專利名稱：生產(chǎn)pf1022物質(zhì)衍生物的轉(zhuǎn)化體及其制備方法以及新型生物合成基因的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生產(chǎn)PF1022物質(zhì)衍生物的轉(zhuǎn)化體以及使用該轉(zhuǎn)化體制備PF1022物質(zhì)衍生物的方法。本發(fā)明還涉及參與由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途徑的新型基因。
背景技術(shù)：
PF1022物質(zhì)具有驅(qū)蟲活性，是有望應(yīng)用于藥物、動物藥領(lǐng)域的物質(zhì)。PF1022物質(zhì)是式(I) 所示的環(huán)狀縮肽，已知可通過發(fā)酵法制備(特開平3-35796號)該PF1022物質(zhì)是由L-N-甲基亮氨酸[(CH3)2CHCH2CH(NHCH3)COOH](縮寫H-L-MeLeu-OH)、D-乳酸[CH3CH(OH)COOH](縮寫H-D-Lac-OH)和D-苯基乳酸[C6H5CH2CH(OH)COOH](縮寫H-D-PhLac-OH)通過酯鍵和酰胺鍵連接而構(gòu)成的環(huán)狀縮肽。
另外，PF1022物質(zhì)也可以以式(II)表示。
式(II)環(huán)(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac)關(guān)于PF1022物質(zhì)衍生物，已報道可通過發(fā)酵法制備PF1022B、PF1022C、PF1022D、PF1022E、PF1022F、PF1022G和PF1022H7種衍生物(特開平5-170749號、特開平6-184126號、WO98/05655號)。另外通過化學(xué)合成方法也可以制備具有驅(qū)蟲活性的各種PF1022物質(zhì)衍生物(WO94/19334號、WO97/11064號、特許第2874342號)。其中式(III) 或式(IV)環(huán)(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NO2PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NO2PhLac)[式中，D-p-NO2PhLac表示D-對硝基苯基乳酸。]表示的PF1022物質(zhì)衍生物PF1022-220和式(V)
或式(VI)環(huán)(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NH2PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NH2PhLac)[式中，D-p-NH2PhLac表示D-對氨基苯基乳酸。]表示的PF1022物質(zhì)衍生物PF1022-260不僅其自身具驅(qū)蟲活性，作為其他具有強力驅(qū)蟲活性的PF1022物質(zhì)衍生物的合成原料也是非常有用的物質(zhì)(特許第2874342號)。
不過，PF1022-220和PF1022-260只能通過化學(xué)合成的方法制備。制備像PF1022物質(zhì)那樣具有復(fù)雜的環(huán)狀母核的環(huán)狀縮肽時，發(fā)酵法的制備方法與化學(xué)合成的制備方法相比，通常在實施時，在所需的全部時間、勞力、經(jīng)費及其它方面有利，且便于實施。因此，對于PF1022-220和PF1022-260所代表的PF1022物質(zhì)衍生物，也希望采用直接發(fā)酵法來制備。
本發(fā)明人已將參與由分支酸到對氨基苯丙酮酸的生物合成途徑的基因?qū)肷a(chǎn)具有對位未被含氮原子的官能團取代的苯環(huán)骨架的次級代謝產(chǎn)物的生物中，獲得了轉(zhuǎn)化體，并已進一步確立了使用該轉(zhuǎn)化體制備具有對位被含氮原子的官能團取代的苯環(huán)骨架的次級代謝產(chǎn)物的方法(WO01/23542號)。
發(fā)明概要本發(fā)明人在將WO01/23542號所記載的方法用于生產(chǎn)PF1022物質(zhì)的宿主時，可以證明得到的轉(zhuǎn)化體制備式(VII) 或式(VIII)環(huán)(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NO2PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac)所示的PF1022物質(zhì)衍生物PF1022-268，以及式(IX) 或式(X)環(huán)(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NH2PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac)所示的PF1022物質(zhì)衍生物PF1022-269，但不能證實可制備PF1022-220和PF1022-260。
另一方面，本發(fā)明人從生產(chǎn)PF1022物質(zhì)的生物中誘導(dǎo)了苯丙氨酸營養(yǎng)突變型菌株，用含有參與由分支酸到對氨基苯丙酮酸的生物合成途徑的多個基因的DNA轉(zhuǎn)化該突變菌株，成功地獲得了新型生產(chǎn)PF1022物質(zhì)衍生物PF1022-220和PF1022-260的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明基于上述認(rèn)識。
本發(fā)明的目的在于提供通過直接發(fā)酵法制備PF1022物質(zhì)衍生物、特別是制備PF1022-220和PF1022-260的方法，以及該方法所使用的轉(zhuǎn)化體。
根據(jù)本發(fā)明，提供生產(chǎn)PF1022物質(zhì)衍生物、特別是PF1022-220(式(III))和PF1022-260(式(V))的轉(zhuǎn)化體，所述轉(zhuǎn)化體可通過將參與由分支酸到對氨基苯丙酮酸的生物合成途徑的基因(生物合成基因)導(dǎo)入從生產(chǎn)式(I) 所示的PF1022物質(zhì)的生物中誘導(dǎo)的苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主中而獲得。
根據(jù)本發(fā)明，還提供PF1022物質(zhì)衍生物的制備方法，其特征在于培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體，收集PF1022物質(zhì)衍生物。
本發(fā)明的目的還在于提供與由分支酸到氨基苯丙酮酸的生物合成途徑有關(guān)的新型基因。
本發(fā)明的新型基因是編碼SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列或具有分支酸變位酶活性的其修飾序列的多核苷酸，以及編碼SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列或具有預(yù)苯酸脫水酶活性的其修飾序列的多核苷酸。
附圖簡述

圖1顯示從委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuelae)中分離的DNA片段的限制性酶切圖譜和可讀框(ORF)的位置。
圖2顯示質(zhì)粒pTrc-papA的構(gòu)建。
圖3顯示用于檢出papA基因產(chǎn)物的酶活性的氨基酸分析儀的色譜圖。
圖4顯示質(zhì)粒pTrc-papB的構(gòu)建。
圖5顯示用于檢出papB基因產(chǎn)物的酶活性的氨基酸分析儀的色譜圖。
圖6顯示質(zhì)粒pET-papC1的構(gòu)建。
圖7顯示用于檢出papC基因產(chǎn)物的酶活性的氨基酸分析儀的色譜圖。
圖8顯示質(zhì)粒pPF260-A3和質(zhì)粒pPF260-A4的構(gòu)建。
圖9顯示含有Abp1基因的6kbHindIII片段的限制性酶切圖譜。
圖10顯示質(zhì)粒pABPd的限制性酶切圖譜。
圖11顯示質(zhì)粒pPF260-B3的構(gòu)建。
圖12顯示質(zhì)粒pPF260-C3的構(gòu)建。
圖13顯示XbaI DNA片段的限制性酶切圖譜和分支酸變位酶基因的位置。
圖14顯示質(zhì)粒pCMHRV4的構(gòu)建。
圖15顯示用于檢出PF1022物質(zhì)衍生物PF1022-220的HPLC色譜圖。A顯示PF1022-220標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖、B顯示從轉(zhuǎn)化體中制備的試樣的色譜圖、C顯示從轉(zhuǎn)化體中制備的試樣和PF1022-220標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。
圖16顯示用于檢出PF1022物質(zhì)衍生物PF1022-260的HPLC色譜圖。A顯示PF1022-260標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖、B顯示從轉(zhuǎn)化體中制備的試樣的色譜圖。
圖17顯示從PF1022菌株(FERM BP-2671)的基因組DNA中分離的SacI片段的限制性酶切圖譜和PDT基因的位置。
圖18顯示質(zhì)粒pDPDT的限制性酶切圖譜。
圖19顯示用于檢出PF1022物質(zhì)衍生物PF1022-220的HPLC色譜圖。A顯示從TF-57菌株中制備的試樣的色譜圖、B顯示從TF-45菌株中制備的試樣的色譜圖。
發(fā)明詳述微生物保藏PF1022菌株于1989年1月24日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(日本國茨城縣筑波市東1丁目1番1中央第6)。保藏號為FERM BP-2671。
由質(zhì)粒pUC118-papA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(大腸桿菌JM109)于1999年9月17日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(日本國茨城縣筑波市東1丁目1番1中央第6)。保藏號為FERM BP-7256。
由質(zhì)粒pTrc-papB轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(大腸桿菌JM109)于1999年9月17日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(日本國茨城縣筑波市東1丁目1番1中央第6)。保藏號為FERM BP-7257。
由質(zhì)粒pET-papC轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(大腸桿菌JM109)于1999年9月17日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(日本國茨城縣筑波市東1丁目1番1中央第6)。保藏號為FERM BP-7258。
由質(zhì)粒pMKD01轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(大腸桿菌JM109)于1996年7月12日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(日本國茨城縣筑波市東1丁目1番1中央第6)。保藏號為FERM BP-5974。
苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主本發(fā)明所使用的苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主是指通過對原本生產(chǎn)PF1022物質(zhì)的生物(以下簡稱為PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌)實施后面描述的突變處理操作，從該生物中誘導(dǎo)出的苯丙氨酸營養(yǎng)突變型菌株。
優(yōu)選的苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主有PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌的突變型菌株，所述突變型菌株是通過使與由分支酸到氨基苯丙酮酸的生物合成途徑有關(guān)的酶活性，更具體地說，是分支酸變位酶和/或預(yù)苯酸脫水酶活性基本上完全喪失、或使它們的酶活性較親株顯著降低，而顯示苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型。
顯示苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型的突變型菌株可通過紫外線照射、或用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸等誘變劑處理PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌，然后從實施了上述處理的生物中選擇在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時不能生長，但通過添加苯丙氨酸則可以恢復(fù)生長的突變型菌株而得到。
突變型菌株還可以通過利用重組DNA技術(shù)而獲得。即，可從PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌中分離編碼分支酸變位酶或預(yù)苯酸脫水酶的基因，用分離出的基因進行同源重組，來破壞染色體上的靶基因，從而獲得目標(biāo)突變型菌株?；蚱茐目梢园凑展姆椒ㄟM行。
利用同源重組進行的基因破壞的方法，大致包括一步基因破壞方法和兩步基因破壞方法兩種方法。下面，以分支酸變位酶基因為例進行說明。
在一步基因破壞方法中，利用插入型載體或置換型載體。
作為插入型載體，首先要準(zhǔn)備含失活的分支酸變位酶基因和用于選擇轉(zhuǎn)化體的選擇性標(biāo)記基因的載體。失活的分支酸變位酶基因可以是除了將可單獨使分支酸變位酶基因失活的突變導(dǎo)入基因2個不相同的位點之外，其余部位均與原來的分支酸變位酶基因相同的基因。將上述插入型載體導(dǎo)入細(xì)胞中，選擇在兩處突變位點之間的區(qū)發(fā)生了與染色體上的靶分支酸變位酶基因同源重組的轉(zhuǎn)化體。在這樣的轉(zhuǎn)化體中，染色體上分支酸變位酶基因變?yōu)?個拷貝。不過，對于任意一個分支酸變位酶基因分別有一個位點導(dǎo)入了突變，因此可以使染色體上的分支酸變位酶基因失活。
作為置換型載體，要準(zhǔn)備含有分支酸變位酶基因的載體，所述基因由于選擇性標(biāo)記基因插入分支酸變位酶基因內(nèi)部從而被選擇性標(biāo)記基因斷開。將該置換型載體導(dǎo)入細(xì)胞，選擇在選擇性標(biāo)記基因的兩側(cè)、來源于分支酸變位酶基因的區(qū)發(fā)生了同源重組的轉(zhuǎn)化體。這樣的轉(zhuǎn)化體中，由于染色體上的靶分支酸變位酶基因與插入了選擇性標(biāo)記基因的基因置換，因此可以使染色體上的分支酸變位酶基因失活。
另一方面，在兩步基因破壞法中，其中的第一步是構(gòu)建由分支酸變位酶和選擇性標(biāo)記基因構(gòu)成的載體，所述分支酸變位酶基因中至少導(dǎo)入了一個以上、可單獨使分支酸變位酶基因失活的突變。將上述載體導(dǎo)入細(xì)胞，使其在分支酸變位酶基因上的突變部位的上游區(qū)與染色體上的靶分支酸變位酶基因發(fā)生同源重組。結(jié)果，在染色體上，形成2個拷貝的靶分支酸變位酶基因夾住含選擇性標(biāo)記基因的載體本身的形式，在2個拷貝的靶分支酸變位酶基因中，產(chǎn)生了含突變和不含突變的基因。
接著，夾于2個拷貝的靶分支酸變位酶基因之間的載體部分環(huán)出，在突變位點的下游區(qū)再次發(fā)生同源重組，結(jié)果，含選擇性標(biāo)記基因的載體和1個拷貝的靶分支酸變位酶基因丟失，染色體上的分支酸變位酶基因被置換為含有突變的靶分支酸變位酶基因，從而可使染色體上的分支酸變位酶基因失活。發(fā)生上述重組的菌株可以以標(biāo)記基因丟失為指標(biāo)進行選擇。此時，顯然作為第一步，在突變位點的下游區(qū)發(fā)生同源重組，即使接著在上游區(qū)發(fā)生同源重組，也可得到同樣的結(jié)果。
本發(fā)明中優(yōu)選的苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主的例子有從屬于無孢目(Agonomycetales)的絲狀菌誘導(dǎo)的苯丙氨酸營養(yǎng)突變型菌株，優(yōu)選從無孢菌類(Mycelia sterilia)誘導(dǎo)的苯丙氨酸營養(yǎng)突變型菌株，更優(yōu)選從以保藏號FERM BP-2671保藏于原生命工學(xué)技術(shù)研究所的PF1022菌株誘導(dǎo)的苯丙氨酸營養(yǎng)突變型菌株。最優(yōu)選從無孢菌類誘導(dǎo)、且其苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型的特征為由內(nèi)源性分支酸變位酶活性和/或預(yù)苯酸脫水酶活性喪失而引起的苯丙氨酸營養(yǎng)突變型菌株。
生物合成基因參與由分支酸到對氨基苯丙酮酸的生物合成的酶有4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶、4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶和4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶(Blanc，V.等，Mol.Microbiol.，23，191-202(1997))。由分支酸到對氨基苯丙酮酸的生物合成途徑大致如下所述。
4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶作用于分支酸，生成4-氨基-4-脫氧分支酸，4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶作用于生成的4-氨基-4-脫氧分支酸，生成4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸，4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶作用于生成的4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸，生成對氨基苯丙酮酸。
這里所說的4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶是指作用于分支酸、將其轉(zhuǎn)化為4-氨基-4-脫氧分支酸的酶。4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶作為從分支酸到對氨基苯甲酸生物合成系統(tǒng)的一部分，廣泛存在于生物界。對氨基苯甲酸由分支酸經(jīng)兩步反應(yīng)生成。其中，4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶催化第一步反應(yīng)，4-氨基-4-脫氧分支酸裂合酶催化之后的反應(yīng)(Green，J.M和Nichols，B.P.，J.Biol.Chem.，266，12971-12975(1991))。
已報道的編碼4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶的基因有來源于大腸桿菌(Escherichia coli)(Kaplan，JB.和Nichols，B.P.，J.Mol.Biol.，168，451-468(1983)、Goncharoff，P.和Nichols，B.P.，J.Bacteriol.，159，57-62(1984))、枯草桿菌(Bacillus subtilis)(Slock，J.等，J.Bacteriol.，172，7211-7226(1990))、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(Kaplan，J.B.等，J.Mol.Biol.，183，327-340(1985)、Goncharoff，P.和Nichols，B.P.，Mol.Biol.Evol.，5，531-548(1988))、始旋鏈霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)(Blanc，V.等，Mol.Microbiol.，23，191-202(1997))、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Brown，M.P.等，Microbiology.，142，1345-1355(1996))、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Edman，J.C.等，Yeast.，9，669-675(1993))的基因，可以使用這些基因。也可以按照常規(guī)方法，從具有4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶活性的生物中分離除上述之外的編碼4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶的基因來使用。
另一方面，4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶有如來源于大腸桿菌、枯草桿菌、肺炎克雷伯氏菌那樣的被分成2條多肽的酶，和如來源于部分放線菌和釀酒酵母那樣的由1條多肽構(gòu)成的酶。本發(fā)明中，由于需要將多個基因?qū)胨拗?，因此，?yōu)選使用編碼由1條多肽構(gòu)成的4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶的基因。
本發(fā)明中，編碼4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶的基因的優(yōu)選例子有編碼SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶活性的其修飾序列的基因。更優(yōu)選含有SEQ ID NO.1所示的DNA序列的基因。
本發(fā)明中，“修飾序列”是指具有選自置換、缺失、插入和添加中的1個以上、例如1～數(shù)個修飾的序列。
本發(fā)明中，對于修飾氨基酸序列是否具有4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶活性，可以使由該氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)作用于底物，通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物來評價。例如可以按照后面描述的實施例2的方法進行評價。
這里所說的4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶是指作用于4-氨基-4-脫氧分支酸，并將其轉(zhuǎn)化為4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸的酶。
這里所說的4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶是指作用于4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸，并將其轉(zhuǎn)化為對氨基苯丙酮酸的酶。
編碼4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶和4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶的基因可以從可生物合成對氨基苯丙酮酸的生物中獲得。更具體地說，可例舉有生產(chǎn)原始霉素I的始旋鏈霉菌、生產(chǎn)春霉素B的勞意德鏈霉菌(Streptomyces loidens)、生產(chǎn)棒桿菌素(corynesin)的石蠟諾卡氏菌(Nocardia parafinnica)和解烴棒桿菌(Corynebacteriumhydrocarboclastus)、生產(chǎn)氯霉素的委內(nèi)瑞拉鏈霉菌等。
其中，已經(jīng)從始旋鏈霉菌中分離出推斷為編碼4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶和4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶的基因，其核苷酸序列也已確定(V.Blanc等，Mol.Microbiol.，23，191-202(1997))，可以用于本發(fā)明。
編碼分支酸變位酶和預(yù)苯酸脫氫酶的基因大多已經(jīng)從細(xì)菌、酵母、植物等中分離出來，可以以這些為基礎(chǔ)，利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)或進化工程技術(shù)來進行修飾，通過置換、缺失或添加適當(dāng)?shù)陌被?，使其具?-氨基-4-脫氧分支酸變位酶活性和4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶活性，修飾后的基因也可以用于本發(fā)明。
編碼本發(fā)明所使用的4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶的基因的優(yōu)選例子有編碼SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶活性的其修飾序列的基因，更優(yōu)選含有SEQ ID NO.3所示的DNA序列的基因。
本發(fā)明中，對于修飾氨基酸序列是否具有4-氨基-4’-脫氧分支酸變位酶活性，可以使由該氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)作用于底物，通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物來評價。例如可以按照后面描述的實施例3的方法進行評價。
編碼本發(fā)明所使用的4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶的基因的優(yōu)選例子有編碼SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶活性的其修飾序列的基因。更優(yōu)選含有SEQ ID NO.5所示的DNA序列的基因。
本發(fā)明中，對于修飾氨基酸序列是否具有4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶活性，可以使由該氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)作用于底物，通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物來評價。例如可以按照后面描述的實施例4的方法進行評價。
本發(fā)明中，如果給出參與生物合成的酶的氨基酸序列，則很容易確定編碼該序列的核苷酸序列，可以選擇編碼SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的各種核苷酸序列。
因此，用于本發(fā)明的生物合成基因是指除SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.5所示DNA序列的部分或完整序列之外，也包括編碼相同氨基酸的DNA序列，即含有簡并密碼子的DNA序列。還包含與此對應(yīng)的RNA序列。
轉(zhuǎn)化體本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是指包含參與由分支酸到對氨基苯丙酮酸的生物合成途徑的多個基因(生物合成基因)的宿主。向宿主導(dǎo)入的基因是指在宿主細(xì)胞內(nèi)可復(fù)制、且所述多個基因是可表達(dá)狀態(tài)的DNA分子，特別指表達(dá)載體。
將包含參與由分支酸到對氨基苯丙酮酸的生物合成途徑的多個基因的DNA導(dǎo)入該宿主，可獲得轉(zhuǎn)化了的生物。本發(fā)明中，將多個生物合成基因?qū)胨拗鲿r，各基因可以包含在相同或不同的DNA分子中。并且，當(dāng)宿主細(xì)胞是細(xì)菌時，可以設(shè)計為使各基因作為多順反子mRNA表達(dá)，也可以作為1個DNA分子。
這里所說的表達(dá)載體，可以參考所用宿主細(xì)胞的種類，從病毒、質(zhì)粒、粘粒載體等中適當(dāng)選擇。例如當(dāng)宿主細(xì)胞為大腸桿菌時，可以選擇λ噬菌體類的噬菌體、pBR、pUC系列的質(zhì)粒；為枯草桿菌時，選擇pUB系列質(zhì)粒；為酵母時，例如，有YEp、YRp、Ycp、YIp系列的質(zhì)粒載體。
另外，優(yōu)選所使用的質(zhì)粒中至少一個含有用于選擇轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記，選擇標(biāo)記可以使用抗藥性基因、與營養(yǎng)缺陷型互補的基因。其優(yōu)選的具體例子有當(dāng)所用的宿主為細(xì)菌時，包括氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因等；為酵母時，包括色氨酸生物合成基因(trpI)、尿嘧啶生物合成基因(ura3.)、亮氨酸生物合成基因(leu2)等；為霉菌時，包括潮霉素抗性基因、雙丙氨膦抗性基因、博來霉素抗性基因、金擔(dān)子素抗性基因等。
并且，在表達(dá)載體中，各基因表達(dá)所需的DNA序列例如啟動子、轉(zhuǎn)錄起始信號、核糖體結(jié)合位點、翻譯終止信號、轉(zhuǎn)錄終止信號等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號、翻譯調(diào)節(jié)信號等也可以可操作地連接到生物合成基因上。調(diào)節(jié)序列的選擇和連接可以按照常規(guī)方法進行。
作為啟動子，可以選擇大腸桿菌中的乳糖操縱子、色氨酸操縱子等啟動子；酵母中的醇脫氫酶基因、酸性磷酸酶基因、半乳糖利用基因、甘油醛三磷酸脫氫酶基因等啟動子；霉菌中的α-淀粉酶基因、葡糖淀粉酶基因、纖維二糖水解酶基因、甘油醛三磷酸脫氫酶基因、Abp1基因等啟動子。
轉(zhuǎn)化宿主時所用的方法，可以采用鈣離子法、鋰離子法、電穿孔法、PEG法、農(nóng)桿菌法、基因槍法等常規(guī)方法，可以根據(jù)轉(zhuǎn)化的宿主來選擇。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體優(yōu)選生產(chǎn)式(III)或式(V)所示的PF1022物質(zhì)衍生物的轉(zhuǎn)化體，其特征在于(a)來源于生產(chǎn)式(I)所示的PF1022物質(zhì)的無孢菌類，(b)通過基因破壞，使內(nèi)源性分支酸變位酶基因和/或預(yù)苯酸脫水酶基因破壞，(c)參與由分支酸到對氨基苯丙酮酸的生物合成途徑的基因被導(dǎo)入所述轉(zhuǎn)化體中。
PF1022物質(zhì)衍生物的制備在本發(fā)明中，可通過培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，獲得該培養(yǎng)物來獲得所需的PF1022物質(zhì)衍生物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可以按照常規(guī)方法，適當(dāng)選擇培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等來進行。
培養(yǎng)基中可以添加本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可同化的碳源、可利用的氮源、無機鹽類、各種維生素、谷氨酸或天冬氨酸等各種氨基酸、核苷酸等微量營養(yǎng)素、抗生素等選擇劑。
另外，還可以適當(dāng)添加有助于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的生長、促進本發(fā)明的PF1022物質(zhì)衍生物的生產(chǎn)的有機物和無機物。并且，可根據(jù)需要使用適當(dāng)含有其它營養(yǎng)物質(zhì)的合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基。
作為培養(yǎng)基所用的碳源和氮源，只要是本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可利用的，可以是任意種類?？赏奶荚纯梢岳美缯崽?、葡萄糖、淀粉、甘油、果糖、麥芽糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖、核糖、糊精、動物油、植物油或它們的水解物等各種碳水化合物。其濃度通常優(yōu)選相對于培養(yǎng)基為0.1～5％。
作為可利用的氮源，也可以使用例如蛋白胨、肉膏、玉米漿、脫脂豆粉等動植物體成分；浸膏類；琥珀酸銨鹽類、酒石酸銨等有機酸銨類；尿素或其它各種無機酸或有機酸等的含氮化合物。
另外，無機鹽類可以適當(dāng)使用例如可生成鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、氯、磷酸、硫酸或其它離子的鹽類。
含有其它成分例如酵母等微生物菌體、浸液和浸膏等以及植物體粉末的培養(yǎng)基，只要不妨礙本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的生長和本發(fā)明的PF1022物質(zhì)衍生物的生產(chǎn)累積，均可適當(dāng)使用。另外，培養(yǎng)顯示營養(yǎng)需求型的突變菌株時，需將滿足該營養(yǎng)需求的物質(zhì)加入培養(yǎng)基中，但當(dāng)使用含有天然物質(zhì)的培養(yǎng)基時，有時無需特別添加這些營養(yǎng)素。
培養(yǎng)基的pH為例如約pH 6～pH 8。培養(yǎng)方法可以通過有氧條件下的振蕩培養(yǎng)、通氣攪拌培養(yǎng)法或有氧浸沒培養(yǎng)法進行。
培養(yǎng)所適宜的溫度為15℃～40℃，多在26℃-37℃附近生長。
本發(fā)明的PF1022物質(zhì)衍生物的生產(chǎn)根據(jù)培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件或所使用的宿主不同而不同，但通常任何一種培養(yǎng)方法均在2天～25天內(nèi)積累達(dá)到最高。在本發(fā)明的PF1022物質(zhì)衍生物的量達(dá)到最高時終止培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中分離、純化目標(biāo)物質(zhì)。
毋庸置言，需要根據(jù)所使用的轉(zhuǎn)化體以及外部條件等，適當(dāng)調(diào)整、選擇這些培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)基的流動性、培養(yǎng)溫度、攪拌速度、通氣量等培養(yǎng)條件，以獲得優(yōu)選的結(jié)果。液體培養(yǎng)過程中，如果培養(yǎng)基起泡，可適當(dāng)使用硅酮油、植物油、礦物油、表面活性劑等消泡劑。
這樣得到的培養(yǎng)物中所積累的本發(fā)明的PF1022物質(zhì)衍生物含在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體內(nèi)和培養(yǎng)濾液中，因此，可將培養(yǎng)物離心，使培養(yǎng)物與轉(zhuǎn)化體分離，從各自中收集本發(fā)明的PF1022物質(zhì)衍生物。
從培養(yǎng)濾液中收集本發(fā)明的PF1022物質(zhì)衍生物時，可以按照常規(guī)方法，將從培養(yǎng)物中收集本發(fā)明的PF1022物質(zhì)衍生物時所用的方法單獨或以任意的順序組合或反復(fù)使用進行。即，可以使用例如提取過濾、離心、透析、濃縮、干燥、冷凍、吸附、解吸、利用對各種溶劑的溶解度差的方法(例如沉淀、結(jié)晶、重結(jié)晶、反向溶解、逆流分布法、層析等)等方法。
另外，可從本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體內(nèi)的培養(yǎng)物中獲得本發(fā)明的PF1022物質(zhì)衍生物。根據(jù)常規(guī)方法，可采用例如從培養(yǎng)物中提取(磨碎處理、加壓破碎等)、回收(過濾、離心等)及純化(鹽析、溶劑沉淀法等)等方法。
得到的粗制物質(zhì)可根據(jù)常規(guī)方法例如使用硅膠、氧化鋁等載體的柱層析或使用ODS載體的反相層析進行純化。通過上述所示方法或?qū)⑵溥m當(dāng)組合，可從本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中獲得純的本發(fā)明的目標(biāo)PF1022物質(zhì)衍生物。
參與由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途徑的酶基因本發(fā)明的目的在于提供參與由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途徑的酶的新型基因。下面，概略描述由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途徑分支酸變位酶作用于分支酸，生成預(yù)苯酸，預(yù)苯酸脫水酶作用于生成的預(yù)苯酸，生成苯丙酮酸。
本發(fā)明的新型基因是編碼SEQ ID NO.27所述的氨基酸序列或具有分支變位酶活性的其修飾序列的多核苷酸，優(yōu)選由SEQ ID NO.26所述的DNA序列構(gòu)成的多核苷酸。
本發(fā)明中，對于多核苷酸是否編碼具有分支酸變位酶活性的修飾氨基酸序列，可以按照公知的基因重組技術(shù)，將該多核苷酸導(dǎo)入宿主(例如大腸桿菌)并表達(dá)，使得到的蛋白質(zhì)作用于底物，通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物來評價(參照實施例2、3、4和9)。
本發(fā)明的新型基因還是編碼SEQ ID NO.38所述的氨基酸序列或具有預(yù)苯酸脫水酶活性的其修飾序列的多核苷酸，優(yōu)選由SEQ ID NO.37所述的DNA序列構(gòu)成的多核苷酸。
本發(fā)明中，對于多核苷酸是否編碼具有預(yù)苯酸脫水酶活性的修飾氨基酸序列，可以按照公知的基因重組技術(shù)，將該多核苷酸導(dǎo)入宿主(例如大腸桿菌)并表達(dá)，使得到的蛋白質(zhì)作用于底物，通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物來評價(參照實施例2、3、4和17)。
本發(fā)明中，若給出參與由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途徑的酶的氨基酸序列，則很容易確定編碼該序列的核苷酸序列，可以選擇編碼SEQ ID NO.27和38所示的氨基酸序列的各種核苷酸序列。因此，本發(fā)明的參與由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途徑的基因是指除SEQID NO.26和37所示的DNA序列的部分或完整序列之外，也包括編碼相同氨基酸的DNA序列，即含有簡并密碼子的DNA序列。還包含與此對應(yīng)的RNA序列。
實施例以下例舉本發(fā)明的實施例，這只是舉例，并不因此限定本發(fā)明，本發(fā)明包括在此未例示的多種改變或修飾的方法的全部。
實施例1由委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中分離編碼4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶的基因、編碼4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶的基因和編碼4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶的基因(1)探針DNA片段的制備在250ml容積的三角燒瓶中制備50ml為1份的液體培養(yǎng)基(2％可溶性淀粉、1％聚胨、0.3％肉膏、0.05％磷酸二氫鉀、pH 7.0)。分別將委內(nèi)瑞拉鏈霉菌ISP5230菌株和140-5菌株接種于上述培養(yǎng)基中，在28℃下培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心，從培養(yǎng)液中收集菌體，按照Genetic Manipulation ofStreptomyces，A Laboratory Manual(D.A.Hopwood等，The John Innes Foundation，p.71～78，1985)記載的方法從該菌體中制備染色體DNA。
接著，以上述委內(nèi)瑞拉鏈霉菌ISP5230菌株的染色體DNA為模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的寡核苷酸為引物進行PCR。使用TaKaRa LA PCRTMkit Ver.2.1(寶酒造公司)，用GeneAmp PCRSystem 2400(Perkin-Elmer)進行PCR。反應(yīng)液包括1μl染色體DNA(相當(dāng)于0.62μg的量)、5μl隨試劑盒附帶的10倍濃度反應(yīng)用緩沖液、8μl2.5mM dNTP溶液、調(diào)節(jié)為100pmol/μl濃度的上述引物各0.5μl、5μl二甲基亞砜(和光純藥公司)、0.5μl TaKaRa LA-Taq(2.5U)、29.5μl無菌水，配制為50μl。反應(yīng)條件是94℃下預(yù)處理10分鐘后，進行94℃1分鐘、50℃ 1分鐘、72℃3分鐘的保溫，共進行25個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取部分反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明約2kbp的DNA片段得到特異性擴增。將余下的反應(yīng)液用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取，用乙醇沉淀。將沉淀重新溶解于無菌水，60μl所得溶液用限制酶BamHI進行消化，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，按照常規(guī)方法，切下約2kbp的條帶，回收DNA片段。
將該DNA片段克隆到質(zhì)粒pTrcHis B(Invitrogen公司)的BamHI位點。得到的質(zhì)粒中的插入片段的限制性酶切圖譜與Brown等(M.P.Brown等，Microbiology，142，1345-1355(1996))報道的pabAB基因(U21728)的一致，因此可判斷克隆了pabAB基因，將該質(zhì)粒命名為pTH-PAB。用限制酶BamHI消化質(zhì)粒pTH-PAB，然后用瓊脂糖凝膠電泳分離、回收，將得到的插入片段作為探針，用于后面描述的染色體DNA文庫的篩選。
(2)染色體DNA文庫的篩選與基因的分離用限制酶Sau3AI部分消化約10μg委內(nèi)瑞拉鏈霉菌140-5菌株的染色體DNA，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，分離并回收10kbp～20kbp的DNA片段。
將約0.5μg上述回收的10kbp～20kbp的DNA片段和1μg事先用限制酶BamHI和XhoI雙重消化的λDASH II用T4 DNA連接酶連接，使用Gigapack III包裝提取物(Stratagene)，進行體外包裝，構(gòu)建染色體DNA文庫。使其感染大腸桿菌XLI-Blue MRA，形成噬菌斑。
以(1)中分離的約2kbp DNA片段作為探針，使用ECL直接DNA/RNA標(biāo)記檢測系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech)進行噬菌斑雜交，篩選了約24000個噬菌斑。對獲得的陽性克隆中的10個進行2次篩選，純化陽性克隆，然后制備噬菌體DNA。
將這些噬菌體DNA用限制酶BamHI消化，進行DNA印跡分析，結(jié)果表明探針與約1.8kbp和約3.4kbp 2種DNA片段進行了雜交。另外，從噬菌體DNA的限制性酶切圖譜的分析中可知這2種DNA片段在染色體上是相鄰的片段。
使用熒光DNA測序儀ABI PRISM 377(Perkin-Elmer)測定這2種DNA片段的全長核苷酸序列。搜索可讀框(ORF)，結(jié)果如圖1所示，可以發(fā)現(xiàn)ORFI～IV的ORF。
利用數(shù)據(jù)庫，對由各ORF推斷的氨基酸序列與已知氨基酸序列進行同源性搜索，結(jié)果表明ORF I與對氨基苯甲酸合成酶、ORF II與預(yù)苯酸脫氫酶，ORF III與分支酸變位酶顯示同源性。這里，將ORFI、II和III的基因分別命名為papA、papC和papB。papA編碼的氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示，papB編碼的氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.3所示，papC編碼的氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQ ID NO.6和SEQID NO.5所示。
實施例2papA基因在大腸桿菌中的表達(dá)為了獲得papA基因的翻譯區(qū)，以來源于實施例1所示的陽性克隆的噬菌體DNA為模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所記載的寡核苷酸為引物，進行PCR。使用KOD Dash(東洋紡織)作為作為DNA聚合酶，用GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmer)進行PCR。反應(yīng)液包括1μl噬菌體DNA(相當(dāng)于1μg的量)、5μl隨酶附帶的10倍濃度反應(yīng)用緩沖液、5μl 2mM dNTP溶液、調(diào)節(jié)為100pmol/μl濃度的上述引物各1μl、5μl二甲基亞砜(和光純藥)、1μl KOD Dash、31μl無菌水，配制為50μl。反應(yīng)條件是94℃下預(yù)處理5分鐘后，進行94℃ 30秒、50℃ 2秒、72℃ 30秒的保溫，共進行15次循環(huán)。將得到的反應(yīng)液用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取，進行乙醇沉淀。將沉淀重新溶解于無菌水，用DNA平端化試劑盒(寶酒造)使DNA末端產(chǎn)生平端。再用T4 DNA激酶(和光純藥)使5’末端磷酸化，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，切下約2kbp DNA片段并回收，將其克隆到質(zhì)粒pUC118的.SmaI位點，得到質(zhì)粒pUC118-papA(FERM BP-7256)。
用熒光DNA測序儀ABI PRISM 310 Genetic Ahalyzer(Perkin-Elmer)測定pUC118-papA(FERM BP-7256)中插入片段的核苷酸序列，結(jié)果顯示SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中第2043號的胞嘧啶被置換為腺嘌呤。這可推斷是由于PCR擴增DNA片段時發(fā)生錯誤，但所編碼的氨基酸序列并無變化，因此，可以將pUC118-papA(FERM BP-7256)的插入片段用于后面的實驗。
將pUC118-papA(FERM BP-7256)導(dǎo)入大腸桿菌JM110，按照常規(guī)方法，從獲得的轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒。將該質(zhì)粒用限制酶BclI消化，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，分離并回收約2kbp的BclI DNA片段。
另一方面，用限制酶NcoI消化質(zhì)粒pTrc99A(Amersham PharmaciaBiotech)，用綠豆核酸酶(和光純藥)使DNA末端產(chǎn)生平端。進一步用限制酶.SmaI消化該質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進行自身連接，得到質(zhì)粒pTrc101。
用限制酶BamHI消化pTrc101，用堿性磷酸酶(寶酒造)進行處理后，與上述的2kbp的BclI DNA片段連接。選擇相對于pTrc中包含的啟動子，papA基因正向插入的質(zhì)粒，命名為pTrc-papA。上述的質(zhì)粒構(gòu)建步驟如圖2所示。
將帶有pTrc-papA的大腸桿菌JM109菌株接種于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(1％細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨、0.5％酵母膏、0.5％氯化鈉)中，在37℃下培養(yǎng)過夜。將1ml得到的培養(yǎng)液接種于100ml的相同培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)4小時，然后添加1ml 100mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，再在30℃下培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)后，通過離心，從培養(yǎng)液中收集菌體，使其懸浮于4ml細(xì)胞破碎用緩沖液(50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)、5mM EDTA、10％甘油)，然后通過超聲波破碎細(xì)胞。破碎后，通過離心得到上清液，以此作為細(xì)胞提取液。另外，對帶有質(zhì)粒pTrc101的大腸桿菌JM109菌株也進行同樣的處理，制備細(xì)胞提取液。
使用如上所述制備的細(xì)胞提取液測定酶活性。即，將100μl細(xì)胞提取液、400μl蒸餾水、500μl底物溶液(10mM分支酸鋇(Sigma)、10mM谷氨酰胺(和光純藥)、10mM氯化鎂、100mM MOPS(和光純藥)、pH 7.5)混合，在30℃下反應(yīng)2小時。反應(yīng)結(jié)束后，將部分反應(yīng)液用全自動氨基分析儀JLC-500/V(日本電子株式會社)進行分析。
結(jié)果如圖3所示，在使用由帶有pTrc-papA的大腸桿菌制備的細(xì)胞提取液的情況下，在與按照Chia-Yu P.Teng等的方法(Chia-Yu P.Teng等，J.Am.Chem.Soc.，107，5008-5009(1985))合成的4-氨基-4-脫氧分支酸標(biāo)準(zhǔn)品相同保留時間的位置檢出了峰。另一方面，在使用煮沸處理的細(xì)胞提取液和從帶有pTrc101的大腸桿菌中制備的細(xì)胞提取液的情況下，則在該位置未檢出峰。上述結(jié)果表明papA基因編碼4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶。
實施例3papB基因在大腸桿菌中的表達(dá)為了獲得papB基因的翻譯區(qū)，以來源于實施例1所示的陽性克隆的噬菌體DNA為模板，以SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所記載的寡核苷酸為引物，進行PCR。使用KOD Dash(東洋紡織)作為DNA聚合酶，用GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmet)進行PCR。反應(yīng)液包括1μl噬菌體DNA(相當(dāng)于1μg的量)、5μl隨酶附帶的10倍濃度反應(yīng)用緩沖液、5μl 2mM dNTP溶液、調(diào)節(jié)為100pmol/μl濃度的上述引物各1μl、5μl二甲基亞砜(和光純藥)、1μl KOD Dash、31μl無菌水，配制為50μl。反應(yīng)條件是94℃下預(yù)處理5分鐘后，進行94℃30秒、50℃2秒、72℃30秒的保溫，共進行15次循環(huán)。將得到的反應(yīng)液用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取，進行乙醇沉淀。將沉淀重新溶解于無菌水，用限制酶BamHI消化后進行瓊脂糖凝膠電泳，按照常規(guī)方法切下約0.3kbp的條帶，回收DNA片段。
用限制酶BamHI消化pTrc101，用堿性磷酸酶(寶酒造)進行處理后，用T4 DNA連接酶與上述0.3kbp的BamHI DNA片段連接。選擇相對于pTrc101中包含的啟動子papB基因正向插入的質(zhì)粒，命名為pTrc-papB(FERM BP-7257)(圖4)。用熒光DNA測序儀ABI PRISM 310Genetic Analyzer(Perkin-Elmer)測定pTrc-papB(FERM BP-7257)中插入片段的核苷酸序列，結(jié)果證實與SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列一致。
將帶有pTrc-papB(FERM BP-7257)的大腸桿菌JM109菌株接種于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(1％細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨、0.5％酵母膏、0.5％氯化鈉)中，在37℃下培養(yǎng)過夜。將1ml得到的培養(yǎng)液接種于100ml的相同培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)2小時，然后添加1ml 100mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，再在37℃下培養(yǎng)5小時。培養(yǎng)后，通過離心，從培養(yǎng)液中收集菌體，使其懸浮于4ml細(xì)胞破碎用緩沖液(50mM Tris-鹽酸(pH 8.0)、5mM EDTA、10％甘油)，然后通過超聲波處理破碎細(xì)胞。破碎后，通過離心得到上清液，以此作為細(xì)胞提取液。另外，對帶有質(zhì)粒pTrc101的大腸桿菌JM109也進行同樣的處理，制備細(xì)胞提取液。
使用如上所述制備的細(xì)胞提取液測定酶活性。即，將50μl細(xì)胞提取液、200μl蒸餾水、250μl底物溶液(2mg/ml 4-氨基-4-脫氧分支酸、10mM氯化鎂、100mM MOPS(和光純藥)、pH7.5)混合，在30℃下反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后，將部分反應(yīng)液用全自動氨基酸分析儀JLC-500/V(日本電子株式會社)進行分析。
結(jié)果如圖5所示，在使用由帶有pTrc-papB(FERM BP-7257)的大腸桿菌制備的細(xì)胞提取液的情況下，4-氨基-4-脫氧分支酸的峰減小，新檢出了4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸的峰。另外，使用煮沸處理5分鐘的細(xì)胞提取液時也得到了同樣的結(jié)果。
另一方面，在使用由帶有pTrc101的大腸桿菌制備的細(xì)胞提取液的情況下，4-氨基-4-脫氧分支酸的峰無變化，也未檢出4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸的峰。上述結(jié)果顯示papB基因編碼4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶，以及papB基因所編碼的4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶具有即使煮沸處理5分鐘也不會失活的耐熱性。
實施例4papC基因在大腸桿菌中的表達(dá)為了獲得papC基因的翻譯區(qū)，以來源于實施例1所示的陽性克隆的噬菌體DNA為模板，以SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所記載的寡核苷酸為引物，進行PCR。使用KOD Dash(東洋紡織)作為DNA聚合酶，用GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmer)進行PCR。反應(yīng)液包括1μl噬菌體DNA(相當(dāng)于1μg的量)、5μl隨酶附帶的10倍濃度反應(yīng)用緩沖液、5μl 2mM dNTP溶液、調(diào)節(jié)為100pmol/μl濃度的上述引物各1μl、5μl二甲基亞砜(和光純藥)、1μl KOD Dash、31μl無菌水，配制為50μl。反應(yīng)條件是94℃下預(yù)處理5分鐘后，進行94℃30秒、50℃2秒、72℃30秒的保溫，共進行15次循環(huán)。將得到的反應(yīng)液用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取，進行乙醇沉淀。將沉淀重新溶解于無菌水，用限制酶BamHI消化后進行瓊脂糖凝膠電泳，按照常規(guī)方法切下約1kbp的條帶，回收DNA片段。
用限制酶BamHI消化質(zhì)粒pET-11c(Stratagene)，用堿性磷酸酶(寶酒造)進行處理后，通過T4 DNA連接酶與上述1kbp的BamHI DNA片段連接。選擇相對于pET-11c中包含的啟動子，papC基因正向插入的質(zhì)粒，命名為pET-papC(FERM BP-7258)。
用熒光DNA測序儀ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Perkin-Elmer)測定pET-papC(FERM BP-7258)中插入片段的核苷酸序列，結(jié)果證實與SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列一致。
另一方面，使用pET-papC(FERM BP-7258)使papC基因表達(dá)時，由來源于載體的14個氨基酸構(gòu)成的肽添加到papC基因產(chǎn)物的N末端一側(cè)，因此，可以推測不能正確地評價papC基因產(chǎn)物的性質(zhì)。因此，用限制酶NdeI消化pET-papC(FERM BP-7258)后，用T4 DNA連接酶進行自身連接，得到質(zhì)粒pET-papCl。通過使用pET-papCl，在大腸桿菌中不是生產(chǎn)融合蛋白質(zhì)，而是生產(chǎn)papC基因產(chǎn)物本身。上述的質(zhì)粒構(gòu)建步驟如圖6所示。
將帶有pET-papCl的大腸桿菌BL21(DE3)菌株在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(1％細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨、0.5％酵母膏、0.5％氯化鈉)中，在37℃下培養(yǎng)過夜。將1ml得到的培養(yǎng)液接種于100ml的相同培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)2小時，然后添加1ml 100mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，再在37℃下培養(yǎng)5小時。培養(yǎng)后，通過離心收集菌體，使其懸浮于4ml細(xì)胞破碎用緩沖液(50mM Tris-鹽酸(pH8.0)、5mM EDTA、10％甘油)，然后用超聲波處理破碎細(xì)胞。破碎后，通過離心得到上清液，以此作為細(xì)胞提取液。另外，對帶有質(zhì)粒pET-11c的大腸桿菌BL21(DE3)也進行同樣的處理，制備細(xì)胞提取液。
使用如上所述制備的細(xì)胞提取液測定酶活性。即，將40μl細(xì)胞提取液、10μl從帶有實施例3中記載的pTrc-papB(FERM BP-7257)的大腸桿菌中制備且煮沸處理了的細(xì)胞提取液、190μl蒸餾水、10μl 10mMNAD溶液、250μl底物溶液(2mg/ml 4-氨基-4-脫氧分支酸、10mM氯化鎂、100mM MOPS(和光純藥)、pH7.5)混合，在30℃下反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后，將部分反應(yīng)液用全自動氨基酸分析儀JLC-500/V(日本電子株式會社)進行分析。
結(jié)果如圖7所示，在使用從帶有pET-papCl的大腸桿菌中制備的細(xì)胞提取液的情況下，4-氨基-4-脫氧分支酸的峰減小，由papB基因產(chǎn)物產(chǎn)生的4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸的峰也消失。全自動氨基酸分析儀JLC-500/V未檢出對氨基苯丙酮酸，因此不能直接確證其生成。
但是，檢出了對氨基苯丙氨酸的峰，可以推測這是由papC基因產(chǎn)物產(chǎn)生的對氨基苯丙酮酸被大腸桿菌的轉(zhuǎn)氨酶氨基化而產(chǎn)生的。另外，在使用經(jīng)煮沸處理的細(xì)胞提取液和從帶有pET-11c的大腸桿菌中制備的細(xì)胞提取液的情況下，由papB基因產(chǎn)物產(chǎn)生的4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸的峰無變化。上述結(jié)果顯示papC基因編碼4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶。
實施例5構(gòu)建用于導(dǎo)入苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主的質(zhì)粒pPF260-A3和pPF260-A4如圖8所示，構(gòu)建用于使papA基因在苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主中表達(dá)的質(zhì)粒pPF260-A3和pPF260-A4。
構(gòu)建PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌用的表達(dá)載體pABPd，然后，將從實施例2中記載的質(zhì)粒pUC118-papA(FERM BP-7256)中得到的DNA片段連接在上述載體上，構(gòu)建表達(dá)載體。表達(dá)載體的構(gòu)建方法具體如下。
PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌的基因組DNA的分離按照(H.Horiuchi等，J.Bacteriol，170，272-278，(1988))記載的方法，進行PF1022菌株(FERM BP-2671)的基因組DNA的分離。具體步驟如下。首先將PF1022菌株(FERM BP-2671)在種子培養(yǎng)基(2.0％可溶性淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％聚胨、0.6％麥胚、0.3％酵母膏、0.2％豆餅和0.2％碳酸鈣；滅菌前為pH 7.0；參照國際公開WO97/00944號實施例1)上培養(yǎng)2天，離心(3500rpm、10分鐘)回收菌體。
然后，將得到的菌體冷凍干燥，懸浮于TE緩沖液(10mM Tris-鹽酸(pH 8.0)、1mM EDTA)，在3％ SDS溶液中、60℃處理30分鐘，然后用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取，除去菌體殘渣。將提取液進行乙醇沉淀后，用RNA酶A(Sigma)和蛋白酶K(和光純藥)處理，進一步通過12％聚乙二醇6000使核酸沉淀。該沉淀用TE飽和苯酚提取，進行乙醇沉淀，將該沉淀溶解于TE緩沖液中，將其作為基因組DNA。
PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌的基因組文庫的構(gòu)建將如上制備的來源于PF1022菌株(FERM BP-2671)的基因組DNA用Sau3AI進行部分消化。用T4連接酶(寶酒造、連接試劑盒Ver.2)將其連接到噬菌體載體λEMBL3克隆試劑盒(Stratagene)中的BamHI臂上。將其進行乙醇沉淀，然后溶解于TE緩沖液。使用Gigapack III Plus包裝試劑盒(Stratagene)，用全部的連接混合物感染大腸桿菌LE392菌株，形成噬菌斑。使用由該方法得到的1.3×104個(2.6×104PFU/ml)的噬菌體文庫進行Abp1基因的克隆。
由來源于PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌的基因組DNA進行的Abp1基因的克隆通過PCR法擴增Abp1基因的翻譯區(qū)作為探針使用。如上所述，以由PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌制備的基因組DNA為模板，使用由8-73U和8-73R構(gòu)成的合成引物，按照LETS GO PCR試劑盒(SAWADYTechnology)進行PCR。PCR的反應(yīng)條件是以94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒的步驟進行25個循環(huán)來進行擴增。以下顯示8-73U和8-73R的DNA序列。8-73UCTCAAACCAGGAACTCTTTC (SEQ ID NO.15)8-73RGAcATGTGGAAACCACATTTTG(SEQ ID NO.16)這樣得到的PCR產(chǎn)物用ECL Direct System(Amersham PharmaciaBiotech)進行標(biāo)記。將如上所述制備的噬菌斑轉(zhuǎn)移到Hybond N+尼龍轉(zhuǎn)移膜(Amersham Pharmacia Biotech)上，進行堿變性處理后，用5×SSC(SSC15mM檸檬酸三鈉、150mM氯化鈉)洗凈，使其干燥，固定DNA。按照試劑盒記載的方法，進行1小時的預(yù)雜交(42℃)，然后添加事先已標(biāo)記的探針，進行16小時(42℃)的雜交。尼龍膜的洗滌按照上述試劑盒中所記載的方法。將洗滌后的尼龍膜浸于檢測溶液中1分鐘，然后使其對醫(yī)用X膠片(富士寫真膠片)曝光，得到1個陽性克隆。將該克隆進行DNA印跡分析，結(jié)果顯示至少6kb的HindIII片段與基因組DNA限制酶片段長度一致。該HindIII片段的限制性酶切圖譜如圖9所示。將HindIII片段亞克隆到pUC119(pRQHin/119)，用于后面的實驗。
表達(dá)載體的構(gòu)建以pRQHin/119為模板，用PCR法擴增Abp1基因的啟動子區(qū)和終止子區(qū)。啟動子的擴增使用由ABP-Neco和ABP-Nbam構(gòu)成的引物，終止子的擴增使用由ABP-Cbam和ABP-Cxba構(gòu)成的引物，通過PCRSuper Mix High Fidelity(Lifetech Oriental Co.，Ltd.)進行PCR。反應(yīng)條件是以94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒的步驟進行25個循環(huán)來進行擴增。以下顯示ABP-Neco、ABP-Nbarm、ABP-Cbam和ABP-Cxba的DNA序列。
ABP-NecoGGGGAATTCGTGGGTGGTGATATCATGGC (SEQ ID NO.17)ABP-NbamGGGGGATCCTTGATGGGTTTTGGG (SEQ ID NO.18)ABP-cbamGGGGGATCCTAAACTCCCATCTATAGC (SEQ ID NO.19)ABP-CxbaGGGTCTAGACGACTCATTGCAGTGAGTGG (SEQ ID NO.20)各PCR產(chǎn)物用Microspin S-400柱(Amcrsham Pharmacia Biotech)純化，進行乙醇沉淀后，啟動子用EcoRI和BamHI消化，終止子用BamHI和XbaI消化，依次連接到用同樣的酶消化的pBluesript II KS+上。將其用XbaI消化，插入來源于pMKD01(國際公開WO98/03667號，F(xiàn)ERMBP-5974)的越霉素抗性盒中，構(gòu)建pABPd(圖10)。pABPd具有Abp1基因的啟動子和終止子。
由實施例2中記載的質(zhì)粒pUC118-papA(FERM BP-7256)中制備約2kbp的BclI DNA片段。將其插入PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌用表達(dá)載體pABPd的BamHI位點，得到質(zhì)粒pPF260-A。
接著，用限制酶PstI和BamHI雙重消化pPF260-A，制備約1.7kbp的DNA片段。將其亞克隆到pUC119的PstI和BamHI位點，得到質(zhì)粒pUC119-A。以pUC119-A為模板DNA，以SEQ ID NO.21所示的寡核苷酸為引物，使用Muta-Gene體外誘變試劑盒(Bio-Rad)進行定點誘變，得到質(zhì)粒pUC119-A1。接著，用限制酶PstI和BamHI雙重消化pUC119-A1和pPF260-A，分別制備約1.7kbp和約8.6kbp的DNA片段，將它們連接，得到質(zhì)粒pPF260-A2。
進一步用限制酶XbaI消化pPF260-A2，然后用T4 DNA連接酶進行自身連接，得到質(zhì)粒pPF260-A3。接著，用限制酶XbaI消化質(zhì)粒pDHBAR(Watanabe，M.等，Appl.Environ.Microbiol.，65，1036-1044(1999))，制備含雙丙氨膦抗性基因的約2.5kbp的DNA片段，將其與事先用限制酶XbaI消化、用磷酸酶處理的pPF260-A3連接，得到質(zhì)粒pPF260-A4。
實施例6構(gòu)建用于導(dǎo)入苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主的質(zhì)粒pPF260-B3如圖11所示，構(gòu)建用于使papB基因在苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主中表達(dá)的質(zhì)粒pPF260-B3。
由實施例3中記載的質(zhì)粒pTrc-papB(FERM BP-7257)中制備約0.3kbp的BamHI DNA片段。將其插入表達(dá)載體pABPd(實施例5)的BamHI位點，得到質(zhì)粒pPF260-B。用限制酶XbaI消化pPF260-B，然后用T4 DNA連接酶進行自身連接，得到質(zhì)粒pPF260-B1。
接著，限制酶PstI消化pPF260-B1，制備約0.6kbp的DNA片段。將其亞克隆到pUC118的PstI位點，使papB基因的方向與lacZ’基因相同方向，得到質(zhì)粒pUC118-B。以pUC118-B為模板DNA，以SEQ IDNO.22所示的寡核苷酸為引物，使用Muta-Gene體外誘變試劑盒(Bio-Rad)進行定點誘變，得到質(zhì)粒pUC118-B1。
接著，用限制酶PstI消化pUC118-B1和pPF260-B1，分別制備約0.6kbp和約8.0kbp的DNA片段，將它們連接，得到質(zhì)粒pPF260-B3。
實施例7構(gòu)建用于導(dǎo)入苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主的質(zhì)粒pPF260-C3如圖12所示，構(gòu)建用于使papC基因在苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主中表達(dá)的質(zhì)粒pPF260-C3。
由實施例4中記載的質(zhì)粒pET-papC(FERM BP-7258)中制備約1kbp的BamHI DNA片段。將其插入表達(dá)載體pABPd(實施例5)的BamHI位點，得到質(zhì)粒pPF260-C。用限制酶XbaI消化pPF260-C，然后用T4DNA連接酶進行自身連接，得到質(zhì)粒pPF260-C1。
接著，用限制酶PstI和SphI雙重消化pPF260-C1，制備約1.7kbp的DNA片段。將其亞克隆到pUC118的PstI和SphI位點，得到質(zhì)粒pUC118-C。以pUC118-C為模板DNA，以SEQ ID NO.23所示的寡核苷酸為引物，使用Muta-Gene體外誘變試劑盒(Bio-Rad)進行定點誘變，得到質(zhì)粒pUC118-C1。
接著，用限制酶PstI和SphI雙重消化pUC118-C1和pPF260-C1，分別制備約1.7kbp和約7.6kbp的DNA片段，用T4 DNA連接酶將它們連接，得到質(zhì)粒pPF260-C3。
實施例8來源于PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌的分支酸變位酶基因的分離來源于PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌的分支酸變位酶基因如下分離。
經(jīng)PCR擴增部分基因片段將來源于擬南芥(Arabidopsis thariana)和釀酒酵母的分支酸變位酶的氨基酸序列進行比較，搜索同源性高的部分。結(jié)果，在來源于釀酒酵母的分支酸變位酶的氨基酸序列中，第159號到第164號以及第244號到第249號的部分的同源性高，合成了由此推定的寡核苷酸。其序列如下。
CMUC-UCAYTWYGGNAARTTYGT(SEQ ID NO.24)CMUD-LTAYTCNACYTSNACYTC(SEQ ID NO.25)(NA、G、C或T；RA或G；SG或C；WA或T；YC或T)不過，CMUC-U中的第9號、CMUD-L中的第6號核苷酸分別用肌苷合成。接著，如下制備作為PCR模板使用的cDNA。
在實施例5記載的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件下培養(yǎng)PF1022菌株(FERM-2671)，離心(3000rpm、10分鐘)回收菌體。用純化水洗滌，在-80℃冷凍，然后在液氮存在下，用攪拌機(日本精機AM-3)粉碎。將其懸浮于變性溶液(4M硫氰酸胍、25mM檸檬酸三鈉、0.5％N-十二烷基肌氨酸鈉、0.1M巰基乙醇)，在室溫下攪拌5分鐘，然后用2M乙酸鈉(pH 4.5)中和，加入TE飽和苯酚進一步攪拌。向其中加入氯仿-異戊醇(24∶1)，攪拌后，通過離心，將用苯酚變性的菌體成分分離?；厥丈蠈?水層)，用異丙醇沉淀核酸。
將該沉淀溶解于TE緩沖液(10mM Tris-鹽酸(pH 8.0)、1mMEDTA)，使核酸濃度為1mg/ml，用2.5M氯化鋰沉淀(5℃、2小時)。離心回收該沉淀，用70％乙醇洗滌，然后重新溶解于TE緩沖液，以此作為總RNA級分。用mRNA純化試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)從總RNA級分中純化mRNA。并以該mRNA為模板，使用Time SavercDNA合成試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)合成cDNA。
以PF1022菌株(FERM-2671)的cDNA為模板，使用SuperTaq premixkit(Sawaday Technology)，進行降落PCR在94℃進行1分鐘的熱變性處理后，以94℃ 1分鐘、50℃ 2分鐘、72℃ 2分鐘進行7個循環(huán)，之后，每輪將退火溫度下降3℃，共計進行28個循環(huán)。
結(jié)果，擴增了約270bp的片段。將其進行瓊脂糖凝膠電泳，使用Sephagrass band prep Kit(Pharmacia Biotech)純化目標(biāo)片段。將其連接到pT7-blue T載體(Novagen)。用自動讀取測序試劑盒和ALF DNA測序儀II(Pharmacia Biotech)進行序列分析，結(jié)果該PCR片段包含了編碼SEQ ID NO.27的氨基酸序列中第171號到第251號的序列。
通過噬菌斑雜交進行分支酸變位酶基因的克隆將實施例5記載的PF1022菌株(FERM-2671)的染色體DNA文庫轉(zhuǎn)移到HiBond-N+(Amersham)，以上述約270bp的PCR片段作為探針，通過DIG系統(tǒng)(Behringer Mannheim)進行噬菌斑雜交。結(jié)果得到6種陽性克隆。這6種陽性克隆中，將與PF1022菌株(FERM-2671)的染色體DNA的DNA印跡分析顯示相同的限制酶片段長度的約7kbp的XbaI片段克隆到pUC18，得到質(zhì)粒pCM-Xba。
利用該質(zhì)粒，使用applied Biosystems公司制造的ABIPRISM 377測序儀進行核苷酸序列的分析。XbaI片段的限制性酶切圖譜和分支酸變位酶基因的位置如圖13所示。從核苷酸序列的分析可推定分支酸變位酶基因中存在1個內(nèi)含子，其存在可從cDNA的分析中證實。分支酸變位酶基因的核苷酸序列和由其推定的氨基酸序列分別如SEQ IDNO.26和SEQ ID NO.27所示。
實施例9PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌的分支酸變位酶基因的破壞如圖14所示，構(gòu)建分支酸變位酶基因破壞用的質(zhì)粒。用限制酶XbaI消化實施例5中記載的質(zhì)粒pABPd(圖10)，制備含有越霉素抗性基因的約3kbp的DNA。將該DNA片段用綠豆核酸酶(Nippon Gene)處理，產(chǎn)生平端。接著，用限制酶HpaI消化實施例8中記載的質(zhì)粒pCM-Xba，用磷酸酶處理后，與上述平端DNA片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒pCMHRV4。
用限制酶XbaI消化pCMHRV4，通過瓊脂糖凝膠電泳提取并純化約10kbp的DNA，然后溶解于TE緩沖液(10mM Tris-鹽酸(pH 8.0)、1mMEDTA)，使其濃度為1μg/μl。將該DNA溶液用于下面的轉(zhuǎn)化實驗。
PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌的轉(zhuǎn)化按照國際公開WO97/00944號的實施例1記載的方法進行。具體步驟如下將PF1022菌株(FERM BP-2671)在實施例5中記載的種子培養(yǎng)基上、在26℃下培養(yǎng)48小時。之后，通過離心(3000rpm、10分鐘)收集菌絲體，用0.5M蔗糖溶液洗滌。將得到的菌絲體置于含有3mg/ml β-葡糖醛酸糖苷酶(Sigma)、1mg/ml殼多糖酶(Sigma)和1mg/ml消解酶(生化學(xué)工業(yè))的0.5M蔗糖溶液中，在30℃下振蕩2小時，原生質(zhì)體。將得到的混合物過濾，除去菌體殘渣。用SUTC緩沖液(0.5M蔗糖、10mM Tris-鹽酸(pH7.5)、10mM氯化鈣)通過2次離心(2500rpm、10分鐘、4℃)洗滌原生質(zhì)體，然后用SUTC緩沖液配制1×107個/ml的原生質(zhì)體懸浮液。
向100μl原生質(zhì)體懸浮液中加入之前制備的DNA溶液，將得到的混合物在冰冷卻下放置5分鐘。之后，向該混合物中加入400μl聚乙二醇溶液(60％聚乙二醇4000(和光純藥)、10mM Tris-鹽酸(pH 7.5)、10mM氯化鈣)，將得到的混合物在冰冷卻下放置20分鐘。
用SUTC緩沖液洗滌如上處理的原生質(zhì)體，然后重懸浮于相同的緩沖液中。將得到的懸浮液與馬鈴薯葡萄糖軟瓊脂培養(yǎng)基一起鋪于含有25μg/ml的潮霉素B和0.5M蔗糖的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上。在26℃下培養(yǎng)5天，出現(xiàn)的菌落為轉(zhuǎn)化體。
將得到的轉(zhuǎn)化體接種于基本培養(yǎng)基(0.5％葡萄糖、0.67％酵母含氮堿(yeast nitrogen base)w/o氨基酸(amino acids)(Difco)、0.12％谷氨酸鈉、0.14％天冬氨酸、2μg/ml氯化可啉、1.5％純化瓊脂(Sigma))時，存在不生長的菌株(V4M-11菌株)。另一方面也證實將V4M-11菌株接種于添加了50μg/ml苯丙氨酸的基本培養(yǎng)基時，則恢復(fù)生長。因此表明，V4M-11菌株顯示為苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型。
接著，如下測定V4M-11菌株的分支酸變位酶活性。將親株和V4M-11菌株在實施例5中記載的條件下培養(yǎng)，然后離心收集菌體，將懸浮于破碎用緩沖液(50mM Tris-鹽酸(pH 8.0)、5mM EDTA、1mMDTT、1mM PMSF、10％甘油)。將該懸浮液進行超聲波處理后，離心收集上清液，以此作為細(xì)胞提取液。將30μl細(xì)胞提取液、20μl 1M Tris-鹽酸(pH 8.0)、50μl 2mM分支酸鋇(Sigma)混合，在30℃保溫1小時。
接著，加入100μl 1N鹽酸，在30℃保溫15分鐘，再加入800μl IN氫氧化鈉溶液，測定320nm下的溶液吸光度。以加入1N鹽酸后加入2mM分支酸鋇的試樣作為對照。結(jié)果如以下表1所示。
表1

以上結(jié)果表明V4M-11菌株喪失分支酸變位酶活性。
實施例10PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌分支酸變位酶基因破壞菌株(苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主)的轉(zhuǎn)化將1μg pPF260-A4、3μg pPF260-A3、3μg pPF260-B3和3μgpPF260-C3混合，用乙醇沉淀后，重新溶解于10μl TE緩沖液(10mM Tris-鹽酸(pH 8.0)、1mM EDTA)。除添加50μg/ml雙丙氨膦取代潮霉素以外，使用上述制備的DNA溶液，按照實施例9記載的方法轉(zhuǎn)化V4M-11菌株。
從得到的轉(zhuǎn)化體中制備染色體DNA，以此為模板進行PCR，除了循環(huán)次數(shù)為25個循環(huán)以外，均按照實施例2、3和4記載的條件進行PCR，進行papA、papB和papC基因的檢測。結(jié)果，選擇出全部3種基因均被導(dǎo)入的轉(zhuǎn)化體TF-57菌株。
實施例11轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)和PF1022-220的檢測將在實施例10中選擇出的轉(zhuǎn)化體TF-57菌株按照國際公開WO97/20945號記載的條件進行培養(yǎng)。即，在實施例5中記載的種子培養(yǎng)基中、在26℃下培養(yǎng)2天。將2ml得到的培養(yǎng)液接種于50ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(0.6％麥胚、1.0％藥物介質(zhì)(pharma media)、2.6％可溶性淀粉、6.0％麥芽糖、0.2％MeSO4·7H2O、0.2％NaCl)，并在26℃下培養(yǎng)6天。培養(yǎng)結(jié)束后，從40ml培養(yǎng)液中離心收集菌體，用30ml的乙酸乙酯提取。將提取液濃縮干燥后，重新溶解于4ml的甲醇。取其中10μl進行HPLC分析。
HPLC的條件如下HPLC系統(tǒng)島津制作所LC-10ADVP柱Inertsil ODS-2 4.6×250mm流動相乙腈∶水＝70∶30流速1.0ml/min柱溫40℃檢測器島津制作所 紫外可見光檢測器 SPD-M10AVPUV波長272nm如圖15所示，在轉(zhuǎn)化體TF-57菌株中檢出與PF1022-220標(biāo)準(zhǔn)品(20.308min)的保留時間一致的峰(20.520min)。另外，在將來源于轉(zhuǎn)化體的提取液與標(biāo)準(zhǔn)品混合之后進行的HPLC分析實驗中，顯示該峰與標(biāo)準(zhǔn)品的峰完全重疊(20.470min)。進一步使用LC-MS(四極臺式LC/MS系統(tǒng)NAVIGATOR with aQaTM(Thermoquest))對該峰所含的物質(zhì)進行質(zhì)譜分析，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品一致。上述結(jié)果表明轉(zhuǎn)化體TF-57菌株生產(chǎn)PF1022物質(zhì)的衍生物PF1022-220。
實施例12轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)和PF1022-260的檢測將在實施例10中選擇出的轉(zhuǎn)化體TF-57菌株按照實施例11記載的條件進行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，從500ml培養(yǎng)液中離心收集菌體，用500ml甲醇提取。將提取液濃縮干燥后，重新溶解于2ml的甲醇。取其中10μl進行HPLC分析。
HPLC的條件如下HPLC系統(tǒng)島津制作所LC-10ADVP柱Inertsil ODS-2 4.6×250mm流動相乙腈∶水＝55∶45流速1.0ml/min柱溫40℃檢測器島津制作所紫外可見光檢測器SPD-M10AVPUV波長245nm如圖16所示，在轉(zhuǎn)化體TF-57菌株中檢出與PF1022-260標(biāo)準(zhǔn)品(27.337min)的保留時間一致的峰(27.301min)。進一步使用LC-MS(四極臺式LC/MS系統(tǒng)NAVIGATOR with aQaTM(Thermoquest))對該峰所含的物質(zhì)進行質(zhì)譜分析，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品一致。上述結(jié)果表明轉(zhuǎn)化體TF-57菌株生產(chǎn)PF1022物質(zhì)的衍生物PF1022-260。
實施例13預(yù)苯酸脫水酶(PDT)的部分純化將PF1022菌株(FERM BP-2671)在實施例11中記載的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，從約700ml得到的培養(yǎng)液中離心(9000×g、30分鐘)回收菌體，將沉淀懸浮于破碎用緩沖液(50mM Tris-鹽酸(pH 8.0)、5mMEDTA、1mM DTT、1mM PMSF、20％甘油)，洗滌菌體。進一步進行離心(9000×g、30分鐘)，將生成的沉淀重懸浮于800ml上述破碎用緩沖液，制成菌體懸浮液。
將菌體懸浮液用超聲波處理(10分鐘、3次)，然后離心(9000×g、30分鐘、2次)，除去菌體殘渣，制成細(xì)胞提取液。將該細(xì)胞提取液進行Q Sepharose Fast Flow柱層析(Amersham Pharmacia Biotech、2.6×32cm)。流速為1ml/分鐘。之后，用540ml緩沖液A(50mM Tris-鹽酸(pH 8.0)、1mM DTT、20％甘油)洗滌柱。進一步用含有1M氯化鈉的緩沖液A，以總量為730ml的0-1.0M氯化鈉的線性濃度梯度洗脫蛋白質(zhì)。開始濃度梯度洗脫300分鐘后，以20ml分部收集，如下測定各流分的PDT活性。即，將20μl 2mM預(yù)苯酸鋇(Sigma)、8μl 1MTris-HCl(pH 7.0)、12μl酶試樣混合，在30℃下保溫30分鐘，然后加入360μl1N氫氧化鈉溶液，測定320nm的吸光度。結(jié)果，在第13號到第16號的流分中檢出強活性，將它們匯總，作為Q Sepharose流分(80ml)。
接著，向全量的Q Sepharose流分中加入19.36g硫酸銨，進行離心(20,000×g、15分鐘)，除去沉淀，回收上清液。將上清液進行Butyl-Toyopearl 650S柱層析(Toso，1.6×25cm)。流速為1ml/分鐘。用含有1.6M硫酸銨的緩沖液A洗滌柱，之后用緩沖液A進行總量為100ml的1.6-0M硫酸銨的線性濃度梯度洗脫，進一步用50ml緩沖液A洗脫蛋白質(zhì)。濃度梯度洗脫開始50分鐘后，以5ml分部收集，如下測定各流分的PDT活性。結(jié)果，在第8號到第15號的流分中檢出活性，將它們匯總，作為Butyl-Toyopearl流分(40ml)。
向全量的Butyl-Toyopearl流分中加入13.48g硫酸銨，離心(20,000×g、15分鐘)回收生成的沉淀。將該沉淀溶解于1ml緩沖液B(50mM磷酸鈉(pH 7.0)、1mM DTT、20％甘油)，進行HiLoad 26/60Superdex200pg(Amersham Pharmacia Biotech、2.6×60cm)，用緩沖液B進行洗脫。流速為1ml/分鐘。填入試樣后，在第160分鐘到第220分鐘之間以5ml分部收集，測定各流分的PDT活性。結(jié)果，在第4號到第8號的流分中檢出活性，將它們匯總，作為Superdex200流分(25ml)。
將全量的Superdex200流分進行Macro-Prep Hydroxyapatite(羥基磷灰石)柱層析(Bio-Rad，0.5×20cm)，用緩沖液B進行洗脫。流速為0.5ml/分鐘。填入試樣后以2ml分部收集，測定各流分的PDT活性。結(jié)果，在第2號到第25號的流分中檢出活性，將它們匯總，作為羥基磷灰石流分(38ml)。
將全量羥基磷灰石流分用CENTRICON PLUS-20(Millipore)濃縮，進行HiTrap Blue HP(Amersham Pharmacia Biotech、5ml)層析，用緩沖液B進行洗脫。流速為1ml/分鐘。填入試樣后以2ml分部收集，測定各流分的PDT活性。結(jié)果，在第6號到第22號的流分中檢出活性，將它們匯總，作為HiTrap Blue流分(34ml)。
將全量HiTrap Blue流分用CENTRICON PLUS-20和Microcon-10(Amicon)濃縮后，進行Superdex75 HR(Amersham Pharmacia Biotech，1.0×30cm)層析，用緩沖液B進行洗脫。流速為0.25ml/分鐘。填入試樣20分鐘后，以0.5ml分部收集，測定各流分的PDT活性。結(jié)果，在第7號到第11號的流分中檢出活性。通過SDS-PAGE對第5號到第13號的流分進行分析，結(jié)果由于約35kDa蛋白質(zhì)的條帶的強弱與酶活性的強弱一致，因此鑒定所得到的蛋白質(zhì)為PDT。
實施例14PDT的部分氨基酸序列的測定(1)N末端氨基酸序列將實施例13中得到的活性流分進行SDS-PAGE(TEFCO)，用Multifor II(Amersham Pharmacia Biotech)將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印到PVDF膜(Immobilon-PSQMillipore)，用考馬斯亮藍(lán)-G250(Nakarai Tesque)染色后，水洗風(fēng)干。從其中切下分子量約為35kDa的條帶，用蛋白質(zhì)測序儀Model 492(Applied Biosystems)分析N末端氨基酸序列。結(jié)果得到下述序列。X表示未確定的氨基酸。
N末端氨基酸序列GHTSAGDAGSKPVVXFLGPISSY(23個殘基)(SEQ ID NO.28)(2)內(nèi)部氨基酸序列分析(肽作圖)將實施例13中純化的活性流分進行SDS-PAGE，用考馬斯亮藍(lán)-R250(Nakarai Tesque)染色后，切下約為35kDa的條帶，在用50％乙腈配制的0.2M碳酸氫銨緩沖液(pH 8.0)中，在30℃下使其完全脫色，在室溫下風(fēng)干2小時。用含0.02％吐溫20的0.2M碳酸氫銨緩沖液(pH 8.0)潤濕該小凝膠片，加入相對于蛋白質(zhì)的1/50摩爾的胰蛋白酶(Promega)，在37℃下放置10分鐘，然后浸于上述緩沖液，在37℃下反應(yīng)2天?；厥辗磻?yīng)后的上清液，進一步用60％乙腈、0.1％三氟乙酸從凝膠片中回收分解產(chǎn)物，與反應(yīng)上清液合并、濃縮，使用Model 172μ制備型HPLC系統(tǒng)(Applied Biosystems)進行柱層析(RP.300 Aquapore C18,220×2.1mm，0.1％三氟乙酸、5％乙腈～0.085％三氟乙酸、35％乙腈的濃度梯度)，分部收集3種肽。將得到的肽用蛋白質(zhì)測序儀測定序列。T-19.4GVETVDVSSTSR(12個殘基)(SEQ ID NO.29)T-21.0TLDHFADR(8個殘基)(SEQ ID NO.30)T-33.4FFVLR (5個殘基)(SEQ ID NO.31)T-47.1AFPLEQFDLMPVTTIK(16個殘基)(SEQ ID NO.32)實施例15PDT基因的分離以實施例14中測定的N末端氨基酸序列(SEQ ID NO.28)中第4號到第9號的氨基酸序列(PDTN-4，5，6)為基礎(chǔ)，合成下述5’一側(cè)的引物。PDTN-4TCYGCNGGNGAYGCNGG (SEQ ID NO.33)PDTN-5TCRGCNGGNGAYGCNGG (SEQ ID NO.34)PDTN-6AGYGCNGGNGAYGCNGG (SEQ ID NO.35)
另外，以SEQ ID NO.32氨基酸序列中第5號到第11號的氨基酸序列為基礎(chǔ)，合成下述3’一側(cè)的引物。PDTC-3GGCATNARRTCRAAYTGYTC(SEQ ID NO.36)使用上述引物，以PDTN-4×PDTC-3、PDTN-5×PDTC-3、PDTN-6×PDTC-3的組合進行PCR。PCR反應(yīng)使用KOD Dash(東洋紡織)作為DNA聚合酶，用PERKIN ELMER GenAmp PCR System 9700進行。反應(yīng)液包括1μl用實施例5中記載的方法制備的PF1022菌株(FERMBP-2671)的基因組DNA(相當(dāng)于1μg的量)、5μl隨酶附帶的10倍濃度反應(yīng)用緩沖液、5μl 2mM dNTP溶液、調(diào)節(jié)為100pmol/μl濃度的上述引物各1μl、5μl二甲基亞砜(特級，和光純藥)、1μl KOD Dash、31μl無菌水，配制為50μl。反應(yīng)條件是94℃下預(yù)處理5分鐘后，進行94℃30秒、55℃30秒、74℃30秒的保溫，共進行30次循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以PDTN-6×PDTC-3組合特異性擴增了約200bp的DNA片段。
接著，從瓊脂糖凝膠中切下該約200bp的DNA片段，提取、純化后，用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)進行克隆。用Perkin Elmer公司制造的熒光DNA測序儀ABI PRISM 310 Genetic Analyzer對得到的質(zhì)粒的插入片段進行核苷酸序列分析，結(jié)果表明該片段編碼的序列與從N末端和肽測定的部分氨基酸序列一致，顯示得到的DNA片段是PDT基因的一部分。
以該DNA片段作為探針，用Alkphos Direct Labelling and DetectionSystem(Amersham Pharmacia Biotech)篩選實施例5中構(gòu)建的PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌的基因組文庫。從得到的陽性克隆中提取噬菌體DNA，用限制酶進行分析，結(jié)果表明作為與上述探針雜交的DNA片段，存在約8.2kbp的SacI片段，因此將該DNA片段亞克隆到pUC118中，得到了質(zhì)粒pUC-PDT。利用該質(zhì)粒，采用Applied Biosystems公司制造的ABI PRISM 377測序儀進行核苷酸序列分析。圖17顯示了SacI片段的限制性酶切圖譜和PDT基因的位置。由核苷酸序列分析可以推斷PDT基因中存在2個內(nèi)含子，其存在已由cDNA分析得到證實。PDT基因的核苷酸序列和由其推斷的氨基酸序列分別如SEQ ID NO.37和SEQ IDNO.38所示。SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列中，第91～192號和第254～380號的核苷酸序列分別是內(nèi)含子。
實施例16構(gòu)建PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌的PDT基因破壞用質(zhì)粒PDT基因破壞用的質(zhì)粒pDPDT如下所示進行構(gòu)建。
首先，以含有市售的殺稻瘟素S抗性基因(BSD)的質(zhì)粒pUCSV-BSD(Funakoshi)作為模板DNA，以SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40記載的寡核苷酸作為引物，按照實施例2中記載的方法進行PCR。反應(yīng)結(jié)束后，將部分反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果證實特異性擴增了約0.4kbp的DNA片段。將余下的反應(yīng)液用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取，進行乙醇沉淀。將沉淀重新溶解于無菌水，取60μl用限制酶ClaI和BglII消化，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，按照常規(guī)方法切下約0.4kbp的條帶，回收DNA片段。
接著，用限制酶ClaI和BamHI消化質(zhì)粒pDHBAR(Watanabe，M.等，Appl.Environ.MiCrobiol.，65，1036-1044(1999))，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，按照常規(guī)方法切下約2kbp的條帶，回收DNA片段。將該DNA片段與上述約0.4kbp的DNA片段連接，得到質(zhì)粒pDHBSD。用限制酶XbaI消化該質(zhì)粒，使用DNA平端化試劑盒(寶酒造)產(chǎn)生平端，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，按照常規(guī)方法切下約2.4kbp的條帶，回收DNA片段。
接著，用限制酶EcoRV部分消化實施例15中記載的質(zhì)粒pUC-PDT，然后按照常規(guī)方法切下約11.1kbp的條帶，回收DNA片段。將該DNA片段與上述約2.4kbp的DNA片段連接，得到質(zhì)粒pDPDT(圖18)。
實施例17PF1022物質(zhì)生產(chǎn)菌的PDT基因的破壞用限制酶SacI消化實施例16中記載的質(zhì)粒pDPDT，然后溶解于TE緩沖液(10mM Tris-鹽酸(pH8.0)、1mM EDTA)，使其濃度為1μg/μl。按照實施例9中記載的方法，用該DNA溶液轉(zhuǎn)化TF-57菌株(記載于實施例10)。此時，使用100μg/ml的殺稻瘟素S代替潮霉素B作為選擇轉(zhuǎn)化體用的藥劑。
將得到的約100株轉(zhuǎn)化體在實施例5記載的條件下培養(yǎng)，離心收集菌體，將其懸浮于破碎用緩沖液(50mM Tris-鹽酸(pH8.0)、5mMEDTA、1mM DTT、1mM PMSF、10％甘油)。將該懸浮液用超聲波處理后離心收集上清液，以此作為細(xì)胞提取液。使用該細(xì)胞提取液，按照實施例13記載的方法測定PDT活性，結(jié)果有5株未檢出PDT活性，表明這些菌株喪失了PDT活性。
從這些菌株中選擇TF-45菌株，與親株TF-57菌株一起按照實施例1記載的方法培養(yǎng)，進行PF1022-220的檢測。結(jié)果如圖19所示。TF-57菌株在20.303分鐘的位置、TF-45菌株在20.294分鐘的位置分別檢出PF1022-220，TF-45菌株的該峰面積是TF-57菌株約4倍。以上結(jié)果表明，通過使PDT活性喪失，可以提高PF1022-220的生產(chǎn)率。
序列表<110>明治制果株式會社(Meiji Seika Kaisha，Ltd.)<120>生產(chǎn)PF1022衍生物的轉(zhuǎn)化體和生產(chǎn)所述衍生物的方法以及新型生物合成基因<130>135522PX<140>
<141>
<150>82227/2001<151>2001-03-22<160>40<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2061<212>DNA<213>Streptomyces venezuelae<220>
<221>CDS<222>(1)..(2058)<400>1atg cgc acg ctt ctg atc gac aac tac gac tcg ttc acc cac aac ctg 48Met Arg Thr Leu Leu Ile Asp Asn Tyr Asp Ser Phe Thr His Asn Leu1 5 10 15ttc cag tac atc ggc gag gcc acc ggg caa ccc ccc gtc gtc gtg ccc 96Phe Gln Tyr Ile Gly Glu Ala Thr Gly Gln Pro Pro Val Val Val Pro20 25 30
aac gac gcc gac tgg tcg cgg ctg ccc gtc gag gac ttc gac gcg atc 144Asn Asp Ala Asp Trp Ser Arg Leu Pro Val Glu Asp Phe Asp Ala Ile35 40 45gtc gtg tcc ccg ggc ccc ggc agc ccc gac cgg gaa cgg gac ttc gga 192Val Val Ser Pro Gly Pro Gly Ser Pro Asp Arg Glu Arg Asp Phe Gly50 55 60atc agc cgc cgg gcg atc acc gac agc ggc ctg ccc gtc ctc ggc gtc 240Ile Ser Arg Arg Ala Ile Thr Asp Ser Gly Leu Pro Val Leu Gly Val65 70 75 80tgc ctc ggc cac cag ggc atc gcc cag ctc ttc ggc gga acc gtc ggc 288Cys Leu Gly His Gln Gly Ile Ala Gln Leu Phe Gly Gly Thr Val Gly85 90 95ctc gcc ccg gaa ccc atg cac ggc cgg gtc tcc gag gtg cgg cac acc 336Leu Ala Pro Glu Pro Met His Gly Arg Val Ser Glu Val Arg His Thr100 105 110ggc gag gac gtc ttc cgg ggc ctc ccc tcg ccg ttc acc gcc gtg cgc 384Gly Glu Asp Val Phe Arg Gly Leu Pro Ser Pro Phe Thr Ala Val Arg115 120 125tac cac tcc ctg gcc gcc acc gac ctc ccc gac gag ctc gaa ccc ctc 432Tyr His Ser Leu Ala Ala Thr Asp Leu Pro Asp Glu Leu Glu Pro Leu130 135 140gcc tgg agc gac gac ggg gtc gtc atg ggc ctg cgg cac cgc gag aag 480Ala Trp Ser Asp Asp Gly Val Val Met Gly Leu Arg His Arg Glu Lys145 150 155 160ccg ctg tgg ggc gtc cag ttc cac ccg gag tcc atc ggc agc gac ttc 528Pro Leu Trp Gly Val Gln Phe His Pro Glu Ser Ile Gly Ser Asp Phe165 170 175
ggc cgg gag atc atg gcc aac ttc cgc gac ctc gcc ctc gcc cac cac 576Gly Arg Glu Ile Met Ala Asn Phe Arg Asp Leu Ala Leu Ala His His180 185 190cgg gca cgg cgc cac ggg gcc gac tcc ccg tac gaa ctc cae gtg cgc 624Arg Ala Arg Arg His Gly Ala Asp Ser Pro Tyr Glu Leu His Val Arg195 200 205cgc gtc gac gtg ctg ccg gac gcc gaa gag gta cgc cgc ggc tgc ctg 672Arg Val Asp Val Leu Pro Asp Ala Glu Glu Val Arg Arg Gly Cys Leu210 215 220ccc ggc gag ggc acc acg ttc tgg ctg gac agc agc tcc gtc ctc gaa 720Pro Gly Glu Gly Thr Thr Phe Trp Leu Asp Ser Ser Ser Val Leu Glu225 230 235 240ggc gcc tcg cgc ttc tcc ttc ctc ggc gac gac cgc ggc ccg ctc gcc 768Gly Ala Ser Arg Phe Ser Phe Leu Gly Asp Asp Arg Gly Pro Leu Ala245 250 255gag tac ctc acc tac cgc gtc gcc gac ggc gtc gtc tcc gtc cgc ggc 816Glu Tyr Leu Thr Tyr Arg Val Ala Asp Gly Val Val Ser Val Arg Gly260 265 270tcc gac ggc acc acg acc cgg acg cgg cgc ccc ttc ttc aac tac ctg 864Ser Asp Gly Thr Thr Thr Arg Thr Arg Arg Pro Phe Phe Asn Tyr Leu275 280 285gag gag cag ctc gaa cgc cga cgg gtc ccc gtc gcc ccc gaa ctg ccc 912Glu Glu Gln Leu Glu Arg Arg Arg Val Pro Val Ala Pro Glu Leu Pro290 295 300ttc gag ttc aac ctc ggc tac gtc ggc tac ctc ggc tac gag ctg aag 960Phe Glu Phe Asn Leu Gly Tyr Val Gly Tyr Leu Gly Tyr Glu Leu Lys305 310 315 320gcg gag acc acc ggc gac ccc gcg cac cgg tcc ccg cac ccc gac gcc 1008
Ala Glu Thr Thr Gly Asp Pro Ala His Arg Ser Pro His Pro Asp Ala325 330 335gcg ttc ctc ttc gcc gac cgc gcc atc gcc ctc gac cac cag gaa ggc 1056Ala Phe Leu Phe Ala Asp Arg Ala Ile Ala Leu Asp His Gln Glu Gly340 345 350tgc tgc tac ctg ctg gcc ctc gac cgc cgg ggc cac gac gac ggc gcc 1104Cys Cys Tyr Leu Leu Ala Leu Asp Arg Arg Gly His Asp Asp Gly Ala355 360 365cgc gcc tgg ctg cgg gag acg gcc gag acc ctc acc ggc ctg gcc gtc 1152Arg Ala Trp Leu Arg Glu Thr Ala Glu Thr Leu Thr Gly Leu Ala Val370 375 380cgc gcc ccg gcc gag ccg acc ccc gcc atg gtc ttc ggg atc ccc gag 1200Arg Ala Pro Ala Glu Pro Thr Pro Ala Met Val Phe Gly Ile Pro Glu385 390 395 400gcg gcg gcc ggc ttc ggc ccc ctg gcc cgc gcg cgc cac gac aag gac 1248Ala Ala Ala Gly Phe Gly Pro Leu Ala Arg Ala Arg His Asp Lys Asp405 410 415gcc tac ctc aag cgc atc gac gag tgc ctc aag gag atc cgc aac ggc 1296Ala Tyr Leu Lys Arg Ile Asp Glu Cys Leu Lys Glu Ile Arg Asn Gly420 425 430gag tcg tac gag atc tgc ctg acc aac atg gtc acc gcg ccg acc gag 1344Glu Ser Tyr Glu Ile Cys Leu Thr Asn Met Val Thr Ala Pro Thr Glu435 440 445gcg acg gcc ctg ccg ctc tac tcc gcg ctg cgc gcc atc agc ccc gtc 1392Ala Thr Ala Leu Pro Leu Tyr Ser Ala Leu Arg Ala Ile Ser Pro Val450 455 460ccg tac ggc gcc ctg ctc gag ttc ccc gaa ctg tcg gtg ctg agc gcc 1440Pro Tyr Gly Ala Leu Leu Glu Phe Pro Glu Leu Ser Val Leu Ser Ala
465 470 475 480tcg ccc gag cgg ttc ctc acg atc ggc gcc gac ggc ggc gtc gag tcc 1488Ser Pro Glu Arg Phe Leu Thr Ile Gly Ala Asp Gly Gly Val Glu Ser485 490 495aag ccc atc aag ggg acc cgc ccc cgg ggc ggc acc gcg gag gag gac 1536Lys Pro Ile Lys Gly Thr Arg Pro Arg Gly Gly Thr Ala Glu Glu Asp500 505 510gag cgg ctc cgc gcc gac ctg gcc ggc cgg gag aag gac cgg gcc gag 1584Glu Arg Leu Arg Ala Asp Leu Ala Gly Arg Glu Lys Asp Arg Ala Glu515 520 525aac ctg atg atc gtc gac ctg gtc cgc aac gac ctc aac agc gtc tgc 1632Asn Leu Met Ile Val Asp Leu Val Arg Asn Asp Leu Asn Ser Val Cys530 535 540gcg atc ggc tcc gtc cac gtg ccc cgg ctc ttc gag gtg gag acc tac 1680Ala Ile Gly Ser Val His Val Pro Arg Leu Phe Glu Val Glu Thr Tyr545 550 555 560gcg ccc gtg cac cag ctg gtg tcg acc atc cgg gga cgg ctg cgg ccc 1728Ala Pro Val His Gln Leu Val Ser Thr Ile Arg Gly Arg Leu Arg Pro565 570 575ggc acc agc acc gcc gcc tgc gta cgc gcc gcc ttc ccc ggc ggc tcc 1776Gly Thr Ser Thr Ala Ala Cys Val Arg Ala Ala Phe Pro Gly Gly Ser580 585 590atg acc ggc gcg ccc aag aag cgc acc atg gag atc atc gac cgc ctg 1824Met Thr Gly Ala Pro Lys Lys Arg Thr Met Glu Ile Ile Asp Arg Leu595 600 605gag gaa ggc ccc cgg ggc gtc tac tcc ggg gcg ctc gga tgg ttc gcc 1872Glu Glu Gly Pro Arg Gly Val Tyr Ser Gly Ala Leu Gly Trp Phe Ala610 615 620
ctc agc ggc gcc gcc gac ctc agc atc gtc atc cgc acc atc gtg ctg 1920Leu Ser Gly Ala Ala Asp Leu Ser Ile Val Ile Arg Thr Ile Val Leu625 630 635 640gcc gac ggc cag gcg gag ttc ggc gtc ggc ggg gcg atc gtg tcc ctc 1968Ala Asp Gly Gln Ala Glu Phe Gly Val Gly Gly Ala Ile Val Ser Leu645 650 655tcc gac cag gag gag gag ttc acc gag acc gtg gta aag gcc cgc gcc 2016Ser Asp Gln Glu Glu Glu Phe Thr Glu Thr Val Val Lys Ala Arg Ala660 665 670atg gtc acc gcc ctc gac ggc agc gcc gtg gcg ggc gcc cga tga 2061Met Val Thr Ala Leu Asp Gly Ser Ala Val Ala Gly Ala Arg675 680 685<210>2<211>686<212>PRT<213>Streptomyces venezuelae<400>2Met Arg Thr Leu Leu Ile Asp Asn Tyr Asp Ser Phe Thr His Asn Leu1 5 10 15Phe Gln Tyr Ile Gly Glu Ala Thr Gly Gln Pro Pro Val Val Val Pro20 25 30Asn Asp Ala Asp Trp Ser Arg Leu Pro Val Glu Asp Phe Asp Ala Ile35 40 45Val Val Ser Pro Gly Pro Gly Ser Pro Asp Arg Glu Arg Asp Phe Gly50 55 60Ile Ser Arg Arg Ala Ile Thr Asp Ser Gly Leu Pro Val Leu Gly Val
65 70 75 80Cys Leu Gly His Gln Gly Ile Ala Gln Leu Phe Gly Gly Thr Val Gly85 90 95Leu Ala Pro Glu Pro Met His Gly Arg Val Ser Glu Val Arg His Thr100 105 110Gly Glu Asp Val Phe Arg Gly Leu Pro Ser Pro Phe Thr Ala Val Arg115 120 125Tyr His Ser Leu Ala Ala Thr Asp Leu Pro Asp Glu Leu Glu Pro Leu130 135 140Ala Trp Ser Asp Asp Gly Val Val Met Gly Leu Arg His Arg Glu Lys145 150 155 160Pro Leu Trp Gly Val Gln Phe His Pro Glu Ser Ile Gly Ser Asp Phe165 170 175Gly Arg Glu Ile Met Ala Asn Phe Arg Asp Leu Ala Leu Ala His His180 185 190Arg Ala Arg Arg His Gly Ala Asp Ser Pro Tyr Glu Leu His Val Arg195 200 205Arg Val Asp Val Leu Pro Asp Ala Glu Glu Val Arg Arg Gly Cys Leu210 215 220Pro Gly Glu Gly Thr Thr Phe Trp Leu Asp Ser Ser Sar Val Leu Glu225 230 235 240Gly Ala Ser Arg Phe Ser Phe Leu Gly Asp Asp Arg Gly Pro Leu Ala245 250 255Glu Tyr Leu Thr Tyr Arg Val Ala Asp Gly Val Val Ser Val Arg Gly260 265 270
Ser Asp Gly Thr Thr Thr Arg Thr Arg Arg Pro Phe Phe Asn Tyr Leu275 280 285Glu Glu Gln Leu Glu Arg Arg Arg Val Pro Val Ala Pro Glu Leu Pro290 295 300Phe Glu Phe Asn Leu Gly Tyr Val Gly Tyr Leu Gly Tyr Glu Leu Lys305 310 315 320Ala Glu Thr Thr Gly Asp Pro Ala His Arg Ser Pro His Pro Asp Ala325 330 335Ala Phe Leu Phe Ala Asp Arg Ala Ile Ala Leu Asp His Gln Glu Gly340 345 350Cys Cys Tyr Leu Leu Ala Leu Asp Arg Arg Gly His Asp Asp Gly Ala355 360 366Arg Ala Trp Leu Arg Glu Thr Ala Glu Thr Leu Thr Gly Leu Ala Val370 375 380Arg Ala Pro Ala Glu Pro Thr Pro Ala Met Val Phe Gly Ile Pro Glu385 390 395 400Ala Ala Ala Gly Phe Gly Pro Leu Ala Arg Ala Arg His Asp Lys Asp405 410 415Ala Tyr Leu Lys Arg Ile Asp Glu Cys Leu Lys Glu Ile Arg Asn Gly420 425 430Glu Ser Tyr Glu Ile Cys Leu Thr Asn Met Val Thr Ala Pro Thr Glu435 440 445Ala Thr Ala Leu Pro Leu Tyr Ser Ala Leu Arg Ala Ile Ser Pro Val450 455 460
Pro Tyr Gly Ala Leu Leu Glu Phe Pro Glu Leu Ser Val Leu Ser Ala465 470 475 480Ser Pro Glu Arg Phe Leu Thr Ile Gly Ala Asp Gly Gly Val Glu Ser485 490 495Lys Pro Ile Lys Gly Thr Arg Pro Arg Gly Gly Thr Ala Glu Glu Asp500 505 510Glu Arg Leu Arg Ala Asp Leu Ala Gly Arg Glu Lys Asp Arg Ala Glu515 520 525Asn Leu Met Ile Val Asp Leu Val Arg Asn Asp Leu Asn Ser Val Cys530 535 540Ala Ile Gly Ser Val His Val Pro Arg Leu Phe Glu Val Glu Thr Tyr545 550 555 560Ala Pro Val His Gln Leu Val Ser Thr Ile Arg Gly Arg Leu Arg Pro565 570 575Gly Thr Ser Thr Ala Ala Cys Val Arg Ala Ala Phe Pro Gly Gly Ser580 585 590Met Thr Gly Ala Pro Lys Lys Arg Thr Met Glu Ile Ile Asp Arg Leu595 600 605Glu Glu Gly Pro Arg Gly Val Tyr Ser Gly Ala Leu Gly Trp Phe Ala610 615 620Leu Ser Gly Ala Ala Asp Leu Ser Ile Val Ile Arg Thr Ile Val Leu625 630 635 640Ala Asp Gly Gln Ala Glu Phe Gly Val Gly Gly Ala Ile Val Ser Leu645 650 655Ser Asp Gln Glu Glu Glu Phe Thr Glu Thr Val Val Lys Ala Arg Ala
660 665 670Met Val Thr Ala Leu Asp Gly Ser Ala Val Ala Gly Ala Arg675 680 685<210>3<211>312<212>DNA<213>Streptomyces venezuelae<220>
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atc acg gag atg tgc cgc gtc gag gac ctg gtg atg agc cgg gag agc 288Ile Thr Glu Met Cys Arg Val Glu Asp Leu Val Met Ser Arg Glu Ser85 90 95ctg acg gcc gag gac cgg cgg tga 312Leu Thr Ala Glu Asp Arg Arg100<210>4<211>103<212>PRT<213>Streptomyces venezuelae<400>4Met Thr Glu Gln Asn Glu Leu Gln Arg Leu Arg Ala Glu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Asp Gly Thr Leu Leu Asp Thr Val Arg Arg Arg Ile Asp Leu Gly20 25 30Val Arg Ile Ala Arg Tyr Lys Ser Arg His Gly Val Pro Met Met Gln35 40 45Pro Gly Arg Val Ser Leu Val Lys Asp Arg Ala Ala Arg Tyr Ala Ala50 55 60Asp His Gly Leu Asp Glu Ser Phe Leu Val Asn Leu Tyr Asp Val Ile65 70 75 80Ile Thr Glu Met Cys Arg Val Glu Asp Leu Val Met Ser Arg Glu Ser85 90 95Leu Thr Ala Glu Asp Arg Arg100
<210>5<211>969<212>DNA<213>Streptomyces venezuelae<220>
<221>CDS<222>(1)..(966)<400>5atg agc ggc ttc ccc cgc agc gtc gtc gtc ggc ggc agc ggg gcg gtg48Met Ser Gly Phe Pro Arg Ser Val Val Val Gly Gly Ser Gly Ala Val1 5 10 15ggc ggc atg ttc gcc ggg ctg ctg cgg gag gcg ggc agc cgc acg ctc96Gly Gly Met Phe Ala Gly Leu Leu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Thr Leu20 25 30gtc gtc gac ctc gta ccg ccg ccg gga cgg ccg gac gcc tgc ctg gtg144Val Val Asp Leu Val Pro Pro Pro Gly Arg Pro Asp Ala Cys Leu Val35 40 45ggc gac gtc acc gcg ccg ggg ccc gaa ctc gcg gcc gcc ctc cgg gac192Gly Asp Val Thr Ala Pro Gly Pro Glu Leu Ala Ala Ala Leu Arg Asp50 55 60gcg gac ctc gtc ctg ctc gcc gta cac gag gac gtg gcc ctc aag gcc240Ala Asp Leu Val Leu Leu Ala Val His Glu Asp Val Ala Leu Lys Ala65 70 75 80gtg gcg ccc gtg acc cgg ctc atg cgg ccg ggc gcg ctg ctc gcc gac288Val Ala Pro Val Thr Arg Leu Met Arg Pro Gly Ala Leu Leu Ala Asp85 90 95acc ctg tcc gtc cgg acg ggc atg gcc gcg gag ctc gcg gcc cac gcc336Thr Leu Ser Val Arg Thr Gly Met Ala Ala Glu Leu Ala Ala His Ala
100 105 110ccc ggc gtc cag cac gtg ggc ctc aac ccg atg ttc gcc ccc gcc gcc 384Pro Gly Val Gln His Val Gly Leu Asn Pro Met Phe Ala Pro Ala Ala115 120 125ggc atg acc ggc cga ccc gtg gcc gcc gtg gtc acc agg gac ggg ccg 432Gly Met Thr Gly Arg Pro Val Ala Ala Val Val Thr Arg Asp Gly Pro130 135 140ggc gtc acg gcc ctg ctg cgg ctc gtc gag ggc ggc ggc ggc agg ccc 480Gly Val Thr Ala Leu Leu Arg Leu Val Glu Gly Gly Gly Gly Arg Pro145 150 155 160gta cgg ctc acg gcg gag gag cac gac cgg acg acg gcg gcc acc cag 528Val Arg Leu Thr Ala Glu Glu His Asp Arg Thr Thr Ala Ala Thr Gln165 170 175gcc ctg acg cac gcc gtg ctc ctc tcc ttc ggg ctc gcc ctc gcc cgc 576Ala Leu Thr His Ala Val Leu Leu Ser Phe Gly Leu Ala Leu Ala Arg180 185 190ctc ggc gtc gac gtc cgg gcc ctg gcg gcg acg gca ccg ccg ccc cac 624Leu Gly Val Asp Val Arg Ala Leu Ala Ala Thr Ala Pro Pro Pro His195 200 205cag gtg ctg ctc gcc ctc ctg gcc cgt gtg ctc ggc ggc agc ccc gag 672Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Arg Val Leu Gly Gly Ser Pro Glu210 215 220gtg tac ggg gac atc cag cgg tcc aac ccc cgg gcg gcg tcc gcg cgo 720Val Tyr Gly Asp Ile Gln Arg Ser Asn Pro Arg Ala Ala Ser Ala Arg225 230 235 240cgg gcg ctc gcc gag gcc ctg cgc tcc ttc gcc gcg ctg gtc ggc gac 768Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Arg Ser Phe Ala Ala Leu Val Gly Asp245 250 255
gac ccg gac cgt gcc gac gcc ccc ggg cgc gcc gac gcc ccc ggc cat816Asp Pro Asp Arg Ala Asp Ala Pro Gly Arg Ala Asp Ala Pro Gly His260 265 270ccc ggg gga tgc gac ggc gcc ggg aac ctc gac ggc gtc ttc ggg gaa864Pro Gly Gly Cys Asp Gly Ala Gly Asn Leu Asp Gly Val Phe Gly Glu275 280 285ctc cgc cgg ctc atg gga ccg gag ctc gcg gcg ggc cag gac cac tgc912Leu Arg Arg Leu Met Gly Pro Glu Leu Ala Ala Gly Gln Asp His Cys290 295 300cag gag ctg ttc cgc acc ctc cac cgc acc gac gac gaa ggc gag aag960Gln Glu Leu Phe Arg Thr Leu His Arg Thr Asp Asp Glu Gly Glu Lys305 310 315 320gac cga tga969Asp Arg<210>6<211>322<212>PRT<213>Streptomyces venezuelae<400>6Met Ser Gly Phe Pro Arg Ser Val Val Val Gly Gly Ser Gly Ala Val1 5 10 15Gly Gly Met Phe Ala Gly Leu Leu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Thr Leu20 25 30Val Val Asp Leu Val Pro Pro Pro Gly Arg Pro Asp Ala Cys Leu Val35 40 45Gly Asp Val Thr Ala Pro Gly Pro Glu Leu Ala Ala Ala Leu Arg Asp
50 55 60Ala Asp Leu Val Leu Leu Ala Val His Glu Asp Val Ala Leu Lys Ala65 70 75 80Val Ala Pro Val Thr Arg Leu Met Arg Pro Gly Ala Leu Leu Ala Asp85 90 95Thr Leu Ser Val Arg Thr Gly Met Ala Ala Glu Leu Ala Ala His Ala100 105 110Pro Gly Val Gln His Val Gly Leu Asn Pro Met Phe Ala Pro Ala Ala115 120 125Gly Met Thr Gly Arg Pro Val Ala Ala Val Val Thr Arg Asp Gly Pro130 135 140Gly Val Thr Ala Leu Leu Arg Leu Val Glu Gly Gly Gly Gly Arg Pro145 150 155 160Val Arg Leu Thr Ala Glu Glu His Asp Arg Thr Thr Ala Ala Thr Gln165 170 175Ala Leu Thr His Ala Val Leu Leu Ser Phe Gly Leu Ala Leu Ala Arg180 185 190Leu Gly Val Asp Val Arg Ala Leu Ala Ala Thr Ala Pro Pro Pro His195 200 205Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Arg Val Leu Gly Gly Ser Pro Glu210 215 220Val Tyr Gly Asp Ile Gln Arg Ser Asn Pro Arg Ala Ala Ser Ala Arg225 230 235 240Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Arg Ser Phe Ala Ala Leu Val Gly Asp245 250 255
Asp Pro Asp Arg Ala Asp Ala Pro Gly Arg Ala Asp Ala Pro Gly His260 265 270Pro Gly Gly Cys Asp Gly Ala Gly Asn Leu Asp Gly Val Phe Gly Glu275 280 285Leu Arg Arg Leu Met Gly Pro Glu Leu Ala Ala Gly Gln Asp His Cys290 295 300Gln Glu Leu Phe Arg Thr Leu His Arg Thr Asp Asp Glu Gly Glu Lys305 310 315 320Asp Arg<210>7<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pabAB基因的PCR引物<400>7ggggggatcc tatgcgcacg cttctgatcg ac 32<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pabAB基因的PCR引物
<400>8ggggggatcc tcatcgggcg cccgccactg cg 32<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述papA基因的PCR引物<400>9ggtgatcata tgcgcacgct tctgatcgac 30<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述papA基因的PCR引物<400>10ggtgatcatc atcgggcgcc cgccacggcg 30<210>11<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述papB基因的PCR引物
<400>11gcggatccat atgaccgagc agaacgagct g 31<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述papB基因的PCR引物<400>12gcggatcctc accgccggtc ctcggc26<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述papC基因的PCR引物<400>13gcggatccat atgagcggct tcccccgca 29<210>14<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述papC基因的PCR引物<400>14
gcggatcctc atcggtcctt ctcgccttc 29<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Abp1基因的PCR引物<400>15ctcaaaccag gaactctttc20<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Abp1基因的PCR引物<400>16gacatgtgga aaccacattt tg 22<210>17<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Abp1基因的PCR引物<400>17ggggaattcg tgggtggtga tatcatggc 29
<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Abp1基因的PCR引物<400>18gggggatcct tgatgggttt tggg 24<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Abp1基因的PCR引物<400>19gggggatcct aaactcccat ctatagc27<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Abp1基因的PCR引物<400>20gggtctagac gactcattgc agtgagtgg 29
<210>21<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于定點誘變的引物<400>21gatcagaagc gtgcgcattg ttaggttgat tgatgggttt tgggaattg 49<210>22<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于定點誘變的引物<400>22ctcgttctgc tcggtcattg ttaggttgat tgatgggttt tgggaattg 49<210>23<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于定點誘變的引物<400>23cgggggaagc cgctcattgt taggttgatt gatgggtttt gggaattg 48
<210>24<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述分支酸變位酶基因的PCR引物<400>24caytwyggna arttygt 17<210>25<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述分支酸變位酶基因的PCR引物<400>25taytcnacyt snacytc 17<210>26<211>869<212>DNA<213>Mycelia sterilia<220>
<221>內(nèi)含子<222>(72)..(148)<400>26atggatacta taatcgatct gaaagatgcc tccaaggcgc ttgacttggg caacatccgc 60ttccaactca tgtaagtggc tagcctcacc gctaccctgt atgccactgg gtgtgttcat 120gtatgcttac tatccctctt catactagac gcctcgaaga cacaatcacc tttcacttga 180
tcgagcgggt gcaatttccc ttgaacaagt cgatctacca gccgggtgcc atcgcgctgg 240gctcggatgc gaatttgagc ttcatggact ggtacctgca ggaacaagag aagctgcagt 300cgttgatccg acgttacgaa gcgccggacg agtacccatt cttcccggat gcgctacaga 360agccgatcct gaagccgctc gactacccca agatcctgca ccctaacgac gttaacgtga 420acgagaagat caagcgcttc tacatcgagc gtttcctgcc cgccgtgtgt ccggacttcg 480gccgcggcga cggcggcgag ttggatgaga actacggatc ctcggccacc tgcgacatcg 540cctgtctcca ggccctctcc cgtcgtatcc atttcggcaa gttcgtcgcc gagtccaagt 600tccagtccga cccggagctc tacacgagac tgatcaaggc cggcgatcgc gacggcatcg 660gcgagtccat caccaacgcg gccgtcgaga agcaggtgct cgcccggctt cgtctcaagg 720cgcagacata tggcacggac ccttcgtcca ctaataccac cggcgcggga aagatcaatg 780ccgatgcggt tgagtccatg tacagggatt tcgtgatccc catcaccaaa gaggtcgaag 840tagagtacct catgcaacga ctagagtag 869<210>27<211>263<212>PRT<213>Mycelia sterilia<400>27Met Asp Thr Ile Ile Asp Leu Lys Asp Ala Ser Lys Ala Leu Asp Leu1 5 10 15Gly Asn Ile Arg Phe Gln Leu Ile Arg Leu Glu Asp Thr Ile Thr Phe20 25 30His Leu Ile Glu Arg Val Gln Phe Pro Leu Asn Lys Ser Ile Tyr Gln35 40 45Pro Gly Ala Ile Ala Leu Gly Ser Asp Ala Asn Leu Ser Phe Met Asp50 55 60Trp Tyr Leu Gln Glu Gln Glu Lys Leu Gln Ser Leu Ile Arg Arg Tyr65 70 75 80Glu Ala Pro Asp Glu Tyr Pro Phe Phe Pro Asp Ala Leu Gln Lys Pro85 90 95
Ile Leu Lys Pro Leu Asp Tyr Pro Lys Ile Leu His Pro Asn Asp Val100 105 110Asn Val Asn Glu Lys Ile Lys Arg Phe Tyr Ile Glu Arg Phe Leu Pro115 120125Ala Val Cys Pro Asp Phe Gly Arg Gly Asp Gly Gly Glu Leu Asp Glu130 135140Asn Tyr Gly Ser Ser Ala Thr Cys Asp Ile Ala Cys Leu Gln Ala Leu145 150 155 160Ser Arg Arg Ile His Phe Gly Lys Phe Val Ala Glu Ser Lys Phe Gln165 170 175Ser Asp Pro Glu Leu Tyr Thr Arg Leu Ile Lys Ala Gly Asp Arg Asp180 185 190Gly Ile Gly Glu Ser Ile Thr Asn Ala Ala Val Glu Lys Gln Val Leu195 200 205Ala Arg Leu Arg Leu Lys Ala Gln Thr Tyr Gly Thr Asp Pro Ser Ser210 215 220Thr Asn Thr Thr Gly Ala Gly Lys Ile Asn Ala Asp Ala Val Glu Ser225 230 235 240Met Tyr Arg Asp Phe Val Ile Pro Ile Thr Lys Glu Val Glu Val Glu245 250 255Tyr Leu Met Gln Arg Leu Glu260<210>28<211>23
<212>PRT<213>Myceria sterilia<400>28Gly His Thr Ser Ala Gly Asp Ala Gly Ser Lys Pro Val Val Xaa Phe1 5 10 15Leu Gly Pro Ile Ser Ser Tyr20<210>29<211>12<212>PRT<213>Myceria sterilia<400>29Gly Val Glu Thr Val Asp Val Ser Ser Thr Ser Arg1 5 10<210>30<211>8<212>PRT<213>Myceria sterilia<400>30Thr Leu Asp His Phe Ala Asp Arg1 5<210>31<211>5<212>PRT<213>Myceria sterilia<400>31
Phe Phe Val Leu Arg1 5<210>32<211>16<212>PRT<213>Myceria sterilia<400>32Ala Phe Pro Leu Glu Gln Phe Asp Leu Met Pro Val Thr Thr Ile Lys1 5 10 15<210>33<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于篩選PDT基因的PCR引物<400>33tcygcnggng aygcngg 17<210>34<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于篩選PDT基因的PCR引物<400>34tcrgcnggng aygcngg 17
<210>35<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于篩選PDT基因的PCR引物<400>35agygcnggng aygcngg 17<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于篩選PDT基因的PCR引物<400>36ggcatnarrt craaytgytc 20<210>37<211>1366<212>DNA<213>Myceria sterilia<220>
<221>內(nèi)含子<222>(91)..(192)<220>
<221>內(nèi)含子<222>(254)..(380)
<400>37atggaggcga gcggtcatac cagcgctgga gatgcaggct ccaaacctgt cgtctgtttc 60ttggggccga tatcgtccta tacacatcag gtatgcacaa tgcactcact tcaagatttc 120gtttttaaat aaacccgtgt ctcattatgc ctatcatcaa ctaataattg agttctcatg 180agttatgtat aggcgacgct gaaagctttt ccactagagc aatttgattt gatgcccgtg 240accacaatca aaggtgtgta acgaatctca agactgactg ttcctttata atgctattgg 300ttcgatatca tatcgatatt attattatta tatatatgtc acgttatgtc aggagtattc 360aagctaatac gtgaagcaag atatctttga cacaacacaa tccggcgccg cgacatacgg 420cgtggtccca ttcgagaact ccaccaacgg ctccgtggtc ttcaccctcg accacttcgc 480cgaccggtcc gggctctacc cggacctcaa cgtctgcagg gagatctacc tagacgtgca 540ccactgcctg ctcggccacg catcatcatc atcctcctcc cccactaact caaactcgga 600ccccatatcc cgcctccgcc gcgtatacag ccacccgcaa gccttcgggc aatgcacgct 660attcctaggc tcgcggctcc cccgcggcgt cgaaaccgtc gacgtgagca gcacgagccg 720cgcagcggaa ctcgcgtccg cggatacatc gggcgagagc gccgccatta gctctgctgc 780tgctgccgag ctgctcggcc tcgatgtgtt ggtgagtaat atcgaggacc gcgaggataa 840tactacgagg ttctttgtgc ttaggagggg tgtgctgggt gattgcgatg ggtctgcgga 900aaaaggggaa gaggaagagg gggaacggga tggggggaaa ggagaaggag atgacgacga 960cgcggccctc ctatcgagca cgaaatccct cctctccttc accgtgccgc atcgtagccc 1020gggggccctc gccgacgtac tctcgtgctt tcgccgtggc gggctgaatc tcacgagcat 1080taatagccgg cctagtctca ccactaccac ctccacttct accacttcca cttctactac 1140caccacttct actactggta ctggtactgg tactggtact gggtcaggct cgggctcggg 1200ctccgtttcc gcggccttcg aatacatctt cttcgtcgag ttcgagggcc atcggttccg 1260cgaccccaag ggcagggtcg cccgggtcct cgccgacgtc gctgctggcg cggcctcgtc 1320gaggtggctt gggagctggg agaatatgcg ggcgagcgtg gggtga1366<210>38<211>378<212>PRT<213>Myceria sterilia<400>38Met Glu Ala Ser Gly His Thr Ser Ala Gly Asp Ala Gly Ser Lys Pro1 5 10 15Val Val Cys Phe Leu Gly Pro Ile Ser Ser Tyr Thr His Gln Ala Thr
20 25 30Leu Lys Ala Phe Pro Leu Glu Gln Phe Asp Leu Met Pro Val Thr Thr35 40 45Ile Lys Asp Ile Phe Asp Thr Thr Gln Ser Gly Ala Ala Thr Tyr Gly50 55 60Val Val Pro Phe Glu Asn Ser Thr Asn Gly Ser Val Val Phe Thr Leu65 70 75 80Asp His Phe Ala Asp Arg Ser Gly Leu Tyr Pro Asp Leu Asn Val Cys85 90 95Arg Glu Ile Tyr Leu Asp Val His His Cys Leu Leu Gly His Ala Ser100 105 110Ser Ser Ser Ser Ser Pro Thr Asn Ser Asn Ser Asp Pro Ile Ser Arg115 120 125Leu Arg Arg Val Tyr Ser His Pro Gln Ala Phe Gly Gln Cys Thr Leu130 135 140Phe Leu Gly Ser Arg Leu Pro Arg Gly Val Glu Thr Val Asp Val Ser145 150 155 160Ser Thr Ser Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Ala Asp Thr Ser Gly Glu165 170 175Ser Ala Ala Ile Ser Ser Ala Ala Ala Ala Glu Leu Leu Gly Leu Asp180 185 190Val Leu Val Ser Asn Ile Glu Asp Arg Glu Asp Asn Thr Thr Arg Phe195 200 205Phe Val Leu Arg Arg Gly Val Leu Gly Asp Cys Asp Gly Ser Ala Glu210 215 220
Lys Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Arg Asp Gly Gly Lys Gly Glu Gly225 230 235 240Asp Asp Asp Asp Ala Ala Leu Leu Ser Ser Thr Lys Ser Leu Leu Ser245 250 255Phe Thr Val Pro His Arg Ser Pro Gly Ala Leu Ala Asp Val Leu Ser260 265 270Cys Phe Arg Arg Gly Gly Leu Asn Leu Thr Ser Ile Asn Ser Arg Pro275 280 285Ser Leu Thr Thr Thr Thr Sar Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr290 295 300Thr Thr Ser Thr Thr Gly Thr Gly Thr Gly Thr Gly Thr Gly Ser Gly305 310 315 320Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ala Ala Phe Glu Tyr Ile Phe Phe Val325 330 335Glu Phe Glu Gly His Arg Phe Arg Asp Pro Lys Gly Arg Val Ala Arg340 345 350Val Leu Ala Asp Val Ala Ala Gly Ala Ala Ser Ser Arg Trp Leu Gly355 360 365Ser Trp Glu Asn Met Arg Ala Ser Val Gly370 375<210>39<211>25<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述BSD基因的PCR引物<400>39gcatcgatgc ctttgtctca agaag 25<210>40<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述BSD基因的PCR引物<400>40gcagatctta gccctcccac acataa 2權(quán)利要求
1.生產(chǎn)PF1022物質(zhì)衍生物的轉(zhuǎn)化體，所述轉(zhuǎn)化體可通過將參與由分支酸到對氨基苯丙酮酸的生物合成途徑的基因(生物合成基因)導(dǎo)入由生產(chǎn)式(I) 所示的PF1022物質(zhì)的生物誘導(dǎo)出的苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主中而獲得。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主喪失內(nèi)源性分支酸變位酶活性和/或預(yù)苯酸脫水酶活性。
3.權(quán)利要求1或2的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主是通過破壞內(nèi)源性分支酸變位酶基因和/或預(yù)苯酸脫水酶基因而獲得的。
4.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)化體，其特征在于通過同源重組使分支酸變位酶基因和/或預(yù)苯酸脫水酶基因破壞。
5.權(quán)利要求1-4的任一項的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主是由屬于無孢目(Agonomycetales)的絲狀菌誘導(dǎo)的。
6.權(quán)利要求1～4的任一項的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主是由無孢菌類(Mycelia sterilia)誘導(dǎo)的。
7.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化體，其中所述無孢菌類是保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所的PF1022菌株，其保藏號為FERM BP-2671。
8.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主由無孢菌類誘導(dǎo)，且喪失內(nèi)源性分支酸變位酶活性和/或預(yù)苯酸脫水酶活性。
9.權(quán)利要求1～8的任一項的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述PF1022物質(zhì)衍生物是式(III) 或式(V)
10.權(quán)利要求1～9的任一項的轉(zhuǎn)化體，其中所述生物合成基因包含編碼4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶的基因、編碼4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶的基因和編碼4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶的基因。
11.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化體，其中所述包含編碼4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶的基因、編碼4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶的基因和編碼4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶的基因的生物合成基因中的至少一個是來源于鏈霉菌屬(Streptomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia)或棒桿菌屬(Corynebacterim)的基因。
12.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述編碼4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶的基因包含編碼SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶活性的其修飾序列的多核苷酸。
13.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述編碼4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶的基因包含SEQ ID NO.1的DNA序列。
14.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述編碼4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶的基因包含編碼SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶活性的其修飾序列的多核苷酸。
15.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述編碼4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶的基因包含SEQ ID NO.3的DNA序列。
16.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述編碼4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶的基因包含編碼SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶活性的其修飾序列的多核苷酸。
17.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述編碼4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶的基因包含SEQ ID NO.5的DNA序列。
18.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述編碼4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶的基因、編碼4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶的基因和編碼4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶的基因分別包含編碼SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶活性的其修飾序列的多核苷酸、編碼SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶活性的其修飾序列的多核苷酸、以及編碼SEQID NO.6所示的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶活性的其修飾序列的多核苷酸。
19.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述編碼4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶的基因、編碼4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶的基因和編碼4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶的基因分別包含SEQ ID NO.1的DNA序列、SEQ ID NO.3的DNA序列和SEQ ID NO.5的DNA序列。
20.PF1022物質(zhì)衍生物的制備方法，其特征在于培養(yǎng)權(quán)利要求1～19的任一項的轉(zhuǎn)化體，并且收集PF1022物質(zhì)衍生物。
21.權(quán)利要求20的PF1022物質(zhì)衍生物的制備方法，其特征在于所述PF1022物質(zhì)衍生物是式(III) 或式(V)
22.一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列或具有分支酸變位酶活性的其修飾序列。
23.權(quán)利要求22的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO.26所示的DNA序列。
24.一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列或具有預(yù)苯酸脫水酶活性的其修飾序列。
25.權(quán)利要求24的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO.37所示的DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供通過直接發(fā)酵法制備PF1022物質(zhì)衍生物、特別是PF1022－220和PF1022－260的方法，以及該方法中所使用的轉(zhuǎn)化體。根據(jù)本發(fā)明還提供可以通過將參與由分支酸到對氨基苯丙酮酸的生物合成途徑的基因?qū)胗缮a(chǎn)PF1022物質(zhì)的生物誘導(dǎo)的苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主中而獲得的生產(chǎn)PF1022物質(zhì)衍生物的轉(zhuǎn)化體。根據(jù)本發(fā)明又提供PF1022物質(zhì)衍生物的制備方法，所述方法包含培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體，并且收集PF1022物質(zhì)衍生物的步驟。
文檔編號C12N15/52GK1509334SQ02810040
公開日2004年6月30日 申請日期2002年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月22日
發(fā)明者矢內(nèi)耕二, 隅田奈緒美, 渡邊學(xué), 守屋達(dá)樹, 村上健, 樹, 緒美 申請人:明治制果株式會社