu，W.Wagner，M.Bilska，A.Craiu，X.X.Zheng，G.R.Krivulka，K.Beaudry，M.A.Lifton，C.E.Nickerson，W.L.Trigona，K.Punt，D.C.Freed，L.Guan，S.Dubey，D.Casimiro，A.Simon，M.E.Davies，M.Chastain，T.B.Strom，R.S.Gelman，D.C.Montefiori，M.G.Lewis，E.A.Emini，J.W.Shiver和N.L.Letvin.2000.ControlofviremiaandpreventionofclinicalAIDSinrhesusmonkeysbycytokine-augmentedDNAvaccination.Science.290486-92；Gallimore，A.，M.Cranage，N.Cook，N.Almond，J.Bootman，E.Rud，P.Silvera，M.Dennis，T.Corcoran，J.Stott，A.McMichael，andF.Gotch.1995.EarlysuppressionofSIVreplicationbyCD8+nef-specificcytotoxicTcellsinvaccinatedmacaques.NatureMed.11167-1173.)所有這組實驗發(fā)現(xiàn)強烈提示，治療和預防策略的至少一個目標應該包括誘導/保持/恢復該免疫應答途徑。已經(jīng)開發(fā)了在動物或人中產(chǎn)生CTLs的方法。重組活載體迄今最為有效。該方法利用無害病毒或細菌，將選擇的病原體基因轉運到受者細胞中，以在此產(chǎn)生該選擇抗原。將基因轉入細胞的方法可以最大限度加工CTL表位并由MHC-I分子呈遞，以及隨后在宿主中有效刺激CTL克隆。痘病毒(痘病毒科家族，Poxvirdaefamily)已經(jīng)較為成功地用作載體。該家族的著名成員為痘苗病毒(VacciniaVirus，VV)，在人類消滅天花運動中廣泛使用。已經(jīng)利用HIV蛋白質的VV重組體進行了若干臨床試驗(CoreyL，McElrathJ，WeiholdK，MatthewaT，StableinD，GrahmB，KeeferM，SchwartzD，GorseG.CytotoxicTCellandNeutralizingAntibodyResponsestoHumanImmunodeficiencyVirusType1Envelopewithacombinationvaccineregimen.JInfectiousDis，1998，177301-9；GrahamBS，MatthewsTJ，BelsheR，ClementsML，DolinR，WrightPF，GorseGJ，SchwartzDH，KeeferMC，BolognesiDP，CoreyL，StableinD，EsterlitzJR，HuSL，SmithGE，F(xiàn)astP，KoffW，JInfectiousDis，1993，167533-7)。然而，VV對于人類使用具有兩個主要限制(1)少量接種人員顯示較強的副作用，對缺乏免疫力的個體可以致死。(2)先前接種過VV的人員對異源抗原的應答差。已經(jīng)利用禽痘病毒(Avipoxvirus)代替VV解決這些缺點。禽痘病毒是痘病毒家族成員，但其復制限于禽類細胞，不能在人類細胞中進行復制循環(huán)。為此目的，已經(jīng)使用了兩種禽痘病毒金絲雀痘病毒(CanarypoxVirus，CPV)和鳥痘病毒(FPV)。許多人類腫瘤相關抗原病原體的禽痘病毒重組體在動物中誘導CTL應答(LimbachKJ和EPaoletti.1996.Non-replicatingexpressionvectorsapplicationsinvaccinesdevelopmentandgenetherapy.Epidemiol.Infect.116241-256)。使用重組禽痘病毒進行疫苗開發(fā)已經(jīng)在美國取得專利(PaolettiE.ycols1992US5174993，PaolettiE.等人1993，US5505941)，特別是在歐洲遞交了使用慢病毒屬抗原的重組禽痘病毒的專利申請。(PaolettiE等人，EP0956360)已經(jīng)在健康自愿者中進行了HIV-1gag、pol和env的CPV重組體的I和II期試驗評價(Clements-MannML，KWeinhold，TJMatthews，BSGraham，GLGorse，MCKeefer，MJMcElrath，R-HHsieh，JMestecky，SZolla-Pazner，JMascola，DSchwartz，RSiliciano，LCorey，PFWright，RBelshe，RDolin，SJackson，SXu，PFast，MCWalker，DStablein，J-LExcler，JTartaglia，A-MDuliege，F(xiàn)Sinangil，EPaoletti.1998.ImmuneresponsestoHumanImmunodeficiencyVirus(HIV)Type1inducedbyCanarypoxexpressingHIV-1MNgp120，HIV-1SF2recombinantgp120，orbothvaccinesinseronegativeadults.JInfectDis1771230-1246；EganMA，WAPavlat，JTartaglia，EPaoletti，KJWeinhold，MLClements，RFSiliciano.1995.InductionofHumanImmunodeficiencyVirusType1(HIV-1)-specificcytolyticTlymphocyteresponsesinseronegativeadultsbyanonreplicating，host-range-restrictedcanarypoxvector(ALVAC)carryingtheHIV-1MNenvgene.JInfectDis1711623-1627)。據(jù)報道在鳥干達，針對至少一種HIV抗原的CTLs占I期試驗接種的50％、II期的30％、最后的I期試驗少于10％。該rCPV(vCP205)是通過在基因組不同的三個非必需區(qū)插入HIV基因制成的，以實現(xiàn)針對一種以上HIV靶的CTL應答。另一方面，也已經(jīng)使用FPV與DNA免疫共同誘導獼猴針對HIV抗原的CTL應答。(RobinsonHL，DCMontefiori，RPJohnson，KHManson，MLKalish，JDLifson，TARizvi，SLu，S-LHu，GPMazzara，DLPanicali，JGHerndon，RGlickmanm，MACandido，SLLydy，MSWyand和HMMcClure.1999.NatureMedicine，5526-534)。在豚尾猴(Macacanemestrina)HIV-1感染模型中，該免疫原組合提供了一定水平的防護。(KentSJ，AZhao，SJBest，JDChandler，DBBoyle，IARamshaw.EnhancedT-Cellimmunogenicityandprotectiveefficacyofahumanimmunodeficiencyvirustype1vaccineregimeconsistingofaconsecutiveprimingwithDNAandboostingwithrecombinantfowlpoxvirus.1998.JVirol，7210180-10188)。然而，由于豚尾猴的HIV感染效率低并難以重現(xiàn)，該動物模型存在嚴重局限。還有報道由若干病原體的一連串精確CTL表位組成的微基因(minigene)產(chǎn)生CTL應答(Whitton，L，ShengN，OldstoneMB和McKeeT.A“stringofbeads”vaccine，comprisinglinkedminigenes，confersprotectionfromlethal-doseviruschallenge，JVirol，1993，67，1348-352；Amultivalentminigenevaccine，containingB-cell，cytotoxicT-LymphocyteandThepitopesfromseveralmicrobes，inducesappropriateresponsesinvivoandconfersprotectionagainstmorethanonepathogen.JVirol，71，32292-2302)。gag的微基因以及完整gag基因的ModifiedVacciniaAnkara(MVA)重組體已經(jīng)用于誘導小鼠CTL應答(HankeT，RVSamuel，TJBlanchard，VCNeumann，TMAllen，JEBoyson，SASharpe，NCook，GLSmith，DIWatkins，MPCranage，AJMcMichael.1999.Effectiveinductionofsimianimmunodeficiencyvirus-specificcytotoxicTlymphocytesinmacaquesbyusingamultiepitopegeneandDNAprime-ModifiedVacciniaVirusAnkaraboostvaccinationregimen.JVirol，73，97524-7532)。這些微基因由gag的一連串分散的CTL表位組成。微基因方法主要的局限在于，各CTL表位的組合僅涵蓋了有限范圍的HLA抗原，因此，所引發(fā)的CTL應答受到很多局限。發(fā)明描述本發(fā)明的本質在于，構建由HIV蛋白質富含CTL表位的區(qū)域組成的嵌和基因，其中這些區(qū)域選自在病毒生活周期的即早期表達的內部保守蛋白質和調節(jié)蛋白質。該方案優(yōu)于所述HIV微基因，因為可以同時加工多個HLA等位基因呈遞的重疊CTL表位。該方案較之若干HIV-1蛋白質的其它禽痘病毒重組體的另一優(yōu)點在于，幾種蛋白質的免疫相關區(qū)集中位于單個基因中，便于產(chǎn)生重組病毒，以及無需在同一重組病毒中使用幾種抗生素抗性系統(tǒng)。另外，這便于在單個重組病毒中組合幾種HIV亞型的表位。所選擇區(qū)域屬于最保守的病毒蛋白質以及早期表達的調節(jié)產(chǎn)物。這些富含CTL表位區(qū)與側翼為兩個賴氨酸的保守的T輔助細胞表位相連，便于細胞蛋白酶的加工。最后加入可由單克隆抗體識別的B細胞表位，便于利用免疫化學方法檢測多肽。連接不同的DNA片段，組裝嵌和基因，其中一些片段由化學合成，其它片段以HIV基因為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。將DNA片段一同克隆于合適的質粒載體、測序，并轉為痘病毒重組載體。更具體而言，本發(fā)明涉及cr3基因，其包含HIV-1蛋白質gp120、gp41和Vpr的Th細胞表位，由Mab2C4識別、位于gp120V3環(huán)的表位(DuarteCA，PérezL，VázquezJ，M，VilarubiaOL，NaveaL，ValdésR，ReyesO，MonteroM，AyalaM和GayilondoJ.Epitopemapping，VregionDNAsequence，andneutralizlngFabfragmentsoftwomonoclonalantibodlesagainsttheHIV-1V3loop.Immunotechnology1996，211-20)以及蛋白質RT、Gag和Nef的富含CTL表位的區(qū)域。將這些嵌和基因插入細菌或病毒活載體(即痘病毒、皰疹病毒、α病毒、脊髓灰質炎病毒、腺病毒、BCG、沙門氏茵)的基因組中，該載體優(yōu)選痘病毒，再明確為禽痘病毒，更明確為FPV。這些重組活載體用于誘導動物或人針對HIV的TH1免疫應答和細胞毒性T細胞。更具體而言，本發(fā)明涉及嵌和蛋白質的FPV重組體，特別涉及包含cr3嵌合基因的、命名為FPCR3和FPSCR3gpt的重組FPV菌株。一旦如上所述組裝，將cr3克隆于痘病毒重組載體，特別是FPV重組載體。質粒pEFL29和pFP67xgpt在此特例中用作重組載體。pEFL29帶有FPB基因組6kbBamHI末端片段的同源區(qū)，其側翼接有轉錄單位，其中在VV7.5K啟動子的控制下插入異源基因，還包含位于FPV4b啟動子控制之下的報告基因和lacZ。pFP67xgpt利用11.2kbBamHI區(qū)的開放閱讀框架6和7作為同源重組信號。這些區(qū)域側翼接有轉錄單元，其中異源基因位于合成的痘病毒E/L啟動子之下，也包含提供霉酚酸抗性的gpt基因，能選擇重組病毒。得到的質粒分別命名為pFPCR3和pFPSCR3gpt。利用現(xiàn)有技術可用的幾種轉染方法之一，將這些質粒轉染原代培養(yǎng)的雞胚成纖維細胞(CEF)。在此特例中，利用lipofectin(Sigma，USA)轉染先前感染上FPVFP29株的CEF，但可以使用其它方法，例如電穿孔和DEAE葡聚糖等。通過質粒和FPV基因組相應非必需區(qū)之間的同源重組，就pFPCR3而言，重組病毒可以恢復表達B半乳糖苷酶，至于pFPSCR3gpt，則耐受霉酚酸。存在選擇標志可以鑒別重組病毒噬斑，并可以通過CEF的若干傳代而純化?？梢酝ㄟ^PCR在篩選的病毒上驗證異源基因的存在，通過western印跡驗證蛋白質表達。本發(fā)明也涉及利用上述獲得的重組FPV，單獨或與選自現(xiàn)有技術的藥學可接受的制劑共同誘導Balb/c小鼠具有CTL活性的TH1免疫應答。本發(fā)明也涉及所述嵌和基因的重組FPV的治療或預防組合，特別涉及FPCR3和FPSCR3gpt，連同免疫調節(jié)劑或佐劑，特別是細胞因子，例如IL2、IL12、IFNg、GMSCF、GSCF等，其優(yōu)先刺激TH1免疫應答。本發(fā)明特別涉及在動物或人中病毒FPCR3或FPSCR3gpt與每日102-107iu劑量IL2的組合。從給予FPV當天開始，或者以后每日給予Balb/c小鼠IL2，加強針對CR3的細胞免疫應答。雖然特別涉及CR3，但本發(fā)明的本質在于還可以使用除CR3以外的富含CTL的片段，或者相當于CR3但來自其它HIV-1分離物的片段。同樣，雖然特別涉及FPV的FP9株，但本發(fā)明的本質在于，構建重組病毒可以使用其它FPV親本株，以及另外的禽痘病毒(例如CPV)、其它痘病毒(例如VV或MVA)、或者其它病毒(例如皰疹病毒、α病毒、腺病毒、脊髓灰質炎病毒)乃至細菌(例如BCG或沙門氏菌)。本發(fā)明的另一實施方案中，基因可以克隆于供哺乳動物細胞表達的合適質粒載體，與藥學可接受的載體共同注入哺乳動物，誘導TH1免疫應答和CTL活性。本發(fā)明又一實施方案中，也包括上述重組質粒與免疫調節(jié)劑或佐劑(例如上述或其它的佐劑，如脂質體、多糖、脂肽、脂質、脂蛋白體或其組合)的治療或預防組合。本發(fā)明另一實施方案中，基因可以克隆于其它質粒，以供在細菌、酵母、真菌、昆蟲或哺乳動物細胞、植物或轉基因動物的乳汁中表達重組蛋白質。從該系統(tǒng)回收的蛋白質如果置于藥學可接受的載體中，以適當方式給予動物或人，也可以用于在動物或人中誘導TH1免疫應答和CTL活性。本發(fā)明又一實施方案中，CR3蛋白質與免疫調節(jié)劑或上述或其它佐劑(例如脂質體、多糖、脂質、脂蛋白體)、或現(xiàn)有技術可用的其它佐劑的治療或預防組合，能夠加強動物或人的TH1型免疫應答和CTL活性。附圖描述圖1.質粒pEFL-cr3，利用6KbBamH1末端區(qū)的ORF-1為插入位點進行鳥痘同源重組?；騝r3位于VVp7.5K啟動子控制之下，報告基因LacZ位于FPV4b啟動子之下。圖2.質粒pFP67xgpt，利用11.2kbBamHI片段ORF-6和ORF-7之間的DNA區(qū)為插入位點，進行FPV同源重組?；騝r3位于合成啟動子E/L控制之下，Ecogpt基因位于VV7.5K啟動子控制之下。圖3.三個獨立的cr3重組FPV的(A)PCR和(B)Western印跡(1)FPCR3.1；(2)FPCR3.2；(3)FPCR3.3；(4)FPL29；(5)DNA分子量標志。圖4.三個獨立的cr3重組FPV的(A)cr3內部寡核苷酸PCR和(B)Western印跡(1)FPSCR3GPT.1；(2)FPSCR3GPT.2；(3)FPSCR3GPT.3；(4)親代病毒；(5)分子量標志。圖5.Western印跡評價CR3表達的穩(wěn)定性。泳道代表FPSCR3GPT病毒原液(1、2、3)或蔗糖墊(sucrosecushion)純化的病毒(4、5、6)感染的三個獨立FPV樣本。泳道7代表親代病毒感染的CEF。圖6.利用FPSCR3gpt以及帶有肽32、或由CR3、Gag或NefVV重組體感染的P815細胞免疫的小鼠脾細胞進行的兩次獨立ELISPOT實驗的結果。結果表示為每106脾細胞中IFNγ分泌細胞的數(shù)目。已經(jīng)減去相應的陰性對照值(單獨或VVWR感染的P815)。圖7.利用FPCR3或FPSCR3gpt以及cr3基因穩(wěn)定轉染的P815免疫的小鼠脾細胞進行IFNγELISPOT實驗。結果表示為每106脾細胞中IFNγ分泌細胞的數(shù)目。已經(jīng)減去陰性對照值(親本P815)。圖8.由AIDS患者的T淋巴細胞識別VVCR3感染的自體B細胞。IFNγELISPOT結果表示為每106外周血單核細胞中IFNγ分泌細胞的數(shù)目。實施例實施例1.獲得cr3。cr3是由不同HIV基因片段組裝成的嵌和基因。將其組裝在與pTAB9基本相同的pTAB11質粒上(GómezCE，NaveaL，LobainaL，DubedM，ExpósitoN，SotoA和DuarteCA.heV3loopbasedMulti-EpitopePolypeptideTAB9AdjuvatedwithMontanideISA720isHighlyImmunogenicinNonhumanPrimatesandInducesNeutralizingAntibodiesAgainstFiveHIV-1isolates.Vaccine172311-2319，1999)，但在該基因5’最末端具有gp120的T1和T2T輔助細胞表位，而不是編碼P64K蛋白質N端部分的片段。將編碼gp120的T2表位、MN株的V3表位以及gp41和vpr的T輔助細胞表位的186bp平端BamHI合成DNA片段，克隆于預先經(jīng)EcoRV-BamHI消化的pTAB11。將編碼兩個連續(xù)賴氨酸的DNA序列插入各個表位之間，以便于細胞內加工。得到的質粒命名為pCR1。利用0.2660和0.2661引物(表1)，PCR擴增編碼p66/p51(RT)蛋白質(HIV-1SF2前病毒2663-3109位)的603bp片段。低熔點瓊脂糖提取PCR片段，BglII-EcoRI消化，亞克隆于BglII-EcoRI切割的pCR1載體，得到編碼CR2蛋白質的pCR2質粒。然后利用0.2662和0.2663引物，PCR擴增包含nef基因(HIV-1LAI分離物8516-8818位)序列的324bp片段。最后，利用0.2664和0.2665引物(表1)，擴增gag基因(HIV-1SF21451-1696位)267bp的另一片段。然后利用20pmol0.2662和0.2666引物(表1)進行重疊PCR。在PCR緩沖液[KCl50mM；Tris-HCl10mM，(pH8.3)，25℃；明膠0.001％]、MgCl22.5mM、每種dNTP0.2mM以及4UTaq聚合酶中，混合等量的每條帶(0.47pmol)，體積為50μL?；旌衔锸紫仍?2C加熱2分鐘，然后50C冷卻，以促進條帶通過0.2663和0.2664寡核苷酸9bp的互補末端退火。最后，溫度升高到72℃5分鐘，以延伸該退火片段。然后將10μL上述反應物加入包含2.5mMMgCl2、0.2mMdNTPs、20pmol0.2662和20pmol0.2666以及4UVentpol.的PCR緩沖液混合物中，總體積為50μL。標準擴增條件為，92℃2分鐘，然后92℃40秒、50℃1分鐘及72℃1分鐘，30個循環(huán)，最終72℃延伸5分鐘。然后利用低熔點瓊脂糖電泳純化重疊的nef-p24擴增條帶，XbaI消化。最后將前述XbaI平端條帶克隆于預先經(jīng)NruI-XbaI切割的pCR2載體，得到pCR3質粒。因此，cr3編碼嵌和蛋白質，其中包括由各種HLA抗原呈遞的gp120、gp41、vpr、RT、nef和gag的T輔助細胞和CTL表位。表1.用于PCR反應的寡核苷酸DNA序列寡核苷酸序列(5′-3′)0.2660GAAGATCTGTACAGAAATGGAAAAG0.2661GGAATTCTCGCGATCCTACATACAAATCATC0.2662GACATCACAAGTAGCAATACAGC0.2663CCCTGCATGTGGCTCAACTGGTACTAGCTTG0.2664GTTGAGCCACATGCAGGGCCTATTGCAC0.2665GCTCTAGATTATTCGGCTCTTAGAGTTTTATAG0.2666GCTCTAGATTATTCGGCTCTTAGAG表2.CR3中的T細胞表位數(shù)字代表相對于每個病毒蛋白質的HXB2氨基酸序列的位置，病毒分離物位于括號內；ND，未明確。實施例2.在pFPL29中克隆cr3。在pCR3中，cr3基因克隆于pTryp控制之下，5’為ClaI位點，3’為T4噬菌體基因32終止子和HindIII位點。該質粒經(jīng)ClaI和HindIII消化和KlenowI處理，獲得帶有5’端ATG、3’翻譯終止密碼子的cr3基因。將該DNA片段克隆于痘病毒重組載體pEFL29。pEFL29具有FPV的6KbBamH1末端片段，用作在FPV基因組中同源重組的非必需區(qū)。該片段包含三個ORF，ORF1是間斷的。該同源區(qū)側接VVp7.5K啟動子，后面是SmaI位點以及位于FPV晚期啟動子4b控制之下的報告基因lacz。該質粒也包括卡那霉素抗性基因和細菌復制起點。PEFL29經(jīng)SmaI消化、堿性磷酸酶處理，與ClaI/HindIII消化的、包含cr3基因的條帶連接。選擇cr3位于p7.5K之下正確方向的若干克隆。使用E.coli菌株DH5α(φ80dlacZΔM15，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17(rK-mK+)，supE44，relA1，deoR，Δ(lacZYA-argF)U169)，在包含卡那霉素(25μg/ml)的LB培養(yǎng)基中增殖和選擇重組質粒。所有基因操作按照Sambrookycol進行(SambrookJ，F(xiàn)ritshEF，ManiatisT.1989.MolecularCloning.ALaboratoryManual.SecEd.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.)利用自動測序儀(Pharmacia)驗證克隆pEFL-cr3(圖1)的DNA序列。利用CsCl梯度純化該克隆，用于轉染雞胚成纖維細胞(CEF)。實施例3.在pFP67xgpt中克隆cr3。PCR擴增cr3基因并克隆到pMosblue載體(Amersham，UK)。得到的質粒命名為pTCR3。pTCR3經(jīng)HpaI/BamHI消化，將包含cr3的較短條帶克隆到痘病毒載體pFP67xgpt中。pFP67xgpt具有FPV基因組的11.2KbBamH1片段，用作在FPV基因組中同源重組的非必需區(qū)(TomleyF，BinnsM，CampwellJ，BoursnellM.SequenceAnalysisofan11.2Kilobase，near-terminal，BamHIfragmentoffowlpoxvirus，JGenVirol，1988，69，1025-1040)。該片段包含該區(qū)域的開放閱讀框架6和7，在基因間區(qū)域進行插入。該同源區(qū)側接E/L合成啟動子(CarrollMw，MossB.E.coliB-glucoronidase(GUS)asamarkerforrecombinantvacciniaviruses，Biotechniques，1995，19，3352-354)，以及位于VV7.5K啟動子控制之下的報告基因Ecogpt。該質粒也包括卡那霉素抗性基因和細菌復制起點。質粒pFP67xgp經(jīng)StuI/BamHI切割，與包含pTCR3經(jīng)HpaI/BamHI消化所得DNA片段的cr3連接。選擇cr3位于E/L合成啟動子之下正確方向的若干克隆(圖1)。使用E.coli菌株DH5α(φ80dlacZΔM15，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17(rK-mK+)，supE44，relA1，deoR，Δ(lacZYA-argF)U169)，在包含氨芐青霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基中增殖和選擇重組質粒。所有基因操作按照Sambrook等人進行。利用自動測序儀(Pharmacia)驗證克隆pFP67xgptct的DNA序列。利用CsCl梯度純化該克隆，用于轉染CEF)。實施例4.產(chǎn)生重組FPVs用于產(chǎn)生重組體的親本FPV是HP-438減毒株，其來自HP-1致病株，經(jīng)過連續(xù)6次CEF傳代、另外2次尿囊絨膜傳代以及最后438次CEF傳代(MayrA和KMalicki.1966.AttenuierungvonvirulentemHuhnerpockenvirusinZellkulturenundEigenschaftendesattenuiertenVirus.Zentralbl.Veterinaermed.ReiheB131-13)。然后將二次噬斑純化的HP438分離物(FP9)傳代6次，形成原種。FPV原種在包含2％新生牛血清(NBCS)的199培養(yǎng)基中的CEFs上生長。如前所述，通過FP9和pEFL29質?；蚱溲苌镏g的同源重組，產(chǎn)生重組FPV。在25cm2培養(yǎng)瓶中生長的CEFs按感染復數(shù)(m.o.i)為2個噬斑形成單位(pfu)/細胞，感染FP9，2小時以后，利用20μgLipofectin(GibcoBRL，USA)轉染經(jīng)CsCl純化的10μg質粒DNA(pEFL-cr3或pFP67xgptctl)。加入新鮮培養(yǎng)基(3ml包含10％胰蛋白磷酸鹽培養(yǎng)液加2％NBCS的199培養(yǎng)基)，在CO2溫箱中37℃溫育。24h之后再次加入新鮮培養(yǎng)基，然后細胞再溫育3-4天。在那之后，將細胞凍融3次。然后在CEF中滴定細胞溶解產(chǎn)物，選擇重組病毒。吸附2hr以后，移去病毒接種物，加入一層包含EMEN的瓊脂糖?；旌系攘康?％低熔點瓊脂糖和含4％胎牛血清(Gibco，GrandIsland，NY)的EMEN2X.(Gibco，GrandIsland，NY)，制備該層。第4天顯現(xiàn)病毒噬斑。培養(yǎng)物中加入另一層含0.33％Xgal(MelfordLaboratories，UK)的瓊脂糖，染色轉染pEFL-cr3的CEF。選擇藍色噬斑，純化3次，直到100％的病毒噬斑為B半乳糖苷酶表達陽性。然后在生長于25cm2培養(yǎng)瓶、包含10％胰蛋白磷酸鹽培養(yǎng)基加2％NBCS的199培養(yǎng)基的CEF中，擴增lacZ+病毒原種。選擇的重組FPV命名為FPCR3。轉染質粒pFP67xgptctl的選擇性培養(yǎng)基包含霉酚酸(25μg/ml)、黃嘌呤(xantine)(250μg/ml)和次黃嘌呤(hypoxantine)(1μg/ml)。第4天顯現(xiàn)病毒噬斑。由于gpt和cr3基因側接相同的同源區(qū)，選擇性培養(yǎng)基中的病毒噬斑分離物表明，發(fā)生重組，兩種基因均插入到FPV基因組中。在CEF中連續(xù)3次純化噬斑。選擇的重組病毒命名為FPSCR3GPT。實施例5.FPCR3的PCR分析。利用PCR分析，檢測包含cr3基因的FPCR3重組體。重組FPV在CEF中繁殖6天，然后收集細胞并沉淀。懸浮該沉淀，于包含1.25mg/ml蛋白酶K的200μl提取緩沖液(10mMTrisHCl，100mMNaCl，10mMEDTA，0.5％SDS，2％β-巰基乙醇)中55℃溫育2h。然后酚-氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。利用分別與cr3基因5’和3’序列互補的下述引物，PCR檢測每個病毒的DNA。使用的PCR條件為，94℃5分鐘，然后94℃1分鐘、45℃1分30秒、72℃1分30秒，25個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。引物序列如下引物775，5′TATTAACATTGCCTAGTAG3′引物776，5′GAAGTAGAATCATAAAGAAC3′PCR反應之后，三個獨立的CR3重組病毒(FPCR3.1；FPCR3.2；FPCR3.3)顯示預期的1.3kb條帶。親代病毒FPL29沒有該條帶(圖3A)。實施例6.FPSCR3GPT的PCR分析利用PCR分析，檢測包含cr3基因的FPSCR3GPT重組體。重組FPV在CEF中繁殖6天，然后收集細胞并沉淀。懸浮該沉淀，于包含1.25mg/ml蛋白酶K的200μl提取緩沖液(10mMTrisHCl，100mMNaCl，10mMEDTA，0.5％SDS，2％β-巰基乙醇)中55C溫育2h。然后酚-氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。利用分別與cr3基因5’和3’序列互補的下述引物，PCR檢測每個病毒的DNA。使用的PCR條件為，94℃5分鐘，然后94℃1分鐘、45℃1分30秒、72℃1分30秒，25個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。引物序列如下引物2660，(257-279)5′GAAGATCTGTACAGAAATGGAAAAG3′引物2663，(1029-1059)5′CCCTGCATGTGGCTCAACTGGTACTAGCTTG3′PCR反應之后，三個獨立的CR3重組病毒(FPSCR3gpt.1；FPSCR3gpt.2；FPSCR3gpt.3)顯示預期的800pb條帶。親代病毒FPL29沒有該條帶(圖4A)。實施例7.評價FPCR3感染的CEF的CR3表達。由Western印跡確認FPCR3的CR3表達。利用重組FPV按0.5pfu/細胞感染60mm培養(yǎng)皿(Petridish)中鋪滿CEF。24小時后收集細胞、沉淀并懸浮于1XSDS凝膠載樣緩沖液中(50mMTrisHClpH6.8，100mMDTT，2％SDS，0.1％溴酚藍，10％甘油)。利用15％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質。然后按標準方法電轉移到硝化纖維素膜(Hybond-C，Amersham，UK)。轉移以后，膜在5％脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖鹽溶液中(PBS2.68mMKCl，1.47mMKH2PO4，0.137MNaCl，8.06mMNa2HPO4)封閉過夜。然后與10ug/ml單克隆抗體6.2(用含1％奶粉的PBS稀釋)在室溫下溫育2h。該單克隆抗體由CR3免疫的小鼠產(chǎn)生(IglesiasE，RuizM，CarrazanaY，CruzLJ，AguilarA，JiménezV，CarpioE，MartínezM，PérezM.MartínezC，CruzO，MartínA，DuarteC.ChimericproteinscontainingHIV-1epitopes.JournalBiochemistry，MolecularBiologyandBiophysics，2001，5109-20.)。然后洗膜，與綴合辣根過氧化物酶(HRPO)(Amersham，UK)的羊抗小鼠抗體(1∶2000)溫育。洗滌幾次以后，利用ECLWestern印跡檢測系統(tǒng)(Amersham，UK)，按照廠家說明書進行免疫印跡。在FPCR3感染的培養(yǎng)物中檢測到分子量50-64kDa的一條特異性條帶。在親代FP9病毒感染的CEF中沒有檢測到蛋白質(圖3B)實施例8.評價FPSCR3gpt感染的CEF的CR3表達。按照與前一實施例類似的方法，利用Western印跡證實FPSCR3gpt的CR3表達。在FPSCR3gpt感染的培養(yǎng)物中也檢測到分子量50y64kDa的一條特異性條帶，而在親代FP9病毒感染的CEF中未檢測到蛋白質(圖4B)。實施例9.純化FPCR3和FPSCR3gpt并免疫小鼠重組FPV的大量原種在從無特定病原體雞群的蛋獲得的CEF中生長。利用BeckmanSW28轉子，細胞質提取物通過25％(w/v)蔗糖墊以29000rpm離心2小時，純化FPV。然后利用CEF單層的噬斑分析，確定病毒滴度。圖5表明，培養(yǎng)物按比例增加以后，CR3的表達不變。通過靜脈內(i.v)、腹膜內(i.p)或皮下(s.c)途徑，利用200μl2.5-5×107pfu的FPCR3、FPSCR3gpt或陰性對照病毒的無菌PBS致敏(primed)年青的成熟(5-8周齡)雌性Balb/c小鼠(得自theSPFbreedingcolony，theInstituteforAnimalHealth，Compton，UK，或theCentroNaciornaldeProduccióndeAnimalesdeLaboratorio(CENPALAB)，Cuba)。2-4周以后，小鼠通過相同途徑加強，二次劑量為200μl2.5-9×107pfu的相同病毒的無菌PBS。實施例10.檢測Balb/c小鼠針對CR3的CTL應答利用基于前已述及的方法，進行酶聯(lián)免疫斑點(Enzyme-linked-immunospot，ELISPOT)分析，檢測抗原特異性IFN-γ-釋放細胞(TanguayS和JJKillion.DirectcomparisonofELISPOTandELISA-basedassaysfordetectionofindividualcytokine-secretingcells.1994.LymphokineCytokineRes，13259-263)。簡言之，immobilon-P膜96孔板(Millipore，Molsheim，F(xiàn)rance)包被100μl/孔的5μg/ml小鼠IFN-γ特異性單克隆抗體R4(Pharmingen，SanDiego，California)，4℃過夜，PBS洗滌3X，利用添加10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基37℃封閉1h。然后加入測試細胞其為利用FPCR3或FPSCR3gpt致敏和加強的小鼠的離體脾細胞懸浮液(如上所述制備)。每孔加入不同數(shù)量的測試細胞106、2×105和4×104。通過加入與1μM合成肽溫育的P815細胞、或者CR3、Gag或Nef的VV重組體按5pfu/細胞的m.o.i感染的P815細胞，對細胞進行刺激。包括不含肽或者經(jīng)對照的痘苗病毒(vSC8或野生型痘苗株WR)感染的P815細胞，以顯示產(chǎn)IFN-γ細胞的本底數(shù)。每孔終體積為200μlR10培養(yǎng)基加上hIL-2。所有分析變量一式兩份進行測試。溫育過夜(至少17小時)以后，平板用PBS洗滌3X，用PBS加上0.05％Tween20洗滌5X，然后加入0.5g/ml生物素綴合的第二抗體XMG1.2(Pharmingen，SanDiego，California)，室溫下反應2h。各孔用PBS加0.05％Tween20洗滌5X，加入在PBS加0.05％Tween20中按1/1000稀釋的堿性磷酸酶(AP)標記的鏈親和素(VectorLabs，CA，USA)，室溫下1h。各孔再用PBS加0.05％Tween20洗滌3X，PBS洗滌3X，利用AP活性試劑盒(Biorad，CA，USA)形成斑點。15分鐘后，各孔用自來水洗滌、干燥，在立體顯微鏡下(LeicaMicroscopySystem，Heerbrugg，Switzerland)計數(shù)斑點。另外，我們在某些分析中使用1/800稀釋的HRPO標記的鏈親和素(Amersham，UK)；然后利用0.1％的3，3’-二氨基聯(lián)苯胺(Sigma，SaintLouis，USA)50mMTris-HCl，pH7.4溶液和0.1％過氧化氫形成斑點。結果表示為每106脾細胞或分離的細胞中斑點形成細胞(SFC)的數(shù)目。數(shù)值超過每組陰性對照(不含肽、或對照VV感染的P815)的兩倍，則認為陽性。兩次獨立ELISPOT分析的結果如圖6所示。在針對經(jīng)VVCR3或VVgag和VVnef感染的、或經(jīng)V3MN肽(LKKKRIHIGPGRAFYERY)致敏的P815的IFNγELISPOT中，F(xiàn)PCR3免疫的Balb/c小鼠的大部分脾細胞是陽性，而陰性病毒免疫則沒有陽性脾細胞。在另一實驗中，如上所述用FPCR3或FPSCR3gpt免疫Balb/c小鼠，利用cr3穩(wěn)定轉染的P815(P815cr3)測定誘導的CTL。該實驗的結果如圖7所示。兩種重組FPV均誘導大部分的CR3特異性的IFBγ分泌細胞。實施例11.AIDS患者淋巴細胞對CR3表位的加工和識別。HIV感染患者的自體B細胞經(jīng)EBV轉化，用CR3的VV重組體(VVCR3)感染。這些靶細胞與HIV患者的外周血淋巴細胞溫育，利用ELISPOT計算分泌IFNγ的脾細胞數(shù)目。本實驗證實，痘病毒表達的cr3基因能夠將其表位有效呈遞給HIV感染患者的CTL淋巴細胞。序列表<110>CENTRODEINGENIERIA基因TICAYBIOTECNOLOGIA<120>人類免疫缺陷病毒嵌名蛋白質的重組痘病毒<130>hiv<140><141><150>CU2001-0057<151>2001-02-28<160>1<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>1333<212>DNA<213>人類免疫缺陷病毒<220><221>基因<222>(1)..(1333)<223>Gencr3序列<400>1atgcgtatcaaacagattatcaacatgtggcaggaagtgggcaaagcgatgtatgccccg60ccgatttctggtatggttgagcagatgcatgaagatatcattagcctgtgggaccagtct120cttaagaaaaagcgtatccacattggcccaggccgtgcattctatgaaagatacctaaag180gatcaacagctcctagggaaaaagcaactgctgtttattcatttcagaattgggtgtcga240catagcagaaagaaagagatctgtacagaaatggaaaaggaagggaaaatttcaaaaatt300gggcctgaaaatccatacaatactccagtatttgctataaagaaaaaagacagtactaaa360tggagaaaactagtagatttcagagaacttaataaaagaactcaagacttctgggaagtt420cagttaggaataccacaccccgcagggttaaaaaagaaaaaatcagtaacagtattggat480gtgggtgatgcatacttttcagttcccttagataaagactttagaaagtatactgcattt540accatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatcagtacaatgtgctgcca600cagggatggaaaggatcaccagcaatattccaaagtagcatgacaaaaatcttagagcct660tttagaaaacagaatccagacatagttatctatcaatacatggatgatttgtatgtagga720tcggacatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaagca780caagaggaggaggagatgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact840tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta900attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac960ttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga1020tggtgctacaagctagtaccagttgagccacatgcagggcctattgcaccaggccaaatg1080agagaaccaaggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaatagga1140tggatgacaaataatccacctatcccagtaggagaaatctataaaagatggataatcctg1200ggattaaataaaatagtaagaatgtatagccctaccagctttctggacataagacaagga1260ccaaaggaaccctttagagattatgtagaccggttctataaaactctaagagccgaataa1320tctagaacggatc133權利要求1.包含不同HIV-1基因片段的嵌合基因，其中這些片段編碼富含細胞毒性T細胞(CTL)表位的區(qū)域，其由多種主要組織相容性復合物(HLA-1)抗原呈遞，也可以包含HIV的T輔助(Th)細胞表位以及至少一種為單克隆抗體靶物的B細胞表位。2.權利要求1所述基因，其編碼包含至少一種HIV結構蛋白質以及一種HIV非結構蛋白質片段的嵌合多蛋白質。3.權利要求2所述基因，其編碼包含HIV-1蛋白質逆轉錄酶、P24和Nef的片段，gp120、gp41和vpr的Th表位以及gp120的B細胞表位的嵌和多蛋白質。4.權利要求3的基因，其編碼包含逆轉錄酶的203-259、P24的219-307和Nef.的45-147片段，gp120的T1和T2、gp41的580-594和vpr的566-580Th細胞表位以及Mab2C4識別的MN株V3區(qū)的B細胞表位的嵌和多蛋白質。5.權利要求4所述基因，其DNA序列與cr3基因序列基本一致。6.嵌和蛋白質，其氨基酸序列與CR3蛋白質的序列基本一致。7.包含不同HIV-1基因片段的異源基因重組病毒，其中所述片段編碼富含CTL表位的區(qū)域，其由多種HLA-1抗原呈遞，也可以包含HIV-1的T輔助細胞表位以及至少一種由Mab識別的B細胞表位。8.權利要求7所述重組病毒，其中該異源基因編碼包含至少一種HIV結構蛋白質以及一種HIV非結構蛋白質的片段的嵌合蛋白質。9.權利要求8所述重組病毒，其中該異源基因編碼包含HIV-1蛋白質RT、P24和Nef的片段，gp120、gp41和vpr的Th表位以及gp120的B細胞表位的嵌和蛋白質。10.權利要求9的重組病毒，其中異源基因編碼包含RT的203-259、P24的219-307和NEF的45-147片段，gp120的T1和T2、gp41的580-594和vpr的566-580Th細胞表位以及Mab2C4識別的MN株V3區(qū)的B細胞表位的嵌和蛋白質。11.權利要求10的重組病毒，其中該異源基因的DNA序列與cr3基本一致。12.權利要求7-11所述病毒，其中該病毒為痘病毒。13.權利要求7-12所述病毒，其中該病毒為禽痘病毒。14.權利要求7-13所述病毒，其中該病毒為鳥痘病毒。15.權利要求7-14所述病毒，其中該病毒為FPCR3。16.權利要求7-14所述病毒，其中該病毒為FPCR3gpt。17.疫苗制劑，其包含·權利要求7-16所述重組病毒?！に帉W可接受的載體。18.權利要求17所述疫苗制劑的用途，用于誘導AIDS病人或未感染者針對HIV的免疫應答。19.由權利要求17所述疫苗制劑以及免疫強化劑物質組成的預防或治療組合。20.權利要求19所述預防或治療組合，其中該免疫強化劑物質為細胞因子。21.權利要求20所述預防或治療組合，其中該細胞因子為IL2。22.包含權利要求1-5所述嵌和基因的質粒載體，該嵌和基因位于哺乳動物細胞啟動子控制之下。23.疫苗制劑，其包含·權利要求22所述重組質粒載體·藥學可接受的載體。24.權利要求23所述疫苗制劑的用途，用于誘導AIDS病人或未感染者針對HIV不同蛋白質的免疫應答。25.由權利要求23所述疫苗制劑以及免疫強化劑物質組成的預防或治療組合。26.權利要求25所述預防或治療組合，其中該免疫強化劑物質為細胞因子。27.權利要求26所述預防或治療組合，其中該細胞因子為IL2。全文摘要本發(fā)明涉及HIV不同基因片段聯(lián)合形成的HIV嵌合基因，其中所述片段包含細胞毒性T細胞(C孔)或HIV－1輔助T細胞的表位，其由人1型主要組織相容性復合物(HLA－1)的多種抗原呈遞。從該基因得到用于抗HIV/AIDS感染的預防和治療接種的重組痘病毒，能夠在接種的實驗動物中產(chǎn)生保護性細胞免疫應答，并可由HIV/AIDS患者的CTL淋巴細胞識別。文檔編號C12N15/39GK1526018SQ02803413公開日2004年9月1日申請日期2002年2月22日優(yōu)先權日2001年2月28日發(fā)明者E·伊格萊西亞斯派瑞茲,E伊格萊西亞斯派瑞茲,D·M·巴斯克斯布魯穆奎斯特,巴斯克斯布魯穆奎斯特,C·A·杜阿爾特卡諾,杜阿爾特卡諾申請人:遺傳工程與生物技術中心