專利名稱：Pcr方法
背景本申請公開了一個快速的PCR方法，特別地聚焦于快速的增倍的QRT-PCR方法和相關(guān)的組合物和儀器。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在分子生物學(xué)領(lǐng)域是有效的工具。這一技術(shù)允許復(fù)制/擴增痕量的DNA片段成在有意義的方法中可以分析的量。正如這一技術(shù)已經(jīng)適用于分子生物學(xué)應(yīng)用途徑中，如DNA測序，DNA指印等等。另外，這一方法具有檢測樣品中特定的DNA片段的能力，這些DNA片段的存在可以反映病理狀態(tài)。所以，這一方法正在分子診斷領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)新的應(yīng)用。另外，隨著實時定量PCR(QPCR)的發(fā)展，這一技術(shù)已經(jīng)變得更可靠和修改成自動化。目前，這一技術(shù)用于檢測臨床樣品的病毒和細菌病原體，檢測有白血病歷史的患者的癌細胞(和其他癌癥如在胸，肺，直腸，食管和皮膚中產(chǎn)生的)。
盡管有優(yōu)點，但分子診斷中的PCR仍然有幾個缺點。這經(jīng)常是一個依賴于操作者的專門技術(shù)的。另外，這項技術(shù)也非常傾向于會污染。這兩個上面提到的因素分別會導(dǎo)致假陰性和假陽性的結(jié)果。所以，需要對感興趣的目標(biāo)進行內(nèi)部控制以及將該過程自動化保證操作的封閉的系統(tǒng)中進行(消除污染)。加入控制步驟包括擴增幾個不同套的DNA片段以及需要的靶。這些控制步驟提供了關(guān)于待分析的樣品的質(zhì)量的信息以及在任何給定的循環(huán)中的實驗的信息。由于技術(shù)原因，當(dāng)目標(biāo)在反應(yīng)開始時沒有以相似的豐度存在時，在PCR的相同的反應(yīng)管中的樣品是不能進行多個DNA目標(biāo)的分析的(已知為增倍)。在歷史上，有研究者試圖通過限制PCR反應(yīng)中的引物來克服。這一途徑是基于在一個反應(yīng)中限制試劑的思想的，它是在該目標(biāo)的適當(dāng)擴增已經(jīng)發(fā)生之后，其他序列的擴增被抑制之前終止了反應(yīng)。雖然這一方法可以擴大兩個目標(biāo)之間開始的豐度的差異，將仍然導(dǎo)致兩個目標(biāo)的成功的擴增，它不允許在大幾個數(shù)量級豐度的第二個目標(biāo)的環(huán)境中檢測一個稀少的目標(biāo)。另外，當(dāng)要求一個快速的QPCR實驗時，降低引物的濃度也使質(zhì)量更糟。
目前的PCR技術(shù)的其他限制是進行PCR診斷花費的時間。通常PCR反應(yīng)要花費的時間是以小時計算而不是分鐘。如下所述，對于許多因素，減少進行PCR反應(yīng)的時間是需要的。所以，需要謹慎分子診斷系統(tǒng)的自動PCR基點，特別是一個快速，增倍的(RT-)PCR試驗。
發(fā)明概述提供了以分鐘而不是小時進行完全的PCR反應(yīng)的快速和需要勞動量的PCR和RT-PCR方法，允許在手術(shù)內(nèi)的診斷中利用PCR，但不限制地也可以用于檢測崗哨淋巴結(jié)中的微轉(zhuǎn)移酶，作為典型的病理方法如淋巴結(jié)的組織病理學(xué)檢測的優(yōu)選的取代或輔助。
同時提供的有作為平衡增倍的PCR反應(yīng)，特別是在QRT-PCR反應(yīng)中有特殊用途的定量PCR擴增的一個方法的引物限制的替換物。該方法當(dāng)待擴增的一個靶序列在同一反應(yīng)混合物中比待擴增的另一個靶序列少得多的情況中有特別的用途。該方法包括在第一擴增時期和第二擴增時期，對PCR反應(yīng)混合物中的DNA樣品進行PCR擴增的步驟。在與第一擴增時期的PCR擴增不同的反應(yīng)條件下進行第二擴增時期的PCR擴增來調(diào)節(jié)第一和第二擴增時期過程中第一引物套的第一擴增子和第二引物套的第二擴增子的生成相對速度。也可以加入其他擴增步驟。
公開了這一方法的兩個非限制特定實施方案。在第一個實施方案中，在開始第二個擴增時期時在反應(yīng)混合物中加入第二個引物套，從而限制了第一時期第二引物的實質(zhì)性存在。在該方法中，優(yōu)選地，在通常是一個對照如β-gus或18SrRNA序列的較多的序列之前擴增較少的目標(biāo)序列。
在第二個實施方案中，PCR反應(yīng)混合物包括具有第一個有效Tm的第一引物套和具有與第一有效Tm不同的第二個有效Tm的第二引物套。在與第二擴增時期的退火步驟不同的溫度下進行第一擴增時期的退火步驟來調(diào)節(jié)在第一和第二擴增時期中第一引物套的第一擴增子和第二擴增時期的第二引物套的產(chǎn)生的相對速度。在這第二個實施方案中，第二擴增時期的退火溫度可以比第一擴增時期的退火溫度更高或更低。
同時提供的是快速RT-PCR方法，其根據(jù)是發(fā)現(xiàn)了RT-PCR方法的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)不需要進行10分鐘以上，優(yōu)選地只有約2分鐘。這一快速步驟，當(dāng)在RT反應(yīng)的同一反應(yīng)容器中與RT反應(yīng)有順序第進行的快速PCR過程結(jié)合時，允許在手術(shù)內(nèi)利用RT-PCR反應(yīng)，特別是當(dāng)全部的過程自動化時。
各個上面敘述的PCR和RT-PCR方法在定量的PCR方法，如QPCR和QRT-PCR中在他們的用途中發(fā)現(xiàn)了特別的用途，通常通過熒光報道物的積累和丟失例如利用TAQMAN和分子光探針來檢測的。
上面敘述的方法可以在基于柱體的系統(tǒng)中自動化，從而減少該方法中的人為錯誤以及污染的潛在性。同時提供了用于自動化系統(tǒng)中的柱體進行上述方法。
同時提供的是本文所述的快速PCR方法的特殊用途。在一個實施方案中，提供了手術(shù)內(nèi)的PCR診斷方法，包括步驟從手術(shù)中的患者得到組織樣品；根據(jù)上面所述的方法的一個分析樣品；如果指示轉(zhuǎn)錄物超過了閾值水平進行缺點；在分析步驟的結(jié)果推斷的方法中繼續(xù)操作。在另一個實施方案中，提供了快速檢測惡性腫瘤的方法，包括步驟從腫瘤活體組織切片得到核酸；根據(jù)上面敘述的PCR方法中的一個進行特異于核酸的指示轉(zhuǎn)錄的PCR方法；和如果指示轉(zhuǎn)錄物的表達超過了閾值水平進行測定，從而指示惡性腫瘤。
在其他實施方案中，提供了快速檢測已轉(zhuǎn)移的食管腺瘤的方法。該方法包括步驟從崗哨淋巴結(jié)得到RNA；根據(jù)上面敘述的PCR方法的任何一個對RNA進行特異于CEA的定量RT-PCR方法；和如果CEA的表達超過閾值水平來測定。
最后，還提供了用于檢測特異于CEA和胰蛋白酶基因的序列以及β-gus和18SrRNA序列的特異的新寡聚核苷酸引物。
附圖的簡要說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的柱體的圖解。
圖2顯示了比較有(B)和沒有(A)分開RT和PCR反應(yīng)的蠟的單管RT-PCR的敏感性的兩個圖。
圖3是比較用和不用蠟層分開RT和PCR反應(yīng)制備的RT-PCR產(chǎn)物的溴化乙錠染色凝膠的圖。
圖4提供了在如實施例3中所述的多重反應(yīng)中的CEA和18SrRNA的擴增的四個圖。組A和C顯示了當(dāng)在利用最佳條件的單倍中跑時，18SrRNA和CEA各自的結(jié)果。組B和D顯示了多重的18SrRNA和CEA。
圖5提供了CEA核苷酸序列，基因庫登記號.XM 012777(SEQID NO1)。
圖6是顯示在10個食管腫瘤(淡灰色)，4個組織學(xué)陽性(N1)淋巴結(jié)(白色)，和10個來自沒有癌癥的患者的淋巴結(jié)(暗灰色)中測量的相對CEA的表達的圖。
圖7顯示了來自30個食管癌癥患者的組織陰性淋巴結(jié)中測量的相對CEA的表達。圖中顯示了每個患者中發(fā)現(xiàn)的最高CEA水平?；颊?-20(暗灰柱)沒有再發(fā)現(xiàn)，而患者21-30(輕灰柱)中有再發(fā)生。點線表明了預(yù)測再發(fā)生的最準(zhǔn)確的截止值。利用這一截止值，QRT-PCR在3年中準(zhǔn)確地鑒定了90％的患者是否有疾病再發(fā)生。
圖8A-D是RT-PCR(8A and 8B)和QRT-PCR(8C and 8D)分類的患者的無疾病生存的Kaplan-Meier生存曲線。雖然log-rank實驗表明，兩個預(yù)示物在統(tǒng)計學(xué)上是明顯的，QRT-PCR與RT-PCR比較下優(yōu)越的特異性導(dǎo)致在再發(fā)生危險的基礎(chǔ)上分開患者的能力更大(對于RT-PCR，P＝0.0038，對于QRT-PCR＜0.0001)。
圖9顯示了來自30個病理上食管癌陰性的患者的結(jié)的甲醛固定的淋巴結(jié)中CEA表達的SmartCycler分析。灰色條(21-30)表示再發(fā)生的患者，黑條(1-20)表示，不再發(fā)生的患者。沒有可檢測的CEA表達的淋巴結(jié)已經(jīng)在0.02水平任意畫圖。點線表示預(yù)測疾病再發(fā)生的最準(zhǔn)確的CEA表達截止值(0.183)。
圖10顯示了根據(jù)SmartcyclerQRT-PCR分類為LN陽性或陰性(在截止值0.183以上或以下)的30個pN0食管癌患者的無Kaplan-Meier疾病的生存曲線。
圖11顯示了在冷凍的淋巴結(jié)中的CEA表達的Smartcycler分析。白色(1-11)＝來自沒有癌癥的患者的結(jié)；黑色(12-17)＝測定最后病理是疾病陰性的結(jié)；灰色(20-23)＝發(fā)現(xiàn)是疾病陽性的結(jié)；灰色(18和19)＝手術(shù)內(nèi)冷凍切片是陰性但固定的組織學(xué)是陽性的結(jié)；星＝來自疾病再發(fā)生的結(jié)陰性患者的高度表達的結(jié)。0.001的值被任意指派到?jīng)]有可檢測的CEA的所有樣品。
圖12A-C顯示β-Gus和CEA的快速Q(mào)RT-PCR實驗的最佳方式。圖12A比較了在不同的變性時間和30秒擴展時間進行實驗的Ct值。圖12B比較了當(dāng)變性時間保持恒定10秒不同的擴展時間對Ct值的影響。圖12C證實了當(dāng)PCR條件恒定，不同的RT時間的效果。
圖13顯示了β-Gus的恒定背景中，CEA的9倍系列稀釋中的β-Gus和CEA的Ct值。該圖比較了慢常規(guī)PCR(10秒的變性，接著30秒的退火/擴展步驟)和快速的PCR(1秒的變性接著6秒的退火/擴展步驟)，◆＝10，30GUS；□＝1，6GUS；△＝10，30CEA；和●＝1，6CEA。
圖14是在15分鐘(2分鐘RT和1/3PCR)，17分鐘(2分鐘RT和1/6PCR)，20分鐘(5分鐘RT，1/6PCR)和38分鐘(10分鐘RT和5/15PCR)實驗之間的RT-PCR進行的時間比較。
圖15顯示了CEA單倍(組A)，在溫度控制的多重中的CEA(組B)，在普通多重中的CEA(組C)和在常規(guī)引物限制的多重中的CEA(組D)的四個擴增圖。
圖16顯示了CEA的單倍與溫度控制的多重，普通多重和常規(guī)引物限制的多重的比較。比較了β-Gus的恒定背景中的CEA的系列稀釋的delta Ct值。Delta Ct 25是不能擴增的系列稀釋點。
圖17是在淋巴結(jié)中的相對于β-Gus的CEA表達的直方圖。黑色的條(1-3)對應(yīng)于來自有癌癥組織學(xué)跡象的患者的淋巴結(jié)。灰色的條(4-8)對應(yīng)于來自沒有癌癥的患者的淋巴結(jié)。樣品4和6沒有可檢測的CEA表達。
圖18顯示了有CEA(A)和酪氨酸酶(C)表達的樣品，沒有CEA(B)和酪氨酸酶(D)的表達的樣品的代表性擴增圖。在組A和B中，顯示了β-gus(+)，CEA(◇)和CEA IC(-)的熒光曲線。同樣在組C和D中，顯示了β-gus(◇)，酪氨酸酶(-)和酪氨酸酶IC(*)。
發(fā)明詳述提供了允許快速循環(huán)和/或PCR基礎(chǔ)的分子診斷的敏感性提高的改良的PCR方法，特別是關(guān)于定量的PCR方法，包括QRT-PCR。這些改良的方法允許手術(shù)內(nèi)利用PCR，同時即使在同時檢測更多的對照核酸的多重PCR反應(yīng)中也可以檢測稀少核酸種類。
一個典型的PCR反應(yīng)包括多個擴增步驟，或選擇性擴增目標(biāo)核酸種類的循環(huán)。PCR過程的全面敘述，和其常見的變化如定量PCR(QPCR)，實時QPCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(QRT-PCR)是在本公開物的范圍之外的，這些方法是本領(lǐng)域中已有敘述的，并且已經(jīng)普遍商業(yè)化了。典型的PCR反應(yīng)包括三個步驟變性步驟，其中目標(biāo)核酸變性了；退火步驟，其中一套PCR引物(正向和反向引物)與互補DNA鏈退火；和擴展步驟，其中熱穩(wěn)定DNA聚合酶擴展了引物。通過重復(fù)這一步驟多次，DNA片段被擴增產(chǎn)生了一個對應(yīng)于目標(biāo)DNA序列的擴增子。典型的PCR反應(yīng)包括30或更多變性，退火和擴展的循環(huán)。在許多情況中，退火和擴展步驟可以同時進行，其中循環(huán)只包括兩個步驟。
變性，退火和擴展時期的長度可以是任何需要長度的時間。但是，在試圖縮短PCR擴增反應(yīng)的時間到適于手術(shù)內(nèi)診斷的情況中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這些步驟的長度可以在秒的范圍而不是分鐘的范圍。具體地說，一些新的熱循環(huán)儀能夠產(chǎn)生至少約每秒5℃的熱斜面速度(δT)，在20分鐘中PCR擴增是可能的。如本文所用，PCR循環(huán)的每個步驟提供的時間不包括斜面時間。變性步驟可以在1秒或更少的時間內(nèi)進行。事實上，一些熱循環(huán)儀不設(shè)定“0秒”，這可能是變性步驟的最適當(dāng)?shù)某志枚取＜礋嵫h(huán)儀達到變性溫度就足夠了。退火和擴展步驟最適當(dāng)是各小于10秒，并且當(dāng)在相同的溫度進行時，退火/擴展步驟的結(jié)合可以小于10秒。
如本文所用，雖然引物的最佳濃度在實驗與實驗之間可以有一些變化，但利用引物濃度的實際增加，通常大于約400nM，經(jīng)常大于約800nM，而基本不破壞擴增子的生產(chǎn)，每個循環(huán)相當(dāng)大地縮短。利用敏感的逆轉(zhuǎn)錄酶(本文所述)和/或高濃度的逆轉(zhuǎn)錄引物可以增強RT-PCR實驗的敏感度來生產(chǎn)PCR開始時的目標(biāo)PCR模板。
任何給定的PCR反應(yīng)的特異性很大程度上依賴于，但不是唯一地依賴于引物套的同一性。引物套是與靶DNA序列退火的正向和反向寡聚核苷酸引物的對，允許目標(biāo)序列的擴增，從而產(chǎn)生了特異于目標(biāo)序列的擴增子。如本文所用，特異的寡聚核苷酸的“衍生物”是結(jié)合與特異的寡聚核苷酸相同的靶序列的寡聚核苷酸并且擴增同一目標(biāo)序列，實質(zhì)地產(chǎn)生與特異的寡聚核苷酸相同的擴增子，但在特異的寡聚核苷酸與衍生物之間是有差異的。衍生物通過插入，缺失和/或取代任何特異序列的殘基而與特異的寡聚核苷酸相區(qū)別，只要衍生物在與特異序列相同目的的用途中保留特異序列的特征。
如本文所用，對于任何酶反應(yīng)混合物，如逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)混合物的“試劑”是加入反應(yīng)混合物的任何化合物或組合物，不限制地是酶，核苷酸或其類似物，引物和引物套，緩沖液，鹽和協(xié)同因子。如本文所用，除非特別表達，“反應(yīng)混合物”包括所有進行酶反應(yīng)必要的化合物和/或組合物，甚至是沒有在表達中指示的那些化合物或組合物。
多重的PCR試驗可以最佳化，或通過時間移變擴增子的產(chǎn)生而不是通過控制引物濃度來平衡。這可以利用兩個引物套來達到，各個引物套具有不同的Tm值使可以進行兩個時期的PCR試驗，各個時期具有不同的退火和/或擴展溫度一個和其他擴增子的產(chǎn)生。這一時間和溫度移變方法允許當(dāng)引物濃度的操作用于平衡反應(yīng)時最好地平衡多重反應(yīng)而不需要面對困難。這一技術(shù)特別可用于多重反應(yīng)，其中需要擴增稀少cDNA和對照cDNA，如下所示的CEA/β-GUS的例子。
提供了在RNA分子(例如，不限制地總RNA或mRNA)群體中快速和準(zhǔn)確檢測低豐度RNA種類的定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QRT-PCR)，包括步驟a)在適于產(chǎn)生cDNA的條件下，與逆轉(zhuǎn)錄酶和高濃度的靶序列特異逆轉(zhuǎn)錄酶引物一起溫育RNA樣品；b)隨后在含有高濃度的特異于cDNA的高濃度PCR引物套的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入適當(dāng)?shù)木酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑，和在逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中加入熱穩(wěn)定DNA聚合酶，和c)將PCR反應(yīng)循環(huán)需要數(shù)目的循環(huán)，和在適當(dāng)?shù)臈l件下生產(chǎn)特異于cDNA的PCR產(chǎn)物(“擴增子”)。通過暫時分開逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR反應(yīng)，和通過利用逆轉(zhuǎn)錄酶最佳化和PCR最佳化的引物，得到特別好的特異性。反應(yīng)式在單個試管中進行的(所有試管，容器，小瓶，小室等等進行本文特指的反應(yīng)的容器通常稱為“反應(yīng)容器”)，單個試管中除去了雙管反應(yīng)中通常發(fā)現(xiàn)的污染源。高濃度的引物允許非?？焖俚腝RT-PCR反應(yīng)，通常從開始逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)到40個循環(huán)的PCR反應(yīng)結(jié)束有20分鐘。這樣的一個快速的QRT-PCR實驗的進行是能夠產(chǎn)生至少約5℃每秒的熱斜面速度(δT)的熱循環(huán)裝置來輔助的。
反應(yīng)c)可以在與逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)相同的試管中，在逆轉(zhuǎn)錄酶(PT)反應(yīng)中加入足夠的試劑產(chǎn)生良好的，甚至PCR進行的最佳條件下進行的。在進行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)之前可以裝載單個試管，裝載物為1)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)混合物，和2)在逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)完成后與cDNA混合物混合的PCR反應(yīng)混合物。逆轉(zhuǎn)錄酶混合物和PCR反應(yīng)混合物可以通過在熔化溫度大于逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的溫育溫度，但低于PCR反應(yīng)的變性溫度的組合物的固體，或半固體(包括非結(jié)晶的，玻璃的物質(zhì)和蠟的)屏障來物理地分離。屏障組合物可以是疏水特性的并且當(dāng)液體形式時與RT和PCR反應(yīng)混合物形成第二相。這樣的屏障組合物的一個例子是通常用于PCR的蠟小珠，如AMPLIWAX PCR GEM產(chǎn)物，可以從加州Foster市的AppliedBiosystem購買得到和STRATASPHERE鎂蠟小珠，可以從加州，La Jolla的Stratagene購買得到。
逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR反應(yīng)的分開可以在逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)完成后通過加入PCR試劑，包括PCR引物套和熱穩(wěn)定DNA聚合酶來完成。優(yōu)選地，PCR試劑是通過機器地或液體的方法來機械加入的，可以使樣品污染相當(dāng)少，可以消除人工的誤差。
在固定數(shù)目的PCR循環(huán)后可以比較QRT-PCR方法的產(chǎn)物來確定與給定的報道基因相比的相對量的RNA種類。比較QRT-PCR方法的產(chǎn)物的相對量的方法是凝膠電泳，例如，將樣品在凝膠上跑，和通過一個已知的方法包括不限制地可以是Southern印跡和用標(biāo)記探針來檢測，用溴化乙錠染色和在擴增子中摻入熒光或放射性標(biāo)記中的一個方法來檢測這些樣品。
但是，PCR反應(yīng)的方法通常是通過分析各個PCR引物套的擴增子產(chǎn)生的相對速度來檢測的。通過許多方法，包括不限制地可以是熒光引物，熒光原探針和結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料來完成對擴增子產(chǎn)物的檢測。常用的方法是熒光5’核酸酶實驗。這一方法探測了一些熱穩(wěn)定DNA聚合酶的5’核酸酶活性(如Taq或Tf1 DNA聚合酶)以便在PCR方法中裂解寡聚物探針。選擇寡聚物在擴展條件下與擴增的靶序列退火。探針通常在它的5’末端具有熒光報道因子，在它的3’末端具有報道因子的熒光淬滅物。只要寡聚物是完整的，就可以淬滅來自報道因子的熒光信號。但是，當(dāng)在擴展過程中消化寡聚物時，熒光報道因子不再在淬滅物的附近擴展。給定擴增子的無熒光報道因子的相對積累可以與對照樣品的相同擴增子的積累和/或與對照基因如不限制地可以是β-gus，β-激動素或18SrRNA比較來確定RNA群體中的給定RNA的給定cDNA產(chǎn)物的相對豐度。熒光5’核酸酶實驗的產(chǎn)物和試劑是容易購買的，例如可以從Applied Biosystem購買。
根據(jù)熒光5’核酸酶實驗和其他QPCR/QRT-PCR方法控制和檢測PCR和QRT-PCR的儀器和軟件也是容易得到的，包括Smart循環(huán)儀，可以從加州Sunnyvale的Cepheid得到，ABI Prism 7700序列檢測系統(tǒng)(TaqMan)，可以從Applied Biosystems得到?；谥w的樣品制備原型系統(tǒng)(GenXpert)結(jié)合了熱循環(huán)儀和具有液體循環(huán)的Smart Cycler產(chǎn)物和能夠自動從組織樣品萃取特異的核酸和對核酸進行QPCR或QRT-PCR的加工元素容量的熒光檢測裝置。系統(tǒng)利用了可以構(gòu)型和用許多試劑預(yù)裝載的可任意處理柱體。這樣的一個系統(tǒng)可以破壞組織和從樣品萃取總RNA或mRNA?？梢栽赗NA中自動加入逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)成分，并且QPCR反應(yīng)成分可以在完成逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)基礎(chǔ)上自動加入。
另外，可以檢測PCR反應(yīng)中特別的熒光團的產(chǎn)生(或丟失)。當(dāng)熒光團水平達到(或落在)需要的水平中，自動系統(tǒng)將自動改變PCR條件。在一個非限制例子中，在上面所述的多重實施方案中這是特別有用的，其中通過第一的，更低的Tm，引物套在比第二，更高的Tm，引物套下擴增的更少的種類更低的溫度時擴增更豐富的(對照)目標(biāo)種類。在PCR的第一時期，在允許擴增更豐富的目標(biāo)種類的溫度時進行循環(huán)反應(yīng)的退火步驟。然后，退火溫度自動上升到基本上終止更豐富的目標(biāo)種類的擴增的溫度。
在上面所述的反應(yīng)中，一些逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR反應(yīng)的量是非典型的，以便可以利用一些熱循環(huán)儀的更快的斜面時間。具體地說，引物濃度是非常高的。逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的特異于典型基因的濃度小于約20nM。為了達到快速逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)發(fā)生在一到二分鐘，逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的引物濃度上升到大于20nM，優(yōu)選地至少約50nM，通常約100nM。標(biāo)準(zhǔn)的PCR引物濃度的范圍是100nM到300nM。也可以在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中利用更高的濃度補償Tm的變化。但是，為了本文的目的，參考的引物濃度是針對各種情況的，其中不需要Tm補償。根據(jù)經(jīng)驗可以確定成比例的更高的引物濃度，并且如果需要Tm補償時也可以利用該濃度。為了完成快速的PCR反應(yīng)，PCR引物濃度通常大于200nM，優(yōu)選地大于約500nM，通常約800nM。通常，逆轉(zhuǎn)錄酶引物與PCR引物的比例是約1到8或更多。引物濃度的提高允許PCR實驗在小于20分鐘的時間內(nèi)進行40個循環(huán)，如下面實施例2所述。
敏感的逆轉(zhuǎn)錄酶在一些情況中是優(yōu)選地，其中存在少量的RNA，或者目標(biāo)RNA是低豐度的RNA。術(shù)語“敏感逆轉(zhuǎn)錄酶”指能夠從用作PCR模板的低拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生適當(dāng)?shù)腜CR模板的逆轉(zhuǎn)錄酶。敏感逆轉(zhuǎn)錄酶的敏感度可以來自酶的物理特性，或來自產(chǎn)生增強的敏感性的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)混合物的特異的反應(yīng)條件。敏感逆轉(zhuǎn)錄酶的一個例子是SensiScript RT逆轉(zhuǎn)錄酶，可以從加州Valencia公司，Qiagen購買得到。為了從小于50ng的RNA樣品產(chǎn)生cDNA而將這一逆轉(zhuǎn)錄酶進行了最佳化，但具有從低拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生PCR模板的能力。
正如上面討論的，本文所述的方法也可以在多重的QRT-PCR方法中利用。從最廣泛的角度來看，多重PCR方法包括在相同的反應(yīng)容器中兩個或多個擴增子的生產(chǎn)?？梢酝ㄟ^凝膠電泳來分析多重擴增子，通過許多方法中的一個，如不限制地可以是溴化乙錠染色，Southern印跡和與探針雜交，或通過在擴增子中摻入熒光或放射性成分和隨后在凝膠上觀察產(chǎn)物來檢測擴增子。但是，實時檢測兩個或多個擴增子的產(chǎn)生是優(yōu)選的。熒光5’核酸酶實驗是最常見的檢測方法。儀器是可以得到的(如，上面所述的Smart Cycler和TaqMan產(chǎn)品)，允許實時檢測同一試管中兩個或多個熒光報道物的累積。對于多重地檢測熒光5’核酸酶實驗，提供了對應(yīng)于待檢測的各個擴增子種類的寡聚物。各個擴增子種類的寡聚物探針具有各個擴增子種類的最大發(fā)散波長與寡聚物探針不同的熒光報道物。各個未淬滅的熒光報道物的累積可以檢測確定對應(yīng)于各個擴增子的目標(biāo)序列的相對量。
在傳統(tǒng)的多重QPCR和QRT-PCR方法中，選擇具有相同的退火和擴展動力學(xué)和相似的大小擴增子的PCR引物套是需要的。設(shè)計和選擇適當(dāng)?shù)腜CR引物套是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。鑒定最佳的PCR引物套和其各個比例(引物限制，即在多重PCR實驗中限制更豐富的RNA種類的PCR引物的豐度)達到平衡多重反應(yīng)的方法也是已知的。“平衡”指一些擴增子對于來源如dNTP或酶沒有截止競爭其他擴增子。同樣推薦對所有PCR引物套進行Tm(熔化溫度)的等量化。參見例如，ABI PRISM 7700序列檢測系統(tǒng)使用者手冊，#5，“多重PCR與TaqMan VIC Probes”，Applied Biosystems(1998/2001)。
盡管如此，對于非常低拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)錄物，甚至通過限制更豐富的對照種類的PCR引物套，設(shè)計準(zhǔn)確的多重PCR實驗是困難的。這一問題的一個解決方案是對更豐富種類的PCR反應(yīng)，在分開的試管中進行低豐度的RNA的PCR反應(yīng)。但是，該方案沒有利用進行多重PCR實驗的優(yōu)點。雙試管方法具有幾個缺點，包括耗費，加入更多的實驗誤差的空間，增加樣品污染的機率，這些在PCR實驗中是十分重要的。
所以提供了進行多重PCR方法的方法，包括QRT-PCR和QPCR，能夠檢測低拷貝數(shù)核酸種類和一個或多個更高拷貝數(shù)種類。低拷貝數(shù)和高拷貝數(shù)核酸種類的差異是相對的，但在本文中指低拷貝數(shù)種類和至少約30倍的高拷貝數(shù)種類但更通常是至少約100倍的高拷貝數(shù)種類的多少中的差異。為了本文的目的，兩個待擴增的核酸種類的相對多少在給定數(shù)目的樣品中的其他核酸種類的關(guān)系中比兩個核酸種類的相對多少更突出，因為在核酸樣品中的其他核酸種類不直接與PCR源的待擴增的種類競爭。
如本文所用，在實驗之前，在給定核酸樣品中的任何給定的核酸種類的多少是未知的。所以，在核酸樣品中的給定核酸種類的拷貝的“期望”數(shù)目經(jīng)常在此處使用，并且是基于核酸樣品中的該種類的多少的歷史數(shù)據(jù)。對于任何給定對數(shù)的核酸種類，可以預(yù)期，根據(jù)樣品中的兩個種類的相對多少的決定簇，各個種類的多少是在一個范圍內(nèi)的。通過確定這些范圍，可以確定各個種類的預(yù)期數(shù)目的目標(biāo)序列的倍數(shù)的差異。
多重PCR方法包括進行兩(或多)時期的PCR擴增，允許調(diào)節(jié)第一個引物套的第一個擴增子，和第二個引物套的第二個擴增子在各個擴增時期的生產(chǎn)的相對速度。在與第一個擴增時期不同的反應(yīng)條件下進行第二個擴增時期的PCR擴增，(“不同的反應(yīng)條件“不限制地包括PCR循環(huán)中的步驟的不同溫度，如退火步驟，或PCR反應(yīng)混合物中的試劑的不同，如引物的不同和/或引物濃度的不同)。通過這一方法，用PCR擴增可以有效地”平衡“產(chǎn)生特異于更低豐度的核酸種類的擴增子的PCR擴增，來產(chǎn)生特異于更高豐度的核酸種類的擴增子的PCR擴增。通過刪除不在第一個擴增時期產(chǎn)生額任何擴增子的PCR引物套可以將反應(yīng)分成兩個或更多的臨時時期。然后可以在第二個擴增時期開始時，在PCR反應(yīng)混合物中加入刪除的PCR引物套。這最好是通過利用自動的方法來完成如上面所述的GenXpert原型系統(tǒng)。兩個或多個分開的擴增時期可以用于剪裁或平衡多重的實驗，和或例外地剪裁各個引物套的濃度。
臨時分開PCR擴增方法成兩個或更多時期的第二個方法是選擇各自的Tm不同的PCR引物套。下面的實施例3和6中提供了這樣的方法的兩個實施例。在一個實施例中，更低拷貝數(shù)的核酸種類的引物具有比更高豐度的種類的引物(Tm2)更高的Tm(Tm1)。在這一方法中，在基本沒有更高豐度的種類的擴增的足夠高的溫度下，進行PCR擴增的第一時期達到預(yù)定數(shù)目的循環(huán)。在第一個擴增時期后，在更低的溫度，通常約Tm2進行PCR反應(yīng)的退火和擴展步驟，使更低和更高豐度的引物能夠擴增。應(yīng)該注意，如本文所用，并且除非特別注明，Tm指“有效Tm”，是給定反應(yīng)混合物中的任何給定引物的Tm，它依賴于一些因子，包括不限制地可以是引物的核酸序列和反應(yīng)混合物中的引物濃度。
應(yīng)該注意，PCR擴增是動力學(xué)方法。不限制地，當(dāng)在多重PCR反應(yīng)中利用調(diào)節(jié)各個PCR反應(yīng)的溫度時，可以在通常范圍是剛剛大于較低的Tm到剛剛高于更高的Tm的任何溫度下進行更高的溫度退火時期，只要反應(yīng)有利于更高的Tm引物套產(chǎn)生擴增子。同樣，不限制地，更低溫度的反應(yīng)的退火通常是在低于低溫引物套的更高Tm的任何溫度，這將允許更低的Tm引物套的足夠的擴增效率。
在上面提供的例子中，在更高的溫度時期，低豐度的RNA的擴增子在比更高豐度的RNA的擴增子(優(yōu)選地基本排除了產(chǎn)生第二個擴增子)更快的速度下擴增。所以，在第二個擴增時期，當(dāng)需要所有擴增子的擴增以基本平衡的方式進行時，更低豐度的RNA的擴增是足夠豐富的，使更高豐度的RNA的擴增不干擾更低的豐度的RNA的擴增。在擴增的第一個時期，當(dāng)?shù)拓S度的核酸的擴增子優(yōu)選地擴增，退火和擴展步驟可以在高于更高的Tm時進行，以得到超過有效性的特異性(在擴增的第二個時期，因為有相當(dāng)大數(shù)目的低豐度核酸擴增子，選擇性不再是明顯的問題，擴增子生產(chǎn)的有效性是優(yōu)選的)。所以，應(yīng)該注意，雖然在許多情況中是有利的，溫度的變化可能不必要地導(dǎo)致完全關(guān)閉一個擴增反應(yīng)到另一個擴增反應(yīng)。
在另一個實施方案中，用第一個Tm設(shè)定的第一個引物可以靶擊更豐富的模板序列(例如，對照模板序列)，并且用更高的Tm設(shè)定的第二個引物可以靶擊更不豐富的模板序列。在這種情況中，更豐富的模板和更不豐富的模板可以在第一個時期，在足夠的溫度下進行，允許更低的Tm引物套，通常在第一Tm，更低的Tm，引物套的Tm或更高的Tm時充分擴增。當(dāng)對應(yīng)于更豐富的模板的擴增子的閾值量達到時，反應(yīng)的退火和/或擴展溫度上升到能有效地關(guān)閉更豐富的模板的擴增。
選擇具有三個或更多不同Tm(例如，Tm1＞Tm2＞Tm3)的三個或更多套PCR引物套可以用于擴增在逐步的方法中改變豐度的序列，只要Tm的差異是足夠大的，允許優(yōu)選地擴增基本排除不需要的序列的需要的序列要求數(shù)目的循環(huán)。在一個方法中，在第一個時期擴增最低豐度的序列預(yù)定數(shù)目的循環(huán)。其次，在第二個時期擴增最低豐度和較少豐度的序列預(yù)定數(shù)目的循環(huán)。最后，在第三個時期擴增所有序列。正如上面所述的兩時期反應(yīng)，各個時期的退火步驟可以根據(jù)各個多重反應(yīng)的擴增反應(yīng)的相對效率而改變。應(yīng)該認識到，兩個或多個擴增物可以具有基本相同的Tm，允許在擴增方法的任何時期具有相同豐度的一個以上的種類的擴增。正如雙時期反應(yīng)，三時期反應(yīng)也可以逐步進行，從最大豐度的核酸種類在最低的退火溫度下擴增到最小豐度的種類在最高退火溫度時的擴增。
通過這一連續(xù)的擴增方法，除了匹配Tm和利用限制量的一個或多個PCR引物套，提供了“平衡”多重PCR反應(yīng)的其他工具。在連續(xù)加入其他引物套的一些情況中，將具有不同Tm的PCR引物套的開發(fā)中文連續(xù)擴增不同擴增子的方法可能是優(yōu)選的。但是，多重PCR反應(yīng)的依賴溫度的測序方法的利用可以與在單個的反應(yīng)混合物中連續(xù)物理加入引物套相結(jié)合。
同時提供了內(nèi)部的陽性對照，證實一個特殊的擴增反應(yīng)的操作方法有一個陰性的結(jié)果。內(nèi)部陽性對照(IPC)是具有與靶基因(CEA或胰蛋白酶)相同的引物序列但具有不同的內(nèi)部探針序列的DNA寡聚核苷酸。IPC中的選擇位點可以選擇性地用尿嘧啶而不是胸腺嘧啶來合成使需要時高度濃縮的模擬物的污染可以利用尿嘧啶DNA糖基化酶來控制。IPC可以加入到任何PCR反應(yīng)的主混合物中，加入的量可以由經(jīng)驗來確定，能夠得到通常大于內(nèi)源引物套靶的Ct值的Ct值。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法來進行PCR實驗，甚至當(dāng)沒有引物套的內(nèi)源靶時也可以進行，IPC進行擴增后，證實擴增目標(biāo)內(nèi)源DNA的衰退不是主混合物中的PCR試劑的衰退。在這一實施方案中，IPC探針的熒光發(fā)生不同于內(nèi)源序列的探針。在RT-PCR反應(yīng)中其利用的變化是IPC是RNA，該RNA包括一個RT引物序列。在這一實施方案中，IPC證實了RT和PCR反應(yīng)的功能。RNA和DNA IPC(對應(yīng)的探針不同)也可以用于區(qū)別RT和PCR反應(yīng)中的難度。
本文所述的方法通?？梢杂糜诙縋CR和RT-PCR方法。本文所述的和附錄的手稿中的是檢測癌胚抗原(CEA)和預(yù)后食管的腺癌。本文所述的方法是同等地可用于其他微轉(zhuǎn)移酶，包括其他許多腫瘤類型中的隱藏的微轉(zhuǎn)移酶的鑒定。本文所述的快速的方案可以在約20分鐘內(nèi)進行。這一短時間允許實驗在手術(shù)內(nèi)進行，使外科大夫可以決定單個手術(shù)過程中的外科手術(shù)方法，而不需要第二個手術(shù)手術(shù)，或需要外科大夫進行不需要的或過分寬泛的預(yù)防過程。例如，在一些癌癥包括胸癌和黑素瘤的外科評估中，崗哨淋巴結(jié)可以在第一個手術(shù)中除去。對于微轉(zhuǎn)移酶，崗哨結(jié)是后來評估的，并且當(dāng)在患者的崗哨淋巴結(jié)中檢測微轉(zhuǎn)移酶時，患者需要第二個手術(shù)，增加了患者的外科手術(shù)的危險，并且患者在多個手術(shù)中將會不舒服。在肺和食管癌的情況中，手術(shù)內(nèi)分析淋巴結(jié)可以用于確定需要的再切除的程度和/或是否需要新的輔助化學(xué)治療。具備了在小于30分鐘內(nèi)，準(zhǔn)確率提高下確定一些特異于腫瘤的標(biāo)記如不限制地可以是CEA，MUC-1，CK-19，胰蛋白酶和MART-1的表達水平的能力，外科大夫可以馬上決定怎樣來進行手術(shù)?？焖俚脑囼灴蓱?yīng)用于醫(yī)生辦公室進行的針活體檢查。患者不需要等幾天就可以得到活體檢查的結(jié)果(如腫瘤或淋巴結(jié)的針活體檢查)，但現(xiàn)在可以在非常短的時間內(nèi)得到更準(zhǔn)確的結(jié)果。本文所述的方法可應(yīng)用于檢查，不限制地可以是各種正?；虿徽１磉_的RNA，DNA重排或其他的或不正常的核酸的存在，如病毒核酸。
在上面所述的多重和非多重的QRT-PCR和/或QPCR的方法的市場化中，一些檢查特異的核酸的試劑盒將是特別有用的。這樣的試劑盒的一個例子將包括上面所述的一個試管的QRT-PCR方法需要的試劑。在一個實施例中，試劑盒將包括上面所述的試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄酶引物，對應(yīng)的PCR引物套，熱穩(wěn)定DNA聚合酶，如Taq聚合酶，適當(dāng)?shù)臒晒鈭蟮牢锶绮幌拗频乜梢允菬晒?’核酸酶試驗的探針，分子光探針，單個染料引物或特異于雙鏈DNA的熒光染料如溴化乙錠。引物可以存在的量將產(chǎn)生上面所述的高濃度。熱穩(wěn)定DNA聚合酶是常見的和可以從各個制造商那里購買的。在試劑盒中的其他材料可以包括適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)試管或小瓶，屏障組合物，通常是蠟珠，可選擇地包括鎂；逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR時期的反應(yīng)混合物(通常10X)，包括需要的緩沖液和試劑如dNTP，無核酸酶或RNA酶的水；RNA酶抑制劑；對照核酸和/或任何其他緩沖液，化合物，協(xié)同因子，離子成分，蛋白質(zhì)和酶，聚合物，等等，可以用于逆轉(zhuǎn)錄酶和/或QRT-PCR反應(yīng)的PCR時期。
第二個試劑盒是特異于上面所述的多重PCR方法的。試劑盒可以包括，不限制地可以是具有第一個Tm的低豐度的核酸的第一個引物套，和具有第二個Tm的高豐度的核酸的第二個引物套。根據(jù)本文所述的方法，選擇引物套的相對Tm的平衡多重PCR反應(yīng)的能力。在QRT-PCR的試劑盒中，試劑盒也可以包括任何適當(dāng)?shù)哪孓D(zhuǎn)錄酶，特異于待擴增的核酸的逆轉(zhuǎn)錄酶引物，屏障組合物如蠟珠，熱穩(wěn)定DNA聚合酶和/或適當(dāng)?shù)臒晒鈭蟮牢?，如不限制地可以是熒?’核酸酶試驗的探針，分子光探針，單一的染料引物或特異于雙鏈DNA的熒光染料如溴化乙錠。試劑盒可以包括用于檢查低豐度RNA的敏感逆轉(zhuǎn)錄酶。如上所述，試劑盒中的其他材料包括適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)試管或小瓶，屏障，通常是蠟珠，或者包括了鎂；逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR時期的反應(yīng)化合物(通常10X)，包括需要的緩沖液和試劑如dNTP；無核酸酶或RNA酶的水；RNA酶抑制劑；對照核酸和/或任何其他緩沖液，化合物，協(xié)同因子，離子成分，蛋白質(zhì)和酶，聚合物等等，可以用于QRT-PCR反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄酶和/或PCR時期。
上面所述的試劑盒和柱體也包括適用于手動或自動從組織樣品萃取核酸的試劑和機械成分。這些試劑通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，通常是設(shè)計選擇的材料。例如，在自動方法中，組織可以試劑或柱體中提供的適當(dāng)?shù)娜芙庖褐谐暡呀?。然后過濾得到的溶解液，并且RNA與同樣是試劑盒或柱體中提供的RNA結(jié)合磁性珠結(jié)合。可以洗滌珠/RNA，并且在逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)之前洗脫RNA。在自動的核酸萃取的情況中，通常推薦通過物理構(gòu)成機械的呵液體的特異萃取系統(tǒng)，如Cepheid’s GenXpet原型系統(tǒng)來選擇試劑和他們的包裝方式(例如可任意處理的一次使用的柱體)。
試劑盒的成分可以一起或分開包裝，各個成分可以存在于一個或幾個試管或小瓶中，或是柱體形式(含有用于自動設(shè)備中的一個或多個試劑的調(diào)節(jié)單元)。獨立的或一起的成分可以包裝在各種狀態(tài)中，包括不限制地可以是凍干的，玻璃化的，水溶液或其他形式。
圖1是用于上面所述的自動方法中的柱體10的橫斷面圖。柱體10包括小包裝20，其中可以儲存使用的任何需要的試劑。艙20由墻25分開。柱體10包括由液體與普通的通道40連接的多重通道30。閥50在普通通道40內(nèi)。閥50控制了試劑從單個小艙20流到普通通道40。普通通道40由液體與反應(yīng)容器(沒有顯示)連接，其中轉(zhuǎn)移了來自艙20的試劑。艙20中含有的試劑可以包括，不限制地可以是細胞溶解試劑，用于核酸純化，用于逆轉(zhuǎn)錄或PCR反應(yīng)。圖1顯示了用于自動分子純化和試驗的柱體設(shè)備的許多可能的變化設(shè)備中的一個。柱體和艙可以具有任何需要的形狀和大小，可以根據(jù)經(jīng)驗以及設(shè)計者的推薦。液體通道和閥的選擇和構(gòu)成也是設(shè)計選擇的問題，可以有很多變化。
實施例實施例1 一個試管的ORT-PCR引入了實時的，基于熒光的5’核酸酶PCR(Gibson，U.E.，C.A.Heid and P.M.Williams.1996.實時定量RT-PCR的一個新方法，Genome Res.6995-1001；Heid，C.A.，J.Stevens，K.J.Livak and P.M.Williams.1996.實時定量PCR。Genome Res.6986-994)和儀器如ABI PRISMTM7700(Taq Man)序列檢測儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)，定量RT-PCR現(xiàn)在是廣泛接受的檢測基因表達水平的方法。定量RT-PCR是敏感的技術(shù)，并且特別有用于分析含有有限量的核酸的樣品，如臨床組織(Collins，C.，J.M.Rommens，D.Kowbel，T.Godrey，M.Tanner，S.I.Hwang，D.Polikoff，G.Nonet et al.1998.Positional cloning of ZNF217 andNABC1在20q13.2擴增和在胸癌中過度表達。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 958703-8708)。當(dāng)定量這些小量的RNA和/或非常低豐度的mRNA種類時，從定量RT-PCR獲得最大敏感度是非常重要的。當(dāng)連續(xù)循環(huán)嵌套PCR經(jīng)常性地用于達到最大敏感度時，達到和維持準(zhǔn)確的定量是困難的。另外，PCR的多重循環(huán)增加的污染的危險，這是在要求敏感度水平的工作中的嚴重問題。一個試管的RT-PCR(利用RT的反向PCR引物在同一試管中的RT和PCR)降低了利用ABI PRISM7700時的污染的危險，引物反應(yīng)試管從不打開。
在理論上，一個試管的方法應(yīng)該具有與兩步驟的途徑相同的敏感度(分開RT接著PCR)，但在實際上不是這樣的(Battaglia，M.，P.Pedrazzoli，B.Palermo，A.Lanza，F(xiàn).Bertolini，N.Gibelli，G.A.Da Prada.A.Zambelli et al.1998.上皮腫瘤細胞檢測和嵌套RT-PCR的未解決的問題沒有假陽性結(jié)果的新的敏感的一步方法。骨髓移植22693-698)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一個試管的RT-PCR的敏感性是受到RT步驟的相對非特異性的限制的。這一非特異性是RT是在相對低的溫度和沒有熱開始狀態(tài)下進行的事實產(chǎn)生的，所以允許需要的RT“反向”引物和“正向”PCR引物額非特異引導(dǎo)。由于輸入的RNA樣品中的靶的量減少，來自冷開始的RT過程的引導(dǎo)人工制品可以競爭和降低需要的靶序列的PCR擴增和降低其效率。所以，當(dāng)一個試管的方法中RNA輸入降低，非特異側(cè)反應(yīng)最后與需要的反應(yīng)外競爭，并且產(chǎn)生了非特異產(chǎn)物。在兩步的或嵌套的RT-PCR方法中，利用熱開始的PCR和RT引物的5’上游的引物套可以獲得特異性。但是，這不是一個試管的方法中的情況，除非希望打開反應(yīng)管加入新的引物(從而使反應(yīng)在一個試管中但兩個步驟)。已經(jīng)有人假設(shè)，利用外部RT引物和保持RT和PCR引物在RT步驟中分開，一個試管的RT-PCR中的PCR特異性和由此的敏感性應(yīng)該是可維持的。這里，大大增強敏感度和可以用于ABI PRISM7700上的定量RT-PCR的修飾的一個管RT-PCR是存在的。
標(biāo)準(zhǔn)的一個試管的反應(yīng)是為β-葡糖醛酸酶(β-gus)mRNA設(shè)立的，在50μL體積中最后的濃度如下10nM β-gus RT引物(5’-TTTGGTTGTCTCTGCCGAGT-3’)(SEQ ID NO2)，100nM的各個β-gus PCR引物(GUS-F，5’-C-CATTTGGAATTTTGCCGATT-3’)(SEQ ID NO3)；GUS-R，(5’-CCGAGTGAAGATCCC-CTTTTTA-3’)(SEQ ID NO4)，100nM β-gus探針(5’-6-fam-TGAACAGTCACCGACG-AGAGTGCTGG-tamra-3’)(SEQ ID NO5)，1X TaqMan反應(yīng)緩沖液(Applied Biosystems)，5.5mM MgCl2，300μM各個dNTP，20U Rnase抑制劑，62.5 U SUPERSCRIPT IITM逆轉(zhuǎn)錄酶(生命技術(shù)公司，Rockville，MD，USA)和1.25 U AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)。
在修改過的方法中，利用AmpliWaxPCR gem 50(AppliedBiosystems)完成了RT反應(yīng)混合物和PCR引物之間的物理分離。首先，將β-gus PCR引物滴到PCR平板上，最后體積是5.0uL。在每個孔中放入一個PCR gem 50，將孔蓋帽，簡單地離心平板，避免試劑與試管壁在蠟屏障上黏連。然后，加熱平板到80℃2分鐘，冷卻到4℃產(chǎn)生蠟屏障。然后將45uL的上層吸到每個孔中。這一混合物含有β-gus RT引物，RNA，Rnase抑制劑和SUPERSCRIPT II逆轉(zhuǎn)錄酶。配制雙層以便含有所有的其余的反應(yīng)成分(緩沖液，核苷酸，MgCl2)，濃度如上所述。在RT層中存在AmpliTaq Gold是無關(guān)重要的，因為這一酶直到加熱到95℃時是無活性的。
所有反應(yīng)是在ABI PRISM 7700上進行的，熱循環(huán)儀條件如下48℃持續(xù)30分鐘，95℃持續(xù)12分鐘，接著40個循環(huán)的95℃20秒和60℃1分鐘。在48℃的RT步驟時蠟層保持完整，但在12分鐘95℃的AmpliTaq Gold活化步驟時期熔化，所以允許兩層在PCR開始時混合。用Applied Biosystem序列檢測軟件分析數(shù)據(jù)。
首先，評估TaqMan試驗中的熒光檢測上的蠟層的效率，確定蠟的熒光淬滅的程度。利用來自肺腺癌細胞系(A549)的任意引導(dǎo)的cDNA，進行有和沒有蠟層的重復(fù)20次的β-gus的PCR。結(jié)果顯示整體熒光沒有降低(p＝0.55)，并且當(dāng)與獨立的樣品t-試驗比較，在兩個步驟之間的循環(huán)閾值中沒有變化(p＝0.55)。
為了比較有和沒有蠟層的一個試管的RT-PCR的敏感性，利用了系列稀釋脾的總RNA(Clontech實驗室，Palo Alto，CA，USA)。沒有蠟層的RT-PCR的結(jié)果顯示，甚至在5ngRNA加入時熒光(ΔRn)是弱的，并且每次稀釋進一步降低平均75％(圖2A)。作為結(jié)果，200pg樣品下降到檢測的閾值下。但是，利用蠟層，ΔRn基本保留在與40pg稀釋時相同，只有10pg的ΔRn是60％的下降(圖2B)。所以，這一修飾過程導(dǎo)致了敏感度至少增加了20倍。RT-PCR的效率(E)(如公式E＝10(1/-s)-1，其中“s”是稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)(PE Applied Biosystems User Bulletin#2.1997.基因表達的相對定量。Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA.)也利用蠟來提高了(沒有蠟67％，有蠟77％)。在10％的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳各個反應(yīng)的10ul的等分試樣，并且用溴化乙錠染色(圖3)。在有啦層的情況中，在所有稀釋液中除了10pg RNA稀釋液可以觀察對應(yīng)于期望大小的81bp的產(chǎn)物(證明了TaqMan檢測對溴化乙錠的特別的敏感度)。但是，在沒有蠟的反應(yīng)液中，沒有反應(yīng)液在81bp產(chǎn)生清楚的信號。但是，在所有RNA濃度都有非特異產(chǎn)物的污染。
利用Sensiscript RT(Qiagen，Valencia，CA，USA)進行相同的實驗。在這一酶作用的情況中，甚至在沒有蠟層時，PCR產(chǎn)物可以檢測到40pg稀釋度。但是，每個連續(xù)的稀釋度總的熒光連續(xù)下降。加入蠟層，ΔRn保持恒定，檢測容易地達到10pg。顯然，這一一個試管的反應(yīng)的效率接近100％(用上面所述的方法檢測)。所以，明顯地利用AmpliWax PCR gem 50可以增強ABI PRISM7700中用于5’熒光原實驗的一個試管的RT-PCR的敏感度。PCRgem最初是為了簡化熱開始的PCR而設(shè)計的，但對于自動的熱開始不再需要新的酶。這里顯示，這些相同的AmpliWAX PCRgem在一個步驟的定量RT-PCR中是有利的。另外，由于不需要打開PCR試管，消除了cDNA或PCR產(chǎn)物的污染。最后，PCR的防腐特異地簡化了需要的產(chǎn)物的擴增，并且甚至在非定量的終點實驗中也是相關(guān)的。
實施例2 在不到20分鐘內(nèi)的定量RT-PCR下面是定量逆轉(zhuǎn)錄的一個試管的兩步驟實驗，接著是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QRT-PCR)，可以利用Cepheid’s Smart Cycler在不到20分鐘內(nèi)完成。在Applied Biosystem’s 7700中的5’熒光原實驗的QRT-PCR的現(xiàn)有方法需要2個小時以上。通過改變引物和探針濃度和利用Smart Cycler的快速斜面能力，逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的時間降低到2分鐘，并且PCR時間利用1秒變性和6秒擴展的40個循環(huán)降低到16分鐘。
各在25ul中設(shè)計β葡糖醛酸酶(β-gus)和癌胚抗原(CEA)cDNA的PCR反應(yīng)，最后濃度如下400nM各個β-gus PCR引物(GUS-F，5’-CTC ATT TGG AAT TTT GCC GAT T-3’)(SEQ IDNO3)；(GUS-R，5‘-CCG AGT GAA GAT CCC CTT TTT A-3’)(SEQ ID NO4)或CEA引物(CEA-F，5’-AGA CAA TCA CAGTCT CTG CGG A-3’)(SEQ ID NO6)；(CEA-R，5’-ATC CTT GTCCTC CAC GGG TT-3’)(SEQ ID NO7)，200nM β-gus探針(5’-6-fam-TGAACAGTCACCGACGAGAGTGCTGG-tamra-3)(SEQ ID NO5)或200nMCEA探針(5’-6-fam-CAA GCC CTC CATCTC CAG CAA CAA CT-tamra-3)(SEQ ID NO8)，1X Platinum Taq反應(yīng)緩沖液，4.5mMMgCl2，300uM各個dNTP，0.06U/ul PlatinumTaq DNA聚合酶(GIBCO BRL)。
利用1.5，2.5，3.5和4.5mM濃度的MgCl2進行實驗，確定4.5mM對于這一實驗是最適當(dāng)?shù)摹＿@些反應(yīng)的cDNA是利用加入250ng來自A549細胞系(GUS)的RNA和CEA陽性的新鮮的淋巴結(jié)RNA，從GUS和CEA的基因特異逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中產(chǎn)生的。
在25ul體積中設(shè)計β-gus mRNA和CEA mRNA的RT-PCR反應(yīng)，PCR濃度如上，逆轉(zhuǎn)錄酶濃度如下60nM β-gus逆轉(zhuǎn)錄酶引物(5’-TTTGGTTGTCTCTGCCGAGT-3’)(SEQ ID NO2)或CEA逆轉(zhuǎn)錄酶引物(5’-GTG AAG GCC ACA GCA T-3’)(SEQ IDNO9)，1ul的Sensiscript和0.8U/ulRnase抑制劑。RT-PCR的RNA加入量是A549 400ng A549和淋巴結(jié)25ng。
首先通過結(jié)合30秒的擴展步驟比較40個循環(huán)中95℃時的1，2，5，7和10秒的變性步驟使變性步驟最佳化。在95℃，30秒進行Platinum Taq激活。這一實驗的結(jié)果顯示，在1秒的變性到10秒的變性中基因都沒有明顯丟失敏感性。其次，結(jié)合15秒的變性，在40個循環(huán)中比較64℃時3，5，7，10，13，15和30秒的擴展來使擴展步驟最佳化。在95℃，30秒進行Platinum Taq激活。
這一實驗的結(jié)果顯示，對于GUS，在30秒到3秒的擴展中約1個半循環(huán)丟失的敏感性最小。對于CEA，30秒到3秒的擴展步驟中沒有看到明顯的敏感性的丟失。
其次，通過比較1/3的第二個PCR和2/15地第二個的PCR的40個循環(huán)來評估改變變性/擴展時間的結(jié)合效果，結(jié)果顯示對于GUS和CEA各丟連續(xù)2.2和1.1個循環(huán)的敏感性。2/15的第二個PCR需要22分鐘，而1/3的第二個PCR需要16分鐘，這一不明顯的敏感性的丟失是值得將反應(yīng)時間切掉6分鐘。
在試圖降低變性到擴展的斜面時間中，評估了從95℃到90℃到85℃地降低變性溫度的效果。對于GUS，當(dāng)變性在95℃或85℃進行時沒有明顯的敏感性的丟失。對于CEA，當(dāng)變性在85℃進行時是不能反應(yīng)的，但在95℃到90℃進行是沒有看到明顯的敏感性的丟失。進行90℃對95℃的變性得到的時間量在40個循環(huán)中約是1.5分鐘。
對Taq激活時間進行評估，每個基因的敏感性在Taq激活從30秒降低到10秒時沒有發(fā)現(xiàn)明顯的丟失。
在將PCR條件最佳化后，將逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)最佳化。在總體積15ul中進行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)。在完成反應(yīng)后，混合物保持在70℃，在這時，加入PCR成分(總體積，10ul)。比較2，3，5，7和10分鐘的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)時間。將逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)結(jié)合PCR條件，包括對兩個基因的40個循環(huán)都是1秒95℃變性，和5秒64℃擴展。
這些逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)時間的實驗的結(jié)果顯示，從10分鐘的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)到2分鐘的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，對于GUS，1.1個循環(huán)和對于CEA，1.81個循環(huán)有敏感性的丟失。其次，通過比較如下的RT-PCR條件，評估降低RT-PCR時間對實驗的敏感性的總效果1)一個“金標(biāo)準(zhǔn)”，10分鐘的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，接著10秒的變性和15秒的擴展，40個循環(huán)，總的進行時間是38分鐘，2)5分鐘的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，接著最佳化的PCR條件，即1秒的變性和5秒的擴展，40個循環(huán)，總的進行時間是20分鐘，3)2分鐘的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，接著最佳化的PCR條件，即總的進行時間17分鐘，和4)一個“快”的RT-PCR，2分鐘的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，接著1秒的變性和3秒的擴展，40個循環(huán)。總的進行時間是15分鐘。對于GUS，“金標(biāo)準(zhǔn)”RT-PCR具有Ct(達到預(yù)定的閾值，參考的熒光水平需要的循環(huán)數(shù))，25.88±0.78而2分鐘的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，最佳化的PCR條件是具有的Ct是29.42±0.7，表現(xiàn)出總的循環(huán)有3.54的差異。對于CEA，“金標(biāo)準(zhǔn)”RT-PCR具有的Ct是29.94±2.2，而2分鐘的RT，最佳化的PCR條件中Ct是34.92±0.5，表現(xiàn)出總的循環(huán)有4.95的差異。
在增加更短的方案中的敏感性的試圖中，評估了增加Gus和CEA的引物濃度的效果。重復(fù)如上所述的實驗，其中RT引物的濃度從60nM增加到100nM和F/R PCR引物的濃度從400nM增加到800nM。這一實驗的結(jié)果顯示對于CEA，金標(biāo)準(zhǔn)對2分鐘的最佳方案有2.3個循環(huán)的差異(4.98是低的引物濃度)，對于Gus是1.63(3.54是低的引物濃度)的循環(huán)差異。這一敏感性的小小的丟失可以認為，總的RT-PCR時間是從38分鐘降低到17分鐘。
利用最佳的條件，即1秒變性和6秒擴展，40個循環(huán)，對新鮮的淋巴結(jié)cDNA的稀釋系列進行CEA的PCR效率的評估。這一實驗的相關(guān)系數(shù)是0.9974，顯示了良好的再生性。PCR效率可以如下計算E＝10(1/-s)-1，其中S等于模板的系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，Ct是針對對數(shù)DNA濃度劃的。所以，這一實驗的PCR效率是96.7％。
其次，利用2分鐘的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)接著40個循環(huán)的最佳條件的PCR來評估實驗的RT-PCR效率。將新鮮淋巴結(jié)RNA的2X稀釋系列制備成400ng的脾RNA。進行CEA和GUS的RT-PCR。平均GUS Ct是28.39±1.36。這一實驗的效率大于100％。利用Superscript II和Sensiscript而不只是Sensiscript進行相同的實驗。這一實驗的效率接近100％。
實施例3 快速ORT-PCR多量實驗?zāi)壳?，Smart Cycler能夠進行4色熒光檢測，所以允許多重的QRT-PCR反應(yīng)。一個目的是重復(fù)RT-PCR的內(nèi)部對照，一個內(nèi)源的參考基因?qū)φ諄硇?zhǔn)RNA輸入，并且靶基因(例如CEA)都在一個試管中。在適中的CEA mRNA水平時最初的重復(fù)β-GUS和CEA的實驗很好，但當(dāng)CEA存在的水平非常低是卻不能進行。所以，這一反應(yīng)的敏感性對于未轉(zhuǎn)移的檢測是不適當(dāng)?shù)??？朔@一問題是一個方法是限制用于內(nèi)源對照基因的PCR引物的量。在理論上，這允許了稀少的CEA mRNA種類能夠更有效地競爭PCR試劑，特別是在后來的循環(huán)中。用β-GUS或第二個內(nèi)源對照基因(18s核糖體RNA)來做都不能得到適當(dāng)?shù)拿舾卸取?br> 有人假設(shè)，當(dāng)在兩個PCR反應(yīng)之間競爭是最關(guān)鍵時，問題存在于最初的循環(huán)中。為了克服這一點，但仍然在一個試管中進行實驗而沒有特別的操作，必須再設(shè)計18s r RNA(和β-GUS)內(nèi)源對照引物，使退火溫度在CEA引物(所有用于本文所述的QRT-PCR反應(yīng)的引物列在下面的表1)以下10℃。然后，在2個20循環(huán)的步驟中進行PCR，首先退火/延長溫度64℃，第二退火/擴展溫度53℃。多重的反應(yīng)的試劑濃度是與用于單個的反應(yīng)的相同的，但修改如下。靶基因引物濃度是400nM，而內(nèi)源對照的濃度是100nM，逆轉(zhuǎn)錄酶濃度是各60nM，循環(huán)條件的修改如前面所述。理論上，18s rRNA引物將不能在第一個20循環(huán)中起作用，CEA擴增不能在沒有競爭時進行。在第二個20循環(huán)中，CEA PCR產(chǎn)物已經(jīng)提升到它能夠有效地競爭18S rRNA PCR的點。這一實驗的結(jié)果表示在圖4中。組A和C表示了當(dāng)利用最佳條件在單倍中進行時18s rRNA和CEA各自的結(jié)果。組B和D表示了多重的18s rRNA和CEA。注意，當(dāng)這些反應(yīng)在同一試管中重復(fù)時，熒光染料不同時，軟件不能使兩種染料在同一圖上劃出。在單倍的反應(yīng)中，在10個循環(huán)中18SrRNA跨過30個熒光單位閾值(組A)。利用新的PCR引物，和修改的方案，18S rRNA PCR反應(yīng)沒有跨過閾值直到26個循環(huán)(組B)，6個循環(huán)是在退火/擴展溫度下降到53℃后的。這一反應(yīng)可期望在30個循環(huán)(20+10)時跨過閾值，所以，似乎有一些18S rRNA PCR擴增是在開始的20個循環(huán)時發(fā)生的，甚至是64℃的情況中。在CEA反應(yīng)中，單倍反應(yīng)在33.5個循環(huán)時達到閾值(組C)，而多倍的CEA在34.5個循環(huán)時達到閾值。所以，在這一反應(yīng)中只有丟失一個循環(huán)的敏感度。
表1
注意，設(shè)計上面所述的CEA引物是要增加跨越到CEA mRNA的外顯子6和7之間的接合處。引物也擴增跨越CEA mRNA的外顯子2-3之間的接合處的序列。選擇這一引物套以便產(chǎn)生對一些過去所述的引物套的更高的敏感性。在CEA引物的5’或3’末端加入一個或幾個CEA序列的側(cè)接核苷酸(圖5，GenBank登記號，XM 012777)將令人滿意地影響上面所述的實驗，除非引物套的Tm有預(yù)期的變化?？梢詮南嗤钠胀▍^(qū)(外顯子2-3和6-7接合處)選擇其他CEA特異引物，使選擇上面所述的CEA正向和反向引物有和上面所述的CEA引物相同或相似的效果。優(yōu)選地，任何選擇的引物套將產(chǎn)生少于100個堿基的擴增子，這增加了進行快速Q(mào)RT-PCR實驗的能力。
實施例4 在結(jié)陰性食管癌患者中定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的預(yù)后價值引言食管的腺癌正在以超過任何其他固體腫瘤的吃驚的速度在增加。有50％的患者有已發(fā)展的疾病，其中10到13％可生存5年。正如其他腫瘤類型，淋巴結(jié)包括在內(nèi)的組織學(xué)證據(jù)正很大程度上預(yù)測食管癌患者的生存。雖然現(xiàn)有的淋巴結(jié)時期性組織學(xué)方法提供了可靠的關(guān)于患者群體的信息，他們還不能預(yù)測群體中個別患者最后結(jié)果。例如，30-50％的組織學(xué)結(jié)陰性食管癌患者在5年內(nèi)有疾病再發(fā)生，盡管已經(jīng)進行了治愈性的切除。存在偶然的有最初的治療失敗的情況的人體是由于腫瘤微轉(zhuǎn)移的速度沒有倍常規(guī)組織學(xué)評估所檢測的。所以，顯然需要更敏感的對淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移酶的檢測，允許更個別化的預(yù)后和為食管癌患者設(shè)計的治療。
現(xiàn)有的淋巴結(jié)評估的主要問題是取樣誤差，和檢測個別的腫瘤細胞或小的病灶的敏感性小。組織學(xué)檢測只取非常小百分比額淋巴結(jié)的樣品，已有計算，病理學(xué)家檢測到三個腫瘤細胞直徑的微轉(zhuǎn)移病灶的機率只有1％。當(dāng)結(jié)合系列的切片時，腫瘤標(biāo)記的免疫組織化學(xué)染色提高了微轉(zhuǎn)移檢測的敏感度，降低了取樣的誤差，導(dǎo)致了明顯數(shù)目的患者的出現(xiàn)。這一技術(shù)已經(jīng)用于食管癌癥中，17％的組織學(xué)陰性結(jié)發(fā)現(xiàn)含有微轉(zhuǎn)移疾病。在這個報告中，IHC3陽性淋巴結(jié)與疾病的再發(fā)生相關(guān)，但這些發(fā)現(xiàn)在后來的研究中被提出了問題，其中IHC不具有任何預(yù)后價值。其他研究已經(jīng)利用了分子方法如RT-PCR檢測微轉(zhuǎn)移酶。RT-PCR能夠檢測腫瘤標(biāo)記如各種組織包括無組織癌癥的血液，骨髓，和淋巴結(jié)中的CEA，細胞角蛋白19，細胞角蛋白20和其他的mRNA。在食管癌中，RT-PCR已經(jīng)用于幾個小系列的患者，但RT-PCR陽性結(jié)的臨床意義沒有顯示，因為小的臨床跟蹤已經(jīng)有報道。在其他腫瘤類型中，研究已經(jīng)顯示，RT-PCR能提高敏感性，但在沒有癌癥的患者的對照淋巴結(jié)中的特異性小和假陽性結(jié)果已經(jīng)使這一信息的臨床應(yīng)用變得困難。假陽性至少部分上是由于前面所述的異位基因表達，導(dǎo)致所有組織類型中的大多數(shù)基因的表達的背景水平非常低。所以，雖然前面的研究已經(jīng)利用了定性的，基于凝膠的RT-PCR方法，這一簡單的正/負方法在檢測腫瘤標(biāo)記時是否總是可靠的微轉(zhuǎn)移酶的信號還不明顯。在引入的熒光5’核酸酶實驗后，QRT-PCR現(xiàn)在是一個相當(dāng)簡單的技術(shù)。所以，假設(shè)，定量分析在基于凝膠的RT-PCR基礎(chǔ)上提供了明顯的優(yōu)點，并且將允許組織學(xué)結(jié)陰性的食管癌患者中準(zhǔn)確地預(yù)測疾病的再發(fā)生?，F(xiàn)有的目的有3個a)確定QRT-PCR準(zhǔn)確區(qū)別淋巴結(jié)的CEA背景基因表達和診斷真正的微轉(zhuǎn)移的臨床相關(guān)水平；b)利用實時QRT-PCR分析來自30個結(jié)陰性的食管癌患者的淋巴結(jié)，并且將結(jié)果與疾病的再發(fā)生相關(guān)；和c)比較QRT-PCR與相同樣品上的標(biāo)準(zhǔn)的基于凝膠的RT-PCR。發(fā)現(xiàn)，QRT-PCR可以容易地區(qū)別背景表達和真正的轉(zhuǎn)移疾病，QRT-PCR對于檢測結(jié)陰性的食管癌患者中的疾病的再發(fā)生的是敏感的和特異的，并且QRT-PCR具有比基于凝膠的RT-PCR更大的特異性。從這些結(jié)果，可以相信，定量的方法報道的所有的問題，已經(jīng)阻止RT-PCR成為微轉(zhuǎn)移疾病的有用的臨床測試方法。
材料和方法患者研究了來自進行了組織學(xué)淋巴結(jié)陰性食管癌治愈性切除的30個患者的含有387個淋巴結(jié)的140個石蠟塊的組織。在1991到1998年P(guān)ittsburgh大學(xué)的藥學(xué)中心的胸外科部進行了所有的外科手術(shù)。從醫(yī)學(xué)記錄綜述，和與最初的護理人員的個人聯(lián)系和死亡證書中得到了病毒狀態(tài)和再發(fā)生的信息。到2001年8月證實了所有患者的跟蹤數(shù)據(jù)。生存患者的平均跟蹤時間是49個月(范圍，28-91個月)。收集了人口統(tǒng)計和臨床特征(表2)。得到了10個初級腫瘤(8個腺癌和2個扁平細胞癌)和4個組織學(xué)陽性淋巴結(jié)的組織快作為陽性對照。從進行與癌癥不相關(guān)的原因進行食管外科手術(shù)(疝修復(fù)和抗回流方法)并且淋巴結(jié)附帶移除的患者得到陰性對照(良性)淋巴結(jié)。
表2研究群體的臨床特征QRT-PCR結(jié)果
*四個接受化學(xué)治療的患者在外科手術(shù)時沒有腫瘤。
組織和RNA分離用于該研究的所有組織是從病理組織庫中得到的甲醛固定的，石蠟包埋的檔案中的樣本。同樣重新得到每個組織塊的H&E染色的玻片，檢測證實原始結(jié)陰性的診斷。在切片機上安放組織塊，切5-155.0cm的切片，放置于2.0ml的無Rnase的試管中。在同時，切2個5.0uM的切片(第一個和最后一切)，安放在顯微鏡玻片上，用抗CEA抗體進行免疫組織化學(xué)染色。利用前面所述的方法分離RNA(Godfrey，T.E.，Kim，S.-H.，Chavira，M.，Ruff，D.W.，Warren，R.S.，Gray，J.W.，and vJensen，R.H.從甲醛固定的，石蠟包埋的組織，利用5’核酸酶定量RT-PCR進行定量的mRNA表達分析，J.Mol.Diagn.，284-91，2000)，儲存在RNA安全的再懸浮溶液中(Ambion，Austin，TX)。RNA是用無DNA的試劑盒(Ambion)進行Dnase處理，并且進行色譜定量。
QRT-PCR利用5’核酸酶實驗和Applied Biosystems 7700序列檢測儀器(TaqMan)進行QRT-PCR。利用前面所述的比較CT方法，測量相對于內(nèi)源的對照基因，β-Gus，的CEA表達(Godfrey，T.E.，Kim，S.-H.，Chavira，M.，Ruff，D.W.，Warren，R.S.，Gray，J.W.，and Jensen，R.H.利用5’核酸酶定量RT-PCR對來自甲醛固定的，石蠟包埋的組織進行定量的mRNA表達分析。J.Mol.Diagn.，284-91，2000.；Tassone，F(xiàn).，Hagerman，R.J.，Taylor，A.K.，Gane，LW.，Godfrey，T.E.，and Hagerman，P.J.在攜帶者男性中FMR1mRNA的水平提高在脆弱-X綜合癥中包括的新機制.Am.J.Hum.Genet.，666-15，2000)。在力加入兩個RNA，400和100ng時進行QRT-PCR實驗，設(shè)置各個濃度的雙倍反應(yīng)。所以，報道的CEA表達水平是四個獨立的QRT-PCR反應(yīng)的平均值。利用400ngRNA但刪除了逆轉(zhuǎn)錄酶，對所有樣品進行RT-陰性對照的實驗。對各個PCR平板也進行模板陰性對照的實驗。對所有平板平行擴增校準(zhǔn)RNA樣品，允許比較不同時間進行的樣品實驗(Godfrey，T.E.，Kim，S.-H.，Chavira，M.，Ruff，D.W.，Warren，R.S.，Gray，J.W.，and Jensen，R.H.利用5’核酸酶定量RT-PCR從甲醛固定的，石蠟包埋的組織進行定量的mRNA表達分析。J.Mol.Diagn.，284-91，2000.；PE Applied Biosystems user bulletin#2.相對定量ofgene表達，Perkin-Elimer，Corp.，Norwalk，CT，1997.)。
為了最大的敏感性和為了消除交叉污染的危險，利用了前面所述的一個試管的QRT-PCR方法(Raja，S.，Luketich，J.D.，Ruff，D.W.，Kelly，LA.，and Godfrey，T.E.一個步驟的定量RT-PCR的敏感性增加的方法。Biotechiques，29702-705，2000)。在這一方法中，利用蠟層物理分離逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物(RT)和PCR引物導(dǎo)致更特異的和更敏感的RT-PCR。在PCR平板中滴PCR引物，體積10ul。然后，在各個孔中放置一個Ampliwax PCR gem 50(AppliedBiosystems)，將平板加熱到80℃2分鐘，冷卻到4℃產(chǎn)生蠟屏障。然后，在每個孔中滴40ul的上層。反應(yīng)成分的最后濃度如下1XPCR緩沖液A，300nM各個脫氧核苷酸三磷酸，3.5mM MgCl2，0.4單位/ulRnase抑制劑，1.25單位/ul的Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies，Inc.Gaithersburg，MD)，0.06單位/ul AmplitaqGold(Applied Biosystems)，20nM逆轉(zhuǎn)錄酶引物，200nM各個PCR引物，200nM的探針(β-gus引物，和探針是100nM)，和100或400ng總RNA。利用的寡聚核苷酸序列表示在表3。在ABI 7700進行所有的RT-PCR反應(yīng)，熱循環(huán)儀的條件如下48℃保持40分鐘，95℃保持12分鐘，接著45個循環(huán)的95℃15秒，64℃(β-gus60℃)1分鐘。利用序列檢測軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)，對于CEA閾值設(shè)定在0.03，對于β-gus設(shè)定在0.045。
表3對CEA和Gus RT-PCR利用寡聚核苷酸序列
*Taq Man探針是用5’6-羧基熒光素和3’6-羧基四甲基羅丹明基于凝膠的RT-PCR分析為了避免PCR產(chǎn)物污染的可能性，不打開儲存進行QRT-PCR反應(yīng)的所有PCR平板直到定量分析完成。然后，在4％的瓊脂糖凝膠上分開兩個400ng的RNA加入的反應(yīng)和400ng No-RT對照的PCR產(chǎn)物，用溴化乙錠染色，在凝膠文檔系統(tǒng)中觀察。如果在兩個雙倍的反應(yīng)但不是在No-RT對照中觀察到準(zhǔn)確大小的帶，可以將患者鑒定成RT-PCR陽性。
統(tǒng)計分析用Mann-Whitney U實驗進行對照組織樣品中CEA水平的比較(圖6)。對于來自食管癌癥患者的病理陰性的淋巴結(jié)，最初的終點是從外科手術(shù)時間到診斷再發(fā)生或跟蹤的最后日期測量到的疾病的再發(fā)生。利用來自各個患者的組織塊的最高CEA水平構(gòu)建利用再發(fā)生作為金標(biāo)準(zhǔn)的ROC曲線。鑒定CEA表達水平截止值產(chǎn)生最準(zhǔn)確的鑒定，該水平用于鑒定患者是否為再發(fā)生危險的QRT-PCR陽性或陰性。因為第二系列的患者對于截止的前景無效性是不可得的，可以通過交叉無效性來統(tǒng)計評估截止選擇方法，并且通過鞋襻計算ROC曲線統(tǒng)計的SD(Davison，A.C.，andHinkley，D.V.鞋襻方法和它們的應(yīng)用，Cambridge，英國劍橋大學(xué)出版社，1997)。對臨床和病理因子包括標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR和QRT-PCR結(jié)果劃出Kaplan-Meier無疾病和整個生存曲線。無疾病生存的分析是通過log-rank實驗來進行的，通過構(gòu)建Cox成比例的危險模型進行多變量的分析。預(yù)測者的列表中包括了類目因素性別，腫瘤病理，RT-PCR和QRT-PCR的鑒定，預(yù)操作的化學(xué)治療和/或放射治療，和病理T時期，以及CEA表達水平的定量因素，年齡，從檢測種除去的結(jié)的數(shù)目。所有模型之間的比較是基于嵌套的模型的可能性比例實驗之間的差異的。比例假設(shè)的適當(dāng)性的檢測有兩個方法在對數(shù)時間劃對數(shù)累積的危險曲線，和劃Schoenfeld殘余，并且估計回歸系數(shù)和時間之間的相關(guān)性。
結(jié)果-結(jié)陰性患者的特征TNM鑒定有結(jié)陰性食管癌的30個患者包括T1N0M0(n＝10)，T2N0M0(n＝5)，和T3N0M0(n＝10)。有活體檢查診斷癌癥的一個患者沒有再切除樣本癌癥的證據(jù)，接受新輔助治療的四個患者在切除時間沒有可檢測腫瘤殘余。最初的腫瘤的定位包括25個較低的第三個，5個中間的，和0個上面的食管位點。有26個腺的和4個扁平細胞癌。有22個男性和8個女性，診斷的患者的中間年齡是70歲。30個患者中17個已經(jīng)死亡，10個由于癌癥，7個由于其他原因?qū)τ谏娴幕颊?，跟蹤的平均時間是49個月(范圍，28-91個月)。整個生存患者的平均時間是36個月?；颊咛卣鞯耐耆诸愄峁┰谙旅娴谋?中。
定量分析CEA表達從三個與結(jié)陰性的研究組不同的來源分離和分析RNA，包括初級的食管腫瘤，轉(zhuǎn)移酶組織學(xué)陽性的淋巴結(jié)(N1)，和來自沒有癌癥的患者的良性淋巴結(jié)。在所有的腫瘤，和N1結(jié)和50％的良性淋巴結(jié)中檢測CEA的表達(圖6)。來源Mann-Whitney U實驗進行個別的，成對的比較，在腫瘤和N1結(jié)中的表達水平分析是明顯比在良性淋巴結(jié)中的更高(各為p＝0.002，和0.0021)。腫瘤樣品中的CEA表達稍微比N1淋巴結(jié)中高，但統(tǒng)計學(xué)上不明顯(p＝0.171)。
分析來自該研究組的組織學(xué)陰性(N0)淋巴結(jié)證明了有大范圍的CEA表達。表達的范圍從檢測不到到一個結(jié)的CEA表達相當(dāng)于組織學(xué)陽性的淋巴結(jié)中看到的。利用EOC曲線分析來分析來自每個患者的最高表達的結(jié)的數(shù)據(jù)和疾病的再發(fā)生信息。從這一分析，確定最準(zhǔn)確預(yù)測的再發(fā)生的表達水平截止(圖7)。在ROC曲線下的面積是0.88，95％的置信度為0.71到0.97，表明鑒定準(zhǔn)確率明顯比單個的機會好。在分析的140個組織塊中，12個(9％)具有截止點以上的CEA表達水平，總共11個患者(34％)具有表達水平在截止以上的一個或多個塊。這11個患者鑒定為具有隱藏的微轉(zhuǎn)移酶的QRT-PCR證據(jù)。來自所有除了一個(患者第28)“最陽性”組織塊的切片是用抗CEA的抗體沒有組織化學(xué)染色陰性的。
CEA表達的基于凝膠的分析利用基于凝膠的實驗，總共有25個(18％)的組織塊是CEA表達陽性的，15個(50％)的患者至少在這一分析中有一個陽性塊。在來自良性紊亂的患者的10個淋巴結(jié)的2個中，基于凝膠的實驗中存在CEA PCR產(chǎn)物。定量的和基于凝膠的實驗的比較顯示，所有凝膠上的陽性樣品在TaqMan實驗中得到信號。
隱藏的轉(zhuǎn)移酶和再發(fā)生在研究的30個患者中，10個有疾病再發(fā)生，在研究結(jié)束是死亡。其余20個患者中，7個死于其他原因，13個仍然活著，沒有再發(fā)生的證據(jù)。一個患者有早期的聯(lián)結(jié)再發(fā)生，可以用光動力治療和放射治療來治療。這一患者是后來診斷的，有并且死于小細胞肺癌。利用最準(zhǔn)確的定量實驗的截止，總共11個患者鑒定為QRT-PCR陽性，9個有再發(fā)生。同樣這9個患者利用基于凝膠的實驗鑒定為RT-PCR陽性，其他6個患者沒有再發(fā)生。利用QRT-PCR實驗預(yù)測疾病再發(fā)生的敏感性和特異性是90和90％，陽性預(yù)測值是82％。利用基于凝膠的實驗，敏感性和特異性是90和70％，陽性預(yù)測值是60％。圖8顯示了RT-PCR(A)和QRT-PCR(C)股鑒定為無疾病生存的患者完全生存(B和D)。當(dāng)利用各個實驗死，RT-PCR陰性的無疾病生存的患者是94％。通過各個方法，陽性特征的患者的預(yù)后更少。Log-rank實驗表明，QRT-PCR(0001)和基于凝膠的RT-PCR(p＝0038)在結(jié)陰性食管癌患者中明顯預(yù)測了再發(fā)生。在QRT-PCR-或RT-PCR陽性患者中完全生存也更糟(P＝0.0006和0.106)。
除了QRT-PCR和RT-PCR，在這一股中唯一發(fā)現(xiàn)能預(yù)測疾病再發(fā)生的其他臨床，病理或治療因素是病理T時期(log-rank實驗，P＝0.0777)，和預(yù)操作化學(xué)治療和/或放射性治療(log rank實驗，P＝0.0307)。在多變量分析中，來自Cox回歸模型的可能的比例統(tǒng)計顯示，與病理T時期和與操作化學(xué)治療或放射性治療相比，CEA作為二元可變的，QRT-PCR陽性或陰性的特征是再發(fā)生明顯的不起獨立的預(yù)測指示。
討論在許多固體腫瘤中，淋巴結(jié)的參與是最強的預(yù)后因素，在最近的文獻中，檢測淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)受到了關(guān)注?，F(xiàn)有的淋巴結(jié)評估包括顯微鏡檢測H&E染色的組織切片，并且受到兩個主要的限制(a)單個腫瘤細胞或小的細胞病灶是容易錯過的；和(b)只研究一個或兩個組織切片，所有每個結(jié)的大部分仍然沒檢測。系列切片可以克服組織的取樣誤差，IHC可以鑒定各個腫瘤細胞。但是，結(jié)合這些方法對于常規(guī)分析太耗價耗時，并且是局限于特別的情況如崗哨淋巴結(jié)的檢測。RT-PCR克服了取樣誤差的問題，因為可以分析更大量的組織，并且有幾個報告表明，RT-PCR能比IHC鑒定更多陽性的淋巴結(jié)。這也是目前的研究中的情況，而IHC分析中只有一個QRT-PCR陽性淋巴結(jié)塊是陽性的。
最近的研究也顯示，非-QRT-PCR陽性率與疾病再發(fā)生相關(guān)，但在這些研究中報道的特異性是低的。在Liefers et al.的一個研究中(13.Liefers，G.J.，Cleton-Jansen，A.M.，van de Velde，C.J.，Hermans，J.，van Krieken，J.H.，Cornelisse，C.J.，and Tollenaar，R.A.在第二時期的結(jié)腸癌中的微轉(zhuǎn)移酶和生存[參見評論].N.Engl.J.Med.，339223-228，1998.)，26個組織學(xué)N0直腸癌患者在利用RT-PCR檢測時14個有微轉(zhuǎn)移疾病的證據(jù)，其余12個是RT-PCR陰性。在12個RT-PCR N0患者中，只有1個在6年的跟蹤期中有再發(fā)生，而14個RT-PCR N1患者中有7個再發(fā)生。所以，利用再發(fā)生作為終點，這一研究達到了88％的敏感性。但是，特異性只有61％，因為RT-PCR陽性結(jié)的7個患者沒有再發(fā)生。其他研究已經(jīng)顯示，在黑素瘤患者中有相似的第特異性的非QRT-PCR。Shivers et al.(Shivers，S.C.，Wang，X.，Li，W.，Joseph，E.，Messina，J.，Glass，L.F.，DeConti，R.，Cruse，C.W.，Berman，C.，F(xiàn)enske，N.A.，Lyman，G.H.，and Reintagen，D.S.惡性黑素瘤的分子時期有臨床結(jié)果的相關(guān)性。JAMA，2801410-1415，1998)獲得了86％的敏感性和51％的特異性，Bostick et al.(Bostick，P.J.，Morton，D.L.，Turner，R.R.，Huynh，K.T.，Wang，H.J.，Elashoff，R.，Essner，R.，and Hoon，D.S.在早期的黑素瘤患者中通過崗哨lymphadenectomy和逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測檢測隱藏轉(zhuǎn)移酶的預(yù)后明顯性。J.Clin.Oncol.，173238-3244，1999)報道了100％的敏感性和67％的特異性。這一低特異性以及不能準(zhǔn)確控制inter-run可變性已經(jīng)限制了RT-PCR在臨床上的潛力。
在本研究中，評估了在組織學(xué)N0食管癌患者的淋巴結(jié)中利用TaqMan RT-PCR定量測試CEA表達和檢測隱藏的微轉(zhuǎn)移酶。這一定量分析導(dǎo)致了確定臨床相關(guān)的CEA表達水平截止和克服了與背景或其他報道的異位的CEA表達相關(guān)的問題。利用這一途徑，30個患者中11個鑒定為QRT-PCR陽性，9個有疾病再發(fā)生。19個患者中只有一個是QRT-PCR陰性的，在這一研究過程中有再發(fā)生。有趣的是，在沒有再發(fā)生的20個患者中，11個具有比對照淋巴結(jié)(比背景水平高)中看到的更高的可檢測CEA表達，兩個是在截止水平以上，預(yù)測了疾病有再發(fā)生。在一些情況中，這可以指示存在有限的結(jié)節(jié)疾病，可以通過外科治愈，因為甚至pN1患者也可以有約20％預(yù)期有5年的生存期。在其余的樣品中的CEA表達可能是不能生存并且可能進行細胞程序死亡的的個別彌散性腫瘤細胞，作為初級位點的腫瘤細胞程序死亡的結(jié)果的淋巴系統(tǒng)中的無細胞RNA或外科手術(shù)無意中介入的污染細胞的結(jié)果。
與QRT-PCR陽性患者比較，在QRT-PCR陰性患者中無疾病生存和完全生存明顯更高。另外，在QRT-PCR陽性組中無疾病生存在3年中只有27％，表明微轉(zhuǎn)移疾病可能與組織學(xué)N1疾病在臨床上一樣明顯。除了一個患者，每個患者只鑒定出一個陽性組織塊，表明疾病擴散有限。所有陽性淋巴結(jié)是區(qū)域性的，并且所以是N1狀態(tài)狀態(tài)而不是M1a，如腹腔或頸淋巴結(jié)參與所確定的。在這些組織學(xué)N0患者中包括有限的結(jié)節(jié)強調(diào)了，需要在分時期的方法中，從不同的結(jié)節(jié)位置取適當(dāng)?shù)牧馨徒Y(jié)。
雖然過去，有結(jié)陰性疾病的患者已經(jīng)相當(dāng)少，但是食管癌的戲劇性增多已經(jīng)導(dǎo)致產(chǎn)生了正在更快地鑒定有早期疾病的患者的監(jiān)視方法。所以，這些患者的準(zhǔn)確的分時期方法變得更重要。本文的定量數(shù)據(jù)與相同樣品的基于凝膠的分析的比較顯示，QRT-PCR在保持同樣高的敏感性下提高了實驗的特異性。QRT-PCR也給出了目的性結(jié)果，這些結(jié)果是經(jīng)得起自動的，無手分析的檢驗的，其PCR產(chǎn)物交叉污染的危險最小。如果QRT-PCR變成常規(guī)的臨床測試方法，這樣的自動化是必須的。
另外，定量方法允許利用嚴格的控制來證明測試方法一次次的準(zhǔn)確率和可依賴性。例如，在所述的實驗中，在所有PCR平板上跑校準(zhǔn)樣品校準(zhǔn)每天的變化率。利用這一方法，再生產(chǎn)力實驗表明，測量方法的95％的置信度限制是0.511個循環(huán)(數(shù)據(jù)沒有表示)。如果RT-PCR是用于臨床的，準(zhǔn)確評估定量測試方法的再生性的能力是必須的。在基于凝膠的測試中，這一水平的測試證實是達不到的。已知，通過QRT-PCR確定的CEA水平來鑒定患者的預(yù)測能力是最佳的，因為截止值是在同一患者中評估的。似乎如果最準(zhǔn)確的截止的相同方法應(yīng)用于第二套患者中，鑒定將不太成功。這時，將通過交叉證實來進行敏感性，特異性，和鑒定準(zhǔn)確率的再分析(n＝10000)。特異性的交叉證實估計值是0.82，準(zhǔn)確率是0.82(與在原始樣品中0.90和0.90比較)。所以，原始樣品的鑒定成功是稍微夸大了，但甚至在與這一最佳化相關(guān)后，QRT-PCR來鑒定仍然比基于凝膠的測試有改良。
結(jié)論是，這些數(shù)據(jù)證明，QRT-PCR可以在高特異性下檢測食管癌患者的組織學(xué)陰性淋巴結(jié)中的微轉(zhuǎn)移疾病。同樣也已經(jīng)顯示，微轉(zhuǎn)移疾病的存在是癌癥再發(fā)生的強而獨立的預(yù)示，并且其定量是超過標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR測試的。定量的RT-PCR應(yīng)該能夠鑒定哪個有早期食管癌的患者是有高的再發(fā)生危險的，和哪個可能受益于其他治療。最后，這一定量途徑應(yīng)該在其他腫瘤類型中產(chǎn)生相同的優(yōu)點。
表4個別患者的生存和RT-PCR數(shù)據(jù)
aNED，沒有疾病證據(jù)b有扁平細胞癌的患者c在化學(xué)治療后沒有殘留腫瘤的患者d在生物活體檢測樣本中有癌癥，但在切除后沒有癌癥的患者實施例5 手術(shù)內(nèi)定量RT-PCR檢測有食管癌的患者中的結(jié)轉(zhuǎn)移引言食管癌和其他惡性腫瘤的外科切除經(jīng)常是基于手術(shù)內(nèi)的淋巴結(jié)的冷凍切片分析的。有食管癌的患者的5年的生存仍然很少，只有5-10％，因為許多患者在開始出現(xiàn)時疾病就發(fā)展了。但是如果位置和區(qū)域淋巴結(jié)是組織學(xué)陰性的，5年的生存就有很大的提高。然而，30-50％的組織學(xué)結(jié)陰性患者有疾病的再發(fā)生。這最可能是由于檢測微轉(zhuǎn)移酶中現(xiàn)有的分時期技術(shù)的限制。作為結(jié)果，其他技術(shù)如免疫組織化學(xué)或逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)已經(jīng)用于檢測組織隱藏微轉(zhuǎn)移酶的嘗試中。
對食管，結(jié)腸，黑素瘤和胸癌的研究已經(jīng)顯示，RT-PCR可以檢測組織學(xué)隱藏的微轉(zhuǎn)移酶，并且可以預(yù)測再發(fā)生。但是，這些數(shù)據(jù)已經(jīng)被批評，因為在對照樣品中有假陽性結(jié)果，并且RT-PCR隨后的特異性低，和有陽性預(yù)測值。已經(jīng)顯示，定量RT-PCR(QRT-PCR)允許將背景，異位的基因表達與真正的微轉(zhuǎn)移酶區(qū)別，并且所以可以避免假陽性，和提高預(yù)測疾病再發(fā)生的特異性。另一個目的是能夠在重要的外科切除手術(shù)內(nèi)進行時提供外科大夫這一關(guān)鍵的信息。
在這一實施例中所述的是可以在不到30分鐘內(nèi)進行的特別快速的QRT-PCR實驗的發(fā)展和操作。為了使這一快速測試方法合法化，將它與標(biāo)準(zhǔn)的QRT-PCR和有食管癌的患者中的臨床結(jié)果比較。
材料和方法患者追溯以往的分析，從進行治愈性切除組織學(xué)淋巴結(jié)陰性食管癌的30個患者(表6)研究淋巴結(jié)。所有外科手術(shù)是在1991年到1998年在Pittsburgh大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的胸外科分部進行的。從醫(yī)護記錄中得到臨床的跟蹤記錄，并且如2001年8月證實是對所有患者的。所有患者的醫(yī)學(xué)臨床跟蹤時間是36個月，對生存患者是49個月(范圍18-91月)。
表6研究群體的臨床特征
*4接受化學(xué)治療的患者在外科手術(shù)時間沒有腫瘤+1在生物活體檢查有但切除后沒有癌癥的患者為了進行前景分析，從1999到2000年在Pittsburgh醫(yī)學(xué)中心的胸外科進行鑒定的食管癌分時期或切除的12個患者中得到淋巴結(jié)樣品(表7)。從進行抗回流過程的腹外科手術(shù)的患者偶然得到?jīng)]有癌癥的患者的對照結(jié)。在切除時，為了分析，將每個淋巴結(jié)的一半冷凍在液氮中，其余送去做常規(guī)病理分析。在我們研究所，切除的組織是常規(guī)臨床過程的一部分，不起沒有其他組織除去是用于任何純粹的研究目的。在Pittsburgh大學(xué)，所有組織收集是作為正在進行的，IRB同意的，食管癌危險登記方案的一部分。
表7在新鮮的冷凍淋巴結(jié)上進行的快速Q(mào)RT-PCR研究中的患者的腫瘤時期和組織學(xué)
組織和RNA分離用于后前景研究的所有組織是用甲醛固定，石蠟包埋的檔案中的樣本，是從病理組織庫中得到的。每個組織塊也得到了蘇木精和曙紅染色的玻片，檢查證明了原始的結(jié)陰性診斷。組織塊被安放在切片機上，切5到15，5.oum的切片，放置于2.0ml的無RNA酶的試管中。同時，切2，5.0uM的切片(第一和最后的切片)，放置于顯微鏡的玻片上，進行H & E染色，以及用抗CEA的抗體進行免疫組織化學(xué)染色。利用前面所述的方法分離RNA(GodfreyTE，Kim S-H，Chavira M，Ruff DW，Warren RS，Gray JW et a1.，從甲醛固定的，石蠟包埋的組織，利用5’核酸酶定量RT-PCR進行定量mRNA表達分析。Journal of Molecular Diagnostics 2000；2(2)84-91.)和進行光譜定量。
在OCT化合物中包埋新鮮的冷凍的淋巴結(jié)組織，切10-15，4.0uM的切片。同時，切2，4.0uM的切片(第一和最后的切片)，安放于顯微鏡的玻片上進行H&E染色。其余的切片安放在1.5ml的無RNA酶的試管中，試管中有來自Rneasy Mini試劑盒的溶解緩沖液(Qiagen，Valencia，CA)。利用有下面的修改處的制造商推薦的方案萃取RNA。將離心時間超過1分鐘降低到1分鐘，在60ul的RNA安全再懸浮溶液(Ambion，Austin，TX)中再構(gòu)成RNA。雖然大多數(shù)樣品是一起加工的，有5個樣品分別加工，以確定每個樣品的平均萃取時間。為了質(zhì)量控制，光譜確定RNA的產(chǎn)量和純度。
定量逆轉(zhuǎn)錄PCR利用5’核酸酶實驗進行QRT-PCR。在Cepheid SmartCycler(CSC)上實時擴增和利用如下所述的檢測系統(tǒng)進行快速Q(mào)RT-PCR。在Applied Biosystems 7700序列檢測儀器(TaqMan)上，利用如本文所述的一個試管的QRT-PCR方法進行標(biāo)準(zhǔn)的QRT-PCR。
快速Q(mào)RT-PCR利用前面所述的比較CT方法測量與內(nèi)源控制基因，β-葡糖醛酸酶(β-GUS)相關(guān)的CEA表達(Godfrey TE，Kim S-H，Chavira M，Ruff D W，Warren RS，Gray JW et al.從甲醛固定的，石蠟包埋的組織，利用5‘核酸酶定量RT-PCR進行定量的mRNA表達分析，Journal of Molecular Diagnostics 2000；2(2)84-91.；Tassone F，Hagerman RJ，Taylor AK，Gane LW，Godfrey TE，Hagerman PJ，在攜帶者男性中FMR1 mRNA的水平升高包括在fragile-X綜合癥中的新機制，Am.J.Hum.Genet.2000；66(1)6-15.)。對三份400ng的總RNA進行QRT-PCR實驗。設(shè)計CEA和β-GUS PCR引物，但不擴增基因組DNA。但是，仍然利用RNA進行對照反應(yīng)，但沒有逆轉(zhuǎn)錄(No-RT對照)，并且水(沒有模板對照)替代了cDNA作為PCR模板。這些對照反應(yīng)一起排除了信號是從RNA的基因DNA污染或試劑的PCR產(chǎn)物污染中產(chǎn)生的可能性。另外，在所有實驗中平行擴增了校準(zhǔn)RNA樣品，允許比較不同時間的樣品實驗(Godfrey et al.(2000)；PE Applied Biosystems使用手冊#2。ABI Prism 7700序列檢測系統(tǒng)基因表達的相對定量。1997.Norwalk，CT，Perkin Elmer Corp.)，并且確定了實驗的再生性。
反應(yīng)成分的最后濃度如下1xPCR Platinum Taq緩沖液，300nM各dNTP，4.5mMMgCl2，0.8U/ul Rnase抑制劑，1.25U/ulSensiscript逆轉(zhuǎn)錄酶(Qiagen，Valencia，CA)，0.06U/ulPlatinum Taq(Gibco，Gaithersburg，MD)，60nM RT引物，400nM各個PCR引物，200nM探針和400ng總RNA。新鮮組織分析加入的總RNA是5ul的樣品。對于固定的組織分析，利用了5ul的80ng/ul的RNA貯備液的稀釋液。在快速的實驗中，進行RT反應(yīng)，其中沒有PCR引物或探針，然后，打開試管，加入引物和探針。這是必須的，引物標(biāo)準(zhǔn)的一步QRT-PCR缺乏檢測稀少信息的敏感度。利用的寡聚核苷酸序列如下β-GUS RT引物5’TGG TTG TCT CTG CCG A3’(SEQ ID NO15)，β-GUS正向PCR引物，5’CTC ATT TGG AAT TTT GCC GAT T3’(SEQ IDNO3)，β-GUS反向引物5’CCG AGT GAA GAT CCC CTT TTT A3’(SEQ ID NO4)，β-GUS探針5’-Vic TGA ACA GTC ACC GACGAG AGT GCT GG3’(SEQ ID NO5)，CEA RT引物5’GTG AAGGCC ACA GCA T3’(SEQ ID NO9)，CEA正向PCR引物5’AGACAA TCA CAG TCT CTG CGG A3’(SEQ ID NO6)，CEA反向PCR引物5’ATC CTT GTC GTC CAC GGG TT 3’(SEQ ID NO6)，CEA反向PCR引物5’ATC CTT GTC CTC CAC GGG TT3’(SEQID NO7)和CEA探針5’-Fam CAA GCC CTC CAT CTC CAGCAA CAA CT3’(SEQ ID NO8)。在CSC上進行快速Q(mào)RT-PCR反應(yīng)，熱循環(huán)條件如下48℃持續(xù)5分鐘，70℃持續(xù)60秒(加入PCR引物和探針，95℃持續(xù)30秒(Platinum Taq激活)，接著45個循環(huán)的，95℃2秒，64℃15秒。用Smartcycler軟件分析(1.o版)，利用第二個派生方法分析數(shù)據(jù)，確定閾值。對于固定的組織分析，需要30分鐘的RT反應(yīng)，因為在固定的組織的RNA樣品中與內(nèi)在的降解相關(guān)的敏感度降低。
統(tǒng)計分析通過無疾病生存的成比例的危險回歸評估快速Q(mào)RT-PCR確定CEA表達水平的預(yù)測的真實性。從外科手術(shù)時間到診斷食管癌再發(fā)生的時間確定無疾病生存。2001年8月1日審查了由于其他原因的死亡和活著沒有疾病的患者。CEA表達水平也用于鑒定QRT-PCR陽性或陰性的患者。ROC曲線分析鑒定的截止水平(DeLong ER，Delong DM，Clarke-Pearson DL.比較在兩個或多個相關(guān)的接受者手術(shù)特征曲線下的面積非參數(shù)途徑。Biometrics1988；44(3)837-845；Heagerty PJ，Lumley T，Pepe MS.審查的生存數(shù)據(jù)和一個診斷北京的依賴時間的ROC曲線。Biometrics 2000；56(2)337-344)，被確定為利用疾病再發(fā)生作為標(biāo)準(zhǔn)的最準(zhǔn)確的分類的CEA表達水平。QRT-PCR結(jié)果的敏感性和特異性是為診斷隱藏轉(zhuǎn)移而計算的。用log-rank實驗測試根據(jù)鑒定的方法分類為QRT-PCR陽性或陰性的患者中無疾病生存的差異。
結(jié)果歸檔的組織分析分析了來自有食管癌的30個患者的初級的，歸檔的組織學(xué)陰性(N0)淋巴結(jié)(圖9)。在30個分析的組織塊中，13個具有比ROC曲線確定的截止更高的CEA表達(CEA表達高于0.183)。在這一組中，9個患者有疾病的再發(fā)生，在研究結(jié)束時死亡，2個患者死于其他原因，2個活著沒有疾病。在其余的17個QRT-PCR陰性患者中，1個在5個月時有疾病的再發(fā)生，在研究結(jié)束時死亡，5個死于其他原因，11個仍然活著，無疾病(表8)。利用快速Q(mào)RT-PCR測試方法，預(yù)測疾病再發(fā)生的敏感性和特異性各為90％和80％，在這股中83％的患者的鑒定是準(zhǔn)確的。圖10顯示了QRT-PCR陽性和陰性患者的Kaplan-Meier無疾病生存曲線。QRT-PCR陰性和陽性的患者的生存在5年中分別是94％和20％。這兩個組的生存功能是明顯不同的(p＝0.001，log-rank實驗)。
表8利用0.183的CEA表達截止的30個pN0食管癌患者的快速Q(mào)RT-PCR結(jié)果。敏感性是90％(9/10)特異性是80％。
利用無疾病生存的成比例危險模型，一個單位的CEA表達的增加的相對危險(RR)是1.52(1.11-2.09，p＝0.027)，并且與CEA表達小于或等于0.183相比，CEA表達大于0.183的是3.78(1.34-10.7，p＝0.0007)。
新鮮組織分析分析了來自進行食管癌或良性食管紊亂最小的侵入分期的患者的淋巴結(jié)的新鮮冷凍切片。在來自良性情況的11個淋巴結(jié)中，只在2個淋巴結(jié)中快速Q(mào)RT-PCR檢測到了非常低水平的CEA表達(患者8和11，圖11)。在良性情況中，這一低水平代表了背景的異位CEA表達。在任何良性結(jié)中的CEA表達的最高水平比最低的表達的陽性結(jié)低34倍(圖11)，只有小的包括腫瘤的病灶。
在來自食管癌的12個患者的26個淋巴結(jié)中，12個(6個患者)最后顯示最后病理是陽性的。但是，在這些淋巴結(jié)中的2個(2個患者)，手術(shù)內(nèi)的冷凍切片分析是陰性的，N1狀態(tài)確定是操作后的。在這兩個結(jié)中，快速Q(mào)RT-PCR顯示CEA表達水平是在組織學(xué)陽性結(jié)的范圍中的(患者18和19，圖11)。在有組織學(xué)結(jié)陰性食管癌的6個患者中，只有一個在快速Q(mào)RT-PCR中有CEA表達提高的單一的結(jié)(患者15，圖11)。這一患者在跟蹤的16.5個月中食管癌有臨床的再發(fā)生。
對每個實驗的校準(zhǔn)樣品進行的分析發(fā)現(xiàn)，在13個獨立的實驗中，delta Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.14個循環(huán)(相對表達測量值的～10％標(biāo)準(zhǔn)偏差)。另外，QRT-PCR需要約25分鐘進行所有40個循環(huán)實驗。在RNA分離時間7分鐘時，整個實驗需要約30分鐘。所以，這是一個非?？斓目稍偕膶嶒灐?br> 討論在許多惡性腫瘤中，如在食管癌中，TNM分期產(chǎn)生了最好的預(yù)后信息。沒有結(jié)參與是與定位更好的病灶有關(guān)的，表明單獨通過外科手術(shù)切除可以達到治愈。但是，結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤傳播到初級腫瘤以外的位置的指示，并且需要系統(tǒng)治療。雖然在食管癌中化學(xué)治療的作用仍然是有爭論的，但是一些實驗已經(jīng)顯示了手術(shù)前的化學(xué)治療有優(yōu)勢的趨勢。這一途徑的一個優(yōu)點是有比在非?？膳碌耐饪剖中g(shù)治療后接受治療更多的患者能夠完成化學(xué)治療方案。正在進行的有前景的，隨機的臨床實驗應(yīng)該能解決手術(shù)前的化學(xué)治療在最近的將來的食管癌患者中的用途。隨著分時期的最小侵入性外科途徑的出現(xiàn)，在切除之前存在分時期的潛在性，并且提供適當(dāng)?shù)氖中g(shù)前的化學(xué)治療。所以，在嘗試治愈性切除之前準(zhǔn)確確定結(jié)的時期在有食管癌的患者中進行切除的方法中非常重要。
目前，通過冷凍切片和H&E染色進行手術(shù)內(nèi)的結(jié)分時期。當(dāng)這一方法學(xué)與甲醛固定，H&E染色的組織檢測的金標(biāo)準(zhǔn)至少有93％的相關(guān)性時，兩個方法都是有明顯限制的。具體地說，盡管潛在有治愈性切除，30-50％的組織學(xué)結(jié)陰性食管癌患者有疾病的再發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)最可能是由于取樣的誤差，這是常規(guī)方法所內(nèi)在的問題，以及由于缺乏檢測微轉(zhuǎn)移的敏感性。單一的腫瘤細胞，或小的細胞病灶是容易錯過的，因為只有一個或兩個4uM的切片被研究，并且各個結(jié)節(jié)的大部分沒有檢查。系列切片淋巴結(jié)可以降低取樣的誤差，所以可以使這一限制性最小。例如，在對胸癌的研究中，系列切片淋巴結(jié)結(jié)合免疫組織化學(xué)導(dǎo)致其他常規(guī)組織病理評估中陰性的結(jié)的10-23％處于劣勢。但是，由于各種情況中許多淋巴結(jié)的系列切片中包括的大量的時間和勞動，這一方法不是經(jīng)常使用的。
在最后十年，在嘗試提高微轉(zhuǎn)移檢測的敏感性中，許多研究已經(jīng)利用RT-PCR檢測淋巴結(jié)中與腫瘤相關(guān)的mRNA。對幾個癌癥類型的研究已經(jīng)報道，RT-PCR是合理的預(yù)后指示，但盡管如此，RT-PCR在臨床實踐還沒有利用。主要的原因是特異性小(40-60％)，和來自沒有癌癥的患者的對照結(jié)的假陽性結(jié)果，并且缺乏多中心實驗的標(biāo)準(zhǔn)化實驗。在其他工作中，已經(jīng)顯示，因為背景或異位基因表達，RT-PCR(QRT-PCR)的定量途徑可以克服假陽性，并且增強預(yù)測疾病再發(fā)生的特異性，Godfrey TE，Raja S，F(xiàn)inkelstein SD，Kelly LA，Gooding W，Luketich JD.在淋巴結(jié)陰性食管癌患者中定量RT-PCR預(yù)測疾病再發(fā)生。美國癌癥研究協(xié)會2001年度會議進程，42，3-1-2001。但是，由于研究中利用的技術(shù)，RNA分離和RT-PCR測試需要4-6小時完成。結(jié)果是該方法只能在手術(shù)后使用。手術(shù)中的QRT-PCR只有如果進行得足夠快，在與手術(shù)中冷凍切片分析可比較的時間框架內(nèi)(約20-30分鐘)產(chǎn)生結(jié)果才能成為事實。伴隨著快速RNA分離和逆轉(zhuǎn)錄方案，需要非常快的PCR取樣時間，如Roche Light Cycler或CepheidSmart Cycler可以達到的。由于容易使用，獨立控制各個反應(yīng)位點，可獲得四色多重倍和自動樣品制備和QRT-PCR的潛力，此處利用了Cepheid儀器(沒有玻璃毛細現(xiàn)象)。利用這一儀器，已經(jīng)顯示，QRT-PCR實驗可以在RNA萃取到結(jié)果的30分鐘內(nèi)在OCT包埋組織切片上進行。帶著本文報告的方案的修改，QRT-PCR可以在18.5分鐘內(nèi)進行(數(shù)據(jù)未顯示)。利用快速的實驗，可以進行跟蹤期平均36個月的患者的歸當(dāng)?shù)慕M織的RNA回顧分析。數(shù)據(jù)顯示，快速實驗預(yù)測了疾病的再發(fā)生，敏感度和特異性分別為90％和80％。這一數(shù)據(jù)是可以與更慢的，和更傳統(tǒng)的，Taq Man基礎(chǔ)的分析比較的(90％和90％)。在新鮮的組織分析中，在30分鐘內(nèi)區(qū)別所有的組織陽性結(jié)和良性對照結(jié)是可能的。利用CEA表達水平，由于具有相似于良性或病理陽性結(jié)的表達方式，鑒定病理陰性結(jié)也是可能的。
從這一數(shù)據(jù)可見，似乎快速Q(mào)RT-PCR至少與被固定的組織的檢測一樣敏感，并且比手術(shù)中的冷凍切片的檢測更敏感。這一點被兩個在手術(shù)中的檢測過程中延遲或漏診的陽性結(jié)證實了。為了證實這一數(shù)據(jù)，計劃了更大數(shù)目的新鮮淋巴結(jié)的研究，目的是將結(jié)果與病理分期相關(guān)聯(lián)。當(dāng)該數(shù)據(jù)設(shè)置完成后，QRT-PCR就與再發(fā)生相關(guān)了。這將能允許在新鮮組織的數(shù)據(jù)設(shè)置中確定最佳的CEA表達截止值，因為這可能與檔案中的組織的截止值不同。由于新鮮組織的數(shù)據(jù)是初步的和檔案中的組織的分析中的內(nèi)在的問題，特異性和陽性預(yù)測值隨著新鮮組織的分析而提高是可能的。
另外，為了將手術(shù)中的QRT-PCR從手術(shù)床轉(zhuǎn)移到手術(shù)床以外，發(fā)展這一技術(shù)是必須的。在臨床設(shè)備中，QRT-PCR測試必須實驗簡單的和自動的過程，其中的手動過程必須是最少的。最后的目的是發(fā)展一個基于柱體的自動分析信息處理儀。有人預(yù)想，最終的產(chǎn)品將是一個單一用途的，可任意處理的能夠進行RNA分離和定量RT-PCR的柱體。當(dāng)與快速循環(huán)，實時定量熱循環(huán)儀結(jié)合時，這一系統(tǒng)將在不到25分鐘內(nèi)從冷凍切片得到QRT-PCR結(jié)果。在發(fā)展和新的和準(zhǔn)確的標(biāo)記得到鑒定的基礎(chǔ)上，這項技術(shù)也可以用于外科范圍的分子分析以及作為細針抽吸細胞學(xué)的輔助。這樣，第一次外科大夫可以在手術(shù)中得到關(guān)于微轉(zhuǎn)移酶的分子信息和完成切除。另外，可以進行自動的和可再生的QRT-PCR方式允許在標(biāo)準(zhǔn)化的多中心實驗中評估QRT-PCR的真正分子診斷值。
實施例6多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的新方法的描述引言盡管聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)具有巨大的功能并且可變通，這項技術(shù)在臨床診斷實驗室中應(yīng)用的速度是慢的。很大程度上，這是由于PCR過程(從樣品的加工到進行反應(yīng)和數(shù)據(jù)分析)是勞動強度大的，趨于污染的和技術(shù)要求高的方法。結(jié)果是，假陽性和假陰性結(jié)果頻率高，并且構(gòu)成了臨床應(yīng)用中的主要問題。所以，大多數(shù)臨床診斷實驗室仍然進行少數(shù)的內(nèi)部合法的，基于PCR的測試方法用于各種應(yīng)用中，如病毒檢測和白血病患者中的最小殘留疾病檢測。簡化的并且如果可能，使PCR過程自動的技術(shù)發(fā)展將能大大增強這些測試方法的可再生性和可依賴性。
一項這樣的技術(shù)的發(fā)展，引入快速循環(huán)的，定量PCR儀器，打開了新的分子測試方法的潛在用途。在不到30分鐘內(nèi)完成PCR測試方法的能力現(xiàn)在可以是進行依賴時間的護理分子診斷的點成為可能，如測試懷孕的婦女中B組鏈球菌和無免疫應(yīng)答的患者中的醫(yī)院感染因子。在癌癥診斷中，這樣的快速測試使當(dāng)患者在外科手術(shù)時間仍然在臨床的腫瘤狀態(tài)中時在核心活體檢查或細針抽吸(FNA)的基礎(chǔ)上進行初級癌癥診斷以確定對化學(xué)治療的應(yīng)答和手術(shù)中測試淋巴結(jié)和外科范圍確定疾病的程度和選擇治療成為可能。例如，逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)已經(jīng)顯示，在許多研究中，可以提高出現(xiàn)結(jié)陰性時期的癌癥患者的淋巴結(jié)中進行癌癥細胞檢測的敏感度。這些患者的疾病再發(fā)生危險很高，可以受益于更攻擊性的治療。有縱隔淋巴結(jié)參與的患者可以受益于新的輔助化學(xué)治療，但淋巴結(jié)狀態(tài)仍然需要在主要的外科手術(shù)干預(yù)之前確定。這可以提高最小的侵入性外科手術(shù)活著超聲波指導(dǎo)的FNA來完成。準(zhǔn)確的手術(shù)中淋巴結(jié)診斷將允許陰性患者進行完全的腫瘤切除，而在結(jié)陽性患者中外科手術(shù)將停止允許給予化學(xué)治療。同樣的方案存在于胸癌或黑素瘤患者中。在兩種疾病中，崗哨淋巴結(jié)陽性率導(dǎo)致進行完全的淋巴結(jié)解剖。
因為目前的手術(shù)中的淋巴結(jié)分析方法不是非常敏感的(胸癌中-70％(Weiser MR，Montgomery LL，Susnik B，Tan LK，BorgenPI，Cody RS，胸癌中的崗哨淋巴結(jié)的常規(guī)手術(shù)中的冷凍切片檢測，Ann Surg Oncol.2000；7651-5)和黑素瘤中47％(FitzgeraldRC，Triadafilopoulos G.當(dāng)前Barrett食管中的分子鑒定的進展，Dig.Dis.1998；1663-80.))。許多患者沒有診斷為淋巴結(jié)陽性，直到在外科手術(shù)后。然后，這些患者不得不進行第二次外科手術(shù)完成淋巴結(jié)的解剖。更敏感的，手術(shù)中的淋巴結(jié)評估將顯然對這些患者有益。這一例子說明了，除了其他，基于快速PCR測試方法只有一個潛在的用途可能在不遠的將來是即將可用的。但是，又一次，PCR技術(shù)需要發(fā)展使這些令人激動的可能用途在臨床診斷實驗室得到實踐。
由于不需要PCR后的加工和凝膠電泳，最近介入的基于熒光的PCR，和RT-PCR已經(jīng)大大地簡化了數(shù)據(jù)分析。這一技術(shù)的其他優(yōu)點包括降低測試的污染(因為PCR試管從不打開)，和得到高度準(zhǔn)確和可再生的定量結(jié)果的能力。定量不僅增強了許多潛在的診斷的測試方法的臨床用途，而且提供了利用外部定性對照標(biāo)準(zhǔn)從一個測試到一個測試方法中證實測試方法的敏感度和可再生性。內(nèi)部質(zhì)量對照也是需要的，包括擴增內(nèi)源對照序列，檢測模板DNA或RNA的質(zhì)和量，和擴增內(nèi)部陽性對照證實測試方法在陰性結(jié)果的情況中能進行。當(dāng)這些“內(nèi)部”對照可以真正在分開的試管中進行時，如果所有測試可以在同一PCR試管中進行(多重)，利用不同色的熒光原探針區(qū)別PCR產(chǎn)物，將是十分有利的。不幸的是，當(dāng)擴增的靶在反應(yīng)開始時不是以相似的豐度存在時，標(biāo)準(zhǔn)的多重PCR將不能很好地進行，并且在大范圍的靶濃度中維持準(zhǔn)確的定量是特別困難的。通過嚴重限制PCR反應(yīng)中的跟豐富的基于的PCR引物濃度，可以將定量多重反應(yīng)的動力學(xué)范圍提高到一定的程度。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR測試方法中這一途徑可以合理地進行時，引物限制與快速PCR測試方法的要求相抵觸，快速PCR測試中維持擴增必須更高的引物濃度。此處，對與單倍的PCR相同的敏感性和定量動力學(xué)范圍的多重PCR敘述的一個方法，該方法也可以在快速RT-PCR反應(yīng)中進行。此處證實，這一方法可以用于多個不同的擴增靶，并且在加入了合成的寡聚核苷酸模擬物后，它提供了內(nèi)部控制的，快速的多重QRT-PCR。此處，通過檢測食管癌和黑素瘤患者的淋巴結(jié)中的腫瘤細胞證實了癌癥診斷中這一方法的價值。這一快速的，手術(shù)中的QRT-PCR最終可以用于更準(zhǔn)確的手術(shù)中的癌癥分時期，并且所以導(dǎo)致了更適當(dāng)?shù)暮透袝r間性的癌癥患者的治療。
材料和方法通過Pittsburgh大學(xué)IRB同意的方案得到所有患者的組織樣品。在液氮中快速冷凍來自有食管癌的患者的淋巴結(jié)和良性淋巴結(jié)(偶然從進行抗回流手術(shù)的患者中得到)，并且根據(jù)制造商的方案利用Rneasy Mini試劑盒(Qiagan，Valencia CA)萃取RNA。從黑素瘤患者得到組織學(xué)陽性和陰性淋巴結(jié)作為甲醛固定的和石蠟包埋的歸檔樣品，利用前面所述的方案萃取RNA(Godfrey TE，Kim SH，Chavira M，Ruff DM，Warren RS，Gray JW，Jensen RH，利用5’核酸酶定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從甲醛固定的，石蠟包埋的組織進行定量的mRNA表達分析，J.Mol.Diagn.2000284-91)。
快速PCR測試方法的發(fā)展最初利用來自從人結(jié)腸總RNA作為模板合成的cDNA測試快速PCR。用大小81和77個堿基對的擴增子將β-葡糖醛酸酶(β-gus)和癌胚抗原(CEA)的PCR引物和探針設(shè)計成cDNA特異的。避免了CEA的已知假基因，并且對200ng的基因組DNA的對照PCR是陰性的。在含有800nmol/L的各個引物，200nmol/L的各個探針的25uL反應(yīng)物中(引物和探針序列表示在表9)和PCR主混合物中(1Xplatinum Taq反應(yīng)緩沖液，4.5mmol/L MgCl2，300umol/L各個dNTP和0.09U/uL PlatinumTaq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad CA)中進行PCR。在CepheidSmartcyclerTM(Cepheid，Sunnyvale，CA)上進行測試，并且用Smartcycler軟件1.2b版進行分析。最初，在單一加入cDNA的基礎(chǔ)上測試PCR變性(95℃)，時間10，7，5，2和1秒，和退火/延長(64℃)，時間30，15，10，7，5和3秒。然后，利用最佳的快速PCR循環(huán)條件(1秒變性接著6秒退火/延長)比較快速PCR方案和更常規(guī)的循環(huán)時間，10秒變性和30秒退火/延長。這是針對系列稀釋的CEA標(biāo)準(zhǔn)曲線進行的，以便確定快速PCR方案的任何對大范圍的CEA加入的影響。在β-gus模板(純化的β-gusPCR產(chǎn)物)的恒定背景中，以經(jīng)驗確定得到19到20個循環(huán)之間的β-gus循環(huán)閾值(Ct)的量系列稀釋(8X)CEA cDNA。進行相同的實驗使酪氨酸酶測試最佳化和合理化。
表9引物和探針序列
*C和U改變到它們的丙炔嘧啶部分。
快速逆轉(zhuǎn)錄測試方法的發(fā)展。RT-PCR中加入的RNA是從A549肺腺癌細胞系得到的400ngRNA和從有轉(zhuǎn)移食管腺癌的淋巴結(jié)得到的25ngRNA的混合物。在含有如上所述的PCR主混合物，和60nmol/Lβ-gus和CEA RT引物， 1uLSensiScript逆轉(zhuǎn)錄酶(Qiagen)和0.8U/ul Rnase抑制劑的25uL體積中對β-gus和CEAmRNA進行RT-PCR反應(yīng)。在48℃，20.5uL體積中進行RT-PCR反應(yīng)，在4.5uL體積的反應(yīng)混合物中，在保持70℃的過程中加入PCR引物和探針，接著進行RT。這是為了維持PCR特異性和敏感性進行的。利用30，10，7，5，3和2分鐘進行RT測試確定最快的RT，盡可能不損失敏感性。
多重PCR測試方法在溫度控制的多重反應(yīng)中，在反應(yīng)混合物中加入CEA和β-gus的引物和探針系列。但是，在這種情況中，再設(shè)計β-gus引物(β-gus-80，400nmol/L)，使具有與CEA引物Tm 60℃比較，Tm為50℃。用1秒的變性，4秒保持在53℃退火和6秒保持在64℃延長進行PCR，并且進行光學(xué)讀數(shù)(總的退火/延長時間10秒)。在β-gus擴增圖線達到閾值后(在分開的單倍反應(yīng)中確定)消除一個循環(huán)的53℃退火步驟，隨后如在最佳的快速PCR單倍測試中進行循環(huán)只有64℃退火/延長。對兩個基因利用800nM的引物進行簡單的多重反應(yīng)，并且利用我們的標(biāo)準(zhǔn)β-gus-81(Tm 60℃)引物系列。利用300nmol/L β-gus-81引物進行常規(guī)引物限制多重反應(yīng)，引物，這一濃度是不導(dǎo)致快速PCR中β-gus Ct值明顯增加(＞1個循環(huán))的最低濃度。利用常規(guī)方法的開始20個PCR循環(huán)進行時，退火/延長時間為10秒，64℃，接著其余的循環(huán)改變到6秒。這是為了更好地刺激用于溫度控制的多重反應(yīng)的條件而進行的，并且允許直接比較該方法。為了確定與單倍反應(yīng)可比的準(zhǔn)確度和動力范圍，對CEA cDNA(如上所述)測試所有三個多重反應(yīng)的方法。
內(nèi)部陽性對照。內(nèi)部陽性對照(IPC)是具有與靶基因(CEA或酪氨酸酶)相同的引物序列但具有不同的內(nèi)部探針序列的DNA寡聚核苷酸(表10)。在IPC中的選擇位點是用脲嘧啶取代胸腺嘧啶而合成的，使高度濃縮的模擬物的污染如果需要可以用脲嘧啶DNA糖基化酶控制。在反應(yīng)主混合物中加入IPC，加入的量是根據(jù)經(jīng)驗確定得到Ct值36-27個循環(huán)的量。然后，如上所述進行快速三倍測試實驗，以便進行有引物限制的多重反應(yīng)(兩倍)，并且加入內(nèi)部對照探針(IC)，濃度為200nmol/L。
表10CEA和酪氨酸酶內(nèi)部陽性對照模擬物 斜體＝基因特異引物位點，黑體＝來自細菌β-葡萄糖苷酶基因的探針序列。
淋巴結(jié)檢測為了證明這一技術(shù)的用途，利用快速的多重QRT-PCR測試來自食管癌和黑素瘤患者的組織學(xué)陽性和陰性淋巴結(jié)。利用三重QRT-PCR(β-gus，CEA或酪氨酸酶和適當(dāng)?shù)哪M物)分析淋巴結(jié)RNA，其中利用了溫度控制的引物限制技術(shù)。如上所述用5分鐘的RT進行逆轉(zhuǎn)錄，接著將加入的PCR引物在70℃保持30秒。在一個預(yù)先的單重進行的實驗中確定β-gus的循環(huán)閾值，使溫度變化可以在多重反應(yīng)中的適當(dāng)?shù)难h(huán)中開始。結(jié)果快速PCR發(fā)展在多重反應(yīng)中利用之前，在多重的實驗中對所有基因分開進行快速的PCR實驗。為了發(fā)展快速PCR實驗，評估了減少變性時間(10，7，5，2，1秒，95℃)和退火/延長時間(30，15，13，10，7，6，3秒，64℃)的影響，以便確定Ct值中的任何可觀察到的變化。對于變性時間實驗，退火/延長時間保持恒定30秒，對于退火/延長時間實驗，變性時間保持恒定10秒。發(fā)現(xiàn)，將變性時間降低到1秒對CEA或β-gus基因的Ct值沒有影響(圖12，組A)。同樣，降低退火/延長時間到5秒對于兩個基因的Ct值的影響最小(約0.5個循環(huán))，而3秒退火/延長時間導(dǎo)致CEA1.1個循環(huán)額Ct的增加和β-gus 1.8個循環(huán)的增加，相比之下對照是30秒的退火/延長(圖12，組B)。所以，對于進一步的實驗，選擇1秒的變性和6秒的退火延長。為了評估快速PCR實驗在大范圍的CEA輸入量時對敏感性和定量的影響，產(chǎn)生了在β-gusPCR靶的恒定背景中的一系列的CEA cDNA稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用這一標(biāo)準(zhǔn)曲線，將快速實驗與更常規(guī)的10秒變性和30秒退火/延長的PCR比較(圖13)?？焖賹嶒瀸?dǎo)致CEA的Ct值平均增加1.6個循環(huán)，β-gus平均增加0.2個循環(huán)。這些增加在點到點之間是一致的，作為結(jié)果，快速實驗的定量能力是與較慢的PCR相同的。利用快速實驗進行40個循環(huán)的總PCR時間是15分鐘，而較慢的PCR方案是48分鐘。
快速逆轉(zhuǎn)錄利用RT-PCR進行快速的基因表達分析要求實驗的逆轉(zhuǎn)錄和PCR是快的。由于這一原因，評估了將逆轉(zhuǎn)錄時間從30分鐘降低到10，7，5，3和2分鐘的效果(圖12，組C)。在這一實驗中，PCR時間保持恒定的2秒變性和15秒退火/延長。結(jié)果顯示，對于β-gus Ct值僅1.1和0.6個循環(huán)，逆轉(zhuǎn)錄是5分鐘，對于CEA，Ct僅1.1和1.8個循環(huán)，2分鐘的逆轉(zhuǎn)錄，這一增加是與30分鐘比較而言的，而這些差異中沒有一個在個別時間點的比較中是明顯的，沒有明顯的期望的趨勢如增加Ct值而時間減少。利用4個不同的RT和PCR參數(shù)可以評估RT和PCR時間對實驗的敏感性的影響(圖14)。再次觀察到有這樣的趨勢，更高的Ct和更短的RT-PCR方案，但在20分鐘的總RT-PCR時間中(5分鐘RT 1/6個PCR)，對于兩個基因Ct的差異只有1.4個循環(huán)，而總RT-PCR有38分鐘(10分鐘RT，10/15個PCR)。
對不同的多重實驗的方法的測試是在相同的CEA稀釋系列中進行的，其中β-gus的背景是恒定的，這一背景也用于發(fā)展快速PCR方法。這一稀釋系列跨越了約12個循環(huán)，相對應(yīng)的，在曲線的第一和最后的點之間起始CEA豐度有4.096倍的差異(圖15，組A)。利用稀釋系列比較各個基因的單倍反應(yīng)和簡單的多重PCR反應(yīng)(圖15，組C)，常規(guī)引物限制多重PCR(組15，組D)和我們的溫度控制，引物限制多重PCR(圖15，組B)。當(dāng)對CEA和β-gus進行簡單的多重反應(yīng)時，系列的5個點中只有開始的3個達到CEA的閾值，而更大豐度的β-gus的反應(yīng)的擴增一致(沒有顯示)。對于常規(guī)引物限制反應(yīng)觀察到了相同的結(jié)果，而溫度控制引物限制產(chǎn)生的結(jié)果差不多與單倍的反應(yīng)的相同。
或許，在用不同技術(shù)可以達到的delta Ct的范圍比CEA濃度的范圍關(guān)系更大(在更大豐度的β-gus基因和CEA靶基因之間的Ct值是有差異的)。在這些實驗中，β-gus Ct在所有實驗中恒定在19到20個循環(huán)之間，所以單倍實驗的稀釋系列中，最大的deltaCt差不多是15個循環(huán)(在豐度上約32,000倍的不同)。圖16顯示，delta Ct的圖是針對三個多重反應(yīng)方法以及單倍反應(yīng)的數(shù)據(jù)的每一個的。在簡單的多重反應(yīng)中，系列中的三個點具有38.5個循環(huán)的Ct值，相比之下在單倍反應(yīng)中的相同的點是29.0，而隨后的點不能完全擴增。所以，簡單的多重反應(yīng)證明，沒有delta真正Ct值約8個循環(huán)的量，并且動力范圍非常有限。常規(guī)引物限制多重反應(yīng)進行得稍微好些(三個稀釋點的deltaCt是4.0個循環(huán)，比單倍反應(yīng)更高)，但又一次，稀釋點4和5不能擴增。所以，似乎盡管標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中有靈活性，常規(guī)引物限制還是不能補充快速實驗方法，因為其中要求引物濃度增高。在比較中，溫度控制多重反應(yīng)擴增了所有稀釋系列中的點，deltaCt值直到最后的點都沒有觀察到差異。這些結(jié)果明顯證明了，在快速Q(mào)PCR實驗中，溫度控制引物限制是可以與單倍反應(yīng)比較的，而所有其他多重反應(yīng)途徑仍然是不合適的。另外，這一技術(shù)已經(jīng)在其他靶上如酪氨酸酶中利用，該方法似乎是容易適應(yīng)新的靶的。
利用快速，多重RT-PCR進行淋巴結(jié)分析對于淋巴結(jié)分析，多重反應(yīng)中包括CEA和酪氨酸酶的內(nèi)部陽性對照模擬物。這一內(nèi)部控制的，快速RT-PCR多重反應(yīng)用于評估來自食管癌患者和黑素瘤患者的淋巴結(jié)，以及來自沒有癌癥的患者的良性淋巴結(jié)。在三個組織陽性食管癌淋巴結(jié)中，檢測了高水平的CEA表達。在來自非癌癥患者的淋巴結(jié)中，5個結(jié)中有2個沒有可檢測水平的CEA表達，其余三個有低水平的CEA表達(圖17)。另外，在檢測CEA信號的情況中，內(nèi)部陽性對照沒有擴增(圖18，組A)。但是，在CEA陰性樣品中，由于沒有CEA表達和不是失敗的CEA PCR，存在確實是陰性結(jié)果的CEA內(nèi)部陽性對照的擴增(圖18，組B)。利用酪氨酸酶mRNA作為癌癥標(biāo)記，黑素瘤結(jié)中得到了相似的結(jié)果。測試了黑素瘤中的5個組織學(xué)陽性的淋巴結(jié)和沒有任何癌癥跡象的5個淋巴結(jié)。在所有組織學(xué)陽性結(jié)中檢測到高水平的酪氨酸酶，在5個陰性結(jié)中只有一個有非常低水平的酪氨酸酶(數(shù)據(jù)沒有顯示)。在陽性結(jié)中，酪氨酸酶的表達比β-gus更高，并且作為結(jié)果只有酪氨酸酶基因擴增是可以看到的。在所有5個陰性結(jié)中，都看到了β-gus和IPC的擴增(圖18，組C和D)。
討論能夠?qū)崟r根據(jù)熒光進行定量的快速循環(huán)PCR的儀器的引入已經(jīng)打開了分子診斷實驗在臨床狀況中的應(yīng)用，其中時間是限定的，或其中的快速結(jié)果對患者是有心理或物理的益處的?？焖俜肿訉嶒灴赡苡袃?yōu)勢的一種情況是惡性腫瘤，如黑素瘤，胸癌和肺癌的情況下在手術(shù)中將淋巴結(jié)分時期。冷凍組織切片的常規(guī)分析是非?？斓?在大多數(shù)情況中約20分鐘)，但這一技術(shù)的敏感性在檢測小的腫瘤病灶時是非常低的。另外，許多組織學(xué)檢測分為淋巴結(jié)陰性時期的患者有疾病的再發(fā)生，這可能是隱藏腫瘤細胞被常規(guī)檢測遺漏的結(jié)果。有許多跡象表明，RT-PCR和特定的定量RT-PCR可以檢測這些隱藏細胞，并且可以鑒定有高危險再發(fā)生的患者。如果這一信息可以在手術(shù)中發(fā)現(xiàn)，外科大夫?qū)⒛軌蜃鞒鲂畔⒏敿毜年P(guān)于輔助治療和切除范圍的要求的治療決定。
已經(jīng)表明，在手術(shù)中時間框架內(nèi)進行QRT-PCR是易行的，并且這項技術(shù)可以比冷凍切片更優(yōu)異，并且至少可以與甲醛固定的組織學(xué)比較。在現(xiàn)有的實施例中，這些快速Q(mào)RT-PCR方案被測試了，并且有顯示，這一整個測試過程可以在20分鐘內(nèi)進行。這一時間框架是適于手術(shù)中的測試過程的，但在確認快速Q(mào)RT-PCR可以在臨床診斷中應(yīng)用之前仍然有幾個實踐和技術(shù)上的障礙需要解決。相信，測試方法必須標(biāo)準(zhǔn)化，從而允許在多中心實驗的位點之間進行數(shù)據(jù)比較，必須自動化(包括RNA分離)來消除依賴手術(shù)人的可變性和污染，并且必須控制實驗的所有方面包括內(nèi)部的內(nèi)源和外源陽性對照。
這些要求中較遲的質(zhì)量控制必須在快速Q(mào)RT-PCR中加入多重反應(yīng)。至少需要兩個對照反應(yīng)，證實RNA的存在，適當(dāng)?shù)牧亢唾|(zhì)的內(nèi)源對照基因和證實在陰性靶基因表達的樣品中以適當(dāng)敏感度起作用的靶QRT-PCR的外部陽性對照。這兩個對照一起保證了陰性結(jié)果是真陰性而不是失敗的RT-PCR的結(jié)果。所以，至少需要三重的PCR反應(yīng)。不幸的是，甚至在標(biāo)準(zhǔn)的慢的PCR實驗中，維持多重PCR中的量也是不容易的。這是因為積累一個PCR產(chǎn)物(來自最豐富的靶基因)抑制了其他靶的擴增。
最初，這一抑制可以看作與單重反應(yīng)比較時，循環(huán)閾值向更高的循環(huán)數(shù)的轉(zhuǎn)變和總熒光的下降(圖15，組A，C和D)。但是，如果兩個基因的豐度的差異太大，較小豐度的基因?qū)⒉荒芡耆珨U增。所以，典型的多重反應(yīng)沒有量，動力范圍很小。抑制較少豐度的靶序列可能是幾個因素的結(jié)果，包括DNA合成過程中核苷酸的加入釋放的焦磷酸，和積累PCR產(chǎn)物對Taq酶的抑制/扣留。克服這一抑制的一個方法是在已經(jīng)檢測到信號后不久和焦磷酸和PCR產(chǎn)物積累足夠引起抑制之前，一定程度地終止較大豐度的基因的擴增。為此，常規(guī)的方法是依賴對更大豐度的靶基因的引物濃度加以限制使引物利用起來的同時，這一特異靶的PCR在抑制發(fā)生之前終止。雖然PCR測試實驗中，這一方法應(yīng)用得相當(dāng)好，但在快速實驗中降低引物濃度導(dǎo)致PCR效率較低，甚至PCR完全失敗。在我們的研究中，不改變β-gus的循環(huán)閾值的最低引物濃度被確定了，并且利用快速PCR方法，在常規(guī)引物限制實驗中進行了測試。一方面證明了這比沒有引物限制的多重反應(yīng)稍微進步，但另一方面與單重反應(yīng)比較，定量和動力學(xué)范圍仍然不佳。這本文所述的方法中，設(shè)計了比靶基因(CEA或酪氨酸酶)更低的溫度時起作用的更大豐度的基因類型(β-gus)的引物的熔化溫度(Tm)。PCR本身是分兩個時期進行的。PCR的第一時期的退火步驟是在相當(dāng)?shù)偷耐嘶饻囟认逻M行的(在這一實施例中是53℃)，直到更大豐度的基因類型的擴增曲線達到檢測閾值。在這之后，PCR的第二時期在至少比低溫引物的Tm高10℃的退火溫度下進行的(這一實施例中是64℃)。第二時期的較高的溫度使低溫β-gus PCR引物的結(jié)合狀態(tài)向有利于單鏈的狀態(tài)轉(zhuǎn)變，有效地終止了β-gus的擴增，而CEA靶的擴增仍然是不受抑制的。所以，維持較大豐度的對照基因的快速PCR需要的高引物濃度，并且仍然維持靶基因的大動力范圍下的量是可能的。
除了發(fā)展快速多重反應(yīng)技術(shù)，加入了可以用于證明靶基因表達陰性的樣品中達到了適當(dāng)?shù)腞T-PCR敏感度的內(nèi)部陽性對照模擬物。這一模擬物利用了與靶基因相同的引物，從而控制了這些寡聚核苷酸的功能。DNA模擬物可以用也包括逆轉(zhuǎn)錄引物位點的RNA模擬物來替代。然后，這樣將控制靶基因擴增的RT和PCR步驟。通過在樣品中以足夠低至產(chǎn)生大于35個循環(huán)的Ct值的濃度加入這一模擬物，可以保證，RNA分離和RT-PCR反應(yīng)不僅可以進行而且進行得足夠好到能檢測到存在的非常低豐度的靶基因。在靶基因高度表達的情況中，內(nèi)部模擬物可能不能擴增。這是可以接受的，因為模擬物只是打算作為陰性反應(yīng)的對照的。
所以，在癌癥患者的淋巴結(jié)中檢測轉(zhuǎn)移腫瘤細胞的快速Q(mào)RT-PCR的潛在用途已經(jīng)顯示出來。雖然這是一個特別激動人的快速分子診斷用途，但它僅僅是一個潛在的應(yīng)用。由于新的癌癥標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，也將快速Q(mào)RT-PCR用于手術(shù)中分析外科邊緣，臨床中分析活體檢測樣本，或細針抽吸或分析初級腫瘤預(yù)測對化學(xué)治療或新的活體治療如酪氨酸激酶抑制劑的應(yīng)答也是可能的。雖然雙重溫度PCR循環(huán)需要溫度控制的多重反應(yīng)，并且在整個反應(yīng)時間中加了約2分鐘，但完全的多重的QRT-PCR實驗仍然可以在22分鐘內(nèi)進行。在SmartCyclerTM，或它將來的新生代中加入內(nèi)部冷卻步驟，可以相信能另外節(jié)省3-4分鐘。同樣，在現(xiàn)有的工作中，需要開始溫度變化的循環(huán)數(shù)是預(yù)定的。最終，在儀器的軟件中，小小的修改將自動增加內(nèi)源對照基因熒光達到閾值后的PCR退火溫度。因為所有的PCR位點是分別控制的，這將允許同時進行多重翻譯，而開始RNA模板的量是未知的。最后，快速Q(mào)RT-PCR現(xiàn)在在臨床設(shè)備中已經(jīng)變得可利用了。利用目前正在發(fā)展的技術(shù)，RNA分離也可以在自動的方法中非?？斓剡M行。最后，根據(jù)一系列的程序化步驟，完全整合的RNA分離，逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR儀器，如Cepheid’s GenXpertTM將自動化，所有這些在30分鐘內(nèi)發(fā)展和提供了一個QRT-PCR結(jié)果?？焖俚?，內(nèi)部控制的多重技術(shù)與自動化樣品加工平臺的結(jié)合將允許在封閉的環(huán)境中進行準(zhǔn)確的和仍然加速的測試過程。這一整合系統(tǒng)的簡單和敏感性應(yīng)該能使癌癥診斷中應(yīng)用許多新的分子測試。
本說明書中的專門利用的各種范圍中的許多值，除非特別說明，都是近似值，盡管所述范圍的最小和最大值都有“大約”在前。這樣的方式下，在所述范圍或上或下的輕微變化可以用于獲得與范圍內(nèi)的值基本相同的結(jié)果。同樣，公開這些范圍是打算作為連續(xù)的范圍，包括最小和最大值之間的每個值。
序列表<110>匹茲堡大學(xué)托尼·E·戈德弗里詹姆斯·D·盧克蒂奇西瓦·拉杰洛瑞·A·凱利西德內(nèi)·D·芬凱利斯特因<120>PCR方法<130>010211<150>60/273.277<151>2001-03-02<160>25<170>專利版本3.1<210>1<211>2975<212>DNA<213>人工序列<400>1ctcagggcag agggaggaag gacagcagac cagacagtca cagcagcctt gacaaaacgt60tcctggaact caagctcttc tccacagagg aggacagagc agacagcaga gaccatggag120tctccctcgg cccctcccca cagatggtgc atcccctggc agaggctcct gctcacagcc180tcacttctaa ccttctggaa cccgcccacc actgccaagc tcactattga atccacgccg240ttcaatgtcg cagaggggaa ggaggtgctt ctacttgtcc acaatctgcc ccagcatctt300tttggctaca gctggtacaa aggtgaaaga gtggatggca accgtcaaat tataggatat360gtaataggaa ctcaacaagc taccccaggg cccgcataca gtggtcgaga gataatatac420cccaatgcat ccctgctgat ccagaacatc atccagaatg acacaggatt ctacacccta480
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<223>β-gus RT引物<400>2tttggttgtc tctgccgagt 20
<210>3<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>β-dus正向PCR引物<400>3ctcatttgga attttgccga tt 22<210>4<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>β-gus反向引物<400>4ccgagtgaag atcccctttt ta 22<210>5<211>26<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>β-gus taqman探針<400>5tgaacagtca ccgacgagag tgctgg 26<210>6<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>β-dus正向PCR引物
<400>6agacaatcac agtctctgcg ga 22<210>7<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>CEA反向PCR引物<400>7atccttgtcc tccacgggtt20<210>8<211>26<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>CEATaqman探針<400>8caagccctcc atctccagca acaact 26<210>9<211>16<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>CEA RT引物<400>9gtgaaggcca cagcat16
<210>10<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>18SrRNS Taqman探針<400>10tgctggcacc agacttgccc tc 22<210>11<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>18SrRNA正向PCR引物<400>11ccctgtaatt ggaatgagtc cac23<210>12<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>18SrRNA反向PCR引物<400>12gctggaatta ccgcggct 18<210>13<211>19<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>18SrRNA正向-低溫-PCR引物<400>13ccctgtaatt ggaatgagt 19<210>14<211>15<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>18SrRNA反向-低溫PCR引物<400>14gctggaatta ccgcg 15<210>15<211>16<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>B-gus RT引物<400>15tggttgtctc tgccga16<210>16<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>B-gus正向PCR引物-低溫<400>16ctcatttgga attttgcc 18
<210>17<211>17<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>B-gus反向引物-低溫<400>17cgagtgaaga tcccctt 17<210>18<211>15<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>CEAtaqman探針<220>
<221>misc_特征<222>(15)..(15)<223>脲嘧啶殘基<220>
<221>misc_特征<222>(4)..(4)<223>脲嘧啶殘基<400>18agcngcccaa gcccn 15<210>19<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>酪氨酸酶正向PCR引物<400>19acttactcag cccagcatca ttc23<210>20<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>酪氨酸酶反向PCR引物<400>20actgatggct gttgtactcc tcc23<210>21<211>29<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>酪氨酸酶Taqman探針<400>21tctcctcttg gcagattgtc tgtagccga 29<210>22<211>17<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>酪氨酸酶RT引物<400>22cgttccattg cataaag 17
<210>23<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Internal control probe<400>23agcatcatcc tctgcatggt caggtcat 28<210>24<211>77<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>CEA mimic-Intemal Control<400>24agacaatcac agtctctgcg gaagcatcat cctctgcatg gtcaggtcat aactccaaac60ccgtggagga caaggat 77<210>25<211>77<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Iyrosinase mimic-Internal Control Probe<220>
<221>misc_特征<222>(7)..(7)<223>脲嘧啶殘基
<220>
<221>misc_特征<222>(18)..(18)<223>脲嘧啶殘基<220>
<221>misc_特征<222>(62)..(62)<223>脲嘧啶殘基<220>
<221>misc_特征<222>(73)..(73)<223>脲嘧啶殘基<400>25acttacncag cccagcanca ttctagcatc atcctctgca tggtcaggtc atttggagga60gnacaacagc cancagt 77
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)66.權(quán)利要求65所述的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是在約2分鐘中進行的。
67.包括SEQ ID NOS6，7，13，14，16，17，19，20和23-35的寡聚核苷酸和其衍生物。
68.一種手術(shù)中的PCR診斷方法，包括步驟(a)從手術(shù)中的病人得到組織樣品；(b)根據(jù)權(quán)利要求1的方法分析樣品；(c)如果指示轉(zhuǎn)錄物的表達超過閾值水平，進行測定；和(d)根據(jù)分析步驟的結(jié)果推斷的方法進行手術(shù)。
69.一種手術(shù)中的PCR診斷方法，包括步驟(a)從手術(shù)中的病人得到組織樣品；(b)根據(jù)權(quán)利要求60的方法分析樣品；(c)如果指示轉(zhuǎn)錄物的表達超過閾值水平，進行測定；和(d)根據(jù)分析步驟的結(jié)果推斷的方法繼續(xù)手術(shù)。
70.一種手術(shù)中的PCR診斷方法，包括步驟(a)從手術(shù)中的病人得到組織樣品；(b)根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法分析樣品；(c)如果指示轉(zhuǎn)錄物的表達超過閾值水平，進行測定；和(d)根據(jù)分析步驟推斷的方法繼續(xù)手術(shù)。
71.一種快速檢測惡性腫瘤的方法，包括步驟a)從腫瘤活體檢測樣本樣本得到核酸；b)根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，對核酸進行特異于指示轉(zhuǎn)錄物的PCR方法；和c)如果指示轉(zhuǎn)錄物的表達超過閾值水平，進行測定，指示惡性腫瘤。
72.權(quán)利要求71所述的方法，其中指示轉(zhuǎn)錄物是CEA。
73.一種用于自動PCR系統(tǒng)的柱體，包括含有第一個PCR引物套和第二個PCR引物套的一個或多個艙，第一個PCR引物套和第二個PCR引物套是在相同或不同的艙中。
74.權(quán)利要求73所述的柱體，包括含有第一個PCR引物套的第一個艙和包括第二個PCR引物套的第二個艙。
75.權(quán)利要求73的柱體，其中第一個PCR引物套具有第一個有效的Tm，第二個PCR引物套具有與第一個有效的Tm不同的有效Tm。
76.權(quán)利要求73所述的柱體，進一步包括第三個艙，其中含有逆轉(zhuǎn)錄試劑，細胞溶解試劑和RNA純化試劑中的一個。
77.一種快速檢測轉(zhuǎn)移的食管腺癌的方法，包括步驟(a)從崗哨淋巴結(jié)得到RNA；(b)對RNA進行特異于CEA的定量RT-PCR方法；和(c)如果CEA的表達超過閾值水平，進行測定。
權(quán)利要求
1.一種多重PCR反應(yīng)的方法，包括在PCR反應(yīng)混合物中，在DNA樣品上進行PCR擴增的步驟，潛在PCR擴增是在開始的擴增時期和第二個擴增時期進行的，各個擴增時期包括一個或多個PCR循環(huán)，各個PCR循環(huán)包括變性步驟，退火步驟和延長步驟，這些步驟可以在與退火步驟相同的溫度下進行，其中第二個擴增時期的PCR擴增是在與第一個擴增時期不同的反應(yīng)條件下進行的，可以調(diào)節(jié)第一個引物套的第一個擴增子和第二個引物套的第二個擴增子在第一個和第二個擴增時期的生產(chǎn)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中第二個引物套在開始第二個擴增時期加入到反應(yīng)混合物中。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中第一個PCR引物套和第二個PCR引物套中的一個產(chǎn)生了特異于β-gus特異擴增子，和18SrRNA特異擴增子，CEA特異擴增子和酪氨酸酶特異擴增子中的一個。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中第一個PCR引物套和第二個PCR引物套中的一個包括SEQ ID NOS3，4，6，7，11，12，13，14，16，17，19，和20或其他衍生物中的一個序列。
5.權(quán)利要求3的方法，其中第一個PCR引物套和第二個PCR引物套中的一個包括SEQ ID NOS3，4，6，7，11，12，13，14，16，17，19和20或它們的衍生物中的一個引物。
6.權(quán)利要求3的方法，其中第一個PCR引物套和第二個PCR引物套中的一個包括SEQ ID NO3，4，6，7，11，12，13，14，16，17，19和20中的一個引物。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中反應(yīng)混合物包括DNA樣品，第一個引物套具有第一個有效Tm，第二個引物套具有與第一個有效Tm不同的第二個有效Tm，其中第一個擴增時期的退火步驟是在與第二個擴增時期不同的溫度下進行的。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中第一個擴增時期和第二個擴增時期中至少一個時期的PCR循環(huán)的退火步驟和延長步驟是在相同的溫度下進行的。
9.權(quán)利要求7所述的方法，其中第一個擴增時期和第二個擴增時期中至少一個時期的PCR循環(huán)中的退火和延長步驟是在不同的溫度下進行的。
10.權(quán)利要求7所述的方法，其中第一個引物套產(chǎn)生β-GUS特異擴增子，第二個引物套產(chǎn)生CEA特異擴增子，第一個引物套的Tm約比第二個引物套低10℃，第一個擴增時期的PCR擴增的退火溫度約比第二個擴增時期的PCR擴增的退火溫度低10℃。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中第一個PCR引物套包括SEQID NOS16和17，第二個引物套包括SEQ ID NOS6和7，第一個擴增時期的PCR擴增的退火溫度約等于53℃，第二個擴增時期的PCR擴增的退火溫度約等于64℃，根據(jù)是兩個PCR引物套的最初引物濃度約400nM/L，第一個PCR引物套的有效Tm約50℃，第二個PCR引物套的有效Tm約60℃。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中各個循環(huán)的變性步驟約1秒。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中各個循環(huán)的變性步驟小于1秒。
14.權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括在第一個擴增時期增強和在反應(yīng)混合物中加入PCR引物之前對RNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，產(chǎn)生反應(yīng)混合物的DNA樣品的DNA。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是在不到10分鐘內(nèi)進行的。
16.權(quán)利要求14所述的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是在約2分鐘內(nèi)進行的。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中內(nèi)部陽性對照RNA和內(nèi)部陽性對照DNA中的一個加入到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。
18.權(quán)利要求1所述的方法，其中內(nèi)部陽性對照DNA加入到PCR反應(yīng)混合物中。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中內(nèi)部陽性對照DNA包括SEQID NOS23-25或它的衍生物中的一個序列。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其中內(nèi)部陽性對照DNA含有一個或多個脲嘧啶殘基。
21.權(quán)利要求1所述的方法，其中擴增時期包括利用熒光報道物進行定量PCR反應(yīng)，指示了特異擴增子的積累。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中定量PCR反應(yīng)是熒光5’核酸酶測試方法。
23.權(quán)利要求21所述的方法，其中熒光報道物是分子光束。
24.權(quán)利要求1所述的方法，其中提供一個或多個反應(yīng)混合物的試劑用于適當(dāng)構(gòu)成的柱體中的反應(yīng)混合物中，用于自動系統(tǒng)中。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中柱體是在一次使用中可任意處理的。
26.權(quán)利要求24所述的方法，其中柱體含有其他試劑或可獨立艙化的機械成分和反應(yīng)混合物的試劑，加入的試劑和機械成分適于一個細胞或組織的溶解，RNA純化和逆轉(zhuǎn)錄。
27.權(quán)利要求24所述的方法，其中擴增步驟包括利用熒光報道物定量PCR反應(yīng)，顯示特異擴增子的積累，該自動系統(tǒng)自動將PCR從第一個擴增時期轉(zhuǎn)移到第二個擴增時期，此時熒光報道物在反應(yīng)混合物中積累到閾值水平。
28.權(quán)利要求1所述的方法，其中第一和第二個時期是在相同的反應(yīng)容器中按順序進行的。
29.權(quán)利要求1所述的方法，其中預(yù)期，DNA樣品的第一個引物套和第二個引物套的靶序列數(shù)目至少有30-100倍的差異。
30.一種多重PCR反應(yīng)的方法，包括在第一個時期和第二個時期，對PCR反應(yīng)混合物進行PCR擴增，反應(yīng)混合物包括DNA樣品，第一個引物套具有第一個有效Tm，第二個引物套具有與第一個有效Tm不同的有效Tm，各個擴增時期包括一個或多個PCR循環(huán)，各個PCR循環(huán)包括變性步驟，退火步驟和延長步驟，這些步驟可以在相同的溫度下進行，如退火步驟，其中第一個擴增時期的退火步驟是在與第二個擴增時期不同的溫度下進行的，可以調(diào)節(jié)在第一個和第二個擴增時期中的第一個引物套的第一個擴增子和第二個引物套的第二個擴增子的產(chǎn)生速度。
31.權(quán)利要求30的方法，其中第一個擴增時期和第二個擴增時期中至少一個時期的PCR循環(huán)中的退火步驟和延長步驟是在相同的溫度下進行的。
32.權(quán)利要求30的方法，其中第一個擴增時期和第二個擴增時期中至少一個的PCR循環(huán)中的退火和延長步驟是在不同的溫度下進行的。
33.權(quán)利要求30的方法，其中第一個引物套的有效Tm和第二個引物套的有效Tm之間的區(qū)別至少約5℃。
34.權(quán)利要求30的方法，其中第一個PCR引物套和第二個PCR引物套中的一個產(chǎn)生β-GUS特異擴增子，和18SrRNA特異擴增子，CEA特異擴增子和酪氨酸酶特異擴增子中的一個。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中第一個引物套和第二個引物套中的一個包括SEQ ID NOS3，4，6，7，11，12，13，14，16，17，19和20或其衍生物中的一個序列的引物。
36.權(quán)利要求34所述的方法，其中第一個PCR引物套和第二個PCR引物套中的一個包括SEQ ID NOS3，4，6，7，11，12，13，14，16，17，19和20或其衍生物中的一個引物。
37.權(quán)利要求34所述的方法，其中第一個PCR引物套和第二個PCR引物套中的一個包括SEQ ID NOS3，4，6，7，11，12，13，14，16，17，19和20或其衍生物中的一個引物。
38.權(quán)利要求30所述的方法，其中第一個擴增時期的退火步驟是在比第二個擴增時期的退火步驟更高的溫度下進行的。
39.權(quán)利要求38所述的方法，其中第一個和第一個引物套中的一個產(chǎn)生β-GUS特異擴增子，CEA特異擴增子，18SrRNA擴增子和酪氨酸酶擴增子中的一個。
40.權(quán)利要求38所述的方法，其中第一個引物套產(chǎn)生β-GUS特異擴增子，第二個引物套產(chǎn)生CEA特異擴增子。
41.權(quán)利要求30所述的方法，其中第一個擴增時期的退火步驟是在不第二個擴增時期的退火步驟更低的溫度下進行的。
42.權(quán)利要求30所述的方法，進一步包括在第一個擴增時期之前和在反應(yīng)混合物中加入PCR引物或熱穩(wěn)定DNA聚合酶之前對RNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟，可以在反應(yīng)混合物的DNA樣品中產(chǎn)生DNA。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是在不到10分鐘的時間中進行的。
44.權(quán)利要求42所述的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是在約2分鐘中進行的。
45.權(quán)利要求42所述的方法，其中內(nèi)部陽性對照RNA和內(nèi)部陽性對照DNA中的一個是加入到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的。
46.權(quán)利要求30所述的方法，其中內(nèi)部陽性對照DNA是加入到PCR反應(yīng)混合物中的。
47.權(quán)利要求46所述的方法，其中內(nèi)部陽性對照RNA包括SEQID NOS23-25的一個序列。
48.權(quán)利要求30所述的方法，其中反應(yīng)混合物中的一個或多個試劑是提供用于適當(dāng)構(gòu)型，在自動系統(tǒng)中使用的柱體中的反應(yīng)混合物的。
49.權(quán)利要求48所述的方法，其中柱體是在一次使用后可任意處理的。
50.權(quán)利要求48所述的方法，其中柱體含有其他試劑或獨立艙化的機械成分，或與反應(yīng)混合物的試劑一起，其他試劑或機械成分適于一個細胞或組織溶解，RNA純化和逆轉(zhuǎn)錄。
51.權(quán)利要求30所述的方法，其中擴增時期包括利用熒光報道物進行定量PCR反應(yīng)，顯示特異擴增子的積累。
52.權(quán)利要求51所述的方法，其中定量PCR反應(yīng)是熒光5’核酸酶測試方法。
53.權(quán)利要求51所述的方法，其中熒光報道物是分子光束。
54.一種PCR方法，包括步驟，進行PCR擴增，PCR擴增包括多個PCR循環(huán)，PCR反應(yīng)混合物中包括核酸樣品，引物套，其中各個引物套的引物的濃度至少約400nM，各個PCR循環(huán)包括變性步驟，退火步驟和延長步驟，可以與退火步驟同時進行，其中PCR擴增產(chǎn)生了β-GUS特異擴增子，18SrRNA特異擴增子，酪氨酸酶特異擴增子，和CEA特異擴增子中的一個。
55.權(quán)利要求54所述的方法，其中引物套包括SEQ ID NOS3，4，6，7，11-14，16，17，19和20的一個引物。
56.權(quán)利要求54所述的方法，其中PCR方法是定量的PCR方法，利用了熒光報道物顯示特異擴增子的積累。
57.權(quán)利要求56所述的方法，其中PCR方法是熒光5’核酸酶測試方法。
58.權(quán)利要求56所述的方法，其中熒光報道物是分子光束。
59.一種RT-PCR方法，包括步驟(a)在不到10分鐘內(nèi)對反應(yīng)混合物中的RNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，產(chǎn)生DNA樣品；(b)在反應(yīng)混合物中加入具有第一個有效Tm的第一個引物套和具有與第一個有效Tm不同的第二個有效Tm的第二個引物套和熱穩(wěn)定DNA聚合酶；和(c)在第一個擴增時期和第二個擴增時期中進行反應(yīng)混合物的PCR擴增，各個擴增時期包括一個或多個PCR循環(huán)，各個PCR循環(huán)包括約1秒或更少的變性步驟，少于約10秒的退火步驟，少于約10秒的延長步驟，可以在相同的溫度下進行，如退火步驟，其中第一個擴增時期的退火步驟是比第二個擴增時期的退火步驟更低的溫度下進行的，可以調(diào)節(jié)第一個引物套的第一個靶序列和第二個引物套的第二個靶序列在第一個和第二個擴增時期的擴增速度，其中第一個靶序列預(yù)期在DNA樣品中的豐度比第二個靶序列的至少約高30倍。
60.一種增加一個管RT-PCR方法的敏感性和特異性的方法，包括步驟(a)在反應(yīng)混合物中對RNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，產(chǎn)生DNA樣品；(b)在反應(yīng)混合物中加入含有PCR引物套和熱穩(wěn)定DNA聚合酶的PCR試劑；和(c)在反應(yīng)混合物中進行PCR擴增。
61.權(quán)利要求60所述的方法，其中在PCR擴增之前，通過物理屏障將PCR試劑組合物從反應(yīng)混合物中分開，物理屏障是在PCR反應(yīng)之前或在第一個循環(huán)過程中除去的，從而在反應(yīng)混合物中加入PCR試劑組合物。
62.權(quán)利要求60的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是在不到10分鐘內(nèi)進行的。
63.權(quán)利要求60所述的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是在約2分鐘內(nèi)進行的。
64.權(quán)利要求60所述的方法，其中RT-PCR方法是在自動系統(tǒng)中進行的，RT-PCR方法的試劑存儲在具有多個艙的柱體中，其中試劑是在用于RT-PCR方法之前存儲的，其中自動系統(tǒng)在根據(jù)程序化的序列在柱體的反應(yīng)容器中加入試劑。
65.一種RT-PCR方法，包括步驟(a)在反應(yīng)混合物中，對RNA樣品，在不到10分鐘的時間內(nèi)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；和(b)對反應(yīng)混合物進行PCR反應(yīng)。
66.權(quán)利要求65中的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進行了約2分鐘。
67.一種包括SEQ ID NOS6，7，13，14，16，17，19，20和23-35之一的寡聚核苷酸，和其衍生物。
68.一種手術(shù)中的PCR診斷方法，包括步驟(a)從手術(shù)中的病人獲取組織樣品；(b)通過權(quán)利要求A的方法分析樣品；(c)如果指示轉(zhuǎn)錄物的表達超過了閾值水平，進行測定；和(d)根據(jù)分析步驟的結(jié)果繼續(xù)進行手術(shù)。
69.一種手術(shù)中的PCR診斷方法，包括步驟(a)從手術(shù)中的病人身上得到組織樣品；(b)通過權(quán)利要求E的方法分析樣品；(c)如果指示轉(zhuǎn)錄物的表達超過閾值水平，進行測定；和(d)根據(jù)分析步驟的結(jié)果推斷的方法繼續(xù)手術(shù)。
70.一種手術(shù)中的PCR診斷方法，包括步驟(a)從手術(shù)中的病人獲取組織樣品；(b)根據(jù)權(quán)利要求B的方法分析樣品；(c)如果指示轉(zhuǎn)錄物的表達超過的閾值水平，進行測定；和(d)根據(jù)分析步驟的結(jié)果推斷的方法繼續(xù)手術(shù)。
71.一種快速檢測惡性腫瘤的方法，包括步驟(a)從腫瘤活體檢測樣本得到核酸；(b)根據(jù)權(quán)利要求A的方法，對該核酸進行特異于指示轉(zhuǎn)錄物的PCR反應(yīng)；和(c)如果指示轉(zhuǎn)錄物的表達超過閾值水平，進行測定，從而指示惡性腫瘤。
72.權(quán)利要求71所述的方法，其中指示轉(zhuǎn)錄物是CEA。
73.一種用于自動PCR系統(tǒng)的柱體，包括含有第一個PCR引物套和第二個PCR引物套的一個或多個艙，第一個PCR引物套和第二個PCR引物套可以在相同的艙中或在不同的艙中。
74.權(quán)利要求73所述的柱體，包括第一個含有第一個PCR引物套的艙和第二個含有第二個PCR引物套的艙。
75.權(quán)利要求73所述的柱體，其中第一個PCR引物套具有第一個有效Tm，第二個PCR引物套具有與第一個有效Tm的第二個有效Tm。
76.權(quán)利要求73的柱體，另外具有第三個艙，包括逆轉(zhuǎn)錄試劑，細胞溶解試劑和RNA純化試劑中的一個。
77.一種快速檢測轉(zhuǎn)移的食管腺癌的方法，包括步驟(a)從崗哨淋巴結(jié)得到RNA；(b)對RNA進行特異于CEA的定量RT-PCR方法；和(c)如果CEA的表達超過閾值水平，進行測定。
全文摘要
提供了平衡的增倍PCR方法的方法。在該方法中，當(dāng)在第一和第二個擴增時期當(dāng)引物的或選物限制地調(diào)節(jié)第一個引物套的第一個擴增子和第二個引物套的第二個擴增子生成的相對速度時，在單個試管中利用兩個或多個成順序的暫時PCR時期有效地分開兩個或多個PCR反應(yīng)。同時提供了在手術(shù)內(nèi)診斷和預(yù)后中發(fā)現(xiàn)特殊用途的快速RT－PCR方法，例如通過確定在崗哨淋巴結(jié)中的瘤胚抗原(CEA)的表達水平，在診斷惡性食管腺癌中發(fā)現(xiàn)的。
文檔編號C12P19/34GK1500151SQ02807671
公開日2004年5月26日 申請日期2002年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月2日
發(fā)明者托尼·E·戈德弗里, 托尼 E 戈德弗里, D 盧克蒂奇, 詹姆斯·D·盧克蒂奇, 拉杰, 西瓦·拉杰, A 凱利, 洛瑞·A·凱利, D 芬凱利斯特因, 西德內(nèi)·D·芬凱利斯特因 申請人:匹茲堡大學(xué)