專(zhuān)利名稱(chēng)：抑制靶基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制靶基因表達(dá)的方法，用途，和藥物。
從WO 99/32619和WO 00/44895已知使用雙鏈核糖核酸(dsRNA)抑制醫(yī)學(xué)或生物技術(shù)上令人感興趣的基因的方法。盡管該已知的方法有高效率，但是勿庸置疑對(duì)于進(jìn)一步提高它們的效率仍然存在著需求。
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。特別地，公開(kāi)了一種方法，應(yīng)用，和藥物，通過(guò)它們可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的更有效的抑制。
通過(guò)權(quán)利要求1，41，和81的特征實(shí)現(xiàn)該目的。有利的實(shí)施方案來(lái)自權(quán)利要求2-40，42-80，和82-120的特征。
令人驚奇地，根據(jù)本發(fā)明要求的特征，體外和體內(nèi)靶基因表達(dá)的抑制效率實(shí)現(xiàn)大大提高。作為dsRNA末端特定形成的結(jié)果，能以定向的方式實(shí)現(xiàn)它們?cè)诮閷?dǎo)對(duì)靶基因的表達(dá)的抑制作用以及它們的穩(wěn)定性的效率。作為這種提高的穩(wěn)定性的結(jié)果提高了細(xì)胞中的活性濃度。
在本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)中，″靶基因″理解意思是細(xì)胞中雙鏈DNA的DNA鏈，它與包括所有的作為轉(zhuǎn)錄模板的被轉(zhuǎn)錄區(qū)的DNA鏈互補(bǔ)。換句話(huà)說(shuō)，″靶基因″一般是有義鏈。一條鏈，或反義鏈(as1)能與RNA轉(zhuǎn)錄物或者其在靶基因表達(dá)期間形成的加工產(chǎn)物例如mRNA互補(bǔ)。術(shù)語(yǔ)″導(dǎo)入″理解是指攝取到細(xì)胞中。利用細(xì)胞本身可以進(jìn)行攝取。但是，輔助試劑或裝置也可以介導(dǎo)攝取?！逋怀龆恕謇斫庵肝挥谝欢说耐怀鑫?，它不是沃森-克里克堿基配對(duì)多核苷酸?！咫p鏈結(jié)構(gòu)″理解是指一般根據(jù)沃森-克里克堿基配對(duì)的各條鏈的核苷酸結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)中，雙鏈結(jié)構(gòu)也可以具有各個(gè)錯(cuò)配。
在特別有利的實(shí)施方案中，dsRNA I在一條鏈或反義鏈as1的3′-端和/或另一條鏈或反義鏈ss1的3′-端有突出端。dsRNA I還可以在一段是平端。在這種情況下，平端有利地位于具有一條鏈(反義鏈；as1)的5′-端的dsRNA I的這一側(cè)上。在該實(shí)施方案中，在生物活體中dsRNA I具有非常好的效率和大的穩(wěn)定性。總體內(nèi)效率是出色的。突出端有利地由1-4個(gè)核苷酸組成，優(yōu)選1或2個(gè)核苷酸。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)向細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)于本發(fā)明的dsRNA I的至少一條另外的dsRNA II時(shí)本發(fā)明的效率能被進(jìn)一步提高，其中dsRNA I的雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈，或一條鏈的至少一個(gè)片段與靶基因的有義鏈的第一區(qū)互補(bǔ)，并且dsRNA II的雙鏈結(jié)構(gòu)的另一條鏈，或另一條鏈的至少一個(gè)片段與靶基因的有義鏈的第二區(qū)互補(bǔ)。在這種情況下靶基因表達(dá)的抑制作用被大大增強(qiáng)。第一和第二區(qū)片段能重疊，彼此連接，或是分開(kāi)的。
進(jìn)一步證明當(dāng)dsRNA I和/或另外的dsRNA II長(zhǎng)度少于25個(gè)連續(xù)的核苷酸對(duì)時(shí)是有利的。已經(jīng)證明19和23個(gè)核苷酸對(duì)長(zhǎng)度是特別有效的。當(dāng)優(yōu)選19-23個(gè)核苷酸對(duì)形成的雙鏈中存在包含1-4個(gè)核苷酸的單鏈突出的時(shí)效率被進(jìn)一步提高。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，靶基因具有所附序列表中所示序列SQ001-SQ140之一。它可以選自下組癌基因，細(xì)胞因子基因，Id蛋白質(zhì)基因，朊病毒基因，來(lái)自誘導(dǎo)血管生成分子的基因，來(lái)自粘附分子的基因，和來(lái)自細(xì)胞表面受體的基因；來(lái)自轉(zhuǎn)移和/或侵入過(guò)程中涉及的蛋白質(zhì)的基因；來(lái)自蛋白酶和調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡和細(xì)胞周期的分子的基因；表達(dá)EGF受體的基因。特別地，靶基因可以是MDR1基因。因此可以使用序列SQ141-173之一或者合成整體反義-(as)和有義序列(ss)的組合之一組成的dsRNA I/II。
根據(jù)另一個(gè)有利的實(shí)施方案，根據(jù)RNA干擾原理抑制表達(dá)。
靶基因有利地在致病生物體，優(yōu)選瘧原蟲(chóng)中表達(dá)。它可以是病毒或類(lèi)病毒特別是在人體中是致病性的病毒或類(lèi)病毒的成分。病毒或類(lèi)病毒也可以是在動(dòng)物或植物中呈致病性的病毒或類(lèi)病毒。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，未配對(duì)的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
dsRNA I/II的至少一個(gè)末端可以被修飾來(lái)阻止在細(xì)胞中分解或者各條鏈解離。有利地，通過(guò)至少一個(gè)化學(xué)鍵增強(qiáng)互補(bǔ)核苷酸對(duì)產(chǎn)生的雙鏈結(jié)構(gòu)的內(nèi)聚性。通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵，氫鍵，疏水作用可以實(shí)現(xiàn)化學(xué)鍵，優(yōu)選利用范德華作用或堆積作用，或利用金屬離子配位作用。另外，還證明了如果在一端附近存在化學(xué)鍵則是有利的并且提高穩(wěn)定性。在權(quán)利要求24-30中關(guān)于化學(xué)鍵給出了其它有利的實(shí)施方案，不需要再進(jìn)一步解釋。
當(dāng)dsRNA I/II被圍繞在微團(tuán)結(jié)構(gòu)優(yōu)選脂質(zhì)體中時(shí)，它可以特別容易地被導(dǎo)入細(xì)胞中。對(duì)于將dsRNA I/II轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)它們與至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)結(jié)合，與至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)締合，或者被至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)圍繞，所述病毒外殼蛋白質(zhì)源于病毒，或者來(lái)自病毒，或者是合成制備的。所述外殼蛋白可以來(lái)自多瘤病毒。特別地，所述外殼蛋白可以含有多瘤病毒的病毒蛋白質(zhì)1(VP1)和/或病毒蛋白質(zhì)2(VP2)。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，提出在從外殼蛋白形成殼體或殼體樣結(jié)構(gòu)時(shí)，一側(cè)轉(zhuǎn)向殼體或殼體樣結(jié)構(gòu)內(nèi)部。此外，有利的是，dsRNA I/II的一條鏈(as1/as2)與靶基因的初始的或加工過(guò)的RNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)。所述細(xì)胞可以是脊椎動(dòng)物細(xì)胞或人細(xì)胞。
此外，已經(jīng)證明可以對(duì)哺乳動(dòng)物優(yōu)選對(duì)人施用dsRNA I/II，甚至以每天每千克體重5毫克的最大劑量。即使在該低劑量下功效也是出色的。令人驚奇地，已經(jīng)證明dsRNA I/II可以在緩沖液中混合，然后口服或者注射或灌注給藥，通過(guò)靜脈內(nèi)，腫瘤內(nèi)，腹膜內(nèi)，或者吸入給藥。
此外，本發(fā)明提供一種雙鏈核糖核酸(dsRNA I)抑制靶基因在細(xì)胞中表達(dá)的用途，其中dsRNA I具有最多由49個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)組成的雙鏈結(jié)構(gòu)，而且其中所述雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈(反義鏈，as1)或者所述該條鏈的至少一個(gè)片段與靶基因的有義鏈互補(bǔ)，并且其中dsRNA I在一端具有一個(gè)由1-4個(gè)核苷酸組成的突出端。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供含有足以抑制靶基因在細(xì)胞中表達(dá)的量的雙鏈核糖核酸(dsRNA I)的藥物，其中dsRNA I具有最多由49個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)組成的雙鏈結(jié)構(gòu)，而且其中所述雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈(as1)或者一條鏈(as1)的至少一個(gè)片段與靶基因的有義鏈互補(bǔ)，并且其中dsRNA I在一端至少具有一個(gè)由1-4個(gè)核苷酸組成的突出端。
參照上面的討論，可以得到dsRNA I/II的其它有利實(shí)施方案。
根據(jù)下面的附圖和實(shí)施例解釋本發(fā)明。這些是

圖1a，b第一和第二雙鏈RNA圖，圖2靶基因圖，圖3NIH/3T3細(xì)胞中施用各種dsRNAs之后相對(duì)YFP熒光(第一個(gè)實(shí)驗(yàn))，圖4NIH/3T3細(xì)胞中施用各種dsRNAs之后相對(duì)YFP熒光(第二個(gè)實(shí)驗(yàn))，
圖5NIH/3T3細(xì)胞中施用各種dsRNAs之后相對(duì)YFP熒光(第三個(gè)實(shí)驗(yàn))，圖6NIH/3T3 胞中施用各種dsRNAs之后相對(duì)YFP熒光(第四個(gè)實(shí)驗(yàn))，圖7Hela-S3細(xì)胞中施用各種dsRNAs之后相對(duì)YFP熒光(第五個(gè)實(shí)驗(yàn))，圖8pcDNA-YFP轉(zhuǎn)染之后或pcDNA-YFP和各種ds RNAs共轉(zhuǎn)染之后NIH/3T3細(xì)胞的熒光顯微成像，圖9pcDNA-YFP轉(zhuǎn)染之后或pcDNA-YFP和各種dsRNAs共轉(zhuǎn)染之后HeLa-S3細(xì)胞的熒光顯微成像，圖10在小鼠血清中溫育之后S1的凝膠電泳分離，圖11在人血清中溫育之后S1的凝膠電泳分離，圖12在小鼠血清中溫育之后S7的凝膠電泳分離，圖13在人血清中溫育之后S7的凝膠電泳分離，圖14在小鼠血清中溫育之后K3的凝膠電泳分離，圖15在小鼠血清中溫育之后PKC1/2的凝膠電泳分離，圖16在人血清中溫育之后S1A/S4B的凝膠電泳分離，圖17在人血清中溫育之后K2的凝膠電泳分離，和圖18來(lái)自轉(zhuǎn)基因GFP小鼠的腎石蠟切片的GFP-特異性免疫過(guò)氧化物酶染色，圖19來(lái)自轉(zhuǎn)基因GFP小鼠的心臟石蠟切片的GFP-特異性免疫過(guò)氧化物酶染色，圖20來(lái)自轉(zhuǎn)基因GFP小鼠的胰腺石蠟切片的GFP-特異性免疫過(guò)氧化物酶染色，圖21血漿中GFP表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析，圖22腎中GFP表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析，圖23心臟中GFP表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析，圖24U-87MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中EGFR表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析，圖25a結(jié)腸癌細(xì)胞系LS174T中MDRI mRNA水平的RNA印跡分析，其中在74小時(shí)之后收集細(xì)胞，圖25b圖25a泳帶的定量分析，其中平均值由兩個(gè)值得出的，
圖26a結(jié)腸癌細(xì)胞系LS174T中MDRI mRNA水平的RNA印跡分析，其中在48小時(shí)之后收集細(xì)胞，圖26b圖26a泳帶的定量分析，其中代表兩個(gè)值的平均值，圖27 175nM dsRNA(表4中序列R1)轉(zhuǎn)染作用的發(fā)射光-和熒光顯微成像之比較。
圖1a和1b中圖示說(shuō)明的雙鏈核酸dsRNA I和dsRNA II具有第一末端(E1)和第二末端(E2)。第一和第二核糖核酸dsRNA I/dsRNA II在兩端(E1，E2)具有單鏈片段，由大約1-4個(gè)未配對(duì)的核苷酸形成。給出了兩種可能的變體(變體1和2)，其中變體2具有平端(E2)。然而平端也可以位于其它變體的另一端(E1)。
圖2圖示說(shuō)明位于DNA上的靶基因。用黑線(xiàn)表示靶基因。其具有第一區(qū)(B1)和第二區(qū)(B2)。
在各種情況下，第一dsRNA I(as1)或第二dsRNA II(as2)的一條鏈分別與靶基因中相應(yīng)的B1或B2區(qū)互補(bǔ)。
當(dāng)dsRNA I/dsRNA II在其末端(E1，E2)具有單鏈片段時(shí)靶基因的表達(dá)被特別有效地抑制。單鏈片段可以位于as1鏈或as2鏈上，或者位于反義鏈(ss1或ss2)上，或者位于鏈as1，as2，和反義鏈上。
如圖2所示B1和B2區(qū)可以彼此分開(kāi)，然而它們也可以連接或重疊。
I.成纖維細(xì)胞中YFP基因表達(dá)的抑制作用雙鏈RNAs衍生自黃色熒光蛋白質(zhì)(YFP)的序列，一種來(lái)自Aequoria victoria藻類(lèi)的GFP(綠色熒光蛋白質(zhì))的變體，并且和YFP-編碼質(zhì)粒一起微注射到成纖維細(xì)胞中。接著，分析與沒(méi)有dsRNA的細(xì)胞相比熒光的減少。
實(shí)驗(yàn)方案利用RNA合成儀(Expedite 8909，Applied Biosystems，Weiterstadt，德國(guó))和常規(guī)化學(xué)方法從序列表SQ148，SQ149和SQ159合成單鏈RNA和它們的互補(bǔ)單鏈。這些接著用HPLC純化。通過(guò)將10mM磷酸鈉緩沖液，pH6.8，和100mM NaCl中單鏈的化學(xué)計(jì)量混合物加熱至90℃然后使其緩慢冷卻6小時(shí)達(dá)到室溫，使各條鏈雜交成雙鏈。將用這種方法獲得的dsRNA微注射到試驗(yàn)細(xì)胞中。
用于該細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的試驗(yàn)系統(tǒng)是鼠成纖維細(xì)胞系NIH/3T3，ECACC No.93061524(歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)。pcDNA-YFP質(zhì)粒，其在pcDNA3載體的相應(yīng)限制位點(diǎn)包含800bp Bam HI/Eco RI-YFP片段，被用于微注射。研究同時(shí)轉(zhuǎn)移的序列同源dsRNA的影響下YFP的表達(dá)。最早注射3小時(shí)之后在熒光顯微鏡下進(jìn)行綠熒光分析。
細(xì)胞培養(yǎng)物的制備在培養(yǎng)箱中在37℃下在含有5％CO2的大氣中細(xì)胞在DMEM中與4.5g/l葡萄糖和10％胎牛血清(FCS)，2mM L-谷酰胺，和青霉素/鏈霉素(100IU/100μg/ml，Biochrom)溫育。為了將細(xì)胞保持在指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞每三天傳代。在轉(zhuǎn)染之前的一天，使細(xì)胞受胰蛋白酶作用(10x胰蛋白酶/TEDTA，Biochrom)并且放在包被的培養(yǎng)皿(CORNING細(xì)胞培養(yǎng)皿，35mm，Corning Inc.，Corning NY)中，細(xì)胞密度是0.3×105。該培養(yǎng)皿在37℃ 下與0.2％明膠(Biochrom)溫育至少30分鐘，用PBS洗滌一次，并且立即用于培養(yǎng)細(xì)胞。為了再次發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞，使用CELLocate蓋玻片(55μm見(jiàn)方大小，Eppendorf)。
微注射在微注射之前大約10分鐘從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿。對(duì)于每個(gè)培養(yǎng)皿和每次培養(yǎng)微注射大約50個(gè)細(xì)胞(FemtoJet，Micromanipulator5171，Eppendorf)。使用內(nèi)頂端直徑是0.5μm的玻璃毛細(xì)管(FemtoTip，Eppendorf)。30hPA壓力下注射時(shí)間是0.8秒。在裝有熒光檢測(cè)裝置的Olympus IX50顯微鏡下進(jìn)行微注射。使用的注射緩沖液由含有0.01μg/μl pcDNA-YFP的14mM NaCl，3mM KCl，和10mMKH2PO4，pH7.0，組成。為了微注射成功，向試驗(yàn)加入0.08％(w/v)偶聯(lián)有葡聚糖70000的Texas紅(Molecular Probes，Leiden，Nether lands)注射液。為了分析特異dsRNA對(duì)YFP表達(dá)的抑制作用，向注射液中加入dsRNAs試驗(yàn)10.01μM dsRNA(序列表SQ148/149)；試驗(yàn)20.01μM dsRNA(序列表SQ148/159)；試驗(yàn)3沒(méi)有RNA。微注射之后，細(xì)胞在培養(yǎng)箱中溫育至少又3小時(shí)。然后在顯微鏡下分析胞內(nèi)YFP熒光細(xì)胞同時(shí)發(fā)出紅色和綠色熒光微注射是成功的，沒(méi)有觀(guān)察到作為dsRNA的結(jié)果的YFP表達(dá)的抑制作用；或者有其中沒(méi)有注射dsRNA的對(duì)照細(xì)胞；只有紅色熒光細(xì)胞微注射是成功的，dsRNA抑制YFP表達(dá)。
結(jié)論與沒(méi)有具有單一突出鏈的末端的dsRNA相比較，0.1μg dsRNA濃度下，使用具有在兩個(gè)3′-端均具有由兩個(gè)核苷酸組成的突出端的單鏈區(qū)的dsRNA(序列表SQ148/159)大大提高成纖維細(xì)胞中YFP基因表達(dá)的抑制作用(表1)。
使用短dsRNA分子，該分子包含帶有由幾個(gè)，優(yōu)選1-3個(gè)非堿基配對(duì)單鏈核苷酸組成的突出端的19-25個(gè)堿基對(duì)，使得有可能在相同RNA濃度下比使用具有相同數(shù)目的堿基對(duì)而沒(méi)有相應(yīng)的單鏈突出端的dsRNAs相對(duì)更強(qiáng)地抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)。
表1符號(hào)給出沒(méi)有-或弱-熒光細(xì)胞的相對(duì)比例(+++＞90％；++60-90％-+30-60％；-＜10％)。
II.dsRNA時(shí)培養(yǎng)的HELA-S3細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞中靶基因的基因表達(dá)的抑制通過(guò)操作堿基對(duì)區(qū)的3′-端和長(zhǎng)度可以調(diào)節(jié)以RNA干擾為基礎(chǔ)的dsRNA對(duì)YFP-編碼質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染之后YFP表達(dá)的抑制有效性。
實(shí)施例為了測(cè)定基因表達(dá)的特異抑制中dsRNA的有效性，使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞(來(lái)自NIH瑞士小鼠胚胎的成纖維細(xì)胞，ECCAC[歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心]No.93061524)和HELA-S3(人宮頸癌細(xì)胞，DSMZ[德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)中心]No.ACC 161)。轉(zhuǎn)染使用pcDNA-YFP質(zhì)粒，其在載體pcDNA 3的相應(yīng)切割位點(diǎn)包含800-bp BamHI/Eco RI-YFP片段。制備從黃色熒光蛋白質(zhì)(YFP)的序列來(lái)源的雙鏈RNAs(dsRNAs)，并且和pcDNA-YFP質(zhì)粒一起瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到成纖維細(xì)胞中(使用的特異dsRNAs的反義鏈與YFP和GFP基因序列的相應(yīng)片段互補(bǔ))。48小時(shí)之后定量測(cè)定熒光的減少。只轉(zhuǎn)染了pcDNA-YFP或pcDNA-YFP和對(duì)照dsRNA(不是從YFP序列來(lái)源的)的細(xì)胞被用作對(duì)照物。
試驗(yàn)方案dsRNA合成利用RNA合成儀(Expedite 8909，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)，以及通過(guò)常規(guī)化學(xué)方法，合成序列表中給出的各RNA鏈以及它們的互補(bǔ)單鏈。然后借助于HPLC進(jìn)行粗合成產(chǎn)物的純化。使用NucleoPac PA-100，9×250柱(Dionex)，20mM tris，10mM NaClO4，pH6.8，10％乙腈用作低鹽緩沖液，并且20mM tris，400mM NaClO4，pH6.8，10％乙腈用作高鹽緩沖液。流速是每分鐘3ml。通過(guò)將10mM磷酸鈉緩沖液，pH6.8，和100mM NaCl中單鏈的化學(xué)計(jì)量混合物加熱至80-90℃，然后使其緩慢冷卻6小時(shí)達(dá)到室溫，使單鏈雜交成雙鏈。
接種細(xì)胞在合適的工作臺(tái)(HS18/Hera Safe，Kendro，Heraeus)在無(wú)菌條件下進(jìn)行所有的細(xì)胞培養(yǎng)。對(duì)于小鼠成纖維細(xì)胞在DMEM(Dulbecco′smodified eagle medium，Biochrom)中，對(duì)于HELA細(xì)胞在Ham′s F12中，在飽和的大氣濕度下，在37℃，5％CO2，在培養(yǎng)箱(CO2-培養(yǎng)箱T20，Hera Cell，Kendro，Heraeus)中，用10％FCS(胎牛血清，Biochrom)，2mM L-谷酰胺(Biochrom)，和青霉素/鏈霉素(100IU/100μg/ml，Biochrom)培養(yǎng)NIH/3T3細(xì)胞和HELA-S3。為了將細(xì)胞保持在指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞每三天傳代。在轉(zhuǎn)染之前24小時(shí)，使細(xì)胞受胰蛋白酶作用(10x胰蛋白酶/EDTA，Biochrom，德國(guó))，并且放在96-孔板(Multiwell Schalen 96-孔，平底，Schubert & Weiss Laboratories，GmbH)中，細(xì)胞密度是1.0×104細(xì)胞/孔，并且在150μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
實(shí)施瞬時(shí)轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine PlusTM試劑(Life Technologies)根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。0.15μg pcDNA-YFP質(zhì)粒放在各個(gè)孔中。整個(gè)轉(zhuǎn)染體積是60μl。在各種情況下，開(kāi)始使用3個(gè)樣品。首先，質(zhì)粒DNA與dsRNA一起復(fù)合。在沒(méi)有血清的培養(yǎng)基中稀釋質(zhì)粒DNA和dsRNA，每0.1μg質(zhì)粒DNA(體積10μl)使用1μl PLUS試劑?；旌?5分鐘之后在室溫下溫育。溫育期間對(duì)于每0.1μg質(zhì)粒DNA在10μl沒(méi)有血清的培養(yǎng)基中稀釋0.5μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑，充分混合，加給質(zhì)粒/dsRNA/PLUS-混合物，并且再溫育15分鐘。在溫育期間更換培養(yǎng)基。細(xì)胞用200μl沒(méi)有血清的培養(yǎng)基洗滌一次，然后在培養(yǎng)箱中與40μl沒(méi)有血清的培養(yǎng)基溫育，直到加入DNA/dsRNA/PLUS/脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑。每孔加入20μl DNA/dsRNA/PLUS/脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑之后，細(xì)胞在培養(yǎng)箱中溫育2.5小時(shí)。溫育之后，用200μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌一次，并且在培養(yǎng)箱中在200μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基中溫育24小時(shí)，然后進(jìn)行熒光檢測(cè)。
熒光檢測(cè)最后一次更換培養(yǎng)基之后24小時(shí)，使用帶有USH I02D汞燈(Ushio Inc.，東京，日本)，安裝有WIB熒光管和數(shù)字CCD照相機(jī)(Orca IIIm，Hamamatsu)，和C4742-95預(yù)覽監(jiān)視器的熒光顯微鏡(IX50-S8F2，U-ULS100Hg熒光部件，Brenner U-RFL-T200，Olympus)對(duì)細(xì)胞熒光照像。使用分析軟件3.1(Soft Imaging System GmbH，德國(guó))分析熒光成像。為了使YFP熒光度與細(xì)胞密度相關(guān)，進(jìn)行細(xì)胞核染色(Hoechst染色)。為此將細(xì)胞固定，首先在100μl甲基卡諾氏液(methylcarnoy)(75％甲醇，25％冰醋酸)中固定5分鐘，然后再在甲基卡諾氏液中固定10分鐘?？諝怙L(fēng)干之后，固定的細(xì)胞避光下每孔與100μl Hoechst染劑(75ng/ml)溫育30分鐘。用PBS(DulbeccoPBS w/o Ca2+，Mg2+，Biochrom)洗滌兩次之后，在熒光顯微鏡(Olympus，用于Hoechst的WU熒光管)下對(duì)已經(jīng)Hoechst染色的細(xì)胞照像。
圖3-9中總結(jié)了dsRNA對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞中YFP表達(dá)的抑制結(jié)果表3，4，5和6中總結(jié)了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染之后NIH/3T3小鼠成纖維細(xì)胞中YFP-特異性dsRNAs和對(duì)照dsRNAs對(duì)YFP表達(dá)的效果。根據(jù)試驗(yàn)方案所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。dsRNA的濃度與在轉(zhuǎn)染反應(yīng)期間培養(yǎng)基中的濃度相關(guān)。dsRNA命名可以見(jiàn)表2。它給出以表面百分比表示的每個(gè)成像的相對(duì)熒光度。對(duì)每個(gè)孔分析三個(gè)不同的成像。從三個(gè)成像獲得平均值。
圖7和9給出HELA-S3細(xì)胞中YFP-基因表達(dá)的特異性抑制作用。圖7說(shuō)明不同濃度的不同構(gòu)型的dsRNA構(gòu)建體(表2)對(duì)HeLa細(xì)胞中YFP表達(dá)的抑制作用。圖8給出沒(méi)有dsRNA和有特異性抗-YFP-定向dsRNAs(100倍放大)下，YFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的NIH/3T3小鼠成纖維細(xì)胞的代表性熒光顯微照片。
8AYFP對(duì)照
8BS1，10nM8CS4，10nM8DS7，10nM8ES7/S11，1nM8FS7/S12，1nM圖9給出沒(méi)有dsRNA和有特異性抗-YFP-定向dsRNAs(100培放大)下，YFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HELA-3S細(xì)胞的代表性熒光顯微照片。
9AK2對(duì)照，10nM9BS1，10nM9CS4，10nM9DS7，10nM9ES7/11，1nM9FS7/12，1nM9GS1A/S4B，10nM9HYFP對(duì)照結(jié)論圖3說(shuō)明當(dāng)含有22-和19-堿基對(duì)的dsRNAs區(qū)的3′-端具有由2個(gè)核苷酸(nt)組成的單鏈片段時(shí)，YFP質(zhì)粒和特異性抗-YFP-序列-定向dsRNAs共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞之后YFP表達(dá)能被特別有效地抑制。而帶有3′-平端的S1 dsRNA在1nM濃度下(相對(duì)于轉(zhuǎn)染期間細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度)對(duì)YFP表達(dá)沒(méi)有抑制作用，S7 dsRNA(19個(gè)核苷酸對(duì))和S4(22個(gè)核苷酸對(duì))，各自在兩個(gè)3′-端帶有2nt突出端，分別將YFP表達(dá)抑制50％和70％，與相應(yīng)對(duì)照dsRNAs(K3和K2)比較而言。在10nM濃度下，命名為S1的帶有平端的dsRNA抑制YFP表達(dá)約65％，而S4 dsRNA抑制YFP表達(dá)～93％(圖4)。命名為S4和S7的dsRNAs的抑制作用是濃度依賴(lài)性的(圖3和4；也參見(jiàn)圖7)。
圖4說(shuō)明YFP基因表達(dá)的有效表達(dá)不需要兩個(gè)(有義和反義鏈)3′-端有單鏈構(gòu)型。為了實(shí)現(xiàn)YFP表達(dá)的有效抑制，只需要反義鏈的3′-端有2nt突出端，因此，對(duì)于S4 dsRNAs(兩個(gè)3′-端帶有2nt突出端)和S1A/S4B(反義鏈的3′-端有一個(gè)2nt突出端)，1nM濃度下的YFP表達(dá)的抑制是～70％。不過(guò)，如果另一方面，2nt突出端位于有義鏈的3′-端(并且反義鏈的3′-端不具有單鏈區(qū))，YFP基因表達(dá)的抑制是50％。類(lèi)似地，當(dāng)反義鏈的3′-端至少帶有2nt突出端，則較高濃度下抑制作用好得多。
當(dāng)堿基對(duì)區(qū)具有21個(gè)核苷酸對(duì)而不是22(S1和S4)，20(S13或S13/14，或19(S7)(圖5，6，和7)，則實(shí)現(xiàn)更顯著的YFP表達(dá)的抑制作用。因此，在5nM濃度下，S1(帶有平端的22個(gè)堿基對(duì))對(duì)YFP表達(dá)的抑制是～40％，而也是5nM下，S7/S12(帶有平端的21個(gè)堿基對(duì))的抑制作用是約92％。如果帶有21個(gè)堿基對(duì)的dsRNA在反義鏈3′-端帶有另一個(gè)2nt突出端(S7/S11)，則抑制作用是～97％(比較而言，S4是約73％抑制，S7是～70％抑制)。
III.雙鏈RNA(dsRNA)的血清穩(wěn)定性分析目的是利用細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的dsRNAs介導(dǎo)的的對(duì)靶基因基因表達(dá)的抑制作用的有效性并且強(qiáng)化其體內(nèi)應(yīng)用。通過(guò)提高dsRNA在血清中的穩(wěn)定性，并且通過(guò)延長(zhǎng)分子在血液循環(huán)中的滯留時(shí)間，或者通過(guò)由上述產(chǎn)生的功能分子的有效濃度，實(shí)現(xiàn)該目的。
實(shí)施例離體對(duì)鼠和人血清測(cè)試抑制GFP-表達(dá)的dsRNAs的血清穩(wěn)定性。
試驗(yàn)方案37℃下溫育人和鼠血清與相應(yīng)的dsRNA。在各種情況下，85μl血清與15μl 100μN(yùn)M dsRNA溫育。溫育一段時(shí)間之后(30分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí))，樣品在-80℃下冷凍。0時(shí)間的沒(méi)有血清的dsRNA+85μl ddH2O)和有血清的dsRNA被用作對(duì)照物。
為了從培養(yǎng)物中分離dsRNA，在冰上進(jìn)行，向個(gè)培養(yǎng)物加入400μl0.1％ SDS，然后用苯酚萃取500μl苯酚∶氯仿∶異戊醇(IAA，25∶24∶1，Roti phenol，Roth，Karlsruhe)，然后在最高設(shè)置下渦旋30秒(Vortex Genie-2，Scientific Industries)。在冰上溫育10分鐘之后，通過(guò)在12,000xg，4℃下離心10分鐘進(jìn)行相分離(Sigms 3K30，Rotor 12131-H)。收集上層水相(大約200μl)，然后進(jìn)行消化首先用DNA酶I然后用蛋白酶K20μl 10x DNA酶緩沖液(100mM tris，pH7.5，25mM MgCl2，1mM CaCl2)和10U DNA酶I(D7291，Sigma-Aldrich)，加入，在37℃下溫育30分鐘，然后再加入6U DNA酶I，在37℃ 下再溫育20分鐘。然后加入5μl蛋白酶K(20mg/ml，04-1075，Peqlab，德國(guó))，在37℃下溫育30分鐘。然后進(jìn)行苯酚萃取。向其中加入500μl苯酚∶氯仿∶IAA(25∶24∶1)，最高設(shè)置下渦旋30秒，然后在4℃ 下以12,000xg離心10分鐘。去除上清液并且依次換成40μl 3M Na-Ac(乙酸鈉)，pH5.2，和1ml 100％EtOH；充分混合并且在-80℃下沉淀至少1小時(shí)。在4℃下以12,000xg離心30分鐘使沉淀物成顆粒狀物，用70％EtOH洗滌，再次離心(10分鐘，12,000xg，4℃)。然后將風(fēng)干的顆粒狀物混合在30μl RNA凝膠應(yīng)用緩沖液(7M脲，1x TBE
溴酚藍(lán)，0.2％[w/v]二甲苯苯胺)中，并且在凝膠應(yīng)用之前保存在-20℃下。
為了表征dsRNA，進(jìn)行分析，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(分析PAGE)。在電泳之前制備脲凝膠攪拌下7M脲(21g)溶解于25ml 40％丙烯酰胺/雙丙烯酰胺水溶液(Rotiphoresis凝膠，A515.1，Roth)和5ml 10x TBE(每升蒸餾水108g tris，55g硼酸，3.9g EDTA)，并且用蒸餾水稀釋至50ml。倒入之前，加入50μl TEMED(N，N，N′，N′-四甲基乙二胺)和500μl 10％APS(硫酸過(guò)氧化氨)。聚合作用之后，將凝膠放在垂直電泳儀器(Merck，Darmstadt)中，在恒定的安培數(shù)40mA下流出第一級(jí)分30分鐘。1x TBE緩沖液用作洗脫緩沖液。在將它們應(yīng)用到凝膠上之前，將RNA樣品在100℃加熱5分鐘，在冰上冷卻，然后在臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf Minispin)上離心20。對(duì)凝膠加15μl的各種樣品。試驗(yàn)在40mA的恒定安培數(shù)下進(jìn)行大約2小時(shí)。電泳之后，用全染劑溶液(20ml全染劑溶液[200mg全溶劑溶解于200ml甲醛]和200ml蒸餾水和100ml甲酰胺)對(duì)凝膠染色，然后通過(guò)用蒸餾水淋洗45分鐘去除本底染劑。使用Pharmacia的Image MasterVDS光文件編制系統(tǒng)對(duì)凝膠照像。圖10至17說(shuō)明與人或鼠血清溫育，接著在20％ 7M脲凝膠中電泳分離之后dsRNA的血清穩(wěn)定性。
圖10小鼠血清中S1(0-22-0)的溫育1.0時(shí)間(沒(méi)有血清)2.0時(shí)間3.30分鐘4.1小時(shí)5.2小時(shí)
6.4小時(shí)7.12小時(shí)8.2μl 100μM S1，沒(méi)有溫育S1A)有義鏈S1(10μl 20μM S1A)S1B)反義鏈S1(10μl 20μM S1B)圖11人血清中S1(0-22-0)的溫育1.沒(méi)有處理的2μl 100μM S1(沒(méi)有溫育)2.30分鐘3.2小時(shí)4.4小時(shí)5.6小時(shí)6.8小時(shí)7.12小時(shí)8.24小時(shí)S1A)有義鏈S1(10μl 20μM S1A)S1B)反義鏈S1(10μl 20μM S1B)圖12小鼠血清中S7(2-19-2)的溫育1.0時(shí)間(沒(méi)有血清)2.30分鐘3.4小時(shí)4.12小時(shí)圖13人血清中S7(2-19-2)的溫育1.有義鏈S7(10μl 20μM S7A)2.反義鏈S7(10μl 20μM S7B)3.30分鐘4.1小時(shí)5.2小時(shí)6.4小時(shí)7.6小時(shí)8.12小時(shí)9.24小時(shí)10.0時(shí)間(沒(méi)有血清)
圖14小鼠血清中K3(2-19-2)的溫育1.有義鏈K3(10μl 20μM K3A)2.反義鏈K3(10μl 20μM K3B)3.0時(shí)間(沒(méi)有血清)4.0時(shí)間(有血清)5.30分鐘6.1小時(shí)7.2小時(shí)8.4小時(shí)9.12小時(shí)圖15小鼠血清中PKC1/2(0-22-2)的溫育1.30分鐘2.1小時(shí)3.2小時(shí)4.4小時(shí)5.12小時(shí)6.2μl 100μM PKC1/2(沒(méi)有處理的)圖16人血清中S1A/S4B(0-22-2)的溫育1.0時(shí)間(沒(méi)有血清)2.24小時(shí)3.12小時(shí)4.8小時(shí)5.6小時(shí)6.4小時(shí)7.2小時(shí)8.30分鐘9.有義鏈S1A(10μl 20μM S1A)10.反義鏈S4B(10μl 20μM S4B)圖17人血清中K2(2-22-2)的溫育1.有義鏈K2(10μl 20μM K2A)2.反義鏈K2(10μl 20μM K2B)3.0時(shí)間(沒(méi)有血清)
4.30分鐘5.2小時(shí)6.4小時(shí)7.6小時(shí)8.8小時(shí)9.12小時(shí)10.24小時(shí)結(jié)果與3′-端有單鏈2nt突出端的dsRNAs相比，在人和小鼠血清中，3′-端沒(méi)有單鏈區(qū)的dsRNAs穩(wěn)定得多(圖10-14和17)。各自在鼠血清和人血清中溫育S1 12和24小時(shí)之后，原來(lái)大小的一條泳帶幾乎保持完全完整。相反，兩個(gè)3′-端有2nt突出端的dsRNAs的穩(wěn)定性在人和鼠血清中大大降低。即使在S7(圖12和13)或K3(圖14)只溫育4小時(shí)之后，仍然檢測(cè)不到原來(lái)大小的泳帶。
為了提高dsRNA在血清中的穩(wěn)定性，如果dsRNA帶有一個(gè)平頭端就足夠了。當(dāng)與S7(4小時(shí)之后完全分解；圖12，泳道3)相比較時(shí)，溫育4小時(shí)之后，在所有的小鼠血清中，原來(lái)大小的帶幾乎沒(méi)有破碎(圖15，泳道4)。
關(guān)于dsRNA的生物有效性的最佳折中方案可以是利用帶有一個(gè)平端和一個(gè)2nt單鏈區(qū)的dsRNA，其中單鏈突出端位于反義鏈的3′-端。
這里使用的序列在下面表2中和在序列表SQ148-151和153-167中重復(fù)表示。
表2IV.體內(nèi)研究對(duì)蛋白質(zhì)生物合成中涉及的所有細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的″GFP實(shí)驗(yàn)室小鼠″的尾靜脈注射分別從GFP序列和非特異性dsRNA來(lái)源的雙鏈RNA(dsRNA)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)殺死動(dòng)物并且分析組織切片和血漿GFP表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)方案dsRNA合成利用RNA合成儀(Expedite 8909，Applied Biosystems，Weiterstadt，德國(guó))，并通過(guò)常規(guī)化學(xué)方法，合成序列表中給出的各RNA鏈和它們的各互補(bǔ)鏈。然后借助HPLC對(duì)粗合成產(chǎn)物進(jìn)行純化。使用NucleoPac PA-100，9×250柱(Dionex)20mM tris，10mMNaClO4，pH6.8，10％乙腈被用作低鹽緩沖液，而20mM tris，400mMNaClO4，pH6.8，10％乙腈被用作高鹽緩沖液。流速是每分鐘3ml。通過(guò)將10mM磷酸鈉緩沖液，pH6.8，100mM NaCl中各條鏈的化學(xué)計(jì)量混合物加熱至80-90℃，然后使其經(jīng)6小時(shí)緩慢冷卻到室溫，使各條鏈雜交成雙鏈。
試驗(yàn)動(dòng)物條件和實(shí)驗(yàn)過(guò)程使用轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)小鼠品種TgN(GFPU)5Nagy(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)；該品種已顯示在所有以前的試驗(yàn)細(xì)胞中表達(dá)GFP(帶有β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和CMV中間體早期增強(qiáng)子)，(Hadjantonakis AK等，1993，Mech Dev.7679-90；HadjantonakisAK等.，1998，Nature Genetics 19220-222)。根據(jù)熒光(使用手持UV燈)容易從相應(yīng)的野生型(WT)區(qū)分GFP-轉(zhuǎn)基因小鼠。為了繁殖的目的，相應(yīng)的WT總是與雜合GFP型相配對(duì)。根據(jù)德國(guó)動(dòng)物權(quán)利法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每組有3-5只動(dòng)物，動(dòng)物被放在III型Makrolon籠(Ehret，Emmendingen)中，處在控制環(huán)境下，恒溫22℃和12小時(shí)晝/夜節(jié)律。使用8/15細(xì)?；拘?Altomin，Lage)。動(dòng)物隨意接受自來(lái)水和標(biāo)準(zhǔn)飼料(Altormin 1324顆粒狀物)。
實(shí)驗(yàn)中使用的雜合GFP動(dòng)物如上所述，3只動(dòng)物一組放在籠子中。12小時(shí)一周期(5:30-7:00和17:30-19:00)，歷經(jīng)5天時(shí)間對(duì)尾靜脈靜脈內(nèi)(i.v.)注射dsRNA溶液。注射體積是每10g體重注射60μl，劑量分別是每千克體重2.5mg dsRNA或50μg。如下分組A組PBS(磷酸緩沖鹽水)每10g體重各60μl，B組每千克體重2.5mg非特異性對(duì)照dsRNA(有平端和一個(gè)由22個(gè)核苷酸對(duì)組成的雙鏈區(qū)的K1對(duì)照)，C組每千克體重2.5mg另一種非特異性對(duì)照dsRNA(在兩個(gè)3′-端有2nt突出端和一個(gè)由19個(gè)核苷酸對(duì)組成的雙鏈區(qū)的K3對(duì)照)，D組每千克體重2.5mg dsRNA(特異性抗-GFP定向的，下面稱(chēng)作S1，有平端和一個(gè)由22個(gè)核苷酸對(duì)組成的雙鏈區(qū))，E組每千克體重2.5mg dsRNA(特異性抗-GFP定向的，下面稱(chēng)作S7，在兩條鏈的兩個(gè)3′-端有2nt突出端和一個(gè)由19個(gè)核苷酸對(duì)組成的雙鏈區(qū))，F(xiàn)組每千克體重50μg S1 dsRNA(換句話(huà)說(shuō)是D組劑量的1/50)。
總計(jì)注射10次之后，14-20小時(shí)之后殺死動(dòng)物，根據(jù)所述取出器官和血樣。
器官取出利用CO2吸入殺死動(dòng)物之后馬上取出血樣和各種器官(胸腺，還有，心臟，脾臟，胃，腸，胰腺，腦，腎，和肝)。用冷的無(wú)菌PBS將器官快速淋洗，并且使用消毒解剖刀切片。一部分在甲基卡諾氏液(MC，60％甲醇，30％氯仿，10％冰醋酸)中固定24小時(shí)用于免疫組織化學(xué)染色；一部分在液氮中速凍并且保存在-80℃下用于制備冷凍切片和用于蛋白質(zhì)分離；另一較小部分在RNAeasy Protect(Qiagen)中在-80℃下冷凍用于RNA分離。血液取出后立即放在冰上30分鐘，混合，以2000rpm(Mini spin，Eppendorf)離心5分鐘。吸取上清液(這里稱(chēng)之為血漿)并且保存在-80℃下。
進(jìn)行活組織檢查組織在MC中固定24小時(shí)之后，組織切片在室溫遞增醇系列中脫水每次40分鐘，70％甲醇，80％甲醇，2×96％甲醇和3×100％異丙醇。之后，組織在培養(yǎng)箱中在100％異丙醇中在60℃下溫?zé)?，在異丙?石蠟混合物中在60℃下溫育1小時(shí)并且在石蠟中溫育2小時(shí)三次，然后包埋在石蠟中。對(duì)于免疫過(guò)氧化物酶染色，制備厚度是3μm的組織切片，使用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(Leica)，放在載玻片上(Superfrost，Vogel)，并且在培養(yǎng)箱中在60℃下溫育30分鐘。
對(duì)GFP的免疫過(guò)氧化物酶染色在二甲苯中將切片去石蠟3×5分鐘，在遞減醇系列(3×3分鐘，100％乙醇，2×2分鐘，95％乙醇)中再水合，然后在3％H2O2/甲醇中溫育以封閉內(nèi)源過(guò)氧化物酶。下面所有的溫育步驟都在潮濕室內(nèi)進(jìn)行。用PBS沖洗3×3分鐘之后，用一抗(山羊抗-GFP，sc-5384，SantaCruz Biotechnology)1∶500在1％BSA/PBS中在4℃下進(jìn)行溫育。然后在室溫下用生物素化二抗(驢抗-山羊；Santa CruzBiotechnology；稀釋度1∶2000)溫育30分鐘，其然后用抗生物素蛋白D過(guò)氧化物酶(稀釋度1∶2000，Vector Laboratories)溫育。每次抗體溫育之后，切片在PBS中洗滌3×3分鐘，從切片去除緩沖液殘留物和細(xì)胞碎屑。所有的抗體在1％牛血清白蛋白(BSA)/PBS中稀釋。使用DAB底物試劑盒(Vector Laboratories)根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。對(duì)于核酸計(jì)數(shù)染色使用Gill′s蘇木精I(xiàn)II(Merck)。在遞增醇系列和3×5分鐘二甲苯中脫水之后，用Entellan(Merck)蓋住切片。使用安裝有CCD照相機(jī)(Hamamatsu)的OlympusIX50顯微鏡對(duì)染色進(jìn)行顯微鏡分析。
從組織切片分離蛋白質(zhì)向仍然冷凍著的切片加入800μl分離緩沖液(50mM HEPES，pH7.5；150mM NaCl；1mM EDTA；2.5mM EGTA；10％甘油；0.1％Tween；1mM DDT；10mM β-磷酸甘油酯；1mM NaF；0.1mMNa3VO4和Roche生產(chǎn)的″完全″蛋白酶抑制劑片劑)，然后使用Ultraturrax(DIAX 900，6G粉碎器，Heidolph)勻化2×30秒，并且在勻化步驟之間在冰上冷卻。在冰上溫育30分鐘之后，混合，并且以10,000xg，在4℃下(3K30，Sigma)離心20分鐘。然后上清液再在冰上溫育10分鐘，混合，以15,000xg離心20分鐘。然后根據(jù)Zor & Selinger，1996改進(jìn)的Bradford，1976的方法，使用Roth生產(chǎn)的Roti-Nanoquant系統(tǒng)，根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，對(duì)上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定。使用BSA(牛血清白蛋白)在濃度范圍是10-100μg/ml內(nèi)對(duì)蛋白質(zhì)校準(zhǔn)。
SDS凝膠電泳在Biometra生產(chǎn)的Multigel-Long電泳池中對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，根據(jù)Lmmli(Nature 277680-685，1970)使用變性的，不連續(xù)15％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)。向頂部倒入分離凝膠達(dá)厚度為1.5mm∶7.5ml丙烯酰胺/雙丙烯酰胺(30％，0.9％)，3.8ml 1.5M tris/HCl，pH8.4，150μl 10％ SDS，3.3ml雙蒸餾水，250μl過(guò)硫酸銨[10％]，9μl TEMED(N，N，N′，N′-四亞甲基二胺)并且加一層0.1％SDS，直到發(fā)生聚合作用。然后收集的凝膠倒入0.83μl丙烯酰胺/雙丙烯酰胺(30％/0.9％)，630μl 1M tris/HCl，pH6.8，3.3ml雙蒸餾水，50μl 10％SDS，50μl 10％過(guò)硫酸銨，5μl TEMED。
在施加給凝膠之前，向蛋白質(zhì)加入相應(yīng)量的4x樣品緩沖液(200mM tris，pH6.8，4％SDS，100mM DTT[二硫蘇糖醇]，0.02％溴酚藍(lán)，20％甘油)，在100℃加熱封閉變性。在冰上冷卻之后，將其快速離心并且加到凝膠上。對(duì)各條泳道使用相同量的血漿或蛋白質(zhì)(3μl血漿或25μg總蛋白質(zhì))。室溫下恒壓50V進(jìn)行水冷卻電泳。來(lái)自BioRad(Kaleidoscope預(yù)染色標(biāo)準(zhǔn)物)被用作標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度。
蛋白質(zhì)印跡和免疫檢測(cè)使用Kyhse-Anderson(J.Biochem.Biophys.Methods10203-210，1984)的半干燥方法，在室溫下和恒定安培數(shù)0.8mA/cm2下將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至PVDF(聚二氟乙烯)膜(Hybond-P，Amersham)，進(jìn)行1.5小時(shí)。使用tris/甘氨酸緩沖液(39mM Gly，46mM tris，0.1％SDS，和20％甲醇)作為轉(zhuǎn)移緩沖液。為了分析電泳轉(zhuǎn)移，使用考馬斯藍(lán)(0.1％考馬斯G250，45％甲醇，10％冰醋酸)免疫檢測(cè)之后對(duì)印跡后凝膠和印跡膜染色。為了讓非特異性鍵飽和，轉(zhuǎn)移之后印跡膜在1％脫脂奶粉/PBS中在室溫下溫育1小時(shí)。之后，用0.1％Tween-20/PBS將其洗滌三次三分鐘。所有的下面的抗體溫育和洗滌都使用0.1％ Tween-20/PBS進(jìn)行。室溫下以1∶1000的稀釋度溫育一抗(山羊抗-GFP，sc-5384，Santa Cruz Biotechnology)1小時(shí)。之后，洗滌3×5分鐘，室溫下以1∶10000的稀釋度用二抗(驢抗-山羊IgG辣根過(guò)氧化物酶，Santa Cruz Biotechnology)標(biāo)記1小時(shí)。然后使用Amersham的ECL系統(tǒng)根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。
圖18-20表示在3-μm石蠟切片上，靜脈內(nèi)注射用抗-GFP免疫過(guò)氧化物酶染色的特異性抗-GFP定向dsRNA之后GFP表達(dá)的抑制作用。在試驗(yàn)進(jìn)行中，在歷經(jīng)5天的12小時(shí)循環(huán)中使用具有沒(méi)有3′-端突出端的22個(gè)核苷酸對(duì)組成的雙鏈區(qū)的抗-GFP定向dsRNA(D)和相應(yīng)的非特異性對(duì)照dsRNA(B)，以及具有3′-端有2nt突出端的19個(gè)核苷酸對(duì)組成的雙鏈區(qū)的特異性抗-GFP定向dsRNA(E)和相應(yīng)的非特異性對(duì)照dsRNA(C)。(F)接受D組劑量的1/50。沒(méi)有接受dsRNA(A)的動(dòng)物和野生型動(dòng)物也用作進(jìn)一步對(duì)照試驗(yàn)。圖18說(shuō)明腎切片中GFP表達(dá)的抑制作用，圖19是心臟組織切片，圖20是胰腺組織。圖21-23給出血漿和組織中GFP表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析。圖21說(shuō)明血漿中GFP表達(dá)的抑制作用；圖22是腎組織，圖23是心臟組織。圖23說(shuō)明來(lái)自不同動(dòng)物的總蛋白質(zhì)分離物的使用。對(duì)各條泳道使用相同量的總蛋白質(zhì)。在接受非特異性對(duì)照dsRNA的動(dòng)物中(B和C組的動(dòng)物)，無(wú)論怎樣與沒(méi)有接受dsRNA的動(dòng)物相比，GFP表達(dá)沒(méi)有減弱。與沒(méi)有處理的動(dòng)物相比(圖18-23)，接受了包含位于兩條鏈的3′-端的2nt突出端和19個(gè)核苷酸對(duì)組成的雙鏈區(qū)的特異性抗-GFP定向dsRNA的動(dòng)物，在檢查的組織(心臟，腎臟，胰腺，和血液)中表現(xiàn)出GFP表達(dá)的顯著抑制。在給與了具有平端和22個(gè)核苷酸對(duì)組成的雙鏈區(qū)的特異性抗-GFP定向dsRNA的D和F組的動(dòng)物中，只有接受每天每千克體重50μg劑量的那些動(dòng)物才表現(xiàn)出GFP表達(dá)的特異性抑制作用，但是比E組中的動(dòng)物小得多。
概括組織切片和蛋白質(zhì)印跡上GFP抑制作用分析表明GFP表達(dá)抑制作用在血液和腎中最強(qiáng)(圖18，21，和22)。
V.dsRNA對(duì)EGF受體基因表達(dá)的抑制作用作為EGFR過(guò)量表達(dá)或EGFR-誘導(dǎo)的增殖為特征的癌癥的治療方案表皮生長(zhǎng)因子(＝EGF)受體(＝EGFR)屬于酪氨酸激酶受體，是在一系列細(xì)胞過(guò)程控制中涉及的具有固有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，所述一系列細(xì)胞過(guò)程是例如細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞分化，遷移過(guò)程，和細(xì)胞存活(綜述見(jiàn)Van der Geer等，1994)。EGFR家族由4個(gè)成員組成，EGFR(ErbB1)，HER2(ErbB2)，HER3(ErbB3)，和HER4(ErbB4)，帶有跨膜區(qū)，半胱氨酸富集胞外區(qū)，和催化性胞內(nèi)區(qū)。EGFR序列，一種170-kDa蛋白質(zhì)，自從1984年就是已知的了(Ullrich等，1984)。
EGFR被肽生長(zhǎng)因子激活，例如EGF，TGFα(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子)，雙調(diào)蛋白，β動(dòng)物纖維素，HB-EGF(肝素結(jié)合EGF-樣生長(zhǎng)因子)，和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。
配體結(jié)合誘導(dǎo)形成同型二聚體或異二聚體，接著進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)酪氨酸的自磷酸化作用(Ullrich & Schlessinger，1990；Alroy& Yarden，1997)。磷酸化氨基酸形成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中信號(hào)傳遞近端階段中涉及的多種蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。在大多數(shù)各種各樣的腫瘤病灶中涉及EGFR，因此是治療方法的合適的靶物(Huang & Harari，1999)。導(dǎo)致異常EGFR活性的機(jī)理可能與突變受體形式的過(guò)量表達(dá)，擴(kuò)增，組成型激活，或自分泌環(huán)有關(guān)(Voldberg等，1997)。對(duì)于一系列腫瘤有人描述過(guò)EGFR的過(guò)量表達(dá)，例如乳房癌(Walker & Dearing，1999)，非小細(xì)胞肺癌(Fontaninii等，1998)，胰腺癌，結(jié)腸癌(Salomon等，1995)，和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(Rieske等，1998)。對(duì)于惡性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，特別地，迄今為止還沒(méi)有有效而特異性的治療劑。
實(shí)施例為了檢測(cè)dsRNA在EGFR基因表達(dá)特異性抑制中的有效性，使用U-87 MG細(xì)胞(人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞)，ECCAC(歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)No.89081402，用特異性抗-EGF-受體定向dsRNA(序列表SQ 51)轉(zhuǎn)染。溫育大約72小時(shí)之后，收集細(xì)胞，分離蛋白質(zhì)，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析EGFR表達(dá)。
試驗(yàn)方案dsRNA合成使用RNA合成儀(Expedite 8909，Applied Biosystems，Weiterstadt，德國(guó))，以及通過(guò)傳統(tǒng)化學(xué)方法合成序列表中給出的各RNA鏈和它們各自的互補(bǔ)鏈。然后借助HPLC將粗合成產(chǎn)物純化。使用NucleoPac PA-100，9×250柱(Dionex)，20mM tris；10mM NaClO4，pH6.8，10％乙腈用作低鹽緩沖液，而20mM tris，400mM NaClO4，pH6.8，10％乙腈用作高鹽緩沖液。流速是每分鐘3ml。通過(guò)在10mM磷酸鈉緩沖液，pH6.8，100mM NaCl中將各條鏈的化學(xué)計(jì)量混合物加熱至80-90℃，然后再經(jīng)6小時(shí)將它們緩慢冷卻至室溫，使各條鏈雜交成雙鏈。
接種細(xì)胞所有的細(xì)胞培養(yǎng)都在合適的工作臺(tái)(HS18/Hera Safe，Kendro，Heraeus)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。U-87MG細(xì)胞的培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中(CO2-培養(yǎng)箱T20，Hera細(xì)胞，Kendro，Heraeus)在37℃，5％ CO2和飽和大氣濕度下在DMEM(Dulbecco′s改進(jìn)的eagle培養(yǎng)基，Biochrom)中用10％ FCS(胎牛血清，Biochrom)，2mM L-谷酰胺(Biochromone)mM丙酮酸鈉(Biochrom)，1×NEAA(非必需氨基酸，Biochrom)，和青霉素/鏈霉素(100IU/100μg/ml，Biochrom)進(jìn)行。為了將細(xì)胞保持在指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞每三天傳代。利用轉(zhuǎn)染使用dsRNA之前24小時(shí)，使細(xì)胞受胰蛋白酶作用(10x胰蛋白酶/EDTA，Biochrom，德國(guó))，并且放在1.5μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基中在6-孔板上(6-孔板，Schubert & WeissLaboratories，GmbH)。
培養(yǎng)的U-87MG細(xì)胞中dsRNA的應(yīng)用使用OLIGOFECTAMINETM試劑(Life Technologies)，根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，通過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)行dsRNA施用?？偟霓D(zhuǎn)染體積是1ml。首先，dsRNA稀釋在無(wú)血清培養(yǎng)基中每孔0.5μl的20μM特異性抗EGFR定向dsRNA儲(chǔ)液和9.5μl的20μM用175μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的非特異性dsRNA(K1A/K2B)儲(chǔ)液(轉(zhuǎn)染溫育物中200nM dsRNA或10M特異性EGFR-dsRNA)。OLIGOFECTAMINETM試劑也在無(wú)血清培養(yǎng)基中稀釋3μl，每孔12μl，然后室溫下溫育10。然后將稀釋的OLIGOFECTAMINETM試劑加給稀釋的dsRNA培養(yǎng)基，混合，并且在室溫下又溫育20分鐘。溫育期間更換培養(yǎng)基。用1ml無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1x，并且在培養(yǎng)箱中用800μl無(wú)血清培養(yǎng)基連續(xù)溫育，直到加入dsRNA/OLIGOFECTAMINETM試劑。每孔加入200μl dsRNA/OLIGOFECTAMINETM試劑之后，將細(xì)胞在培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)直到分離蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)分離轉(zhuǎn)染之后大約72小時(shí)，收集細(xì)胞并且分離蛋白質(zhì)。去除培養(yǎng)基，并且用PBS沖洗細(xì)胞單層一次。加入200μl蛋白質(zhì)分離緩沖液(1x″完全″蛋白酶抑制劑，Roche，50mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，2.5mM EGTA，10％甘油，0.1％Tween-20，1mM DTT，10mM β-磷酸甘油酯，1mM NaF，0.1mM Na3VO4)之后，借助細(xì)胞刮刀取出細(xì)胞，在冰上溫育10分鐘，轉(zhuǎn)移至Eppendorf試管，并且在-80℃下貯存至少30分鐘。解融之后，用分散儀(DIAX 900，6G分散儀，Heidolph Instruments GmbH，Schwabach)在第三設(shè)置下將溶胞產(chǎn)物勻化10秒，在冰上溫育10分鐘，然后以14,000xg，4℃(3K30，Sigma)離心15分鐘。使用來(lái)自Roth(Roth GmbH，Karlsruhe)的Roti-Nanoquant系統(tǒng)根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明對(duì)上清液進(jìn)行Bradford蛋白質(zhì)檢測(cè)。合適的稀釋度的200μl蛋白質(zhì)溶液與800μl 1x工作液混合，然后在貝克曼分光光度計(jì)(DU 250)中用蒸餾水在450nm和590nm下在半微量比色池中測(cè)定消光度。BSA稀釋液用于校正(液滴BSA，Sigma)。
SDS凝膠電泳根據(jù)Lmmli(Nature 27768 0-685，1970)，在Biometra的Multigel-Long電泳池中用變性不連續(xù)7.5％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離。在上面倒入分離凝膠達(dá)1.5mm厚度3.75ml丙烯酰胺/雙丙烯酰胺(301％，0.9％)，3.8ml 1Mtris/HCl，pH8.4，150μl 10％ SDS，7.15ml蒸餾水，150μl過(guò)硫酸銨(10％)，9μl TEMED(N，N，N′，N′-四亞甲基二胺)，并且加一層0.1％SDS，直到發(fā)生聚合作用.然后，倒入收集的凝膠0.83ml丙烯酰胺/雙丙烯酰胺(30％/0.9％)，630μl 1M tris/HCl，pH6.8，3.4ml蒸餾水，50μl 10％SDS，50μl 10％過(guò)硫酸銨，5μl TEMED。
在施加給凝膠之前，以1∶3的比例向蛋白質(zhì)加入4x樣品緩沖液(200mM tris，pH6.8，4％SDS，100mM DTT[二硫蘇糖醇]，0.02％溴酚藍(lán)，20％甘油)量，在100℃加熱變性5分鐘。在冰上冷卻之后，將其快速離心并且加到凝膠上。對(duì)各條泳道使用相同量的蛋白質(zhì)(35μg總蛋白質(zhì))。室溫下恒壓50V進(jìn)行水冷卻電泳。Kaleidoscope預(yù)染色標(biāo)準(zhǔn)物(BioRad)被用作標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度。
蛋白質(zhì)印跡和免疫檢測(cè)使用Kyhse-Anderson(J.Biochem.Biophys.Methods10203-210，1984)的半干燥方法，在室溫下和恒定安培數(shù)0.5mA/cm2下將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至PVDF(聚二氟乙烯)膜(Hybond-P，Amersham)，進(jìn)行1.5小時(shí)。陰極緩沖液(30mM tris，40mM甘氨酸，10％甲醇，and 0.01％ SDS，pH9.4)，陽(yáng)極緩沖液I(300mM tris，pH10.4，10％甲醇)，和陽(yáng)極緩沖液II(30mM tris，pH10.4，10％甲醇)用作轉(zhuǎn)移緩沖液。在用3MM Whatman紙(Schleicher & Schüll)裝在印跡泳道之前，凝膠在陰極緩沖液中，PVDF膜(事先在100％甲醇中溫育30秒)在陽(yáng)極緩沖液II(5分鐘)中溫育2層3MM紙(陽(yáng)極緩沖液I)，1層3MM紙(陽(yáng)極緩沖液II)，PVDF膜，凝膠，3層3MM紙(陰極緩沖液)。為了分析電泳轉(zhuǎn)移，免疫檢測(cè)之后用考馬斯藍(lán)(0.1％考馬斯G250，45％甲醇，10％冰醋酸)對(duì)印跡后凝膠和印跡膜染色。
轉(zhuǎn)移之后，印跡膜在室溫下在1％脫脂奶粉/PBS/0.1％Tween-20中溫育1小時(shí)。之后，用0.1％Tween-20/PBS將其沖洗3分鐘。所有的接下來(lái)的抗體溫育和清洗都使用0.1％ Tween-20/PBS進(jìn)行。在搖動(dòng)器上在室溫下以1.5μg/ml的濃度用一抗(人EGFR胞外域，特異性山羊IgG，目錄號(hào)AF231，R&D Systems)溫育2小時(shí)。然后沖洗3×5分鐘，并且在室溫下與1∶10,000稀釋度的二抗(標(biāo)記的驢抗-山羊IgG辣根過(guò)氧化物酶，Santa Cruz Biotechnology)溫育1小時(shí)。沖洗之后(3×3分鐘，用PBS/0.1％ Tween-20)，利用ECL反應(yīng)(增強(qiáng)的化學(xué)光)立即檢測(cè)。向18ml蒸餾水吸移200μl A溶液(250mM魯米諾，Roth，溶解于DMSO)，89μl B溶液(90mM p-香豆酸，Sigma，溶解于DMSO)，和2ml 30％H2O2溶液。根據(jù)膜的大小，直接將4-6ml吸移至膜上，室溫下溫育1分鐘，然后立刻層鋪到x-射線(xiàn)膜上(BiomaxMS，Kodak)。
下面表3中，以及序列表SQ153，157，158，168-173，包括這里使用的序列。
表3U-87 MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中EGFR表達(dá)的抑制接種細(xì)胞24小時(shí)之后，用指出的10nM dsRNA轉(zhuǎn)染(oligofectamine)。72小時(shí)之后，收集細(xì)胞并且分離蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離在7.5％ SDS-PAGE中進(jìn)行。對(duì)每一條泳道加35μg總蛋白質(zhì)。圖24給出相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡分析，它表明，與相應(yīng)的對(duì)照物相比，使用反義鏈的3′-端有2nt突出端的特異性抗-EGFR定向dsRNA，在U-87MG細(xì)胞中轉(zhuǎn)染之后EGFR表達(dá)被大大抑制。利用特異性dsRNA的內(nèi)源基因表達(dá)的該抑制作用證實(shí)了實(shí)施例II的結(jié)果，即瞬時(shí)轉(zhuǎn)染之后插入到細(xì)胞中的人工基因的表達(dá)的抑制。ES-7和ES-8介導(dǎo)的EGFR表達(dá)的抑制明顯更小。表3給出圖24中使用的dsRNAs。
VI.抑制多藥物抗性基因1(MDR1)的表達(dá)試驗(yàn)方案使用結(jié)腸癌細(xì)胞系LS174T(ATCC-美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；Tom等，1976)對(duì)MDR1表達(dá)的封閉進(jìn)行體外檢測(cè)。已知該細(xì)胞系MDR1的表達(dá)是由向培養(yǎng)基加入利福平誘導(dǎo)的(Geick等，2001)。使用各種商售轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染(Lipofectamine，Oligofectamine，都來(lái)自Invitrogen；TransMessenger，Qiagen)，其中TransMessenger試劑盒被證實(shí)對(duì)于這種細(xì)胞系最合適。
使用四種短雙鏈核糖核酸(R1-R4)進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)。它們的序列見(jiàn)表4。該核糖核酸與MDR1(序列表SQ 30)的編碼序列的片段是同源的。序列R1-R3由22體有義和24體反義鏈組成，其中得到的雙鏈在3′-端具有2-核苷酸突出端(0-22-2)。序列R4相應(yīng)于R1；但是它由19體雙鏈組成，每一個(gè)都在各自的3′-端具有2-核苷酸突出端(2-19-2)。
表4表4中給出的序列在序列表中指定為序列SQ141-147，152，153，和158。各種情況下dsRNA被作為雙份試驗(yàn)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，濃度是175nM，細(xì)胞在前一天接種到12-孔板上，3.8×105細(xì)胞/孔。對(duì)于各轉(zhuǎn)染分析，將93.3μl EC-R緩沖液(TransMessenger試劑盒，Qiagen，Hilden)與3.2μl Enhancer R混合，然后加入3.5μl特定20μMdsRNA，充分混合，室溫下溫育5分鐘。加入6μl TransMessenger轉(zhuǎn)染試劑之后，將轉(zhuǎn)染試驗(yàn)劇烈混合10秒，然后在室溫下溫育10分鐘。同時(shí)，從細(xì)胞中提取培養(yǎng)基，用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌一次，然后向各孔的細(xì)胞加入200μl沒(méi)有FCS的新鮮培養(yǎng)基。溫育10-分鐘之后，將100μl沒(méi)有FCS的培養(yǎng)基吸移至各轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，混合，并且逐滴吸移混合物到細(xì)胞上(175μM的dsRNA濃度與400μl培養(yǎng)基總體積相關(guān))。dsRNA/TransMessenger復(fù)合體在沒(méi)有FCS的培養(yǎng)基中在37℃下與細(xì)胞溫育4小時(shí)。然后變換培養(yǎng)基；新鮮培養(yǎng)基含有10μM利福平和10％FCS。與MDR1基因序列沒(méi)有同源性的非特異dsRNA序列(K)被用作對(duì)照物，進(jìn)行模擬轉(zhuǎn)染，其含有除了dsRNA之外的所有的試劑。
24，48，和72小時(shí)之后收集細(xì)胞，用Qiagen的RNeasy小試劑盒提取總RNA。10μg來(lái)自各樣品的總蛋白質(zhì)然后在1％瓊脂糖-甲醛凝膠上電泳分離，在尼龍膜上印跡，然后雜交，作為內(nèi)部對(duì)照，特異性探針隨機(jī)用5′-α32p-dCTP標(biāo)記，首先對(duì)MDR1，印跡被剝離之后，對(duì)GAPDH，然后在x-射線(xiàn)膜上曝光。
使用Image-Quant軟件對(duì)x-射線(xiàn)膜數(shù)字化處理(Image Master，VDS，Pharmacia)并定量測(cè)定。此時(shí)，進(jìn)行MDR1-特異性泳帶和相應(yīng)的GAPDH泳帶之間的校正。
結(jié)果圖25和26說(shuō)明用相應(yīng)的GAPDH值(圖25b，26p)校正之后MDR1-特異性泳帶的定量分析的RNA印跡(圖26a，26a)。與模擬轉(zhuǎn)染相比較，MDR1-mRNA減少55％，與非特異性對(duì)照轉(zhuǎn)染相比較，有45％。48小時(shí)之后，指定為R1，R2，和R3(表4)的dsRNA構(gòu)建體中MDR1-mRNA水平顯著減少。使用R4 dsRNA構(gòu)建體，與對(duì)照相比較，48小時(shí)之后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著減少(圖26a和26b)。74小時(shí)之后，與48小時(shí)的值相比較，R1，R2，和R3 MDR1-mRNA水平相對(duì)于對(duì)照物減少得明顯更多(圖25a和26b)。此時(shí)R4也是可見(jiàn)到MDR1-mRNA水平顯著減少。因此，與兩條鏈(反義鏈和有義鏈)的3′-端具有2nt突出端和具有由19個(gè)核苷酸對(duì)組成的雙鏈區(qū)的構(gòu)建體相比，反義鏈3′-端具有2nt突出端和具有由22個(gè)核苷酸對(duì)組成的雙鏈區(qū)的構(gòu)建體更有效減小MDR1-mRNA水平，各種情況下相對(duì)獨(dú)立于與MDR1基因同源的序列區(qū)(48小時(shí)之后；圖26b)。結(jié)果強(qiáng)調(diào)了實(shí)施例IV中的發(fā)現(xiàn)，其中描述了在U-87MG細(xì)胞中轉(zhuǎn)染之后利用特異性dsRNAs對(duì)EGFR基因表達(dá)的抑制。
在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中借助用Texas紅(TexRed-A[GATC]5T；也用175nM轉(zhuǎn)染)標(biāo)記的DNA寡核苷酸測(cè)定轉(zhuǎn)染效率(圖27a，27b；400x放大，轉(zhuǎn)染之后48小時(shí))。與總細(xì)胞數(shù)相比，以紅色熒光細(xì)胞為基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)染效率大約是50％。如果考慮到細(xì)胞的轉(zhuǎn)染比例大約是50％，則看起來(lái)合理地得出結(jié)論，觀(guān)察到MDR1-mRNA水平降低大約45-55％(與對(duì)照物相比較)，在成功轉(zhuǎn)染了特異性dsRNA的所有的細(xì)胞中MDR1-mRNA幾乎完全地特異地破壞。
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<302>ephrin A2<310>XM002088<400>2gaagttgcgc gcaggccggc gggcgggagc ggacaccgag gccggcgtgc aggcgtgcgg 60gtgtgcggga gccgggctcg gggggatcgg accgagagcg agaagcgcgg catggagctc 120caggcagccc gcgcctgctt cgccctgctg tggggctgtg cgctggccgc ggccgcggcg 180gcgcagggca aggaagtggt actgctggac tttgctgcag ctggagggga gctcggctgg 240ctcacacacc cgtatggcaa agggtgggac ctgatgcaga acatcatgaa tgacatgccg 300
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<300>
<302>beta5整聯(lián)蛋白<310>X53002<400>10ncbsncvwra tgccgcgggc cccggcgccg ctgtacgcct gcctcctggg gctctgcgcg 60ctcctgcccc ggctcgcagg tctcaacata tgcactagtg gaagtgccac ctcatgtgaa 120gaatgtctgc taatccaccc aaaatgtgcc tggtgctcca aagaggactt cggaagccca 180cggtccatca cctctcggtg tgatctgagg gcaaaccttg tcaaaaatgg ctgtggaggt 240gagatagaga gcccagccag cagcttccat gtcctgagga gcctgcccct cagcagcaag 300ggttcgggct ctgcaggctg ggacgtcatt cagatgacac cacaggagat tgccgtgaac 360ctccggcccg gtgacaagac caccttccag ctacaggttc gccaggtgga ggactatcct 420gtggacctgt actacctgat ggacctctcc ctgtccatga aggatgactt ggacaatatc 480cggagcctgg gcaccaaact cgcggaggag atgaggaagc tcaccagcaa cttccggttg 540ggatttgggt cttttgttga taaggacatc tctcctttct cctacacggc accgaggtac 600cagaccaatc cgtgcattgg ttacaagttg tttccaaatt gcgtcccctc ctttgggttc 660cgccatctgc tgcctctcac agacagagtg gacagcttca atgaggaagt tcggaaacag 720agggtgtccc ggaaccgaga tgcccctgag gggggctttg atgcagtact ccaggcagcc 780gtctgcaagg agaagattgg ctggcgaaag gatgcactgc atttgctggt gttcacaaca 840gatgatgtgc cccacatcgc attggatgga aaattgggag gcctggtgca gccacacgat 900ggccagtgcc acctgaacga ggccaacgag tacacagcat ccaaccagat ggactatcca 960tcccttgcct tgcttggaga gaaattggca gagaacaaca tcaacctcat ctttgcagtg 1020acaaaaaacc attatatgct gtacaagaat tttacagccc tgatacctgg aacaacggtg 1080gagattttag atggagactc caaaaatatt attcaactga ttattaatgc atacaatagt 1140atccggtcta aagtggagtt gtcagtctgg gatcagcctg aggatcttaa tctcttcttt 1200actgctacct gccaagatgg ggtatcctat cctggtcaga ggaagtgtga gggtctgaag 1260attggggaca cggcatcttt tgaagtatca ttggaggccc gaagctgtcc cagcagacac 1320acggagcatg tgtttgccct gcggccggtg ggattccggg acagcctgga ggtgggggtc 1380acctacaact gcacgtgcgg ctgcagcgtg gggctggaac ccaacagcgc caggtgcaac 1440gggagcggga cctatgtctg cggcctgtgt gagtgcagcc ccggctacct gggcaccagg 1500tgcgagtgcc aggatgggga gaaccagagc gtgtaccaga acctgtgccg ggaggcagag 1560ggcaagccac tgtgcagcgg gcgtggggac tgcagctgca accagtgctc ctgcttcgag 1620agcgagtttg gcaagatcta tgggcctttc tgtgagtgcg acaacttctc ctgtgccagg 1680aacaagggag tcctctgctc aggccatggc gagtgtcact gcggggaatg caagtgccat 1740gcaggttaca tcggggacaa ctgtaactgc tcgacagaca tcagcacatg ccggggcaga 1800gatggccaga tctgcagcga gcgtgggcac tgtctctgtg ggcagtgcca atgcacggag 1860ccgggggcct ttggggagat gtgtgagaag tgccccacct gcccggatgc atgcagcacc 1920aagagagatt gcgtcgagtg cctgctgctc cactctggga aacctgacaa ccagacctgc 1980cacagcctat gcagggatga ggtgatcaca tgggtggaca ccatcgtgaa agatgaccag 2040gaggctgtgc tatgtttcta caaaaccgcc aaggactgcg tcatgatgtt cacctatgtg 2100gagctcccca gtgggaagtc caacctgacc gtcctcaggg agccagagtg tggaaacacc 2160cccaacgcca tgaccatcct cctggctgtg gtcggtagca tcctccttgt tgggcttgca 2220ctcctggcta tctggaagct gcttgtcacc atccacgacc ggagggagtt tgcaaagttt 2280cagagcgagc gatccagggc ccgctatgaa atggcttcaa atccattata cagaaagcct 2340
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<302>beta3整聯(lián)蛋白<310>NM000212<400>11atgcgagcgc ggccgcggcc ccggccgctc tgggcgactg tgctggcgct gggggcgctg 60gcgggcgttg gcgtaggagg gcccaacatc tgtaccacgc gaggtgtgag ctcctgccag 120cagtgcctgg ctgtgagccc catgtgtgcc tggtgctctg atgaggccct gcctctgggc 180tcacctcgct gtgacctgaa ggagaatctg ctgaaggata actgtgcccc agaatccatc 240gagttcccag tgagtgaggc ccgagtacta gaggacaggc ccctcagcga caagggctct 300ggagacagct cccaggtcac tcaagtcagt ccccagagga ttgcactccg gctccggcca 360gatgattcga agaatttctc catccaagtg cggcaggtgg aggattaccc tgtggacatc 420tactacttga tggacctgtc ttactccatg aaggatgatc tgtggagcat ccagaacctg 480ggtaccaagc tggccaccca gatgcgaaag ctcaccagta acctgcggat tggcttcggg 540gcatttgtgg acaagcctgt gtcaccatac atgtatatct ccccaccaga ggccctcgaa 600aacccctgct atgatatgaa gaccacctgc ttgcccatgt ttggctacaa acacgtgctg 660acgctaactg accaggtgac ccgcttcaat gaggaagtga agaagcagag tgtgtcacgg 720aaccgagatg ccccagaggg tggctttgat gccatcatgc aggctacagt ctgtgatgaa 780aagattggct ggaggaatga tgcatcccac ttgctggtgt ttaccactga tgccaagact 840catatagcat tggacggaag gctggcaggc attgtccagc ctaatgacgg gcagtgtcat 900gttggtagtg acaatcatta ctctgcctcc actaccatgg attatccctc tttggggctg 960atgactgaga agctatccca gaaaaacatc aatttgatct ttgcagtgac tgaaaatgta 1020gtcaatctct atcagaacta tagtgagctc atcccaggga ccacagttgg ggttctgtcc 1080atggattcca gcaatgtcct ccagctcatt gttgatgctt atgggaaaat ccgttctaaa 1140gtagagctgg aagtgcgtga cctccctgaa gagttgtctc tatccttcaa tgccacctgc 1200ctcaacaatg aggtcatccc tggcctcaag tcttgtatgg gactcaagat tggagacacg 1260gtgagcttca gcattgaggc caaggtgcga ggctgtcccc aggagaagga gaagtccttt 1320accataaagc ccgtgggctt caaggacagc ctgatcgtcc aggtcacctt tgattgtgac 1380tgtgcctgcc aggcccaagc tgaacctaat agccatcgct gcaacaatgg caatgggacc 1440tttgagtgtg gggtatgccg ttgtgggcct ggctggctgg gatcccagtg tgagtgctca 1500gaggaggact atcgcccttc ccagcaggac gaatgcagcc cccgggaggg tcagcccgtc 1560tgcagccagc ggggcgagtg cctctgtggt caatgtgtct gccacagcag tgactttggc 1620aagatcacgg gcaagtactg cgagtgtgac gacttctcct gtgtccgcta caagggggag 1680atgtgctcag gccatggcca gtgcagctgt ggggactgcc tgtgtgactc cgactggacc 1740ggctactact gcaactgtac cacgcgtact gacacctgca tgtccagcaa tgggctgctg 1800tgcagcggcc gcggcaagtg tgaatgtggc agctgtgtct gtatccagcc gggctcctat 1860ggggacacct gtgagaagtg ccccacctgc ccagatgcct gcacctttaa gaaagaatgt 1920gtggagtgta agaagtttga ccgggagccc tacatgaccg aaaatacctg caaccgttac 1980tgccgtgacg agattgagtc agtgaaagag cttaaggaca ctggcaagga tgcagtgaat 2040
tgtacctata agaatgagga tgactgtgtc gtcagattcc agtactatga agattctagt 2100ggaaagtcca tcctgtatgt ggtagaagag ccagagtgtc ccaagggccc tgacatcctg 2160gtggtcctgc tctcagtgat gggggccatt ctgctcattg gccttgccgc cctgctcatc 2220tggaaactcc tcatcaccat ccacgaccga aaagaattcg ctaaatttga ggaagaacgc 2280gccagagcaa aatgggacac agccaacaac ccactgtata aagaggccac gtctaccttc 2340accaatatca cgtaccgggg cacttaa 2367<210>12<211>3147<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<300>
<302>alpha v整聯(lián)蛋白<310>NM0022210<400>12atggcttttc cgccgcggcg acggctgcgc ctcggtcccc gcggcctccc gcttcttctc 60tcgggactcc tgctacctct gtgccgcgcc ttcaacctag acgtggacag tcctgccgag 120tactctggcc ccgagggaag ttacttcggc ttcgccgtgg atttcttcgt gcccagcgcg 180tcttcccgga tgtttcttct cgtgggagct cccaaagcaa acaccaccca gcctgggatt 240gtggaaggag ggcaggtcct caaatgtgac tggtcttcta cccgccggtg ccagccaatt 300gaatttgatg caacaggcaa tagagattat gccaaggatg atccattgga atttaagtcc 360catcagtggt ttggagcatc tgtgaggtcg aaacaggata aaattttggc ctgtgcccca 420ttgtaccatt ggagaactga gatgaaacag gagcgagagc ctgttggaac atgctttctt 480caagatggaa caaagactgt tgagtatgct ccatgtagat cacaagatat tgatgctgat 540ggacagggat tttgtcaagg aggattcagc attgatttta ctaaagctga cagagtactt 600cttggtggtc ctggtagctt ttattggcaa ggtcagctta tttcggatca agtggcagaa 660atcgtatcta aatacgaccc caatgtttac agcatcaagt ataataacca attagcaact 720cggactgcac aagctatttt tgatgacagc tatttgggtt attctgtggc tgtcggagat 780ttcaatggtg atggcataga tgactttgtt tcaggagttc caagagcagc aaggactttg 840ggaatggttt atatttatga tgggaagaac atgtcctcct tatacaattt tactggcgag 900cagatggctg catatttcgg attttctgta gctgccactg acattaatgg agatgattat 960gcagatgtgt ttattggagc acctctcttc atggatcgtg gctctgatgg caaactccaa 1020gaggtggggc aggtctcagt gtctctacag agagcttcag gagacttcca gacgacaaag 1080ctgaatggat ttgaggtctt tgcacggttt ggcagtgcca tagctccttt gggagatctg 1140gaccaggatg gtttcaatga tattgcaatt gctgctccat atgggggtga agataaaaaa 1200ggaattgttt atatcttcaa tggaagatca acaggcttga acgcagtccc atctcaaatc 1260cttgaagggc agtgggctgc tcgaagcatg ccaccaagct ttggctattc aatgaaagga 1320gccacagata tagacaaaaa tggatatcca gacttaattg taggagcttt tggtgtagat 1380cgagctatct tatacagggc cagaccagtt atcactgtaa atgctggtct tgaagtgtac 1440cctagcattt taaatcaaga caataaaacc tgctcactgc ctggaacagc tctcaaagtt 1500tcctgtttta atgttaggtt ctgcttaaag gcagatggca aaggagtact tcccaggaaa 1560cttaatttcc aggtggaact tcttttggat aaactcaagc aaaagggagc aattcgacga 1620gcactgtttc tctacagcag gtccccaagt cactccaaga acatgactat ttcaaggggg 1680ggactgatgc agtgtgagga attgatagcg tatctgcggg atgaatctga atttagagac 1740aaactcactc caattactat ttttatggaa tatcggttgg attatagaac agctgctgat 1800
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<302>CaSm(癌癥相關(guān)SM-樣癌基因)<310>AF000177<400>13atgaactata tgcctggcac cgccagcctc atcgaggaca ttgacaaaaa gcacttggtt 60ctgcttcgag atggaaggac acttataggc tttttaagaa gcattgatca atttgcaaac 120ttagtgctac atcagactgt ggagcgtatt catgtgggca aaaaatacgg tgatattcct 180cgagggattt ttgtggtcag aggagaaaat gtggtcctac taggagaaat agacttggaa 240aaggagagtg acacacccct ccagcaagta tccattgaag aaattctaga agaacaaagg 300gtggaacagc agaccaagct ggaagcagag aagttgaaag tgcaggccct gaaggaccga 360ggtctttcca ttcctcgagc agatactctt gatgagtact aa402<210>14<211>1923<212>DNA<213>人(Homo sapiens)
<300>
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<302>c-myc
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<302>Bak<310>U16811<400>32atggcttcgg ggcaaggccc aggtcctccc aggcaggagt gcggagagcc tgccctgccc 60tctgcttctg aggagcaggt agcccaggac acagaggagg ttttccgcag ctacgttttt 120taccgccatc agcaggaaca ggaggctgaa ggggtggctg cccctgccga cccagagatg 180gtcaccttac ctctgcaacc tagcagcacc atggggcagg tgggacggca gctcgccatc 240atcggggacg acatcaaccg acgctatgac tcagagttcc agaccatgtt gcagcacctg 300cagcccacgg cagagaatgc ctatgagtac ttcaccaaga ttgccaccag cctgtttgag 360agtggcatca attggggccg tgtggtggct cttctgggct tcggctaccg tctggcccta 420cacgtctacc agcatggcct gactggcttc ctaggccagg tgacccgctt cgtggtcgac 480ttcatgctgc atcactgcat tgcccggtgg attgcacaga ggggtggctg ggtggcagcc 540ctgaacttgg gcaatggtcc catcctgaac gtgctggtgg ttctgggtgt ggttctgttg 600ggccagtttg tggtacgaag attcttcaaa tcatga 636<210>33<211>579
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<300>
<302>Bax delta<310>U19599<400>35atggacgggt ccggggagca gcccagaggc ggggggccca ccagctctga gcagatcatg 60aagacagggg cccttttgct tcaggggatg attgccgccg tggacacaga ctccccccga 120gaggtctttt tccgagtggc agctgacatg ttttctgacg gcaacttcaa ctggggccgg 180gttgtcgccc ttttctactt tgccagcaaa ctggtgctca aggccctgtg caccaaggtg 240ccggaactga tcagaaccat catgggctgg acattggact tcctccggga gcggctgttg 300ggctggatcc aagaccaggg tggttgggac ggcctcctct cctactttgg gacgcccacg 360tggcagaccg tgaccatctt tgtggcggga gtgctcaccg cctcgctcac catctggaag 420aagatgggct ga 432<210>36<211>495<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<300>
<302>Bax epsolin<310>AF007826<400>36atggacgggt ccggggagca gcccagaggc ggggggccca ccagctctga gcagatcatg 60aagacagggg cccttttgct tcagggtttc atccaggatc gagcagggcg aatggggggg 120gaggcacccg agctggccct ggacccggtg cctcaggatg cgtccaccaa gaagctgagc 180gagtgtctca agcgcatcgg ggacgaactg gacagtaaca tggagctgca gaggatgatt 240gccgccgtgg acacagactc cccccgagag gtctttttcc gagtggcagc tgacatgttt 300tctgacggca acttcaactg gggccgggtt gtcgcccttt tctactttgc cagcaaactg 360gtgctcaagg ctggcgtgaa atggcgtgat ctgggctcac tgcaacctct gcctcctggg 420ttcaagcgat tcacctgcct cagcatccca aggagctggg attacaggcc ctgtgcacca 480aggtgccgga actga 495<210>37<211>582<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<300>
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<302>GD3合酶<310>NM003034<400>136atgagcccct gcgggcgggc ccggcgacaa acgtccagag gggccatggc tgtactggcg 60tggaagttcc cgcggacccg gctgcccatg ggagccagtg ccctctgtgt cgtggtcctc 120tgttggctct acatcttccc cgtctaccgg ctgcccaacg agaaagagat cgtgcagggg 180gtgctgcaac agggcacggc gtggaggagg aaccagaccg cggccagagc gttcaggaaa 240caaatggaag actgctgcga ccctgcccat ctctttgcta tgactaaaat gaattcccct 300atggggaaga gcatgtggta tgacggggag tttttatact cattcaccat tgacaattca 360acttactctc tcttcccaca ggcaacccca ttccagctgc cattgaagaa atgcgcggtg 420gtgggaaatg gtgggattct gaagaagagt ggctgtggcc gtcaaataga tgaagcaaat 480tttgtcatgc gatgcaatct ccctcctttg tcaagtgaat acactaagga tgttggatcc 540aaaagtcagt tagtgacagc taatcccagc ataattcggc aaaggtttca gaaccttctg 600tggtccagaa agacatttgt ggacaacatg aaaatctata accacagtta catctacatg 660cctgcctttt ctatgaagac aggaacagag ccatctttga gggtttatta tacactgtca 720gatgttggtg ccaatcaaac agtgctgttt gccaacccca actttctgcg tagcattgga 780aagttctgga aaagtagagg aatccatgcc aagcgcctgt ccacaggact ttttctggtg 840agcgcagctc tgggtctctg tgaagaggtg gccatctatg gcttctggcc cttctctgtg 900aatatgcatg agcagcccat cagccaccac tactatgaca acgtcttacc cttttctggc 960ttccatgcca tgcccgagga atttctccaa ctctggtatc ttcataaaat cggtgcactg 1020agaatgcagc tggacccatg tgaagatacc tcactccagc ccacttccta g 1071<210>137<211>744<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<300>
<302>FGF14
<310>NM004115<400>137atggccgcgg ccatcgctag cggcttgatc cgccagaagc ggcaggcgcg ggagcagcac 60tgggaccggc cgtctgccag caggaggcgg agcagcccca gcaagaaccg cgggctctgc 120aacggcaacc tggtggatat cttctccaaa gtgcgcatct tcggcctcaa gaagcgcagg 180ttgcggcgcc aagatcccca gctcaagggt atagtgacca ggttatattg caggcaaggc 240tactacttgc aaatgcaccc cgatggagct ctcgatggaa ccaaggatga cagcactaat 300tctacactct tcaacctcat accagtggga ctacgtgttg ttgccatcca gggagtgaaa 360acagggttgt atatagccat gaatggagaa ggttacctct acccatcaga actttttacc 420cctgaatgca agtttaaaga atctgttttt gaaaattatt atgtaatcta ctcatccatg 480ttgtacagac aacaggaatc tggtagagcc tggtttttgg gattaaataa ggaagggcaa 540gctatgaaag ggaacagagt aaagaaaacc aaaccagcag ctcattttct acccaagcca 600ttggaagttg ccatgtaccg agaaccatct ttgcatgatg ttggggaaac ggtcccgaag 660cctggggtga cgccaagtaa aagcacaagt gcgtctgcaa taatgaatgg aggcaaacca 720gtcaacaaga gtaagacaac atag744<210>138<211>1503<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒<300>
<302>gag(HIV)<310>NC001802<400>138atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga aaaaattcgg 60ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acaaataatc cacctatccc agtaggagaa 780atttataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccggttc 900tataaaactc taagagccga gcaagcttca caggaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagcg 1020gctacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtag gaggacccgg ccataaggca 1080agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaattcag ctaccataat gatgcagaga 1140ggcaatttta ggaaccaaag aaagattgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200
acagccagaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320tacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380gagagcttca ggtctggggt agagacaaca actccccctc agaagcagga gccgatagac 1440aaggaactgt atcctttaac ttccctcagg tcactctttg gcaacgaccc ctcgtcacaa 1500taa 1503<210>139<211>1101<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒<300>
<302>TARBP2<310>NM004178<400>139atgagtgaag aggagcaagg ctccggcact accacgggct gcgggctgcc tagtatagag 60caaatgctgg ccgccaaccc aggcaagacc ccgatcagcc ttctgcagga gtatgggacc 120agaataggga agacgcctgt gtacgacctt ctcaaagccg agggccaagc ccaccagcct 180aatttcacct tccgggtcac cgttggcgac accagctgca ctggtcaggg ccccagcaag 240aaggcagcca agcacaaggc agctgaggtg gccctcaaac acctcaaagg ggggagcatg 300ctggagccgg ccctggagga cagcagttct ttttctcccc tagactcttc actgcctgag 360gacattccgg tttttactgc tgcagcagct gctaccccag ttccatctgt agtcctaacc 420aggagccccc ccatggaact gcagccccct gtctcccctc agcagtctga gtgcaacccc 480gttggtgctc tgcaggagct ggtggtgcag aaaggctggc ggttgccgga gtacacagtg 540acccaggagt ctgggccagc ccaccgcaaa gaattcacca tgacctgtcg agtggagcgt 600ttcattgaga ttgggagtgg cacttccaaa aaattggcaa agcggaatgc ggcggccaaa 660atgctgcttc gagtgcacac ggtgcctctg gatgcccggg atggcaatga ggtggagcct 720gatgatgacc acttctccat tggtgtgggc ttccgcctgg atggtcttcg aaaccggggc 780ccaggttgca cctgggattc tctacgaaat tcagtaggag agaagatcct gtccctccgc 840agttgctccc tgggctccct gggtgccctg ggccctgcct gctgccgtgt cctcagtgag 900ctctctgagg agcaggcctt tcacgtcagc tacctggata ttgaggagct gagcctgagt 960ggactctgcc agtgcctggt ggaactgtcc acccagccgg ccactgtgtg tcatggctct 1020gcaaccacca gggaggcagc ccgtggtgag gctgcccgcc gtgccctgca gtacctcaag 1080atcatggcag gcagcaagtg a 1101<210>140<211>219<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒<300>
<302>TAT(HIV)<310>U44023
<400>140atggagccag tagatcctag cctagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaagact 60gcttgtacca cttgctattg taaagagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag aactcctcaa 180ggtcatcaga ctaatcaagt ttctctatca aagcagtaa219<210>141<211>22<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與MDR1序列同源的dsRNA的有義鏈(R1A)<400>141ccaucucgaa aagaaguuaa ga 22<210>142<211>24<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明dsRNA的反義鏈(R1B)，與MDR1序列互補(bǔ)<400>142ucuuaacuuc uuuucgagau gggu24<210>143<211>22<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與MDR1序列同源的dsRNA的有義鏈(R2A)<400>143uauagguucc aggcuugcug ua 22<210>144<211>22<212>RNA<213>合成序列
<220>
<223>合成序列說(shuō)明與MDR1序列同源的dsRNA的有義鏈(R3A)<400>144ccagagaagg ccgcaccugc au 22<210>145<211>24<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與MDR1序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(R3B)<400>145augcaggugc ggccuucucu ggcu 24<210>146<211>21<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與MDR1序列同源的dsRNA的有義鏈(R4A)<400>146ccaucucgaa aagaaguuaa g 21<210>147<211>21<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與MDR1序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(R4B)<400>147uaacuucuuu ucgagauggg u 21<210>148<211>22<212>RNA<213>合成序列
<220>
<223>合成序列說(shuō)明分別與YFP-和GFP序列同源的dsRNA的有義鏈(S1A)<400>148ccacaugaag cagcacgacu uc 22<210>149<211>22<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明分別與YFP-和GFP序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(S1B)<400>149gaagucgugc ugcuucaugu gg 22<210>150<211>21<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明分別與YFP-和GFP序列同源的dsRNA的反義鏈(S7A)<400>150ccacaugaag cagcacgacu u 21<210>151<211>21<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明分別與YFP-和GFP序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(S7B)<400>151gucgugcugc uucauguggu c 21<210>152<211>24<212>RNA<213>合成序列
<220>
<223>合成序列說(shuō)明與MDR-1序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(R2B)<400>152uacagcaagc cuggaaccua uagc 24<210>153<211>22<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與新霉素序列的5`-UTR同源的dsRNA的有義鏈(K1A)<400>153acaggaugag gaucguuucg ca22<210>154<211>22<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與新霉素序列的5`-UTR互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(K1B)<400>154ugcgaaacga uccucauccu gu22<210>155<211>21<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與新霉素序列的5`-UTR同源的dsRNA的有義鏈(K3A)<400>155gaugaggauc guuucgcaug a 21<210>156<211>21<212>RNA<213>合成序列
<220>
<223>合成序列說(shuō)明與新霉素序列的5`-UTR互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(K3B)<400>156augcgaaacg auccucaucc u 21<210>157<211>24<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與新霉素序列的5`-UTR同源的dsRNA的有義鏈(K2A)<400>157acaggaugag gaucguuucg caug 24<210>158<211>24<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與新霉素序列的5`-UTR互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(K2B)<400>158ugcgaaacga uccucauccu gucu 24<210>159<211>24<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明分別與YFP-和GFP序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(S4B)<400>159gaagucgugc ugcuucaugu gguc 24<210>160<211>24<212>RNA<213>合成序列
<220>
<223>合成序列說(shuō)明與蛋白質(zhì)激酶C序列同源的dsRNA的有義鏈(PKC1 A)<400>160cuucuccgcc ucacaccgcu gcaa 24<210>161<211>22<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與蛋白質(zhì)激酶C序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(PKC2 B)<400>161gcagcggugu gaggcggaga ag22<210>162<211>21<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明分別與YFP-和GFP序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(S12B)<400>162aagucgugcu gcuucaugug g 21<210>163<211>23<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明分別與YFP-和GFP序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(S11B)<400>163aagucgugcu gcuucaugug guc23<210>164<211>20<212>RNA<213>合成序列
<220>
<223>合成序列說(shuō)明分別與YFP-和GFP序列同源的dsRNA的有義鏈(S13A)<400>164ccacaugaag cagcacgacu20<210>165<211>22<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明分別與YFP-和GFP序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(S13B)<400>165agucgugcug cuucaugugg uc 22<210>166<211>20<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明分別與YFP-和GFP序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(S14B)<400>166agucgugcug cuucaugugg20<210>167<211>24<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明分別與YFP-和GFP序列同源的dsRNA的有義鏈(S4A)<400>167ccacaugaag cagcacgacu ucuu 24<210>168<211>21<212>RNA<213>合成序列
<220>
<223>合成序列說(shuō)明與人EGFR序列同源的dsRNA的有義鏈(ES-7A)<400>168aacaccgcag caugucaaga u 21<210>169<211>21<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與人EGFR序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(ES-7B)<400>169cuugacaugc ugcgguguuu u 21<210>170<211>22<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與人EGFR序列同源的dsRNA的有義鏈(ES-8A)<400>170aaguuaaaau ucccgucgcu au 22<210>171<211>22<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與人EGFR序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(ES-8B)<400>171ugauagcgac gggaauuuua ac 22<210>172<211>22<212>RNA<213>合成序列
<220>
<223>合成序列說(shuō)明與人EGFR序列同源的dsRNA的有義鏈(ES-2A)<400>172agugugaucc aagcuguccc aa 22<210>173<211>24<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說(shuō)明與人EGFR序列互補(bǔ)的dsRNA的反義鏈(ES-5B)<400>173uugggacagc uuggaucaca cuuu
權(quán)利要求
1.抑制靶基因在細(xì)胞中表達(dá)的方法，包括下面的步驟以足以抑制靶基因表達(dá)的量導(dǎo)入至少一種雙鏈核糖核酸(dsRNAI)，其中dsRNA I具有最多由49個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)組成的雙鏈結(jié)構(gòu)，而且其中所述雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈(as1)或者所述一條鏈(as1)的至少一個(gè)片段與靶基因互補(bǔ)，并且其中dsRNA I的至少一個(gè)末端(E1，E2)具有一個(gè)由1-4個(gè)核苷酸組成的突出端。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中dsRNA I在一條鏈(as1)的3′-端和/或另一條鏈(ss1)的3′-端有突出端。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中dsRNA I在一端(E1，E2)具有平端構(gòu)型。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中平端(E1，E2)包含一條鏈(as1)的5′-端。
5.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中突出端由1-4個(gè)核苷酸，優(yōu)選1或2個(gè)核苷酸組成。
6.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中向細(xì)胞中導(dǎo)入至少另外一個(gè)具有前面權(quán)利要求中定義的dsRNA I的構(gòu)型的雙鏈核糖核酸(dsRNAII)，其中所述dsRNA I的一條鏈(as1)與靶基因的第一區(qū)(B1)互補(bǔ)，并且其中dsRNA II的另一條鏈(as2)或所述另一條鏈(as2)的至少一個(gè)片段與靶基因的第二區(qū)(B2)互補(bǔ)。
7.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中dsRNA I和/或dsRNA II具有短于25個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度，優(yōu)選19至23個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度。
8.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中第一(B1)和第二(B2)區(qū)部分重疊或者彼此連接。
9.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中第一(B1)和第二(B2)區(qū)彼此分開(kāi)。
10.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中靶基因具有序列SQ001至SQ140之一。
11.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中靶基因選自癌基因，細(xì)胞因子基因，Id蛋白質(zhì)基因，朊病毒基因，來(lái)自誘導(dǎo)血管生成分子的基因，來(lái)自粘附分子的基因，和來(lái)自細(xì)胞表面受體的基因；來(lái)自轉(zhuǎn)移和/或侵入過(guò)程中涉及的蛋白質(zhì)的基因；來(lái)自蛋白酶和調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡和細(xì)胞周期的分子的基因。
12.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中靶基因是MDR1基因。
13.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中序列SQ141-173之一或合成整體并且屬于序列SQ141-173的兩個(gè)反義-(as1/2)和有義序列(ss1/2)組成的dsRNA構(gòu)建體被用作dsRNA I/II。
14.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中根據(jù)RNA干擾原理抑制表達(dá)。
15.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中靶基因在致病生物體，優(yōu)選瘧原蟲(chóng)中表達(dá)。
16.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中靶基因是病毒或類(lèi)病毒的成分。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述病毒是人致病病毒或類(lèi)病毒。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述病毒或類(lèi)病毒是動(dòng)物或植物中致病病毒或類(lèi)病毒。
19.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中沒(méi)有配對(duì)的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
20.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中為了阻止在細(xì)胞中的分解或者各條鏈中的解離而修飾dsRNA I/II的至少一個(gè)末端(E1，E2)。
21.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)至少一個(gè)化學(xué)鍵增強(qiáng)互補(bǔ)核苷酸對(duì)實(shí)現(xiàn)的雙鏈結(jié)構(gòu)的內(nèi)聚性。
22.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵，氫鍵，疏水作用，優(yōu)選利用范德華作用或堆積作用，或利用金屬離子配位作用實(shí)現(xiàn)化學(xué)連接。
23.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中在一個(gè)末端(E1，E2)附近形成化學(xué)連接。
24.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中由一個(gè)或幾個(gè)鍵合基團(tuán)建立化學(xué)連接，其中鍵合基團(tuán)優(yōu)選是聚-(氧磷酸亞基-氧-1，3-丙二醇)和/或寡乙二醇鏈。
25.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)使用支化核苷酸類(lèi)似物代替核苷酸形成化學(xué)連接。
26.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)嘌呤類(lèi)似物形成化學(xué)連接。
27.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)氮雜苯單元形成化學(xué)連接。
28.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中在產(chǎn)生化學(xué)連接中使用下面基團(tuán)至少之一亞甲基藍(lán)；雙官能基團(tuán)，優(yōu)選雙-(2-氯乙基)-胺；N-乙?；?N’-(p-乙醛酰-苯甲?；?-胱胺；4-硫尿嘧啶；補(bǔ)骨脂素。
29.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)在雙鏈區(qū)末端(E1，E2)附近連接的硫代磷?；鶊F(tuán)形成化學(xué)連接。
30.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)末端(E1，E2)附近存在的三鏈螺旋鍵形成化學(xué)連接。
31.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中dsRNA I/II被圍繞在微團(tuán)結(jié)構(gòu)中，最有利地被圍繞在脂質(zhì)體中。
32.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中dsRNA I/II結(jié)合于至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)，與至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)締合，或者被至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)圍繞，所述蛋白質(zhì)源于病毒，或者來(lái)自病毒，或者是合成制備的。
33.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中所述外殼蛋白來(lái)自多瘤病毒。
34.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中所述外殼蛋白含有多瘤病毒的病毒蛋白質(zhì)1(VP1)和/或病毒蛋白質(zhì)2(VP2)。
35.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中在形成病毒殼體或病毒殼體樣結(jié)構(gòu)時(shí)，一側(cè)轉(zhuǎn)向殼體或殼體樣結(jié)構(gòu)內(nèi)部。
36.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中dsRNA I/II的一條鏈(as1，as2)與靶基因的初始的或加工過(guò)的RNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)。
37.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞或人細(xì)胞。
38.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中以每天每千克體重5毫克的最大劑量對(duì)哺乳動(dòng)物，優(yōu)選對(duì)人施用dsRNA I/II。
39.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中dsRNA I/II在緩沖液中混合用于施用。
40.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中口服dsRNA I/II或者通過(guò)靜脈內(nèi)，腫瘤內(nèi)，或腹膜內(nèi)注射或灌注，或者通過(guò)吸入給藥。
41.一種雙鏈核糖核酸(dsRNA I)抑制靶基因在細(xì)胞中表達(dá)的用途，其中dsRNA I具有最多由49個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)組成的雙鏈結(jié)構(gòu)，而且其中所述雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈(as1)或者所述一條鏈(as1)的至少一個(gè)片段與靶基因互補(bǔ)，并且其中dsRNA I的至少一個(gè)末端(E1，E2)具有一個(gè)由1-4個(gè)核苷酸組成的突出端。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的用途，其中dsRNA I在一條鏈(as1)的3′-端和/或另一條鏈(ss1)的3′-端有突出端。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42的用途，其中dsRNA I在一端(E1，E2)具有平端構(gòu)型。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的用途，其中平端(E1，E2)包含一條鏈(as1)的5′-端。
45.根據(jù)權(quán)利要求41-44之一的用途，其中突出端由1-4個(gè)核苷酸，優(yōu)選1或2個(gè)核苷酸組成。
46.根據(jù)權(quán)利要求41-45之一的用途，其中向細(xì)胞中導(dǎo)入至少另外一個(gè)具有權(quán)利要求41-45中定義的dsRNA I的構(gòu)型的雙鏈核糖核酸(dsRNA II)，其中所述dsRNA I的雙鏈結(jié)構(gòu)的所述一條鏈(as1)或該鏈(as1)的至少一個(gè)片段與靶基因的有義鏈的第一區(qū)(B1)互補(bǔ)，并且其中dsRNA II的雙鏈結(jié)構(gòu)的另一條鏈(as2)或所述另一條鏈(as2)的至少一個(gè)片段與靶基因的第二區(qū)(B2)互補(bǔ)。
47.根據(jù)權(quán)利要求41-46之一的用途，其中dsRNA I和/或dsRNAII具有短于25個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度，優(yōu)選19至23個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度。
48.根據(jù)權(quán)利要求41-47之一的用途，其中第一(B1)和第二(B2)區(qū)部分重疊或者彼此連接。
49.根據(jù)權(quán)利要求41-48之一的用途，其中第一(B1)和第二(B2)區(qū)彼此分開(kāi)。
50.根據(jù)權(quán)利要求41-49之一的用途，其中靶基因具有序列SQ001至SQ140之一。
51.根據(jù)權(quán)利要求41-50之一的用途，其中靶基因選自癌基因，細(xì)胞因子基因，Id蛋白質(zhì)基因，朊病毒基因，來(lái)自誘導(dǎo)血管生成分子的基因，來(lái)自粘附分子的基因，和來(lái)自細(xì)胞表面受體的基因；來(lái)自轉(zhuǎn)移和/或侵入過(guò)程中涉及的蛋白質(zhì)的基因；來(lái)自蛋白酶和調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡和細(xì)胞周期的分子的基因。
52.根據(jù)權(quán)利要求41-51之一的用途，其中靶基因是MDR1基因。
53.根據(jù)權(quán)利要求41-52之一的用途，其中序列SQ141-173之一或合成整體并且屬于序列SQ141-173的兩個(gè)反義-(as1/2)和有義序列(ss1/2)組成的dsRNA構(gòu)建體被用作dsRNA I/II。
54.根據(jù)權(quán)利要求41-53之一的用途，其中根據(jù)RNA干擾原理抑制表達(dá)。
55.根據(jù)權(quán)利要求41-54之一的用途，其中靶基因在致病生物體，優(yōu)選瘧原蟲(chóng)中表達(dá)。
56.根據(jù)權(quán)利要求41-55之一的用途，其中靶基因是病毒或類(lèi)病毒的成分。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的用途，其中所述病毒是人致病病毒或類(lèi)病毒。
58.根據(jù)權(quán)利要求56的用途，其中所述病毒或類(lèi)病毒是動(dòng)物或植物中致病病毒或類(lèi)病毒。
59.根據(jù)權(quán)利要求41-58之一的用途，其中沒(méi)有配對(duì)的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
60.根據(jù)權(quán)利要求41-59之一的用途，其中為了阻止在細(xì)胞中的分解或者各條鏈中的解離而修飾dsRNA的至少一個(gè)末端(E1，E2)。
61.根據(jù)權(quán)利要求41-60之一的用途，其中通過(guò)至少一個(gè)化學(xué)鍵增強(qiáng)互補(bǔ)核苷酸對(duì)實(shí)現(xiàn)的雙鏈結(jié)構(gòu)的內(nèi)聚性。
62.根據(jù)權(quán)利要求41-61之一的用途，其中通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵，氫鍵，疏水作用，優(yōu)選利用范德華作用或堆積作用，或利用金屬離子配位作用實(shí)現(xiàn)化學(xué)連接。
63.根據(jù)權(quán)利要求41-62之一的用途，其中在一個(gè)末端(E1，E2)附近形成化學(xué)連接。
64.根據(jù)權(quán)利要求41-63之一的用途，其中由一個(gè)或幾個(gè)鍵合基團(tuán)建立化學(xué)連接，其中鍵合基團(tuán)優(yōu)選是聚-(氧磷酸亞基-氧-1，3-丙二醇)和/或寡乙二醇鏈。
65.根據(jù)權(quán)利要求41-64之一的用途，其中通過(guò)使用支化核苷酸類(lèi)似物代替核苷酸形成化學(xué)連接。
66.根據(jù)權(quán)利要求41-65之一的用途，其中通過(guò)嘌呤類(lèi)似物形成化學(xué)連接。
67.根據(jù)權(quán)利要求41-66之一的用途，其中通過(guò)氮雜苯單元形成化學(xué)連接。
68.根據(jù)權(quán)利要求41-67之一的用途，其中在產(chǎn)生化學(xué)連接中使用下面基團(tuán)至少之一亞甲基藍(lán)；雙官能基團(tuán)，優(yōu)選雙-(2-氯乙基)-胺；N-乙?；?N’-(p-乙醛酰-苯甲?；?-胱胺；4-硫尿嘧啶；補(bǔ)骨脂素。
69.根據(jù)權(quán)利要求41-68之一的用途，其中通過(guò)在雙鏈區(qū)末端(E1，E2)附近連接的硫代磷?；鶊F(tuán)形成化學(xué)連接。
70.根據(jù)權(quán)利要求41-69之一的用途，其中通過(guò)末端(E1，E2)附近存在的三鏈螺旋鍵形成連接。
71.根據(jù)權(quán)利要求41-70之一的用途，其中dsRNA I/II被圍繞在微團(tuán)結(jié)構(gòu)中，最有利地被圍繞在脂質(zhì)體中。
72.根據(jù)權(quán)利要求41-71之一的用途，其中dsRNA I/II結(jié)合于至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)，與至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)締合，或者被至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)圍繞，所述蛋白質(zhì)源于病毒，或者來(lái)自病毒，或者是合成制備的。
73.根據(jù)權(quán)利要求41-72之一的用途，其中所述外殼蛋白來(lái)自多瘤病毒。
74.根據(jù)權(quán)利要求41-73之一的用途，其中所述外殼蛋白含有多瘤病毒的病毒蛋白質(zhì)1(VP1)和/或病毒蛋白質(zhì)2(VP2)。
75.根據(jù)權(quán)利要求41-74之一的用途，其中在形成病毒殼體或病毒殼體樣結(jié)構(gòu)時(shí)，一側(cè)轉(zhuǎn)向殼體或殼體樣結(jié)構(gòu)內(nèi)部。
76.根據(jù)權(quán)利要求41-75之一的用途，其中dsRNA I/II的一條鏈(as1，as2)與靶基因的初始的或加工過(guò)的RNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)。
77.根據(jù)權(quán)利要求41-76之一的用途，其中細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞或人細(xì)胞。
78.根據(jù)權(quán)利要求41-77之一的用途，其中以每天每千克體重5毫克的最大劑量對(duì)哺乳動(dòng)物，優(yōu)選對(duì)人施用dsRNA I/II。
79.根據(jù)權(quán)利要求41-78之一的用途，其中dsRNA I/II在緩沖液中混合用于施用。
80.根據(jù)權(quán)利要求41-79之一的用途，其中口服dsRNA I/II或者通過(guò)靜脈內(nèi)，腫瘤內(nèi)，或腹膜內(nèi)注射或灌注，或者通過(guò)吸入給藥。
81.抑制靶基因在細(xì)胞中表達(dá)的藥物，含有足以抑制靶基因表達(dá)劑量的雙鏈核糖核酸(dsRNA I)，其中dsRNA I具有最多由49個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)組成的雙鏈結(jié)構(gòu)，而且其中所述雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈(as1)或者所述一條鏈(as1)的至少一個(gè)片段與靶基因互補(bǔ)，并且其中dsRNA I的的至少一個(gè)末端(E1，E2)具有一個(gè)由1-4個(gè)核苷酸組成的突出端。
82.根據(jù)權(quán)利要求81的藥物，其中dsRNA I在一條鏈(as1)的3′-端和/或另一條鏈(ss1)的3′-端有突出端。
83.根據(jù)權(quán)利要求81或82的方法，其中dsRNA I在一端(E1，E2)具有平端構(gòu)型。
84.根據(jù)權(quán)利要求83的藥物，其中平端(E1，E2)包含一條鏈(as1)的5′-端。
85.根據(jù)權(quán)利要求81-84的藥物，其中突出端由1-4個(gè)核苷酸，優(yōu)選1或2個(gè)核苷酸組成。
86.根據(jù)權(quán)利要求81-85之一的藥物，其中至少另外一個(gè)雙鏈核糖核酸(dsRNA II)具有根據(jù)權(quán)利要求75或76中定義的dsRNA I的構(gòu)型，并且其中dsRNA I的一條鏈(as1)與靶基因的第一區(qū)(B1)互補(bǔ)，并且其中dsRNA II的另一條鏈(as2)或所述另一條鏈(as2)的至少一個(gè)片段與靶基因的第二區(qū)(B2)互補(bǔ)。
87.根據(jù)權(quán)利要求81-86之一的藥物，其中dsRNA I和/或dsRNAII具有短于25個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度，優(yōu)選19至23個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度。
88.根據(jù)權(quán)利要求81-87之一的藥物，其中第一(B1)和第二(B2)區(qū)部分重疊或者彼此連接。
89.根據(jù)權(quán)利要求81-88之一的藥物，其中靶基因具有序列SQ001至SQ140之一。
90.根據(jù)權(quán)利要求81-89之一的藥物，其中靶基因選自癌基因，細(xì)胞因子基因，Id蛋白質(zhì)基因，朊病毒基因，來(lái)自誘導(dǎo)血管生成分子的基因，來(lái)自粘附分子的基因，和來(lái)自細(xì)胞表面受體的基因；來(lái)自轉(zhuǎn)移和/或侵入過(guò)程中涉及的蛋白質(zhì)的基因；來(lái)自蛋白酶和調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡和細(xì)胞周期的分子的基因。
91.根據(jù)權(quán)利要求81-90之一的藥物，其中靶基因是MDR1基因。
92.根據(jù)權(quán)利要求81-91之一的藥物，其中序列SQ141-173之一或合成整體并且屬于序列SQ141-173的兩個(gè)反義-(as1/2)和有義序列(ss1/2)組成的dsRNA構(gòu)建體被用作dsRNA I/II。
93.根據(jù)權(quán)利要求81-92之一的藥物，其中根據(jù)RNA干擾原理抑制表達(dá)。
94.根據(jù)權(quán)利要求81-93之一的藥物，其中靶基因在致病生物體，最有利地在瘧原蟲(chóng)中表達(dá)。
95.根據(jù)權(quán)利要求81-94之一的藥物，其中靶基因是病毒或類(lèi)病毒的成分。
96.根據(jù)權(quán)利要求95的藥物，其中所述病毒是人致病病毒或類(lèi)病毒。
97.根據(jù)權(quán)利要求95的藥物，其中所述病毒或類(lèi)病毒是動(dòng)物或植物中致病病毒或類(lèi)病毒。
98.根據(jù)權(quán)利要求81-97之一的藥物，其中沒(méi)有配對(duì)的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
99.根據(jù)權(quán)利要求81-98之一的藥物，其中為了阻止在細(xì)胞中的分解或者各條鏈中的解離而修飾dsRNAI/II的至少一個(gè)末端(E1，E2)。
100.根據(jù)權(quán)利要求81-99之一的藥物，其中通過(guò)至少一個(gè)化學(xué)鍵增強(qiáng)互補(bǔ)核苷酸對(duì)實(shí)現(xiàn)的雙鏈結(jié)構(gòu)的內(nèi)聚性。
101.根據(jù)權(quán)利要求81-100之一的藥物，其中通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵，氫鍵，疏水作用，優(yōu)選利用范德華作用或堆積作用，或利用金屬離子配位作用實(shí)現(xiàn)化學(xué)連接。
102.根據(jù)權(quán)利要求81-101之一的藥物，其中在一個(gè)末端(E1，E2)附近形成化學(xué)連接。
103.根據(jù)權(quán)利要求81-102之一的藥物，其中由一個(gè)或幾個(gè)鍵合基團(tuán)建立化學(xué)連接，其中鍵合基團(tuán)優(yōu)選是聚-(氧磷酸亞基-氧-1，3-丙二醇)和/或寡乙二醇鏈。
104.根據(jù)權(quán)利要求81-103之一的藥物，其中通過(guò)使用支化核苷酸類(lèi)似物代替核苷酸形成化學(xué)連接。
105.根據(jù)權(quán)利要求81-104之一的藥物，其中通過(guò)嘌呤類(lèi)似物形成化學(xué)連接。
106.根據(jù)權(quán)利要求81-105之一的藥物，其中通過(guò)氮雜苯單元形成化學(xué)連接。
107.根據(jù)權(quán)利要求81-106之一的藥物，其中在產(chǎn)生化學(xué)連接中使用下面基團(tuán)至少之一亞甲基藍(lán)；雙官能基團(tuán)，優(yōu)選雙-(2-氯乙基)-胺；N-乙?；?N’-(p-乙醛酰-苯甲?；?-胱胺；4-硫尿嘧啶；補(bǔ)骨脂素。
108.根據(jù)權(quán)利要求81-107之一的藥物，其中通過(guò)在雙鏈區(qū)末端(E1，E2)附近連接的硫代磷酰基團(tuán)形成化學(xué)連接。
109.根據(jù)權(quán)利要求81-108之一的藥物，其中通過(guò)末端(E1，E2)附近存在的三鏈螺旋鍵形成連接。
110.根據(jù)權(quán)利要求81-109之一的藥物，其中dsRNA I/II被圍繞在微團(tuán)結(jié)構(gòu)中，最有利地被圍繞在脂質(zhì)體中。
111.根據(jù)權(quán)利要求81-110之一的藥物，其中dsRNA I/II結(jié)合于至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)，與至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)締合，或者被至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)圍繞，所述蛋白質(zhì)源于病毒，或者來(lái)自病毒，或者是合成制備的。
112.根據(jù)權(quán)利要求81-111之一的藥物，其中所述外殼蛋白來(lái)自多瘤病毒。
113.根據(jù)權(quán)利要求81-112之一的藥物，其中所述外殼蛋白含有多瘤病毒的病毒蛋白質(zhì)1(VP1)和/或病毒蛋白質(zhì)2(VP2)。
114.根據(jù)權(quán)利要求81-113之一的藥物，其中在形成病毒殼體或病毒殼體樣結(jié)構(gòu)時(shí)，一側(cè)轉(zhuǎn)向殼體或殼體樣結(jié)構(gòu)內(nèi)部。
115.根據(jù)權(quán)利要求81-114之一的藥物，其中dsRNA I/II的一條鏈(as1，as2)與靶基因的初始的或加工過(guò)的RNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)。
116.根據(jù)權(quán)利要求81-115之一的藥物，其中細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞或人細(xì)胞。
117.根據(jù)權(quán)利要求81-116之一的藥物，其中所述第一(B1)和第二(B2)區(qū)彼此分開(kāi)。
118.根據(jù)權(quán)利要求81-117之一的藥物，其中以每劑5毫克的最大量施用dsRNA。
119.根據(jù)權(quán)利要求81-118之一的藥物，其中dsRNA在緩沖液中混合用于施用。
120.根據(jù)權(quán)利要求81-119之一的藥物，其中口服dsRNA或者通過(guò)靜脈內(nèi)，腫瘤內(nèi)，或腹膜內(nèi)注射或灌注，或者通過(guò)吸入給藥。
121.抑制靶基因在細(xì)胞中表達(dá)的方法，包括下面的步驟以足以抑制靶基因表達(dá)的量導(dǎo)入至少一種雙鏈核糖核酸(dsRNAI)，其中dsRNA I具有最多由49個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)組成的雙鏈結(jié)構(gòu)，而且其中所述雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈(as1)或者所述一條鏈(as1)的至少一個(gè)片段與靶基因互補(bǔ)，并且其中dsRNA I的至少一個(gè)末端(E1，E2)具有一個(gè)由1-4個(gè)核苷酸組成的突出端。
122.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中dsRNA I在一條鏈(as1)的3′-端和/或另一條鏈(ss1)的3′-端有突出端。
123.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中dsRNA I在一端(E1，E2)具有平端構(gòu)型。
124.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中平端(E1，E2)包含一條鏈(as1)的5′-端。
125.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中突出端由1-4個(gè)，核苷酸優(yōu)選1或2個(gè)核苷酸組成。
126.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中向細(xì)胞中導(dǎo)入至少另外一個(gè)具有前面權(quán)利要求中定義的dsRNA I的構(gòu)型的雙鏈核糖核酸(dsRNA II)，其中所述dsRNA I的一條鏈(as1)與靶基因的第一區(qū)(B1)互補(bǔ)，并且其中dsRNA II的另一條鏈(as2)或所述另一條鏈(as2)的至少一個(gè)片段與靶基因的第二區(qū)(B2)互補(bǔ)。
127.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中dsRNA I和/或dsRNA II具有短于25個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度，優(yōu)選19至23個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度。
128.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中第一(B1)和第二(B2)區(qū)部分重疊或者彼此連接。
129.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中第一(B1)和第二(B2)區(qū)彼此分開(kāi)。
130.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中靶基因具有序列SQ001至SQ140之一。
131.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中靶基因選自癌基因，細(xì)胞因子基因，Id蛋白質(zhì)基因，朊病毒基因，來(lái)自誘導(dǎo)血管生成分子的基因，來(lái)自粘附分子的基因，和來(lái)自細(xì)胞表面受體的基因；來(lái)自轉(zhuǎn)移和/或侵入過(guò)程中涉及的蛋白質(zhì)的基因；來(lái)自蛋白酶和調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡和細(xì)胞周期的分子的基因。
132.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中靶基因是MDR1基因。
133.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中序列SQ141-173之一或合成整體并且屬于序列SQ141-173的兩個(gè)反義-(as1/2)和有義序列(ss1/2)組成的dsRNA構(gòu)建體被用作dsRNA I/II。
134.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中根據(jù)RNA干擾原理抑制表達(dá)。
135.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中靶基因在致病生物體，優(yōu)選瘧原蟲(chóng)中表達(dá)。
136.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中靶基因是病毒或類(lèi)病毒的成分。
137.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述病毒是人致病病毒或類(lèi)病毒。
138.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述病毒或類(lèi)病毒是動(dòng)物或植物中致病病毒或類(lèi)病毒。
139.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中沒(méi)有配對(duì)的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
140.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中為了阻止在細(xì)胞中的分解或者各條鏈中的解離而修飾dsRNA I/II的至少一個(gè)末端(E1，E2)。
141.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)至少一個(gè)化學(xué)鍵增強(qiáng)互補(bǔ)核苷酸對(duì)實(shí)現(xiàn)的雙鏈結(jié)構(gòu)的內(nèi)聚性。
142.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵，氫鍵，疏水作用，優(yōu)選利用范德華作用或堆積作用，或利用金屬離子配位作用實(shí)現(xiàn)化學(xué)連接。
143.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中在一個(gè)末端(E1，E2)附近形成化學(xué)連接。
144.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中由一個(gè)或幾個(gè)鍵合基團(tuán)建立化學(xué)連接，其中鍵合基團(tuán)優(yōu)選是聚-(氧磷酸亞基-氧-1，3-丙二醇)和/或寡乙二醇鏈。
145.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)使用支化核苷酸類(lèi)似物代替核苷酸形成化學(xué)連接。
146.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)嘌呤類(lèi)似物形成化學(xué)連接。
147.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)氮雜苯單元形成化學(xué)連接。
148.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中在產(chǎn)生化學(xué)連接中使用下面基團(tuán)至少之一亞甲基藍(lán)；雙官能基團(tuán)，優(yōu)選雙-(2-氯乙基)-胺；N-乙?；?N’-(p-乙醛酰-苯甲酰基)-胱胺；4-硫尿嘧啶；補(bǔ)骨脂素。
149.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)在雙鏈區(qū)末端(E1，E2)附近連接的硫代磷?；鶊F(tuán)形成化學(xué)連接。
150.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中通過(guò)末端(E1，E2)附近存在的三鏈螺旋鍵形成化學(xué)連接。
151.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中dsRNA I/II被圍繞在微團(tuán)結(jié)構(gòu)中，最有利地被圍繞在脂質(zhì)體中。
152.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中dsRNA I/II結(jié)合于至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)，與至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)締合，或者被至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)圍繞，所述蛋白質(zhì)源于病毒，或者來(lái)自病毒，或者是合成制備的。
153.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中所述外殼蛋白來(lái)自多瘤病毒。
154.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中所述外殼蛋白含有多瘤病毒的病毒蛋白質(zhì)1(VP1)和/或病毒蛋白質(zhì)2(VP2)。
155.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中在形成病毒殼體或病毒殼體樣結(jié)構(gòu)時(shí)，一側(cè)轉(zhuǎn)向殼體或殼體樣結(jié)構(gòu)內(nèi)部。
156.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中dsRNA I/II的一條鏈(as1，as2)與靶基因的初始的或加工過(guò)的RNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)。
157.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞或人細(xì)胞。
158.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中以每天每千克體重5毫克的最大劑量對(duì)哺乳動(dòng)物，優(yōu)選對(duì)人施用dsRNA I/II。
159.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中dsRNA I/II在緩沖液中混合用于施用。
160.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其中口服dsRNA I/II或者通過(guò)靜脈內(nèi)，腫瘤內(nèi)，或腹膜內(nèi)注射或灌注，或者通過(guò)吸入給藥。
161.一種雙鏈核糖核酸(dsRNA I)抑制靶基因在細(xì)胞中表達(dá)的用途，其中dsRNA I具有最多由49個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)組成的雙鏈結(jié)構(gòu)，而且其中所述雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈(as1)或者所述一條鏈(as1)的至少一個(gè)片段與靶基因互補(bǔ)，并且其中dsRNA I的至少一個(gè)末端(E1，E2)具有一個(gè)由1-4個(gè)核苷酸組成的突出端。
162.根據(jù)權(quán)利要求41的用途，其中dsRNA I在一條鏈(as1)的3′-端和/或另一條鏈(ss1)的3′-端有突出端。
163.根據(jù)權(quán)利要求41或42的用途，其中dsRNA I在一端(E1，E2)具有平端構(gòu)型。
164.根據(jù)權(quán)利要求43的用途，其中平端(E1，E2)包含一條鏈(as1)的5′-端。
165.根據(jù)權(quán)利要求41-44的用途，其中突出端由1-4個(gè)核苷酸，優(yōu)選1或2個(gè)核苷酸組成。
166.根據(jù)權(quán)利要求41-45的用途，其中向細(xì)胞中導(dǎo)入至少另外一個(gè)具有權(quán)利要求41-45中定義的dsRNA I的構(gòu)型的雙鏈核糖核酸(dsRNA II)，其中所述dsRNA I的雙鏈結(jié)構(gòu)的所述一條鏈(as1)或該鏈(as1)的至少一個(gè)片段與靶基因的有義鏈的第一區(qū)(B1)互補(bǔ)，并且其中dsRNA II的雙鏈結(jié)構(gòu)的另一條鏈(as2)或所述另一條鏈(as2)的至少一個(gè)片段與靶基因的第二區(qū)(B2)互補(bǔ)。
167.根據(jù)權(quán)利要求41-47之一的用途，其中dsRNA I和/或dsRNAII具有短于25個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度，優(yōu)選19至23個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度。
168.根據(jù)權(quán)利要求41-47之一的用途，其中第一(B1)和第二(B2)區(qū)部分重疊或者彼此連接。
169.根據(jù)權(quán)利要求41-48之一的用途，其中第一(B1)和第二(B2)區(qū)彼此分開(kāi)。
170.根據(jù)權(quán)利要求41-49之一的用途，其中靶基因具有序列SQ001至SQ140之一。
171.根據(jù)權(quán)利要求41-50之一的用途，其中靶基因選自癌基因，細(xì)胞因子基因，Id蛋白質(zhì)基因，朊病毒基因，來(lái)自誘導(dǎo)血管生成分子的基因，來(lái)自粘附分子的基因，和來(lái)自細(xì)胞表面受體的基因；來(lái)自轉(zhuǎn)移和/或侵入過(guò)程中涉及的蛋白質(zhì)的基因；來(lái)自蛋白酶和調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡和細(xì)胞周期的分子的基因。
172.根據(jù)權(quán)利要求41-51之一的用途，其中靶基因是MDR1基因。
173.根據(jù)權(quán)利要求41-52之一的用途，其中序列SQ141-173之一或合成整體并且屬于序列SQ141-173的兩個(gè)反義-(as1/2)和有義序列(s s1/2)組成的dsRNA構(gòu)建體被用作dsRNA I/II。
174.根據(jù)權(quán)利要求41-53之一的用途，其中根據(jù)RNA干擾原理抑制表達(dá)。
175.根據(jù)權(quán)利要求41-54之一的用途，其中靶基因在致病生物體，優(yōu)選瘧原蟲(chóng)中表達(dá)。
176.根據(jù)權(quán)利要求41-55之一的用途，其中靶基因是病毒或類(lèi)病毒的成分。
177.根據(jù)權(quán)利要求56的用途，其中所述病毒是人致病病毒或類(lèi)病毒。
178.根據(jù)權(quán)利要求56的用途，其中所述病毒或類(lèi)病毒是動(dòng)物或植物中致病病毒或類(lèi)病毒。
179.根據(jù)權(quán)利要求41-58之一的用途，其中沒(méi)有配對(duì)的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
180.根據(jù)權(quán)利要求41-59之一的用途，其中為了阻止在細(xì)胞中的分解或者各條鏈中的解離而修飾dsRNA的至少一個(gè)末端(E1，E2)。
181.根據(jù)權(quán)利要求41-60之一的用途，其中通過(guò)至少一個(gè)化學(xué)鍵增強(qiáng)互補(bǔ)核苷酸對(duì)實(shí)現(xiàn)的雙鏈結(jié)構(gòu)的內(nèi)聚性。
182.根據(jù)權(quán)利要求41-61之一的用途，其中通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵，氫鍵，疏水作用，優(yōu)選利用范德華作用或堆積作用，或利用金屬離子配位作用實(shí)現(xiàn)化學(xué)連接。
183.根據(jù)權(quán)利要求41-62之一的用途，其中在一個(gè)末端(E1，E2)附近形成化學(xué)連接。
184.根據(jù)權(quán)利要求41-63之一的用途，其中由一個(gè)或幾個(gè)鍵合基團(tuán)建立化學(xué)連接，其中鍵合基團(tuán)優(yōu)選是聚-(氧磷酸亞基-氧-1，3-丙二醇)和/或寡乙二醇鏈。
185.根據(jù)權(quán)利要求41-64之一的用途，其中通過(guò)使用支化核苷酸類(lèi)似物代替核苷酸形成化學(xué)連接。
186.根據(jù)權(quán)利要求41-65之一的用途，其中通過(guò)嘌呤類(lèi)似物形成化學(xué)連接。
187.根據(jù)權(quán)利要求41-66之一的用途，其中通過(guò)氮雜苯單元形成化學(xué)連接。
188.根據(jù)權(quán)利要求41-67之一的用途，其中在產(chǎn)生化學(xué)連接中使用下面基團(tuán)至少之一亞甲基藍(lán)；雙官能基團(tuán)，優(yōu)選雙-(2-氯乙基)-胺；N-乙?；?N’-(p-乙醛酰-苯甲?；?-胱胺；4-硫尿嘧啶；補(bǔ)骨脂素。
189.根據(jù)權(quán)利要求41-68之一的用途，其中通過(guò)在雙鏈區(qū)末端(E1，E2)附近連接的硫代磷?；鶊F(tuán)形成化學(xué)連接。
190.根據(jù)權(quán)利要求41-69之一的用途，其中通過(guò)末端(E1，E2)附近存在的三鏈螺旋鍵形成連接。
191.根據(jù)權(quán)利要求41-70之一的用途，其中dsRNA I/II被圍繞在微團(tuán)結(jié)構(gòu)中，最有利地被圍繞在脂質(zhì)體中。
192.根據(jù)權(quán)利要求41-71之一的用途，其中dsRNA I/II結(jié)合于至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)，與至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)締合，或者被至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)圍繞，所述蛋白質(zhì)源于病毒，或者來(lái)自病毒，或者是合成制備的。
193.根據(jù)權(quán)利要求41-72之一的用途，其中所述外殼蛋白來(lái)自多瘤病毒。
194.根據(jù)權(quán)利要求41-73之一的用途，其中所述外殼蛋白含有多瘤病毒的病毒蛋白質(zhì)1(VP1)和/或病毒蛋白質(zhì)2(VP2)。
195.根據(jù)權(quán)利要求41-74之一的用途，其中在形成病毒殼體或病毒殼體樣結(jié)構(gòu)時(shí)，一側(cè)轉(zhuǎn)向殼體或殼體樣結(jié)構(gòu)內(nèi)部。
196.根據(jù)權(quán)利要求41-75之一的用途，其中dsRNA I/II的一條鏈(as1，as2)與靶基因的初始的或加工過(guò)的RNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)。
197.根據(jù)權(quán)利要求41-76之一的用途，其中細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞或人細(xì)胞。
198.根據(jù)權(quán)利要求41-77之一的用途，其中以每天每千克體重5毫克的最大劑量對(duì)哺乳動(dòng)物，優(yōu)選對(duì)人施用dsRNA I/II。
199.根據(jù)權(quán)利要求41-78之一的用途，其中dsRNA I/II在緩沖液中混合用于施用。
200.根據(jù)權(quán)利要求41-79之一的用途，其中口服dsRNA I/II或者通過(guò)靜脈內(nèi)，腫瘤內(nèi)，或腹膜內(nèi)注射或灌注，或者通過(guò)吸入給藥。
201.抑制靶基因在細(xì)胞中表達(dá)的藥物，含有足以抑制靶基因表達(dá)劑量的雙鏈核糖核酸(dsRNA I)，其中dsRNA I具有最多由49個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)組成的雙鏈結(jié)構(gòu)，而且其中所述雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈(as1)或者所述一條鏈(as1)的至少一個(gè)片段與靶基因互補(bǔ)，并且其中dsRNA I的至少一個(gè)末端(E1，E2)具有一個(gè)由1-4個(gè)核苷酸組成的突出端。
202.根據(jù)權(quán)利要求81的藥物，其中dsRNA I在一條鏈(as1)的3′-端和/或另一條鏈(ss1)的3′-端有突出端。
203.根據(jù)權(quán)利要求8 1或82的方法，其中dsRNA I在一端(E1，E2)具有平端構(gòu)型。
204.根據(jù)權(quán)利要求83的藥物，其中平端(E1，E2)包含一條鏈(as1)的5′-端。
205.根據(jù)權(quán)利要求81-84的藥物，其中突出端由1-4個(gè)核苷酸，優(yōu)選1或2個(gè)核苷酸組成。
206.根據(jù)權(quán)利要求81-85之一的藥物，其中至少另外一個(gè)雙鏈核糖核酸(dsRNA II)具有根據(jù)權(quán)利要求75或76中定義的dsRNA I的構(gòu)型，并且其中dsRNA I的一條鏈(as1)與靶基因的第一區(qū)(B1)互補(bǔ)，并且其中dsRNA II的另一條鏈(as2)或所述另一條鏈(as2)的至少一個(gè)片段與靶基因的第二區(qū)(B2)互補(bǔ)。
207.根據(jù)權(quán)利要求81-86之一的藥物，其中dsRNA I和/或dsRNAII具有短于25個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度，優(yōu)選19至23個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度。
208.根據(jù)權(quán)利要求81-87之一的藥物，其中第一(B1)和第二(B2)區(qū)部分重疊或者彼此連接。
209.根據(jù)權(quán)利要求81-88之一的藥物，其中靶基因具有序列SQ001至SQ140之一。
210.根據(jù)權(quán)利要求81-89之一的藥物，其中靶基因選自癌基因，細(xì)胞因子基因，Id蛋白質(zhì)基因，朊病毒基因，來(lái)自誘導(dǎo)血管生成分子的基因，來(lái)自粘附分子的基因，和來(lái)自細(xì)胞表面受體的基因；來(lái)自轉(zhuǎn)移和/或侵入過(guò)程中涉及的蛋白質(zhì)的基因；來(lái)自蛋白酶和調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡和細(xì)胞周期的分子的基因。
211.根據(jù)權(quán)利要求81-90之一的藥物，其中靶基因是MDR1基因。
212.根據(jù)權(quán)利要求81-91之一的藥物，其中序列SQ141-173之一或合成整體并且屬于序列SQ141-173的兩個(gè)反義-(as1/2)和有義序列(ss1/2)組成的dsRNA構(gòu)建體被用作dsRNA I/II。
213.根據(jù)權(quán)利要求81-92之一的藥物，其中根據(jù)RNA干擾原理抑制表達(dá)。
214.根據(jù)權(quán)利要求81-93之一的藥物，其中靶基因在致病生物體，最有利地在瘧原蟲(chóng)中表達(dá)。
215.根據(jù)權(quán)利要求81-94之一的藥物，其中靶基因是病毒或類(lèi)病毒的成分。
216.根據(jù)權(quán)利要求95的藥物，其中所述病毒是人致病病毒或類(lèi)病毒。
217.根據(jù)權(quán)利要求95的藥物，其中所述病毒或類(lèi)病毒是動(dòng)物或植物中致病病毒或類(lèi)病毒。
218.根據(jù)權(quán)利要求81-97之一的藥物，其中沒(méi)有配對(duì)的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
219.根據(jù)權(quán)利要求81-98之一的藥物，其中為了阻止在細(xì)胞中的分解或者各條鏈中的解離而修飾dsRNAI/II的至少一個(gè)末端(E1，E2)。
220.根據(jù)權(quán)利要求81-99之一的藥物，其中通過(guò)至少一個(gè)化學(xué)鍵增強(qiáng)互補(bǔ)核苷酸對(duì)實(shí)現(xiàn)的雙鏈結(jié)構(gòu)的內(nèi)聚性。
221.根據(jù)權(quán)利要求81-100之一的藥物，其中通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵，氫鍵，疏水作用，優(yōu)選利用范德華作用或堆積作用，或利用金屬離子配位作用實(shí)現(xiàn)化學(xué)連接。
222.根據(jù)權(quán)利要求81-101之一的藥物，其中在一個(gè)末端(E1，E2)附近形成化學(xué)連接。
223.根據(jù)權(quán)利要求81-102之一的藥物，其中由一個(gè)或幾個(gè)鍵合基團(tuán)建立化學(xué)連接，其中鍵合基團(tuán)優(yōu)選是聚-(氧磷酸亞基-氧-1，3-丙二醇)和/或寡乙二醇鏈。
224.根據(jù)權(quán)利要求81-103之一的藥物，其中通過(guò)使用支化核苷酸類(lèi)似物代替核苷酸形成化學(xué)連接。
225.根據(jù)權(quán)利要求81-104之一的藥物，其中通過(guò)嘌呤類(lèi)似物形成化學(xué)連接。
226.根據(jù)權(quán)利要求81-105之一的藥物，其中通過(guò)氮雜苯單元形成化學(xué)連接。
227.根據(jù)權(quán)利要求81-106之一的藥物，其中在產(chǎn)生化學(xué)連接中使用下面基團(tuán)至少之一亞甲基藍(lán)；雙官能基團(tuán)，優(yōu)選雙-(2-氯乙基)-胺；N-乙?；?N’-(p-乙醛酰-苯甲酰基)-胱胺；4-硫尿嘧啶；補(bǔ)骨脂素。
228.根據(jù)權(quán)利要求81-107之一的藥物，其中通過(guò)在雙鏈區(qū)末端(E1，E2)附近連接的硫代磷?；鶊F(tuán)形成化學(xué)連接。
229.根據(jù)權(quán)利要求81-108之一的藥物，其中通過(guò)末端(E1，E2)附近存在的三鏈螺旋鍵形成連接。
230.根據(jù)權(quán)利要求81-109之一的藥物，其中dsRNA I/II被圍繞在微團(tuán)結(jié)構(gòu)中，最有利地被圍繞在脂質(zhì)體中。
231.根據(jù)權(quán)利要求81-110之一的藥物，其中dsRNA I/II結(jié)合于至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)，與至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)締合，或者被至少一種病毒外殼蛋白質(zhì)圍繞，所述蛋白質(zhì)源于病毒，或者來(lái)自病毒，或者是合成制備的。
232.根據(jù)權(quán)利要求81-111之一的藥物，其中所述外殼蛋白來(lái)自多瘤病毒。
233.根據(jù)權(quán)利要求81-112之一的藥物，其中所述外殼蛋白含有多瘤病毒的病毒蛋白質(zhì)1(VP1)和/或病毒蛋白質(zhì)2(VP2)。
234.根據(jù)權(quán)利要求81-113之一的藥物，其中在形成病毒殼體或病毒殼體樣結(jié)構(gòu)時(shí)，一側(cè)轉(zhuǎn)向殼體或殼體樣結(jié)構(gòu)內(nèi)部。
235.根據(jù)權(quán)利要求81-114之一的藥物，其中dsRNA I/II的一條鏈(as1，as2)與靶基因的初始的或加工過(guò)的RNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)。
236.根據(jù)權(quán)利要求81-115之一的藥物，其中細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞或人細(xì)胞。
237.根據(jù)權(quán)利要求81-116之一的藥物，其中所述第一(B1)和第二(B2)區(qū)彼此分開(kāi)。
238.根據(jù)權(quán)利要求81-117之一的藥物，其中以每劑5毫克的最大量施用dsRNA。
239.根據(jù)權(quán)利要求81-118之一的藥物，其中dsRNA在緩沖液中混合用于施用。
240.根據(jù)權(quán)利要求81-119之一的藥物，其中口服dsRNA或者通過(guò)靜脈內(nèi)，腫瘤內(nèi)，或腹膜內(nèi)注射或灌注，或者通過(guò)吸入給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制靶基因在細(xì)胞中表達(dá)的方法，包括下面的步驟以足以抑制靶基因表達(dá)的量導(dǎo)入至少一種雙鏈核糖核酸(dsRNA I)。該dsRNA I具有最多由49個(gè)連續(xù)核苷酸對(duì)組成的雙鏈結(jié)構(gòu)。所述雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈(as1)或者所述一條鏈(as1)的至少一個(gè)片段與靶基因的有義鏈互補(bǔ)。該dsRNA I的一個(gè)末端(E1)具有一個(gè)由1－4個(gè)核苷酸組成的突出端。
文檔編號(hào)C12N15/88GK1630724SQ02803557
公開(kāi)日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2002年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月9日
發(fā)明者R·克羅伊策爾, S·林默, S·羅斯特, P·哈德維格 申請(qǐng)人:里伯藥品公司