專利名稱：作為色素上皮移植基底的顯微構(gòu)建組織的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及眼睛失常的治療領(lǐng)域，更具體地說是治療視網(wǎng)膜疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性(pigmenttosa)，和其他的視網(wǎng)膜疾病。另外，本發(fā)明還涉及用于修飾組織的方法和裝置，并且涉及細(xì)胞和組織的移植的方法和裝置。
背景技術(shù)：
視網(wǎng)膜疾病，如與年齡有關(guān)的黃斑變性(AMD)，視網(wǎng)膜色素變性(RP)和其他疾病，是工業(yè)化世界嚴(yán)重視力損傷或致盲的主要原因。
與年齡有關(guān)的斑底退化(AMD)的一個真質(zhì)標(biāo)記，就象在RP中的情況一樣，就是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)的細(xì)胞損失和退化。布魯赫膜也是要被損傷的一個令人擔(dān)心的部位；這樣的損傷會成為視網(wǎng)膜光感受器的存活和維持其適當(dāng)?shù)墓δ軄碚f是極其重要的，它是眼睛中唯一直接感受光亮的細(xì)胞。在視網(wǎng)膜疾病中，如AMD和RP中RPE的退化是與感光功能的喪失有關(guān)，并且視力的損傷是與這些疾病相關(guān)聯(lián)的。
RPE是與神經(jīng)視網(wǎng)膜相鄰近的，直接與視網(wǎng)膜光感受器相對布置的。RPE細(xì)胞以在體內(nèi)的形式形成一個細(xì)胞厚圓石塊那樣的組織，它們是通過緊密的接合處聯(lián)接一起的，帶有不同的頂端和基底膜。RPE細(xì)胞在體內(nèi)以高密度形式緊密地聚集在一起生長，形成一緊密的上皮細(xì)胞，它起到一個屏障的作用，用來調(diào)節(jié)光感受器和在下的布魯赫膜之間、脈絡(luò)膜(choroid)和脈絡(luò)膜的脈管系統(tǒng)之間的輸送。RPE的頂端部分包圍和吞沒光感受器外部(外管節(jié))，為了讓它發(fā)揮吞滅和消化脫落光感受器頂端吸頭(tips)的富有活力的功能和發(fā)揮使視網(wǎng)膜在光色素(photopigments)中再循環(huán)的功能。RPE的底部與布魯赫膜相對布置，一個高度血管化(vascularized)的支持膜(它提供所需氧氣和營養(yǎng)分給RPE和光感受器并且阻止二氧化碳和其它廢物的積累，這些廢物會損害視網(wǎng)膜的功能)。布魯赫膜的損傷會起因于來自外段組織的代謝而生成的廢物的積累，這種損害表現(xiàn)為例如阻止氧氣、生長因子和廢物生成物的代謝。這種受損的代謝的障礙導(dǎo)致光感受器中缺氧。造成的反應(yīng)可以這樣去想，存活信號被發(fā)送去引發(fā)新生血管生長，和產(chǎn)生濕性AMD。
虹膜色素上皮細(xì)胞(IPE)，它象RPE那樣來源于胚胎的神經(jīng)外胚層(neuroectoderm)，與眼球內(nèi)與視網(wǎng)膜相對的那部分虹膜相毗連。這樣，在完整的眼球中IPE細(xì)胞的位置是遠(yuǎn)離視網(wǎng)膜光感受器的。雖然，關(guān)于IPE細(xì)胞的生理學(xué)和功能方面尚有許多知識尚未弄清楚，象在培養(yǎng)基中的RPE細(xì)胞、IPE細(xì)胞已經(jīng)顯出能吞滅外光感受器外段的能力。
RPE細(xì)胞會在人工的基底上生長(Pfeffer、B、A第10章，“人和猴子視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的培養(yǎng)的改進(jìn)方法”《Progress in Retinal Research》雜志，第10卷(1991年)版Osborn，N，和chader，J.；Lu及其它合著人，《Biomater.Sci.Polymer》第9版1187-1205(1998年)，和Lu及其他合著人，《Biomaterials》202351-2361(1999年)。另外，一直以來還有試圖用晶狀體囊組織作為一個供RPE和IPE細(xì)胞成長的培養(yǎng)基(Hartman及其他合著人，《Graefe′s Archiv clin Exp Ophthalmol》237940-945(1999)；Nicolini及其他合著人，《Acta Ophthalmol Scand》2000年10月；78(5)527-31)。
在退行性和進(jìn)行性視網(wǎng)膜疾病的治療中，許多方法已經(jīng)被試驗(yàn)過。例如，曾經(jīng)試圖對AMD進(jìn)行的治療包括光動力治療、輻射治療和黃斑移位，來修復(fù)損傷、阻止進(jìn)行性發(fā)展或?qū)膊〉挠绊戇M(jìn)行補(bǔ)償。然而，這些方法一直沒有重大突破。
因?yàn)镽PE細(xì)胞損失在許多視網(wǎng)膜疾病中發(fā)生，細(xì)胞的移植作為對AMD和其他疾病的治療及可能的治愈具有很大的吸引力。為了替換損失的RPE細(xì)胞，直接移植RPE細(xì)胞到視網(wǎng)膜已經(jīng)被嘗試過。然而，這樣的方法在過去沒有獲得成功，部分原因是由于移植細(xì)胞功能喪失，部分原因是細(xì)胞被移植的動物所排斥(拒絕)。
RPE細(xì)胞的移植已經(jīng)被建議作為一種治療視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的方法(美國專利US5,962,027和US6,045,791)。所有專利和出版物在此被取名supra和infra，兩個都作為一個整體收編參考。此外，實(shí)驗(yàn)證明，IPE細(xì)胞可以代替RPE細(xì)胞，它引出將IPE細(xì)胞移植進(jìn)動物的初步嘗試，為了改善AMD癥候(Abe及其他著作者，Tohoku J.Exp.Med.189295-305(1999年)、Abe及其他著作，Cell Transplantation 8(5)501-10(1999年)；Schraermeyer及其他著者，Invest.Opth.Vis.Sci.40(7)1545-56(1999年)；Thumann及其他著者《Transplantation》68(2)195-201(1999年)；Abe及其他著者《Current EyeResearch》20(4)268-275(2000年)；Lappas及其他著者，Graefes′s Arch Clin ExpOphthalmol 238631-641(2000年)，Thumann及其他作者，Arch.Ophthalmol.1181350-1355(2000年)。
然而，對IPE和RPE兩種細(xì)胞移植方法的挑戰(zhàn)包括在修復(fù)疾病變性的布魯赫膜上存在的困難，對新移植進(jìn)的細(xì)胞的固定和定位的困難缺乏對胞外基質(zhì)對分子發(fā)信號的控制能力，這些分子色素上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和存活來說是關(guān)鍵的。因?yàn)檫@個或別的一些原因，對于IPE和RPE移植的技術(shù)使用抗生素或者免疫抑制劑尚未獲得成功。至今還沒有用這些方法而產(chǎn)生的重大的可見的進(jìn)步被展現(xiàn)出來，組織的重新整合仍然存在問題。因此，雖然細(xì)胞移植的方法貌似有希望成功，AMD和別的視網(wǎng)膜疾病尚無有效的治療手術(shù)。
因此，我們需要創(chuàng)新的方法和設(shè)備，來制作和移植修飾組織，達(dá)到治療視網(wǎng)膜疾病的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要是提供應(yīng)用于移植中組織修飾和細(xì)胞生長所需的操作方法，設(shè)備及相關(guān)產(chǎn)品，尤其適用于視網(wǎng)膜組織細(xì)胞的移植，治療老年黃斑變性和視網(wǎng)膜色素變性等一些視網(wǎng)膜疾病。本文提供的組織修飾新方法可稱為組織顯微構(gòu)建，本發(fā)明包括眼球膜組織顯微構(gòu)建及其它膜組織的構(gòu)建，眼部又可應(yīng)用于晶狀體囊膜，內(nèi)界膜和Bruch氏膜等，本發(fā)明更可應(yīng)用于移植的多個方面，如組織膜顯微構(gòu)建方法，組織膜顯微構(gòu)建利用方法，組織膜顯微構(gòu)建細(xì)胞生長方法，動物眼球細(xì)胞或組織顯微構(gòu)建移植方法。同樣可應(yīng)用于人類。
膜組織顯微構(gòu)建是本發(fā)明主要特點(diǎn)，它將利用磷酸鹽緩沖液處理過的一些生物可吸收材料作為載體，貼附或包裹組織膜，達(dá)到修飾組織的目的。合適的生物可吸收材料有膠原(collagen)，葡糖胺基多糖類(glycosaminoglycans)，脫乙酰殼多糖(chitosan)；聚羥基鏈烷酸酯類(polyhydroxyalkanoates)，聚羥基酸(poly-hydroxyacids)，聚乙二醇酸(polyglycolic acid)聚乳酸(polylactic acid)，聚乙二醇酸和聚乳酸混合物(polylactide-polyglycolide)，合金或共聚合物，聚二氧六環(huán)酮(polydioxanones)，聚己內(nèi)酯(poly caprolactone)，聚正酯類(polyortho esters)，聚酐類(polyanhydrides)；聚磷腈類(polyphosphazenes)，聚氨基酸類(poly amino acids)，其它化合物、聚合物、共聚合物、合金、混合物或上述化合物的組合。合適的組織膜包括晶狀體囊膜，內(nèi)界膜，Bruch氏膜，角膜，羊膜，絨毛膜，粘膜、神經(jīng)組織及其它組織。
通過經(jīng)磷酸鹽緩沖液或其它生理溶液浸泡的底物與組織膜接觸膜或包裹，修飾了組織膜，使諸如虹膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等一些細(xì)胞在上面生長。另外，組織膜構(gòu)建方法可以組織膜為模版，用部分覆蓋的方法，使細(xì)胞生長于組織膜的暴露表面。
膜組織修飾方法可包括機(jī)械方法，如機(jī)械切除，機(jī)械接觸。另外還有光切除方法。本發(fā)明的組織膜修飾方法可應(yīng)用于各種組織，包括眼球組織膜。例如，人類晶狀體囊膜組織和內(nèi)界膜修飾。
膜組織修飾方法包括整體修飾法和表面修飾法。兩種方法可以單獨(dú)使用，也可同時應(yīng)用于同一膜組織上，通過對膜組織的整體和表面特性的修飾，提高了移植的組織適應(yīng)性。這種組織修飾可以改善細(xì)胞的貼附能力和生長能力，也能提高組織滲透性，這種營養(yǎng)物質(zhì)，電解質(zhì)和其它一些生理必需物質(zhì)能更好地通過修飾組織。
不管是整體修飾或表面修飾，都需將膜組織進(jìn)行游離，如將晶狀體囊膜或內(nèi)界膜從眼球內(nèi)取出，然后將膜組織平鋪在玻璃或塑料底物上進(jìn)行磷酸鹽緩沖液處理，為了外科移植的便利也可以將膜組織鋪于臨時性可溶性聚合物上修飾的組織給細(xì)胞提供一個合適的底物，使細(xì)胞進(jìn)行接觸并生長。已有細(xì)胞接觸和生長的修飾組織以及多聚體將移植于動物體內(nèi)的需要位置上。移植后聚合物將溶解并被動物體內(nèi)被移植組織吸收，而移植組織或細(xì)胞則在原位上生長。
合適的可溶性聚合物包括聚乳酸；聚乙二醇酸；聚正酯類；聚酐類；聚瞵嗪類；聚乳酸聚乙二醇酸共聚合物(如1∶1或9∶1及其它比例的乳酸和乙二醇酸共聚合物)，聚乳酸聚合物(PLLA)，聚乙二醇酸聚乳酸共聚合物(PEG/PLA)，以及一些其它混合物和混合聚合物。
整體修飾方法是指修飾膜組織的實(shí)質(zhì)部分，而不是局限于組織的表面部分。表面修飾方法是指修飾膜組織的表面和近表面，而組織的其它部分未作明顯的修飾。
整體修飾方法可對晶狀體囊膜組織和內(nèi)界膜組織等眼球組織進(jìn)行修飾，它可以修飾組織厚度，滲透性以及其它性狀。整體修飾方法包括機(jī)械切除，如磨擦，刮除，切割，加壓或用印記接觸，從而使組織形成一個顯微模板。整體修飾方法的一種具體操作法為，將膜組織取出并鋪平，用激光束或離子束修飾膜組織表面，減少組織厚度。如晶狀體囊膜的正常厚度可達(dá)8-14μm，可用激光切削至2-5μm，這樣其厚度與Bruch氏膜厚度相接近。
整體修飾的另一具體方法包括使用激光切割，如激發(fā)準(zhǔn)分子，鈦蘭寶石激光，或YAG激光或離子束處理。以在膜組織中產(chǎn)生顯微孔或凹窩。顯微孔的直徑可以是幾微米或者更小。經(jīng)過這些處理可以制作出顯微孔或凹窩的顯微模型。
膜組織可以用已失去活性的膠原酶的浸泡處理，再通過激光照射來激活膠原酶，比如，很小區(qū)域的組織(其直徑可以小于1微米)可以通過一種雙光子同焦激光系統(tǒng)照射后被激活。
酶沉積于膜組織上，對膜組織的內(nèi)部和表面產(chǎn)生生物浸蝕，從而產(chǎn)生了所要求的組織局部解剖學(xué)特性和表面粘連特性。這個方法具體為沉積的步驟包括通過一個接觸表面與膜組織接觸，如產(chǎn)生顯微接觸印記，所攜帶的酶可以產(chǎn)生膜組織表面和內(nèi)部生物浸蝕作用。
處理方法也包括膜組織的表面修飾，如包括膜組織上的活質(zhì)分子的沉積，經(jīng)過激光或離子束處理的孔或凹等表面特征的產(chǎn)生。另外這種模型的直徑可以是幾微米或更小，再者，包括肽類和短鏈聚合物等生物分子，選擇性地使定位于膜組織上的接觸細(xì)胞失活。
表面修飾方法中的顯微接觸印刷技術(shù)用來制作膜組織上的活質(zhì)分子的化學(xué)顯微模型時膜表面也可以通過機(jī)械切割方法包括磨擦，刮除，切割和溶液沖刷的方法來加以修飾。
表面修飾方法的另一個具體方面，為組織膜表面覆蓋部分，而非全部組織表層，然后經(jīng)過紫外線照射使暴露組織的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生變性。為了激活特定部分膜組織表面，一種滅活物質(zhì)比如聚乙烯醇(PVA)或膠漿可應(yīng)用于組織表面，通過一個輻射罩用激發(fā)二聚體激光在膜組織表面作顯微模型切割。
遮蓋步驟可以通過在膜組織表面放置一個濾線柵或者通過使用顯微接觸印刷技術(shù)提供給膜組織表面一種保護(hù)分子的模式，以阻止被保護(hù)細(xì)胞或?yàn)V線柵覆蓋區(qū)域細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生變性。
細(xì)胞可以在修飾膜組織上生長，比如細(xì)胞可以在有模板的修飾膜組織的表面生長。具體地說，修飾膜可以是晶狀體囊膜組織或內(nèi)界膜組織，細(xì)胞可以是IPE細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面，修飾膜或細(xì)胞可以從同一個動物中獲取，在這一點(diǎn)上，修飾膜或細(xì)胞移植給這個動物將是自體移植，這將避開動物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的排異。
本發(fā)明也提供使用顯微構(gòu)建膜組織的方法，包括將顯微構(gòu)建膜組織移植入動物體內(nèi)的外科方法。其中包括在動物眼內(nèi)移植顯微構(gòu)建膜組織的方法，比如將顯微構(gòu)建的晶狀體囊膜組織或內(nèi)界膜組織移植于動物視網(wǎng)膜附近或視網(wǎng)膜內(nèi)。移植組織包括生長于顯微構(gòu)建晶狀體囊膜組織或顯微構(gòu)建內(nèi)界膜組織上的IPE細(xì)胞，這將是自體的組織或細(xì)胞移植。
本發(fā)明還提供構(gòu)建技術(shù)中和使用微構(gòu)建組織中的有用產(chǎn)品。這些產(chǎn)品包括制作眼顯微構(gòu)建膜組織(如顯微構(gòu)建晶狀體囊膜和內(nèi)界膜)的工具及產(chǎn)品，同時提供在動物眼內(nèi)移植這些組織和細(xì)胞所使用的工具和產(chǎn)品。
本發(fā)明旨在提供治療AMD、RP及其它視網(wǎng)膜疾病的方法和相關(guān)產(chǎn)品，比如，一種治療AMD的方法是移植RPE細(xì)胞、IPE細(xì)胞、干細(xì)胞或另外細(xì)胞的懸浮液以挽救病變的視網(wǎng)膜，本發(fā)明提供新的組織工程技術(shù)，應(yīng)用于精密的人體自體移植工程(如人類晶狀體囊膜)作為一種細(xì)胞移植的底物來移植RPE細(xì)胞、IPE細(xì)胞、干細(xì)胞或另外細(xì)胞。移植的色素上皮細(xì)胞生長于修飾膜和底物上能生長得更多數(shù)量，同時表示出正常視網(wǎng)膜細(xì)胞固有的，不同的，重要的特征。另外，與先前的方法不同，這種修飾膜組織(包括眼部顯微構(gòu)建膜，如晶狀體囊膜、內(nèi)界膜和另外的底物如供上皮細(xì)胞生長的底物)可有效地代替Bruch氏膜的許多功能，而這些功能的損害將導(dǎo)致一些視網(wǎng)膜變性性疾病，所以目前這種色素上皮細(xì)胞移植的方法和設(shè)備提供了可以高密度生長的移植細(xì)胞，這些細(xì)胞將產(chǎn)生一些必需的生理功能，來代替變性視網(wǎng)膜的一些功能。
本發(fā)明提供一種為移植用的修飾組織和細(xì)胞的方法及其裝置。本發(fā)明的為修飾組織的方法可以被應(yīng)用于異種組織。以下的定義將有助于本發(fā)明的敘述。
述語“自身”在此被用來指取自于同一動物中的別的細(xì)胞或組織；相對組織而言，取自同一動物組織的細(xì)胞叫自身細(xì)胞；對細(xì)胞而言，同樣叫自身組織。
術(shù)語“生物分子”在此被用來表示一個有生物活性分子，當(dāng)它與細(xì)胞或組織接觸時，能影響這些細(xì)胞或組織。
術(shù)語“整體修飾”被用來表示對組織的實(shí)質(zhì)性部分進(jìn)行修改，而不局限于組織的表面部分。
術(shù)語“表面修飾”被用來表示對組織的表面和近表面進(jìn)行修飾。
術(shù)語“膜組織”在此被用來表示一種動物的任何組織，它形成一張薄膜；膜組織通常包封或定界一個組織，或者分離一器官或組織為單獨(dú)的部分?！把矍蚰そM織”被用來表示取自動物眼睛的膜組織；晶狀體囊組織和內(nèi)界膜是眼球膜組織(Ocularmembranous tissue)的例子，它們是角膜，布魯赫膜和別的眼睛的膜組織。
術(shù)語“摘除”(ablation)在此被用來表示組織的變化(alteration)，包括尺寸的減小或組織的移去。正如在此所用的，“機(jī)械的摘除(ablation)“表示用機(jī)械方法變化、減小、或者組織的移去，例如刮挖、刻痕(scoring)，用諸如一種印記(stamp)那樣的接觸表面去接觸，施加張緊力或者別的機(jī)械方法。這里所用的“光切”(photoablaton)表示用紫外線、激光或者別的放射線進(jìn)行輻照，譬如用準(zhǔn)分子(excimer)、鈦藍(lán)寶石、釔鋁石榴石激光器YAG或其它激光器用以改變表面或組織的整體性能?！半x子分離”在此被用來指表面或整體修飾，是通過膜組織的離子束來處理來奏效的。
一種“蛋白酶”是一種分子，它用來使至少部分地消化(切成片)一種蛋白或肽分子。蛋白包括蛋白(水解)酶和蛋白酶、膠原酶(collagenase)，胰蛋白酶(trypsin)，胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、分散酶(dispase)，游離酶(liberase)，嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)，胃蛋白酶(pepsin)和木瓜蛋白酶。
術(shù)語“移植”在此被用來表示細(xì)胞或組織進(jìn)入動物體內(nèi)的插入、沉積和定位。生長在被修飾過的晶狀體囊組織上的細(xì)胞的沉積進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔就是移植的一個例子。
術(shù)語“微接觸印記”(microcontact printin)在此被用來表示所要分子沉著在模型的表面，模型的尺寸在幾十微米或者更小。
術(shù)語“顯微構(gòu)建”在此被用來表示通過表面修飾、整體修飾或者兩者一起的修飾方法產(chǎn)生(制出)被修飾的組織的方法。
術(shù)語“被顯微構(gòu)建的組織”在此被用來表示一種通過顯微構(gòu)建方法已經(jīng)被修飾了的或者被改變了的組織。
一種“接觸表面”是一個用于與一個第二表面接觸的表面，也是用于使起初出現(xiàn)在所述接觸表面上的分子沉積到第二表面上去的一個表面。一個“印記”，“顯微構(gòu)建的印記”，“微接觸加印的印記”，“微接觸印記”或“顯微構(gòu)建加印的印記”是一接觸表面，并且術(shù)語“印記”、“顯微構(gòu)建印記”、“微接觸加印的印記”、“微接觸印記”和顯微構(gòu)建加印的印記”在此被用來表示一個裝置，它適用于將所要的分子在一個幾十微米或者更小級別的模型中沉積。
術(shù)語“微模型”(或稱微型模格)在此被用來表示一個模型(pattern)、諸如一個有序的陣列(an ordered array)、一個設(shè)計(jì)或者一個尺寸在幾十微米或者更小級別的形體(contour)。
By“可溶性的聚合物”是表示一種可生物降解的聚合物，一旦進(jìn)入動物體就會至少是部分游離和散布進(jìn)入動物的液體和組織。
一種“激光”可以是一種準(zhǔn)分子激光器、一種鈦藍(lán)寶石激光器、一種釔鋁石榴石激光器YAG、或者別種激光器。一種激光器能夠發(fā)射由光放大器在激光腔或激光晶體里產(chǎn)生的相干光的強(qiáng)光束來。
在此使用的“準(zhǔn)分子激光器”表示一個激光源，它提供波長低于大約400納米的激光。準(zhǔn)分子激光器可以是氙、氪(krypton)、或者氟(fluorine)激光器或者最好是一種氟化氬激光器。一個氟化氬激光器提供紫外激光、常規(guī)波長約193納米，適合于對上皮組織、結(jié)締組織(connective)和別的組織的摘除(ablation)。如用于組織修飾，脈沖為1-50HZ，每一個脈沖持續(xù)1-200納秒，最好為10-20納秒，氟化氬激光束為幾毫米至幾十毫米。
一種鈦藍(lán)寶石(Tis)激光器是一種調(diào)諧激光器，它可以發(fā)射遠(yuǎn)紅外激光，波長約為700到1100納米。
一種釔-鋁石榴石激光器(YAG)，諸如一種釹YAG，一種horonium YAG，或者一種鉺YAG激光器，是一種發(fā)射微米級波長的固態(tài)激光器。水分了吸收能在微米波長段；水優(yōu)先吸收波長接近3μm能量，摻鉺YAG激光器發(fā)射波長為2.94μm，使它們特別適合于快速光剝離中使用，在細(xì)胞和組織中呈現(xiàn)水的局部蒸發(fā)，引起組織的快速膨脹和剝離。
一種離子光束是一種離子氣體分子光束，是典型地由無線電頻率能量被激發(fā)直接指向靶的。用在本發(fā)明中實(shí)際應(yīng)用的離子束源，可以是任何種類的；在美國專利US5,216,330中敘述過一種離子束。離子束可以被用來在材料上加工成形孔。美國專利6,093,445中敘述了一種用于做出方形和圓形孔(尺寸在10nm至大約2μm)的離子束方法。
一種組織植入物10，它具有顯微構(gòu)建的晶狀體囊組織12、帶有附加的細(xì)胞14和可溶性基底16，在圖1A中顯示了其橫截面。細(xì)胞14被附加在顯微構(gòu)建的晶狀體囊組織12上，并在其上表層上生長，顯微構(gòu)建的晶狀體囊組織12的下表層20處在與可溶性基質(zhì)層16相接觸的狀態(tài)。細(xì)胞14是虹膜色素上皮細(xì)胞(iris pigment epithelial cell)，它有頂端24和底端22膜，底端膜22處于與顯微構(gòu)建晶狀體囊12的上表層18相接觸的狀態(tài)。細(xì)胞14是虹膜色素上皮細(xì)胞，它具有頂端24和底端22膜，底端膜22與晶狀體囊12的上表層18相接觸。特有的細(xì)胞分化進(jìn)入基端(底端)膜22和頂端膜24的表達(dá)顯示了生長在顯微構(gòu)建晶狀體囊上的上皮細(xì)胞的本征功能(proper functioning)，這和在體內(nèi)的色素上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)一樣。
圖1B描述一個哺乳動物的眼球的橫截面，組織10植入體已經(jīng)被手術(shù)置入。圖1C反映一個在眼球26包括神經(jīng)視網(wǎng)膜28和組織植入體10的圈33內(nèi)的詳細(xì)情況。在圖1B和1C中所顯示的是神經(jīng)視網(wǎng)膜28、虹膜色素上皮(IPE)30，視網(wǎng)膜色素上層(RPE)32，它生長在布魯赫膜34上，而布魯赫膜34將脈絡(luò)膜(choroid)36與RPE的底膜38相分離。RPE的頂端40具有許多程序，它在神經(jīng)視網(wǎng)膜28的感光分子層42中將感光分子的光敏部分包圍。在RPE40的頂端膜和感光分子42之間的空間是視網(wǎng)膜下腔44。脈絡(luò)膜36用于維持一種環(huán)境，它能支持感光分子層42的(特定的)和神經(jīng)視網(wǎng)膜28(一般的)較高的代謝(metabolic)要求，做法是，允許營養(yǎng)和電解質(zhì)到視網(wǎng)膜下腔44的通道，并且將廢物從視網(wǎng)膜下腔44排出的通道暢通。
在健康的眼睛里，視網(wǎng)膜下腔44僅僅是一虛的空間，在感光分子42和RPE40的頂端部分之間僅存很小的分離。然而，在許多眼睛疾病，諸如視網(wǎng)膜脫離(detachment)那樣的情況下，感光分子42會和頂端的RPE膜40分離。另外，如有必要神經(jīng)視網(wǎng)膜28和色素上皮30及32，在做眼科手術(shù)時會人工地分離。正如圖1B和1C所示，一種組織植入10會被置入到視網(wǎng)膜下腔44中去。顯微構(gòu)建帶有貼壁IPE細(xì)胞14的晶狀體囊12被顯示出已被植入眼球26，在那兒，IPE細(xì)胞30能夠接觸到感光分子42，并且提供代謝支持。可溶性的基底(substrate)16被顯示在顯微構(gòu)建晶狀體囊12的下表面20和脈絡(luò)膜36之間，就象組織植入物10的置入開始之后那樣。然而，可溶性的基底16將溶解并被從基底空間44移走，僅讓已被植入的顯微構(gòu)建晶狀體囊12和附著的IPE細(xì)胞留在視網(wǎng)膜下腔44那兒。
圖2是一幅聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane)PDMS顯微構(gòu)建印記46的掃描電子顯微照片(SEM)，它體現(xiàn)本發(fā)明的特點(diǎn)。網(wǎng)格線48大約為5μm寬、相隔大約50μm。PDMS印記的結(jié)構(gòu)高度為7μm(從底至面)。網(wǎng)格線48可以被涂以例如象聚-L-賴氨酸(poly-L-lysine)的化合物，通過用印記46接觸表面層，放置到一個表面層上。
圖3為一張用顯示在圖2中的顯微構(gòu)建印記46接觸之后的顯微構(gòu)建晶狀體囊組織的SEM照片。它已被用2％的聚乙烯酒精(PVA)和0.1mg/mL的熒光素的混和物涂覆。明亮的部位顯示熒光素溶液的微印記(microprinting)。微模線(micropattern lines)50遵循與印模46相同的模型(pattern)和空間，印模46是通過與晶狀體囊表面接觸而產(chǎn)生的。
圖4顯示了一幅PDMS印記52的掃描電子顯微照片SEM，它帶有一個由圓井56的陣列給出的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的印記表面54。這樣，印記52的印記表面54具有圓形的凹陷(depressions)56，在凹陷56處得不到涂層，而印記表面54的其余部分接受分子的涂覆，這些分子然后被轉(zhuǎn)移到任何與其接觸的表面。用分子，譬如PVA分子、粘漿分子或者別的抑制性的分子涂覆印記52、然后讓印記52與一個表面相接觸(諸如晶狀體囊表面)、讓這些分子留在所述表面除它們自己圓表面以外任何的地方。這樣的一個抑制性分子的模格(micropattern)允許細(xì)胞在該表面生長并僅僅附在這些圓面積上。因?yàn)槲唇?jīng)修飾的晶狀體囊表面允許細(xì)胞貼附其上生長，抑制性的模型被要求供作為模格化的生長。圓56的直徑大約50μm。
圖5是一幅人眼晶狀體囊58的掃描電子顯微照片SEM，該人眼晶狀體囊58接受一個由如圖3所描述的PDMS印記52得到的PVA抑制性分子的微型模格60。標(biāo)尺長度為25μm。它證明，RPE細(xì)胞62在由微型模格60所確定的模型(Pattern)中生長，該微型模格60通過印記52被沉積在晶狀體囊58上。細(xì)胞在這個模型中長達(dá)24天處在存活狀態(tài)。通過控制網(wǎng)格線的寬度，細(xì)胞可以在或大或小的程度相分離。稀的網(wǎng)格線(grid lines)允許細(xì)胞相互接觸，允許從接觸處運(yùn)送上皮(細(xì)胞)的形成，使細(xì)胞生長。
在顯微構(gòu)建的組織基層上細(xì)胞的附著可以通過顯微構(gòu)建的組織的布置(placement)而得以加速或增強(qiáng)，所述的布置是在一個平底的離心管內(nèi)隨待在顯微構(gòu)建的組織上成長的細(xì)胞一起進(jìn)行布置。離心是以低速，如在每分鐘5000轉(zhuǎn)到大約15000轉(zhuǎn)的速度下進(jìn)行，將細(xì)胞快速地沉積到顯微構(gòu)建的組織上去，并且導(dǎo)引被沉積細(xì)胞在顯微構(gòu)建的組織上生長。
顯微構(gòu)建的組織被放置在一個載體基質(zhì)上或者涂在一個載體基質(zhì)上，在其處理過程中以及在其植入動物體的過程中會有幫助。顯微構(gòu)建組織會被涂在僅僅一個側(cè)面上，或者，在本發(fā)明的一些實(shí)施例上，顯微構(gòu)建的組織會被涂在兩個側(cè)面上。顯微構(gòu)建的晶狀體囊顯微構(gòu)建的內(nèi)界膜、顯微構(gòu)建的布魯赫膜，或者別的顯微構(gòu)建的膜組織以這樣的方法來處理和植入會有幫助，例如，一個載體基質(zhì)使顯微構(gòu)建的組織變得更具剛性以及更加容易處理。另外，一載體基質(zhì)是用于防止組織的折疊和彎曲，使得組織片以平整的、被展開的樣態(tài)被植入。這樣的一個離心展開提供了最大的供被植入細(xì)胞生長的表面面積，并且為被植入的細(xì)胞提供最大的接觸液體和周圍組織的機(jī)會?？缮锝到獾妮d體基質(zhì)體現(xiàn)了本發(fā)明的特點(diǎn)，并且是柔性的，方便適應(yīng)視網(wǎng)膜的形狀。最好，所述的載體基質(zhì)是生物可降解的，這樣，在置入眼球后，會被宿主體在一個所希望的時間內(nèi)所吸收。該所希望的時間可以是大約一個星期到幾個月，最好是幾個星期到大約兩個月，更好的是，體現(xiàn)本發(fā)明的特征的一個載體在植入視網(wǎng)膜后在大約兩個星期到大約六個星期就生物降解。
幫助組織處理和組織植入到眼球的可生物降解的基質(zhì)材料包括例如膠原(collagen)；葡糖胺基聚糖類(glycosaminoglycan)；脫乙酰殼多糖(chitosan)；聚羥基鏈烷酸酯類(hydroxy alkanoates)；聚α-羥酸(poly-α-hydroxy acids)，包括但不限于聚乙二醇酸(PGA)、聚乳酸(polylactic acid)(PLA)，和PGA-PLA混合物，合金和共聚物(PLGA)；聚二氧六環(huán)酮(dioxanones)；聚(ε-已內(nèi)酯)；聚正酯；聚酐類(poly-anhydrides)；聚磷腈類(phosphazenes)；聚氨基酸(polyamino acids)；和別的化合物、聚合物、共聚物、合金、混合物和這些材料的組合。
圖6顯示一晶狀體囊(被染成藍(lán)色)在“聚乳酸/聚乙二醇”的載體基質(zhì)上。標(biāo)尺為1mm長。載體基質(zhì)層及包囊物可以被染色(也就是用trypan blue或rhadamine)，在移植手術(shù)中，改善待移植的組織的血管化，這些包囊物和載體基質(zhì)可用于晶狀囊膜、內(nèi)界膜、布魯赫膜及其它膜組織，包括角膜、羊膜、漿膜、粘膜、神經(jīng)組織。
圖7顯示一在聚交酯/聚乙醇酸交酯載體基質(zhì)上含有一人體晶狀體囊的兔子視網(wǎng)膜的片段。被顯示的該視網(wǎng)膜片段(section)在晶狀體囊組織植入一只兔子眼球里的神經(jīng)和色素視網(wǎng)膜之間的視網(wǎng)膜下腔中之后一個星期。該晶狀體囊具有一平面的形狀，而折疊或彎曲狀會影響營養(yǎng)和廢物的代謝。
有待修飾的組織可以借助于公知技術(shù)來獲得，這些公知技術(shù)可以是在手術(shù)或在尸體解剖用的切除，活組織檢查。這些都是普通技術(shù)人員所理解的。在為獲得它們的過程中，需要小心避免膜組織的污染或損壞，在其后緊接著進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的消毒操作步驟。這將會被大家所理解，即，方法和裝置適合于修飾任何膜組織，包括但不限于眼睛膜組織。
在以下的討論中，為修飾組織用的方法和裝置將使用原有的晶狀體囊組織作為示范的膜組織。方法和裝置這樣就適合于修飾內(nèi)界膜組織和其他的組織，并且也可以被用于修飾內(nèi)界膜和其他組織。本發(fā)明所提供的組織修飾對于改變目標(biāo)t組織的性質(zhì)以提供更加有利的基底給細(xì)胞附著和有利生長，也對改變晶狀體囊組織的物理和生物性質(zhì)以使跨組織的液體和溶液的交換更迅速有效果。
諸如晶狀體包膜組織和內(nèi)界膜這樣的膜組織可獲自于捐贈者的眼睛或者取自于病員(自體的組織)，通過公知的技術(shù)，譬如在作白內(nèi)障切除手術(shù)后接著摘取晶狀體的摘出。例如，晶狀體囊組織可獲自于一個作完白內(nèi)障切除后的眼睛(在做鞏膜切開手術(shù)或角膜切開術(shù)之后也可以)。用這種辦法，在作切開手術(shù)后粘彈體接著被置入先前的空腔。該粘彈物通?？少IHealon(Pharwacia、kalamazoo，MI)或者用viscoat(Alcon、Fort Worth，TX)。然后，用一種載束針進(jìn)行晶狀體囊切手術(shù)。該針通常是扎在先前的囊中央心，形成一個囊瓣(capsule flap)。然后用晶狀體囊刀針抬高這個囊瓣(flap)。用鉗子(Utrata鉗、鑷)去夾住囊的瓣并且將其拉進(jìn)一個圓形fashion。在一個被控制的fashion中拉住囊轉(zhuǎn)360°將會導(dǎo)致一個圓的連續(xù)的囊破裂，使白內(nèi)障暴露。晶狀體和晶狀體囊然后就會被取下。
一旦晶狀體(lens)和晶狀體囊(lens capsule)被取下，膜組織(也就是晶狀體囊、內(nèi)界膜或其他眼睛組織)會被維持在體外狀態(tài)或者準(zhǔn)備好植入體內(nèi)。膜組織然后被置于玻璃、塑料或聚合物基底上。玻璃基底(substrate)可以是譬如蓋玻片。該塑料基底可以是例如一種組織培養(yǎng)盤。聚合物基底可以是一種可生物降解的聚合物?？缮锝到獾谋∧た梢园ň廴樗?，聚乙二醇酸，聚乳酸乙二醇酸共聚物(PLGA)，包括PLGA(50∶50乳酸比乙二醇共聚物)，聚乳酸聚合物(PLLA)，或者聚乙烯乙二醇/聚乳酸共聚物(PEG/PLA)，聚正酯類，聚酐，聚磷腈(polyphosphazene)和它們的混和物(二元)及共聚物。使用生物可降解的聚合物薄膜可以在美國專利US5,512,600中找到。
例如，在美國專利US5,512,600中討論的方法和在《biomedical MaterialsResearch》第34卷87-93(1997年)由Giordano及其他著作者撰寫的論文中所討論的方法可以被用來維護(hù)健康的晶狀體囊、內(nèi)界膜或別的體外和體內(nèi)的膜組織。生物可降解的(也就是說在置入動物體內(nèi)會溶化的)聚合物薄膜包括聚乳酸聚合物(PLLA)，聚乙二醇酸聚合物，聚正酯類，聚酐、聚磷腈、聚乳酸乙二醇酸共聚物(PLGA)，包括PLGA(50∶50乳酸比乙二醇酸共取物)，并且聚乙烯乙二醇/聚乳酸共聚物(PEG/PLA)薄膜可以被置于塑料培養(yǎng)皿的底面。晶狀體囊或別的膜組織隨后被放置在該表面上，并且用吸移管使其展平。膜組織和聚合物膜相互被移植在一起。該薄膜在活體內(nèi)溶解，讓膜組織留在后頭。該薄膜對膜組織提供較大的操作自由度；例如，聚合物薄膜阻止晶狀體囊發(fā)生卷曲，而且正是現(xiàn)有技術(shù)中存在的一個方法上的問題。另外，進(jìn)一步處理膜組織可以使用以下的步驟。
晶狀體組織(或者其他的膜組織)可以被置于一個適合細(xì)胞生長的環(huán)境里，例如一種組織培養(yǎng)的培養(yǎng)箱(incubator)或環(huán)境腔。在本發(fā)明的一個實(shí)施例里，晶狀體囊組織被埋入磷酸鹽緩沖鹽水溶液(PBS)中并且被維持在37℃的溫度下在一個95％氧氣-5％二氧化碳的氣體中。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)之后，用經(jīng)過滅菌的吸移管(pipette)將磷酸鹽緩沖鹽水吸掉，并且讓晶狀體囊平放在無菌的培養(yǎng)皿(petri dish)的底面上。然后晶狀體囊被浸泡在胰蛋酶(trypsin-EDTA)中1小時除去任何晶狀體上皮細(xì)胞，并且接著，浸泡在青霉素/鏈毒素中30分鐘使之消毒。然后晶狀體囊在PBS鹽水中漂清三次，接著，再用蒸留水漂清。每次漂洗都要仔細(xì)地用無菌的移吸管來進(jìn)行。最后，晶狀體和培養(yǎng)皿在紫外線光線下至少消毒三個小時。
在另外一個實(shí)施例中，使用一個界面腔(interface chamber)，在那里晶狀體囊組織(或別的膜組織)被放在濕濾紙上，濕濾紙蓋住一個充滿磷酸鹽緩沖鹽水的盤子。并且被維持在37℃的溫度下處在95％氧氣-5％二氧化碳的氣體中。眾所周知，在公知技術(shù)中許多種鹽水溶液，如碳酸氫鹽(bicarbonate)—緩沖鹽水(saline)或者別的鹽水溶液，可以被用來代替PBS。可供選擇的培養(yǎng)液(譬如象RPMI、DMEM或Hamm′s F12(生命技術(shù)、MD))可以被添加進(jìn)去或者替換本方法中所用的鹽水，并且，生長因子、抗體、血清(serum)和別的材料也可以被添加到鹽水中或者添加到用于維持晶狀體囊組織的培養(yǎng)液中。
修飾組織的方法包括整體修飾的方法和表面修飾方法。整體修飾方法又包括一些方法，即細(xì)胞的實(shí)體部分，本方法不局限于只修飾組織的表面部分。表面修飾的方法又包括組織在靠近組織的表面以及就在組織的表面被修飾，但是在別的組織的部位不作較大的修飾。
本發(fā)明的方法，它被應(yīng)用于晶狀體囊組織，無論是整體修飾還是表面修飾的方法，包括從一個眼睛里移出晶狀體囊，將其在一個無菌的玻璃或塑料基底，諸如培養(yǎng)皿顯微鏡載片或玻璃蓋片(coverslip)上展平，晶狀體囊被埋入磷酸鹽緩沖鹽水或其他的合適的液中，接著還要對晶狀體囊作進(jìn)一步的處理。大家會明白，類似的處理可以應(yīng)用于對內(nèi)界膜組織，布魯赫膜、羊膜或別的組織。
諸如培養(yǎng)皿那樣的基板和諸如顯微鏡載片這樣的玻璃基板可以被用標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟來作無菌處理，這樣的方法有用紫外線光照射，浸沒在酸中緊接著在蒸鎦水中重復(fù)漂洗，或者用別的公知的操作來處理。另外，塑料和玻璃基板可以在有表面涂層或沒有表面涂層的情況下使用。表面涂層包括膠原、膠原凝膠、纖連蛋白(fibronectin)，層粘連蛋白(laminin)，鹽水涂層，諸如聚甲基硅烷(polymethyl silane)，如聚-L-賴氨酸的一種聚合物涂層或者其他公知的涂層。
本發(fā)明的實(shí)施例中，基底(substrate)被制作用來作為膜組織，例如“組織—培養(yǎng)”塑料或以被放在70％的乙醇溶液中漂洗以除去灰塵和油，并且用空氣干燥。接下去的干燥步驟，該組織培養(yǎng)塑料可以被用一種溶液覆蓋，這種溶液包含有一種所希望的胞外基質(zhì)分子[也就是4mg/ml膠原，在PBS中的I類大鼠尾巴，浸在PBS中的25mg/ml取自人血漿的纖連蛋白(fibronectin)][膠原和纖連蛋白可以從Sigma，St.Louis，Mo買到]。在一個小時后，塑料可以被放在無菌蒸鎦水中漂洗兩次，并且被允許在紫外線下通宵干燥一夜。如果晶狀體囊基質(zhì)沒有立刻被加印過，它們被在4℃的溫度下儲藏。
為修飾諸如晶狀體囊組織這樣的膜組織整體修飾的方法包括為修飾厚度、通透度和晶狀體囊組織的其他性質(zhì)。在一個整體修飾方法的實(shí)施例中，這樣的進(jìn)一步的處理包括使用一種準(zhǔn)分子激光器去除晶狀體囊的表面，以便使晶狀體囊的總體厚度減小。例如，晶狀體囊可以被用激光或離子束或者采用機(jī)械方法摘除(be ablated)，以致使總體的厚度與布魯赫膜的厚度極為接近。
一種激光器，諸如準(zhǔn)分子激光器(也就是一種氟化氬激光器(Lambda Physik，201E型)可以被用來提供激光脈沖，用于剝離(ablate)晶狀體囊的表面。例如，在大約10至20納秒的持續(xù)脈沖時間內(nèi)，以大約1至50赫茲的頻率發(fā)生激光脈沖，其脈沖能量密度在大約300至500毫焦/平方厘米，這樣的能量密度可以以所希望的方式剝離(ablate)晶狀體囊的表面。每一個脈沖能去除組織的深度在大約5至50微米之間。因此，重復(fù)的脈沖能夠?qū)⒕铙w囊組織的厚度減小到所希望的總體厚度?？梢圆捎媚切┮呀?jīng)應(yīng)用于角膜手術(shù)的方法，并且，這些方法適合于在晶狀體囊組織的光剝離中采用。這樣的角膜光剝離的方法公開在美國專利US4、665、913和US5、634、920以及US5、735、843中。
在整體修飾方法的另一個實(shí)施例中，將組織放置到玻璃基板上之后，進(jìn)一步的處理包括使用激光器，如一種YAG激光器用于在晶狀體囊中產(chǎn)生微孔(micropores)。這樣的整體修飾通過提供微孔，改變了晶狀體囊組織的特性，以使跨組織的液體和溶液的快速交換得以實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，微孔的直徑尺寸在納米級或者更小。這樣，以整體修飾方法生成的微孔尺寸在大約0.01微米至大約10微米，最好是在0.1微米至大約1微米。一種鉺YAG激光器可以被用來提供持續(xù)時間在10至大約50納秒之間的脈沖，其能量級在大約1至50毫焦之間，最好是在大約1至大約20毫焦之間，這樣能按本發(fā)明的方法在晶狀體囊組織中做出孔來。
在整體修飾方法的另外一個實(shí)施例中，在將膜組織置入一玻璃基板上之后，進(jìn)一步的處理包括使用一種離子束來在晶狀體囊中加工出微孔，從而提供一為細(xì)胞附著更有利的基底，并且，使跨組織間的流體和溶液的迅速交換得以實(shí)現(xiàn)。請看，例如《科學(xué)》雜志第178卷93-98(2000年)Goplani及他人合著的論文，《材料研究學(xué)會論文集會刊》第540卷題目為”在被輻照材料中微結(jié)構(gòu)處理“，第255-260頁(1999年)、和在《核材料》雜志中Ohmichi與他人合著的論文(第248卷第354-359頁1997年)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，微孔的直徑尺寸在幾十個納米至幾Tm之間。
膜組織可以被冷凍干燥，目的在于暴露到離子束中?？晒┻x擇的方案有，膜組織可以被整體干燥，然后在微孔被加工出之后被重新水合(rehydrated)。一種離子束，如一個120MeV的Si28離子束可以被用于輻射組織。在將組織暴露在離子束中之后，接著膜組織可以被重新水合。使用膠原酶(collagenase)和其他蛋白酶(protease)或蛋白溶解酶(proteolytic enzyme)的生物蝕刻在下文中討論，如果大孔被要求，這種蝕刻工藝可以被用于擴(kuò)大微孔。
在整體修飾方法的實(shí)施例中，膜組織的處理包括蛋白酶沉積到膜組織上，使能對膜組織的表面和內(nèi)部進(jìn)行蝕刻(etch)、以為組織提供所需要的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(topology)和表面粘附(粘連)性能。在這種方法的一些實(shí)施例中，沉積步驟包括用載有酶的微接觸印記(printing shamp)去接觸晶狀體囊或別的膜組織。使得能夠?qū)M織的表面和內(nèi)部進(jìn)行生物學(xué)上的蝕刻。在將酶印到組織上之后，白蛋白(albumin)或一種酶抑制劑(enzymeinhibitor)可以被用來阻止在給定的時間之后的反應(yīng)。例如在20℃的溫度下，在一個恒溫的水浴中，擇優(yōu)地用膠原進(jìn)行高達(dá)26小時的不同時間長度的培養(yǎng)(incubation)，并且通過添加EDTA到最終為50mM的濃度阻止膠原酶反應(yīng)。使用胰蛋白酶(trypsin)的培養(yǎng)可以在大約0至5℃的溫度下進(jìn)行大約6至大約18小時(也就是在一個沒有鈣或鎂的胰蛋白濃度為0.25％的平衡鹽溶液中的培養(yǎng))。在用胰蛋白酶進(jìn)行的培養(yǎng)做完之后，胰蛋白酶溶液可以被移走，并且在用含有二價陽離子(如鈣和鎂)，總量約為1至大約5mM的洗液中漂洗之前膜組織被在37℃的溫度下培養(yǎng)20至30分鐘(也可選用含有胰蛋白酶抑制劑，如大豆胰蛋白酶抑制劑)。也可選擇在移走溶液和用含有大約1至5mM的二介陽離子的平衡鹽溶液對膜組織漂洗之前，讓膜組織用分散酶(大約0.5至大約3U/ml)或者別的蛋白酶(proteolytic enzyme)在平衡鹽溶液中(在37℃溫度下基本上沒有二價陽離子的情況下)培養(yǎng)高達(dá)幾小時。
在整體修飾方法的實(shí)施例中，例如，諸如膠原酶(collagenase)、胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotryptsin)，分散酶(dispase)、游離酶(liberase)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)，胃蛋白酶(pepsin)，木瓜蛋白酶(papain)，和別的蛋白水解酶(proteases)，可以用來作為在蒸餾水、磷酸鹽—緩沖鹽水或別的緩沖溶液中的溶液，濃度范圍在大約0.01mg/ml至大約100mg/ml之間，最好是在1mg/ml或大約20mg/ml之間，被施敷到一個微接觸印記(microcontact printing stamp)的表面。該組織表面，如晶狀體囊組織，可以在空氣中接觸或者浸泡在一種鹽水溶液中接觸。在此，蛋白酶在缺鈣的情況下是活性的，諸如像胰蛋白酶(trypsin)，螯合劑例如(EDTA)和(EGTA)在溶液中的濃度范圍最好在大約1至大約10mM。在這樣的情況下，當(dāng)根據(jù)需要向溶液中加入鈣和或鎂，酶的作用就會停止?？傊?，酶作用會被過量的不含酶的溶液稀釋或者通過加入一種合適的酶抑制劑而停止。(例如胰蛋白酶可以被一種胰蛋白酶抑制劑所抑制，這種胰蛋白酶抑制劑有像大豆胰蛋白酶那樣的抑制劑，T-9003，sigma化學(xué)公司st.Louis，Mo)。
在整體修飾方法的另一個實(shí)施例中，內(nèi)界膜或晶狀體囊組織的處理包括用失活的酶，諸如用失活的膠原酶去浸潤組織，然后再用激光照射使之活化過來。例如，在一個實(shí)施例中，一個非常小的區(qū)域，組織的直徑尺寸小于一微米(micron)通過一種“α—光子共焦激光系統(tǒng)”的照射被激活化。酶以這種方法被激活化對降解(degrade)或者對在一個激活被發(fā)生的小區(qū)域內(nèi)去改變組織產(chǎn)生作用，而附近區(qū)域未被該共焦激光系統(tǒng)激活仍舊處于不變狀態(tài)。被激活的酶會被水沖走或被水失活。適合于本發(fā)明的酶包括但不限于膠原酶(collagenase)、胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotryptsin)、分散酶(dispase)、游離酶(liberase)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(pepsin)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)和其他蛋白酶(proteases)。
在表面修飾方法的一個實(shí)施例中，微接觸加印(microcontact printing)技術(shù)被用于構(gòu)建生物分子的化學(xué)微型模格(micropatterns)到組織上。例如，晶狀體囊組織的表面修飾可以包括將生物分子的模型沉積到晶狀體囊組織上去。這樣的模型(patterns)，會包括幾何圖形或線性模型的反復(fù)重復(fù)，或者會包括僅僅幾個或者是單獨(dú)一個模型(pattern)而它不是由較小的模型單元構(gòu)成。這樣，表面修飾的模型可以包括沉著在組織表面上的生物分子的線列或者生物分子的彎曲布置，一長串列的圓形模型(series of circularly-shaped patterns)，諸如生物分子的環(huán)或點(diǎn)，或者，一長串的另外的形狀，包括單一模型的多種形狀。有多種選擇方案，這種模型可包括實(shí)質(zhì)上被沉積的生物分子覆蓋的延伸的面積，或者實(shí)質(zhì)上缺乏沉積的生物分子的延伸面積(extended areas)。這將會使我們明白，這些方法包括任何包含有線條、形狀、或者沉積有分子的區(qū)域，也包括位于沉積有生物分子的區(qū)域之間的缺乏沉積分子的區(qū)域的合適模型。這樣的微型結(jié)構(gòu)總的來說是要增進(jìn)在修飾過的膜表面上細(xì)胞的附著和生長。然而，在本發(fā)明的實(shí)施例中，微型模格(micropatterns)被做在這樣的地方，即，被修飾了的膜組織的區(qū)域變成不適合，或者很少適合細(xì)胞附著和生長。在這樣的情況下，細(xì)胞附著和生長可以被導(dǎo)引至并且限制在未經(jīng)這般處理過的膜組織的那些區(qū)域。
微接觸印記(printing stamps)可以包括整個要被沉積到靶組織上去的模型(pattern)，或者包括所要的模型的一部分。在此，印模(stamp)包括一個所要模型的一部分，往組織表面多次使用微接觸印模(microcontact printing stamp)結(jié)果就提供了我們所要的在組織表面的生物分子的模型。在此，印模(stamp)，包括整個模型，生物分子可以以我們所要的圖模被沉積到微接觸印模自身上去。
在一個微接觸印模上生物分子的模型(pattern)可以被印模上的生物分子的布局(placement)來確定，或者被印模的表面圖案所確定。在此，生物分子的模型是由印模的表面圖形所確定的，該幾何模型(geometric pattern)可以包括局部高出的紋(ridges)，在此，印模與生物分子的一個源相接觸，這種接觸使這樣的生物分子沉積到高起的表面上，在沒有高起的表面部分實(shí)質(zhì)上沒有生物分子被沉積在其上。在這樣的一個微接觸印模中沉積在組織上的生物分子圖型是遵照所述的高起表面上的圖型。有方案可供選擇，所述的圖型可以包括凹域，凹溝或裂縫(fissures)，諸如在一個表面上的刻痕(scratch)，在此，印模與生物分子源接觸的作用是將這樣的生物分子沉積到表面的主要部分，而在表面的凹域上實(shí)質(zhì)上沒有生物分子被沉積。在這樣的一個帶凹域的微接觸印模中生物分子會被沉積在一個組織的實(shí)質(zhì)性部位(substantial portion)，而那些實(shí)質(zhì)上缺乏沉積生物分子的區(qū)域是順著凹表面的圖型。
在這些方法的一些實(shí)施例中，圖型的尺寸在幾個微米或者更小的級別上。因此，本發(fā)明的表面修飾方法的實(shí)施例中單個印模的總體構(gòu)成的尺寸在大約0.1微米至大約20微米之間，最好是在大約0.5微米至大約5微米之間。
適合于沉積到組織表面的生物分子包括蛋白質(zhì)、肽(縮氨酸)(peptide)、有機(jī)分子、寡糖(oligosaccharides)、和短鏈聚合物，包括但不限于膠原(collagcen)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)、硫酸角蛋白(keratin sulfate)，聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate)，聚苯乙烯(polystyrene)，聚甲基苯乙烯(polymethyl styrene)、聚賴氨酸(polylysine)，聚乳酸乙二醇酸(PLGA)衍生出來的聚賴氨酸、聚賴氨酸肽(polylysinepeptides)，和諸如十八烷基三氯硅烷(octadecyltrichlorosilane)(OTS)之類的鹽水聚合物。表面修飾包含生物分子的沉積，表面修飾目的旨在改變組織的生物特性，比如處于顯微構(gòu)建組織上面的細(xì)胞的附著的能力或放便性。例如，疏水性的分子的沉著是為了使在晶狀體囊組織上的選擇的細(xì)胞附著點(diǎn)失活。
微接觸印?？梢杂萌魏文鼙Ａ糇∫贿m合的圖型的材料來制造，比如玻璃、陶瓷、金屬、塑料、聚合物，或別的材料。在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，微接觸印模包括有聚二甲基硅氧烷(dimethylsiloxane)(PDMS)，它是商業(yè)上能購到的(也就是Sylgard 184from Dow Corning、Midland MI 48640)。微接觸印?？梢詮暮兴獔D型的主模板(masters)在PDMS中做成，比如這種模板可以是線狀網(wǎng)格圖型。
可選擇的方案有，要加工成型的模型是由沉積到組織上去的模型(圖型)來確定的，印?？梢园ㄒ粋€簡單的表面，例如一個平表面，它適合載帶生物分子。這樣的印?？梢园ㄡ?pins)，有槽(開縫)的銷、桿，它可以有圓形、三角形、方形，其它多邊形或不規(guī)則形狀的周邊。
在表面修飾方法的實(shí)施例中，晶狀體囊組織被掩膜來進(jìn)行部分覆蓋，而不是晶狀體囊組織的表面的整體全面覆蓋，然后被用紫外線輻照，目的旨在使組織的暴露部分的胞外基質(zhì)(ECM)變性。使專為細(xì)胞粘著用的分子失活，并且抑制或阻止細(xì)胞在被暴露的部位而不是被覆蓋的區(qū)域粘連和生長。
在本發(fā)明的方法的這個實(shí)施例中基底(substrate)的部分可以被去活性，阻止細(xì)胞的附著和生成，然后在特定的部位再激活。通過使蛋白質(zhì)失活，細(xì)胞的生長就被限定在有限的區(qū)域。一個失活的基底阻止成長細(xì)胞的附著、傳播或者兩者。例如，0.2％聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)溶液和粘質(zhì)是用來對基底去活性的。
通過施布一種去活性物質(zhì)于基底，一個表面可以被去活性，而該表面的一部分可以被重新恢復(fù)活性，例如，0.2％PVA被施加到晶狀體囊的表面，目的旨在使晶狀體囊的表面失去活性。失去活性的晶狀體囊表面曝光于來自于準(zhǔn)分子激光器的激光微模型(miropattern of light)，這一暴光使得在晶狀體囊表面刻上一被激光刻出的微模圖型(micropattern)。例如，一幅微型模圖可以通過晶狀體囊表面透過掩膜的照射在晶狀體囊表面產(chǎn)生。被剝落的顯微模圖通過移走或改變失活物質(zhì)，重新激活基底的一些部位使細(xì)胞生長并且傳播進(jìn)入剝落區(qū)域，這樣，引導(dǎo)細(xì)胞按所要的模圖生長。
掩膜步驟可以包括將網(wǎng)格(grid)放置到組織上去，在此，格柵(grid)包含有一種材料，其作用是去阻止表面的輻照。所述的網(wǎng)格可以用包括金屬、玻璃、塑料、陶瓷、聚合物、蛋白質(zhì)等材料或別的材料使吸收或反射紫外線輻射。
在掩膜方法的一個實(shí)施例中，掩膜的步驟包括使用微接觸加印技術(shù)將保護(hù)分子的模型施加到晶狀體囊組織上表面上去，其作用是在有保護(hù)分子覆蓋的區(qū)域阻止ECM變性。這樣，掩膜步驟的網(wǎng)格(grid)可包括一在表面上的涂層，其作用是將表面與輻照隔離。這樣的一層涂層可以包括一種蛋白質(zhì)，最好是富酪氨酸和氨基酸殘留渣，它吸收紫外線光，還包括一種聚合物，其作用是吸收紫外線，或者一種小分子，其作用是屏蔽紫外光線，例如，“對氨基苯甲酸”(para-amino benzoic acid)(PABA)。
本行業(yè)技術(shù)人員將理解，表面修飾方法和整體修飾方法每種可以被應(yīng)用于單一組織。這樣，例如相同的晶狀體囊組織可以被表面修飾處理，也可被用整體修飾的方法處理，修飾的作用是提供顯微構(gòu)建的晶狀體囊組織。
顯微構(gòu)建的組織適合于為生長細(xì)胞的基底之用。一種在顯微構(gòu)建的組織上生長細(xì)胞的方法包括提供一種用上述之一的方法制造出來的顯微構(gòu)建組織，并且將細(xì)胞施加到該顯微構(gòu)建的組織上去。例如，顯微構(gòu)建的組織可以包括一顯微構(gòu)建的帶有印在其表面上印記的晶狀體囊，例如一種膠原的印記，而細(xì)胞可以包括IPE細(xì)胞、RPE細(xì)胞、干細(xì)胞，或者別的細(xì)胞。在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中包含有自體組織和細(xì)胞，顯微構(gòu)建的組織，而細(xì)胞是取自于同種動物。
本發(fā)明還提供使用顯微構(gòu)建組織的方法，它包括將顯微構(gòu)建組織移植到一種動物身上的手術(shù)方法。在較佳實(shí)施例中，將顯微構(gòu)建組織移植到一個動物體的方法，包括用手術(shù)方法來將顯微構(gòu)建的組織移植到一個動物的眼球里。在最佳實(shí)施例中，顯微構(gòu)建的組織移植進(jìn)入一種動物的眼睛，包括顯微構(gòu)建的晶狀體囊移植到一種動物的視網(wǎng)膜內(nèi)或者視網(wǎng)膜附近。在一些實(shí)施中，被移植的組織進(jìn)一步包括在顯微構(gòu)建晶狀體囊組織上生長的細(xì)胞。在另外的一些實(shí)施例中，被移植的組織包括RPE細(xì)胞、IPE細(xì)胞、干細(xì)胞或在顯微構(gòu)建晶狀體囊組織上生長的別的細(xì)胞?？晒┻x擇的方案有，可溶性的聚合物基底可以被用于生長細(xì)胞，這種細(xì)胞是供移植用的。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，被移植的組織包括RPE細(xì)胞、IPE細(xì)胞、干細(xì)胞或別的細(xì)胞，它們生成在顯微構(gòu)建的膜組織上或生長在可溶解的聚合物基底上，在那兒，細(xì)胞和組織被取自于與被接受移植的動物同樣的動物。
從一個眼球分離和移出RPE細(xì)胞的方法可以在《視網(wǎng)膜研究進(jìn)展》雜志第10卷(1991年)上的作者為Pfeffer.B.A，的論文“人類細(xì)胞培養(yǎng)的改進(jìn)的方法論以及猴子視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞”第10章，編輯Osborn，N.，和chader，J.；中可以發(fā)現(xiàn)。這些方法也可以被應(yīng)用于IPE細(xì)胞。該細(xì)胞可以從一個捐贈者的眼睛移出或者從病人的完整的眼睛里移出，包括最終接受顯微構(gòu)建的帶細(xì)胞的組織的移植。收集細(xì)胞的方法在活組織檢查(in a biopsy)中獲得，作為一種自體移植的手術(shù)步驟，這可以在作者Lane，c.，和其他合著人在《Eye》雜志第3卷第27-31頁(1989年)發(fā)表的論文中找到。為獲得RPE和IPE細(xì)胞的進(jìn)一步方法可以在作者Abe及其他合著人在1999年，作者Thumann與其他合著人在1999年；作者Lappas與其他合著人在2000年，以及作者Thurmann與其他合著者在2000年撰寫的論文中找到。
IPE細(xì)胞、RPE細(xì)胞、干細(xì)胞或者別的細(xì)胞可以被浸泡在鹽水中，例如磷酸鹽—緩沖鹽水，其密度大約104個細(xì)胞/毫升至大約107個細(xì)胞/毫升。已分離的RPE細(xì)胞、IPE細(xì)胞、干細(xì)胞或其他細(xì)胞可被施加到顯微構(gòu)建組織上，例如，加到顯微構(gòu)建的晶狀體囊組織通過小心地移吸一種含有IPE細(xì)胞和RPE細(xì)胞干細(xì)胞或其他細(xì)胞的溶液到浸沒在PBS中的顯微構(gòu)建的組織上，接著是將細(xì)胞和組織維持在37℃的溫度下，并處于無菌的濃度為95％的氧氣與5％的二氧化碳的混合氣體中12小時。該P(yáng)BS可以用一無菌的移吸管來移走，并且晶狀體囊被展平放置在無菌的培養(yǎng)皿(petridish)或其它容器的底面上。晶狀體囊然后被浸泡(be soaked)在胰蛋白酶-EDTA中為時1小時以除去任何晶狀體上皮細(xì)胞，并且接下去用青霉素、鏈霉素進(jìn)行30分鐘的消毒滅菌。此后，晶狀體囊可以被在PBS溶液中漂洗三次，接下去再在蒸餾水中漂洗三次。每次漂洗需小心地用無菌的移液吸管來進(jìn)行。最后，晶狀體囊和它的載片在紫外線的照射下進(jìn)行消毒滅菌至少三小時。
在施布細(xì)胞之前，顯微構(gòu)建的組織，例如晶狀體囊，內(nèi)界膜，布魯赫膜和其他組織可以被修飾并且按上述方法被顯微構(gòu)建?？晒┻x擇的方案有，除這樣的修飾和顯微構(gòu)建之外，微觀流體通道或者微觀流體通道(microfluidic channels)的模型可以布置在待修飾的膜表面，一種細(xì)胞和分子的懸浮液可以被提供給膜表面。例如，一種微觀流網(wǎng)絡(luò)(Delamarche及合著者的文章中曾經(jīng)有過描述《科學(xué)》雜志第276卷第779-781頁，1977年)，在此，被結(jié)合起來作為一個整體它可以為了修飾該膜被施布到膜組織表面，在這樣的一個步驟中，一個溝槽或者一串列的溝槽可以被在PDMS上形成，或者在別的生物兼容性材料上形成，一旦將PDMS放置到一個膜組織上面的時候，該溝槽就形成一定的水道，膜組織的表面用作一水道壁面。細(xì)胞或生物分子可以帶進(jìn)水道與膜組織表面接觸，通過帶生物分子或細(xì)胞的溶液，或者既帶細(xì)胞又帶生物分子的溶液在水道內(nèi)的流動，細(xì)胞或生物分子就與膜組織表面接觸。細(xì)胞和生物分子這樣就沉著在膜組織被暴露的表面上，該膜組織形成一個通道的壁面，細(xì)胞和生物分子還可對膜組織被暴露的表面進(jìn)行修飾。
被分離出來的RPE細(xì)胞、IPE細(xì)胞、干細(xì)胞或其他細(xì)胞也可以被施布到一個膜組織上，該膜組織被一模片(stencil)部分地覆蓋。適合于本發(fā)明的模片具有由孔或通道構(gòu)成的模型，這些孔或通道是貫穿其表面的。這樣的模片(stencil)蓋住其下的膜組織，當(dāng)模片被施加到一膜組織上時，而孔或通道的模型(pattern)的作用是讓其下的膜組織的一部分被暴露。一個用于對組織進(jìn)行顯微構(gòu)建的模片可以有厚度比模片的整體厚度還要厚的隆起凸緣(rim)，為了幫助提供機(jī)械強(qiáng)度。一個具有這樣的孔或通道模型的模片可以被施加到待修飾的膜組織的表面，其作用是導(dǎo)引在膜組織上的細(xì)胞的生長或者調(diào)節(jié)膜組織對外表面的制劑(agents)的暴露和處理。在這種方法的一些實(shí)施例中，所述的模型(pattern)的尺寸大小可以在幾個微米或更小，或者在幾微米，這樣，模型可以在大約0.1微米至大約100微米之間，最好是在1微米至大約75微米之間，更好的方案是在大約5微米至大約50微米。一個模片(蓋)可以用任何合適的生物材料來形成，例如，PDMS或PLGA/PEG聚合物。一種合適的模片材料可以是固體或膠狀的，并且最好是柔軟的。模片(蓋)適合貼合于移植到動物眼球用的膜組織，它可以用與那些在論文中所描述的相同的方法來制作，例如Folch及其他合著者J.Bioned.Mater.Res.52期、第346-353頁(2000年)。
顯微構(gòu)建的晶狀體囊組織移植進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔可以用任何能接觸進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔的方法來實(shí)現(xiàn)。通過順眼睛的橫向切開鞏膜就可以進(jìn)入視網(wǎng)膜通過一個更前位的切開通過玻璃體的玻璃體液進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔。這種進(jìn)入并植入視網(wǎng)膜包括視網(wǎng)膜下腔的作業(yè)步驟已經(jīng)被作了敘述；請看論文Abe及其他著者合著的Tohoku J.Exp.Med第189卷第295-305頁1999年，Abe及其他合著的Tohoku J.Exp.Med第191卷第7-20頁2000年，Lappas及其他合著的Graefes′s Arch clin Exp Ophthalmol，第238卷第631-641頁2000年，Thumann及其他人合著的Arch.Ophthalmol.第118卷.第1350-1355頁(2000)，美國專利US5,962,027和美國專利US6,045,791。
可供選擇的方案有，一種顯微接觸印模(stamp)，或者一種模板(stencil)可以被施加到一個體內(nèi)的眼睛膜，例如，進(jìn)入一個完整無損的活的眼球里的布魯赫膜里，這可以通過標(biāo)準(zhǔn)的外科手術(shù)，包括用一種氣體、鹽水、礦物油或別的生物可兼用液體浸制形成一個細(xì)胞泡(bleb)進(jìn)入眼睛的視網(wǎng)膜下腔，并且一個模蓋或者顯微接觸印模的這種應(yīng)用可以被進(jìn)行濕化，也就是出現(xiàn)正常體液，PBS或其他人造生理溶液礦物油或者別的生物可兼容液體?？晒┻x擇的方案有，這樣的顯微接觸印模(microcontact printingstamp)或者模蓋的應(yīng)用會被進(jìn)行干燥，也就是在缺乏正常人體體液或人造生理溶液、比例通過用一種惰性氣體(如氮?dú)饣驓鍤?去填充視網(wǎng)膜下腔。
一個完整的布魯赫膜可以現(xiàn)場顯微構(gòu)建制備，用刮削(scraping)或者清理布魯赫膜以除去RPE細(xì)胞在施布印?；蚰０?stencil)之前。然后一個印模或模蓋可以被用來提供一個所要的模型(pattern)在膜表面上。例如一種具有一個通道模型的PDMS模蓋(stencil)，它可以被施布到布魯赫膜的表面。細(xì)胞可以附著和生長在被通道暴露的膜表面上。相似情況，溶液中的生物分子與膜表面相接觸可以對被通道暴露的膜表面進(jìn)行接觸、修飾或粘附于其上。通道的模型其作用是提供一個適合于用來導(dǎo)引生物分子的沉積的模型，并且該模型導(dǎo)引所加入細(xì)胞的生長，例如，RPE、IPE細(xì)胞、干細(xì)胞或其他所加入的細(xì)胞，或者使取自眼球其他部分的內(nèi)源細(xì)胞(endogenous)重新生長。另外，可選擇的方案有一個顯微接觸的印模載有層粘連蛋白(laminin)、纖連蛋白(fibronectin)，或其他所要的涂層劑(coating agent)，可以被施布到眼球膜表面。在進(jìn)一步的可作選擇體現(xiàn)本發(fā)明的方法中，內(nèi)眼球膜可以通過鞏膜，例如通過鞏膜穿刺、鞏膜切開形成鞏膜窗，或者其他方法被接觸到。取接觸鞏膜的優(yōu)點(diǎn)這類方法中為了進(jìn)入要手術(shù)的眼球膜可以不需要橫過玻璃體液(vitreous humor)。


圖1A為可溶性底物上的顯微構(gòu)建膜組織的剖面圖。
圖1B為一動物眼的剖面圖，在其視網(wǎng)膜下移植了可溶性底物上的顯微構(gòu)建膜組織。
圖1C為圖1之詳圖，顯示眼球內(nèi)視網(wǎng)膜下、視網(wǎng)膜和顯微構(gòu)建組織。
圖2為本發(fā)明中用于制作顯微構(gòu)建膜組織的顯微接觸印記。
圖3為本發(fā)明中與顯微接觸印記連接的顯微構(gòu)建晶狀體囊膜組織。
圖4描述了一種聚二甲基硅氧烷(dimethylsiloxane)(PDMS)印記，該按本發(fā)明的方法將微模型施加到膜組織上。
圖5描述了在晶狀體囊膜上生長的細(xì)胞，晶狀體囊膜已被用PDMS印記微型晶格化處理加工過。
圖6是一在聚乳酸/聚乙二醇載體基質(zhì)上被顯微構(gòu)建處理過的晶狀體囊膜的顯微照片。
圖7是一被移植后一星期的兔子視網(wǎng)膜塊的光學(xué)顯微照片(photomicrograph)，該視網(wǎng)膜包含有一種在聚乳酸/聚乙二醇載體基質(zhì)上顯微構(gòu)建加工過的晶狀體囊膜(lenscapsule)。
具體實(shí)施例方式
例1顯微接觸加印術(shù)(Microcontact printing)被用來在晶狀體囊組織上沉著顯微尺寸的生物分子模型(pattern)。聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)印模被從含有間隔為50微米的網(wǎng)格線(grid lines)的拓?fù)淠Ｐ?topological pattern)的主模鑄成。聚(二甲基硅氧烷)PDMS印模被用主模制成，所述的主模(master)被用硅片(silicon wafer)顯微構(gòu)建做成。聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)模印被用于在晶狀體囊組織上顯微構(gòu)建出許多模型(pattern)。如圖1中所示的是PDMS模印的一掃描電子顯微照片(SEM)，該模印用來將顯微模型(micropattern)沉著到一片人眼晶狀體囊組織上。
如圖2顯示的該P(yáng)DMS印模具有一個由六角形陣列(5μm寬的線條)所給出的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。每條線間隔大約50μm。如圖所示，被用圖1所示的PDMS印模加印過的一個人體晶狀體囊。該P(yáng)DMS印模被用于沉積六角形的PVA模型和熒光素(fluorescein)溶液(2％PVA和0.1mg/ml熒光素)到晶狀體囊上。這個例子顯示印模的作用是在與印模相對應(yīng)的模型表面上產(chǎn)生一個模型。
例2一種帶有圓形模型的PDMS印模的掃描電子顯微照片SEM，這種圓形模型用于顯微構(gòu)建組織，圖4顯示了這幅SEM照片。如圖顯示，印模(stamp)具有一個圓井(其直徑約為50μm)陣列所給出的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(surfacetoplogy)。當(dāng)該釋放模被用抑制性分子，諸如PVA或者粘液(mucilage)涂覆，并該印模貼合(applied)到一個晶狀體囊上去的時候，該抑制性分子就被轉(zhuǎn)移到晶狀體囊上去。圖5顯示一個已被用一種PDMS印模(它具有一個如圖2所示的印圖)印圖后的晶狀體囊的表面，在其上有RPE細(xì)胞生長。這個例子表明印模的作用是將印圖印到晶狀體囊表面上，在該表面上被印的圖型是與印模上的圖型一致的，并且細(xì)胞按照印模上的印圖(pattern)長成這樣的圖型。
這樣，本發(fā)明的印模的貼印能夠讓抑制性分子按圖型沉積，該圖型能導(dǎo)引生長在一個被模印過的基底上生長著的細(xì)胞的生長。因?yàn)樵摼铙w囊自動地得以生長，例如PVA這樣的抑制性分子被擇優(yōu)按模型圖生長。在基底上的印模(它被處理用來抑制生長)的使用會要求使用活化的分子來在基底上構(gòu)圖生長(to pattern growth)。
例3晶狀體囊組織的表面掩膜(Masking)、然后用紫外線輻照被暴露的表面，而不照射被掩膜的表面，掩膜的實(shí)施是通過將SEM網(wǎng)格放置到晶狀體囊組織的表面得以實(shí)現(xiàn)的。一個SEM網(wǎng)格(其間隔距離為50微米)被布置到一個被暴露的表面上，該表面是擱放在一個浸沒在磷酸鹽緩沖鹽水中玻璃蓋玻片(glass coverslip)上的一個被切開的晶狀體囊組織被暴露的表面。該晶狀體囊組織的表面和SEM網(wǎng)格沒有被浸沒在磷酸鹽緩沖鹽水中，而是高出磷酸鹽緩沖鹽水的水平面。紫外線光被直接照射到晶狀體囊組織的暴露表面，其作用是照射沒有立即靜止在低于SEM網(wǎng)格材料的晶狀體囊組織。在照射之后，SEM網(wǎng)格被移走。晶狀體囊表面包含一個線模格，它包括沒有被輻照過的組織(在SEM網(wǎng)格材料以下的區(qū)域)，它將包含有輻照過的組織的區(qū)域包圍起來。
例4平的基底和保證基底一旦被植入眼球的視網(wǎng)膜下腔或其他區(qū)域中不會彎曲或彎折將有助于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和虹膜色素上皮細(xì)胞的單層培養(yǎng)物的生長。一種可生物降解的基質(zhì)涂料被發(fā)現(xiàn)可以阻止晶狀體囊組織上彎折和卷曲。這樣的一種生物可降解基質(zhì)(它阻止基質(zhì)卷或折彎)適合于用來作為移植到眼球用的視網(wǎng)膜色素上層細(xì)胞和虹膜色素上皮細(xì)胞的單層培養(yǎng)物的生長用的基底。
一種生物可降價的聚合物基質(zhì)，它是由聚[(dl-丙交酯/乙交酯(dl-lactide.glycolide)]制成的，制作的方法是，在不同量的二氯甲烷(dichloromethane)中溶解50毫克的一種90∶10的聚(dl-丙交酯/乙交酯)的混合物，做成100毫克/ml(0.5ml二氯甲烷)，150毫克/ml(0.33ml二氯甲烷)和200毫克/ml(0.25ml二氯甲烷)的溶液。這里所述的聚(dl-丙交酯/乙交酯)是warrington PA 18976 polysciences公司的出品。
在做切除白內(nèi)障手術(shù)過程中獲得的人眼晶狀體囊在作無菌消毒前在紫外線照射下及4℃的溫度下被存放在磷酸鹽緩沖鹽水中，(紫外線為254nm，存放時間為3小時，然后用0/0 5％的胰蛋白酶-(乙烯二胺基四乙酸)[trypsin-(ethylene diamine tetraaceticacid)]在37℃的溫度下處理10分鐘來除去非變性上皮細(xì)胞。被處理過的晶狀體囊被在一放在培養(yǎng)皿中的單層石蠟?zāi)ぶ袖佌共ド⒉⑶以谄湟幻嫱恳跃?d-乳酰乙醇酸(PLGA)可生物降解的基質(zhì)，所述的基質(zhì)為單一濃度，通過從一移液吸管中往晶狀體囊表面分滴5μl或20μl的PLGA溶液來鋪展，在此所述的Parafilm(是Pechiney塑料包裝公司Neenah，WI54956的產(chǎn)品)。PLGA溶液被允許在5毫米直徑的圓范圍上鋪展，在該面積的圓范圍內(nèi)有被展開平放的晶狀體囊。溶劑在一化學(xué)通風(fēng)櫥中揮發(fā)(蒸發(fā))。
五只新西蘭白兔體重為2.5至3.5公斤，經(jīng)歷了晶狀體囊/PLGA復(fù)合物的植入遵照以下標(biāo)準(zhǔn)ketamine 40毫克/公斤和Xylazine(5毫克/公斤)來麻醉(anesthesia)進(jìn)行手術(shù)。滴入0.5％Tropicamide和2.5％Phenylephrine眼藥水到左眼的結(jié)膜囊內(nèi)(每五分鐘三次)。先作標(biāo)準(zhǔn)三通道玻璃體切割術(shù)，用42號針頭將約0.5ml平衡鹽液注入黃斑區(qū)形成一個視網(wǎng)膜泡，再進(jìn)行視網(wǎng)膜切開，直徑為1毫米，用視網(wǎng)膜下鉗子將晶狀體囊膜/PLGA通過切開口插入，直至視網(wǎng)膜下腔。再通過氣液交換使視網(wǎng)膜重新復(fù)位。
被做好手術(shù)的眼球在晶狀體囊/PLGA植入后一個星期被移出，并且固定在1.25％的戊二醛(glutaraldehyde)1％的低聚甲醛(paraformaldehyde)，在二甲胂酸鹽(cacodylate)在四氧化鋨(osmium tetroxide)中，在一個分級的series of酒精中干燥，再被埋在環(huán)氧樹脂中，被切割成1μm的切片(sections)并被用甲苯胺藍(lán)(toluidine blue)染色。
移植體植入后一個星期(post-implantation)進(jìn)行的組織學(xué)研究表明，晶狀體囊平展貼附在布魯赫膜上。這可用一個兔子視網(wǎng)膜的片塊來說明，該視網(wǎng)膜具有一晶狀體囊/PLGA移植體(implant)，是取自在移植后一星期，如圖7所示。有一個局部的損壞感光分子層，和一重疊搭接的視網(wǎng)膜分離(detachement)，估計(jì)可能是在先前被細(xì)胞泡所占的那塊面積。PLGA幾乎完全溶解在全部表面里。五個移植塊展示了涂有PLGA的晶狀體囊在手術(shù)中是很容易處理的，并且有足夠的剛性，這樣移植體就會在視網(wǎng)膜下腔中呈平整的狀態(tài)。沒有證據(jù)表明有明顯的炎癥反應(yīng)。
這個實(shí)例表示PLGA大大地改變了在視網(wǎng)膜下腔植入中晶狀體囊的手術(shù)處理，并且待移植的晶狀體不會卷曲。而未處理過的晶狀體囊會卷攏成多層或在移植過程中會彎折，用生物可吸收基質(zhì)涂覆(例如在本實(shí)施例中所用的PLGA涂覆)處理過的晶狀體囊在完成移植后在視網(wǎng)膜下腔中保持相對平整性。因?yàn)镻LGA會在幾個星期之內(nèi)降解掉，事后的對于植入體的免疫反應(yīng)的考慮可以被消除掉。本例顯示出被改進(jìn)了的被涂覆的顯微構(gòu)建晶狀體囊的機(jī)械特性，本例敘述了涂覆顯微構(gòu)建的組織(例如晶狀體囊、內(nèi)界膜、布魯赫膜和別的組織)，克服未被處理過的組織的機(jī)械強(qiáng)度薄弱的缺點(diǎn)，并且提供一個改進(jìn)了的為組織和細(xì)胞移植用的基底。
例5一個治療AMD的例子，它是要將RPE細(xì)胞或者IPE細(xì)胞的懸浮細(xì)胞移植以治療拯救視網(wǎng)膜疾病。本發(fā)明提供新穎的組織工程技術(shù)來精密地人工改進(jìn)自體人類組織作為一個細(xì)胞移植，諸如IPE細(xì)胞、RPE細(xì)胞、干細(xì)胞及其它合適的組織包括膜組織，例如晶狀體囊(也就是人類晶狀體囊)，內(nèi)界膜、布魯赫膜組織、角膜組織、羊膜組織、漿膜組織、粘膜組織和神經(jīng)組織。
一種抑制性分子的顯微幾何結(jié)構(gòu)，它被布置在一個合適的基底的表面上。合適的基底包括人體眼球晶狀體囊、膠原凝膠、膠原-纖連蛋白(fibronectin)，和涂有層粘連蛋白(laminin)的塑料，和溶解性聚合物(例如PLGA或PLLA)。人體眼睛晶狀體囊可以在做白內(nèi)障切除手術(shù)時獲得。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞RPE的培養(yǎng)物是在這些被顯微加工的表面上生長，并且用掃描電子顯微技術(shù)，原子力顯微技術(shù)和熒光顯微技術(shù)被作技術(shù)分析。在自體組織的顯微構(gòu)建表面和合成構(gòu)成的表面和膜之間的種種比較然后就被進(jìn)行。
這些比較表明單個RPE細(xì)胞可以被導(dǎo)引在生物表面上的微環(huán)境中生長。雖然，所有被研究的表面是適合于顯微加工，包括人眼晶狀體囊，這將令大家明白，不同組織的制作工藝方法會被用于改變“細(xì)胞對細(xì)胞”的距離以及生物因子和細(xì)胞粘連分子的微環(huán)境。
例6在本例中，分離的RPE細(xì)胞被貼附在晶狀體囊膜組織上，該組織已被用一模蓋(stencil)局部的覆蓋、并且它們在晶狀體囊上面的生長由模蓋模型(stencil pattern)定向?qū)б?。纖連蛋白(取自于人體血漿、25μg/ml在PBS中)被涂到一個擱置在一浸沒在磷酸鹽緩沖液中的蓋玻片(coverslip)上的一塊被切除的晶狀體囊組織上。一個PDMS模蓋具有一規(guī)則的六角形孔(大約50μm對角線長)的模型，孔與孔相距約10μm，被無菌地擱置在一塊被切除的晶狀體囊組織上面。纖連蛋白促進(jìn)模蓋與晶狀體囊的粘連以及促進(jìn)加入進(jìn)的細(xì)胞的粘連(adherence)。分散在細(xì)胞生長培養(yǎng)基礎(chǔ)(medium)(107個細(xì)胞/毫升)中的RPE細(xì)胞被無菌地加入到在晶狀體囊表面上的鹽溶液中所述的晶狀體囊組織局部地被模蓋所覆蓋。晶狀體囊、模蓋、玻片蓋、加入進(jìn)來的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液被維持在一個組織培養(yǎng)箱的組織培養(yǎng)皿中，并且被維持在合適的培養(yǎng)條件下，在接近37℃的溫度下，在95％氧氣與5％二氧化碳的混合氣氛中維持。所述的模蓋的六角形孔的模型留有暴露于RPE細(xì)胞的做基礎(chǔ)襯底的(underlying)膜組織一些部位。所述的RPE細(xì)胞與暴露的晶狀體囊組織相粘附，并且在其被模蓋導(dǎo)引(directed)的六角模型中生長。作為結(jié)果的顯微構(gòu)建的帶有粘附的RPE細(xì)胞的晶狀體囊組織適合于移植到動物的眼睛。
例7在本例中，一個顯微接觸的印模被貼合到一個體內(nèi)的眼睛膜上，提供一顯微構(gòu)建的膜表面，它適合于細(xì)胞的生長。這樣的顯微構(gòu)建的膜表面適合于細(xì)胞的生長，它對于在眼病的治療或由眼睛膜或眼球細(xì)胞的缺陷所引起的一些情況下有幫助。例如，在一個眼球中，它具有一個病變的RPE細(xì)胞區(qū)域，或者在該區(qū)域中的PRE細(xì)胞已不能正常地起作用，摘除這樣的失去作用的RPE細(xì)胞，并且選擇性地加入細(xì)胞顯微構(gòu)建作為襯底的布魯赫膜，能有效地治療眼睛。
視網(wǎng)膜下腔細(xì)胞泡(subretinal bleb)被用于進(jìn)入一員病人眼睛的視網(wǎng)膜區(qū)域，該員病人帶有疾患的RPE細(xì)胞。接著一個三通道玻璃體切割術(shù)和穿過神經(jīng)視網(wǎng)膜的小通道的穿孔之后，所述的細(xì)胞泡通過注射無菌鹽水進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔而形成，被細(xì)胞泡暴露的RPE細(xì)胞通過刮削或者其他的清除布魯赫膜的方法，例如通過在脈絡(luò)膜神經(jīng)手術(shù)中所用的技術(shù)，被從布魯赫膜的一個部分移出。一種顯微接觸印模(它有一直徑為50μm相隔10μm的許多圓形成的模型)被用取自于人體血漿存放在PBS中的25μg/ml的纖連蛋白來涂覆，被卷成圓筒形形狀，并嵌入進(jìn)一根針里。該根針與一個含有PBS的針筒相連接。該顯微接觸印模和PBS被慢慢地注射進(jìn)入在視網(wǎng)膜下腔中的細(xì)胞泡(bleb)里，然后利用該根針的作用以及針遞送PBS的作用將卷攏的印模展開。該顯微接觸的印模被布置與暴露的布魯赫膜相接觸。一個被涂覆過的微接觸印模的這般擺放有將纖連蛋白的模型沉積到被暴露的布魯赫膜上去的作用?，F(xiàn)場制作完整的用于顯微構(gòu)建的布魯赫膜，其作用是提供一為適合導(dǎo)引被加進(jìn)去的細(xì)胞的生長或者適合于眼球其他區(qū)域的內(nèi)源性細(xì)胞的再生長的模型(pattem)。在15分鐘之后，微接觸印模通過貫穿神經(jīng)視網(wǎng)膜的通路(pathway)被從細(xì)胞泡移出。在一可供選擇的治療中，微接觸印模與布魯赫膜接觸大約1分鐘多至大約1小時。在微接觸印模被移去之后，一個在PBS(106個細(xì)胞/毫升)中RPE細(xì)胞的擴(kuò)散被緩慢地注射到細(xì)胞泡里。在進(jìn)一步可供選擇的處理中，微接觸印模被用生物可降解的材料來制作，微接觸印模不移走，當(dāng)細(xì)胞被加進(jìn)時和加進(jìn)之后繼續(xù)留在原位。然后將手術(shù)工具從眼球移開，閉合切開的口子并且對病人進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)后處理。該RPE細(xì)胞的增生會覆蓋布魯赫膜暴露的部位，并且有助于維持布魯赫膜的健康，也有助于疊加神經(jīng)視網(wǎng)膜的支持。
在本例中，一個模蓋(stencil)被置于體內(nèi)的眼膜上面，提供一個顯微構(gòu)建的膜表面，它適合于細(xì)胞的生長。一個視網(wǎng)膜下腔細(xì)胞泡被用于進(jìn)入病人眼睛的一個視網(wǎng)膜區(qū)域，該病人的RPE細(xì)胞已病變。在一個三通道玻璃體切割術(shù)并穿刺出一個貫通神經(jīng)視網(wǎng)膜的小通道之后，通過將無菌鹽水注射到視網(wǎng)膜下腔空間形成該細(xì)胞泡。所述細(xì)胞泡暴露的RPE細(xì)胞被從布魯赫膜的一個部位移走，移走的方法是通過刮削(scraping)或其他的清除布魯赫膜傷口的辦法來進(jìn)行，這樣的方法就象是在脈絡(luò)膜(choroidal)的新血管再生手術(shù)(neovascular)中所用的技術(shù)。纖連蛋白(取自人體血漿，25μg/ml，在PBS中存放)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞泡去涂覆被暴露的布魯赫膜并且促進(jìn)一個被加進(jìn)的模蓋(stencil)的粘連。一個模被用PDMS制成并且具有一個尺寸為60μm(跨其最寬的尺寸)相互間間隔為10μm的許多六角形的模型，所述的模蓋(stencil)在PBS中被卷攏成圓筒狀，并且被塞進(jìn)一根針里。該模蓋和PBS被緩慢地注射進(jìn)在視網(wǎng)膜下腔里的細(xì)胞泡，再借用針的作用和被針射出的PBS液的作用將本來卷攏的模蓋展開鋪開。該鋪平的模蓋被置入到被暴露的布魯赫膜上。這種在原位將模蓋置入到布魯赫膜上的做法其作用在于在被暴露的布魯赫膜上提供一個模型(a pattern)，還在于導(dǎo)引被加進(jìn)的細(xì)胞的生長或者取自眼睛的其他部位的內(nèi)源細(xì)胞的再生生長。在模蓋置入后，一種IPE細(xì)胞在PBC(105個細(xì)胞/毫升)中的擴(kuò)散液被緩慢地注射進(jìn)所述的細(xì)胞泡內(nèi)。然后醫(yī)療器具被從眼睛移開，閉合切開的傷口并給病人以標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)后的處理。該IPE細(xì)胞的增生覆蓋了被模蓋的縫隙所暴露的布魯赫膜的一些部分，并且有助于維持布魯赫膜的健康和有助于在神經(jīng)視網(wǎng)膜上面的支持。
權(quán)利要求
1.一種修飾膜組織的方法，它包含有施加一個生物分子的微型模格到一接觸表面上去，并且用所述的接觸表面去接觸所述的組織以轉(zhuǎn)移至少一部的在所述組織上的生物分子模格。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，它進(jìn)一步包含將該膜組織暴露到活細(xì)胞中的步驟。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是細(xì)胞被從一個由虹膜色素上皮細(xì)胞(IPE)、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)和干細(xì)胞所組成的組中選出。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述的細(xì)胞為自體細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的組織是人體組織。
6.一種修飾來自于動物的膜組織的方法，它包括用一種基底去接觸膜組織，然后再對該膜組織進(jìn)行修飾。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中基底包含一選自一個由玻璃；塑料；膠原；葡糖胺基聚糖類；脫乙酰殼多糖；聚羥基鏈烷酸酯類(polyhydroxyalkanoates)；聚α-羥酸(polyα-hydroxyacids)，包括聚乙二醇酸(PGA)，聚乳酸(PLA)和PGA-PLA混和物，合金和共聚物(PLGA)；聚二氧六環(huán)酮類(dioxanones)；聚(ε-己內(nèi)酯)(polyε-caprolactone)；聚正酯類；聚酐類；聚磷腈；聚氨基酸和其它復(fù)合物，聚合物，共聚物、合金；混合物和這些化合物的結(jié)合物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中基底(substrate)包含有一種可生物降解的聚合物，它被從由聚乳酸(poly-lactic acid)、聚乙二醇酸(polyglycolic acid)、聚正酯類(polyorthoesters)、聚酐(polyanhydride(S)，聚膦嗪(polyphosphazines)，聚乳酸乙二醇酸共聚物(poly-lactic acid glycolic acid copolymers PLGA)，聚乙烯乙二醇/聚乳酸共聚物(PEG/PLA)，以及它們摻和物和共聚物組成的組中選出。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，在此，膜組織包含有選自由晶狀體囊組織，內(nèi)界膜(inner limiting membrane)組織，角膜組織，布魯赫膜組織，羊膜(anmiotic)組織、漿膜(serosal)組織，粘膜(mucosal)組織和神經(jīng)組織(neurological tissue)的膜組織。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，在此，改變膜組織的方法步驟包括膜組織的整體修飾(bulk modification)，其特征是所述的整體組織的修飾包括一個選自由機(jī)械切除、光消融、離子切除、水解蛋白酶的沉著和水解蛋白酶的光活化組的一種修飾。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征是所述的整體組織修飾是用來增加膜組織對電解質(zhì)的通透性。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征是整體組織的修飾包含所述的膜組織表面的切除(ablaton)，以使將膜組織整體的厚度減小。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征是所述的切除步驟是要減小膜組織的整體厚度至大約2至5μm。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征是所述的整體組織修飾包含通過選自由激光光切除和離子切除的組中選出的方法來在膜組織內(nèi)產(chǎn)生微孔和小窩。
15.如權(quán)利要求6所述的方法，改變(修飾)膜組織的步驟包括膜組織的表面修飾(surface modification)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，表面修飾步驟包括生物分子的微圖式沉積到膜組織上。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征是生物分子被選自一個由蛋白質(zhì)、肽、有機(jī)分子、低聚糖和短鏈聚合物組成的組。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征是所述的生物分子包含有選自由聚(甲基丙烯酸樹脂)、聚苯乙烯、聚(甲基苯乙烯)，膠原、角蛋白、透明質(zhì)酸，葡糖胺基聚糖類(glycosaminoglycan)，十八烷基三氯硅烷(octadecyltrichlorolsilane)，硅烷聚合物，聚賴氨酸，聚乳酸乙二醇酸衍生的聚賴氨酸和聚賴氨酸肽類。
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，表面修飾包含處理膜組織表面去阻止細(xì)胞生成，然后施以選自由摘除(分離)一微型模格(micropattern)到表面上去，讓細(xì)胞在所述的微型模格上有效生長，并且以接觸表面去接觸表面，使生物分子的微型模格沉著，使細(xì)胞得以在所述的微型模格上生長組成的組的治療方法。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，它進(jìn)一步包含為膜組織的部分表面掩膜的工序和用紫外線輻照膜組織的工序，以使膜組織的暴露部分的胞外質(zhì)(ECM)變性，所述的掩膜(masking)工序使得減低或阻止掩膜部分中胞外母質(zhì)(ECM)的變性。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，掩膜工序選自一個組，這個組是由將網(wǎng)格定位(放置)到組織上面和施加保護(hù)分子的微型模格到膜組織的表面上去的工序構(gòu)成的。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中施布工序(applying step)包含有一個接觸表面去接觸膜組織的表面，作用在于施加一個保護(hù)分子的微型模格到膜組織的表面上去。
23.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的動物是人。
24.一種用于在修飾的膜組織表面上生長細(xì)胞的方法，包括用一種基底接觸膜組織，修改膜組織，和施布細(xì)胞到經(jīng)修改的膜組織上。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，基底(substrate)包括一種選自玻璃；塑料，膠原，葡糖胺基聚糖類(glycosaminoglycans)，脫乙酰殼多糖(chitosan)，聚羥基鏈烷酸酯類(polyhydroxyalkanoates)，聚α-羥基酸(poly α-hydroxy acids)，包括聚乙二醇酸(PGA)，聚乳酸(PLA)，聚乳酸-聚乙醇酸交酯類混合物(polylactide-polyglycolide)(PGA-PLA)，合金或共聚物(PLGA)，聚二氧六環(huán)酮(polydioxanones)，聚ε-己內(nèi)酯，聚正酯類(ortho esters)，聚酐類(polyanhydrides)；聚磷腈類(polyphosphazenes)聚瞵嗪，聚氨基酸類(poly amino acids)，其它化合物、聚合物、共聚合物、合金、混合物或上述化合物的組合。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，基底包括有一種可生物降價的聚合物、它選自一個由聚乳酸(poly-lactic acid)、聚乙二醇酸(polyglycolic acid)，聚正酯類(polyorthoesters)、聚酐類(polyanhydrides)、聚膦嗪(polyphosphaxines)、聚-乳酸乙二醇酸共聚物(PLGA)，聚乙烯基乙二醇/聚乳酸共聚物(PEG/PLA)和它們的混和物及共聚物。
27.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，膜組織包括選自晶狀體囊組織、內(nèi)界膜組織、角膜組織、布魯赫膜組織、羊膜組織，漿膜組織，粘膜組織和神經(jīng)組織的膜組織。
28.如權(quán)利要求24所述的方法，它進(jìn)一步包括在一個膜組織的表面提供微型模格。
29.如權(quán)利要求24所述的方法，其中細(xì)胞選自一個由虹膜色素上皮細(xì)胞(IPE)、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)和干細(xì)胞組成的組。
30.如權(quán)利要求24所述的方法，其中膜組織和細(xì)胞自同一動物獲得。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的動物是人體。
32.一種經(jīng)顯微構(gòu)建制成的膜組織，采用修改取自一種動物的膜的方法來制備，包括用基底去接觸膜組織，并且修改該膜組織。
33.如權(quán)利要求32所述的顯微構(gòu)建制成的膜組織，其中，膜組織包括選自由晶狀體囊組織、內(nèi)界膜組織、角膜組織、布魯赫膜組織、羊膜組織、漿膜組織、粘膜組織和神經(jīng)組織組成的組的膜組織組成的組。
34.由權(quán)利要求24的方法制備的一種微加工膜組織，它具有在所述組織上生長的細(xì)胞。
35.具有權(quán)利要求34的細(xì)胞的顯微構(gòu)建組織，其中細(xì)胞包括選自由虹膜色素上皮細(xì)胞(IPE)、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)和干細(xì)胞組成的組中的細(xì)胞。
36.一種培養(yǎng)生長用于移植細(xì)胞的方法，它包括提供一種可溶解的聚合物基底，將所述的可溶性聚合物基底浸潤在磷酸鹽緩沖鹽水中，并且將上皮細(xì)胞施布到可溶性的基底中去。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中，基底包含一種選自一個由聚乳酸、聚乙二醇酸、聚正酯類、聚酐、聚膦嗪、聚乳酸乙二醇酸共聚物(PLGA)、聚乙烯基乙二醇/聚乳酸(PEG/PLA)共聚物和它們的混和物及共聚物。
38.一種微加工膜組織，包含有一種取自動物的膜，所述的膜組織具有至少一個表面，一個在所述膜組織表面上的分子微型模格和支持基質(zhì)層(support substrate)。
39.如權(quán)利要求38所述的微加工制成的膜組織，其中，所述的支持基質(zhì)層包含一可生物吸收的材料。
40.權(quán)利要求39的用顯微構(gòu)建方法做成的膜組織，其中，所述的可生物吸收材料被選自一個可生物吸收材料的組，該組由膠原(collagen)，葡糖胺基聚糖類(glycosaminoglcans)，脫乙酰殼多糖(chitosan)；聚羥基鏈烷酸酯類(polyhydroxyalkanoates)；聚α-羥基酸(poly α-hydroxy acids)，包括聚乙二醇酸類(polyglycolic acid)PGA；聚乳酸類(polylactic acid)PLA；和聚乳酸聚乙二醇酸(PGA-PLA)混合物、合金和共聚物(PLGA)；聚二氧六環(huán)酮(polydioxanones)；聚ε-己內(nèi)酯(ε-caprolactone)；聚正酯(poly ortho esters)；聚酐類(polyanhydrides)；聚磷腈類(poly phosphazenes)；聚氨基酸類(poly amino acids)；和其它化合物，聚合物，共聚物，合金，混合物和這些化合物的組合。
41.權(quán)利要求38、39或40的用顯微構(gòu)建方法做成的膜組織，其中，該膜組織包含有選自一組的膜組織，該組是由晶狀體囊組織、內(nèi)界膜組織、角膜組織、布魯赫膜組織、羊膜組織、漿膜組織、粘膜組織和神經(jīng)組織組成的。
42.如權(quán)力要求38、39、40或41所述的顯微構(gòu)建膜組織進(jìn)一步包含有在所述組織上生長的細(xì)胞。
43.所述的用顯微構(gòu)建法做成的組織具有權(quán)利要求42的細(xì)胞，其中，該細(xì)胞包含選自一個組的細(xì)胞，該組是由IPE細(xì)胞、RPE細(xì)胞和干細(xì)胞組成。
44.一種用顯微構(gòu)建法做成的膜組織，它具有一個組織表面，它包含有一印模板，所述的印模板(stencil)具有一顯微構(gòu)建做成的通道，通道是貼壁于所述的膜組織的表層，所述組織表層的部分通過所述的印模板通道(stencil passages)被暴露。
45.權(quán)利要求44的用顯微構(gòu)建方法做成的膜組織，其中膜組織包含選自一個組的膜組織，這個組是由晶狀體囊組織、內(nèi)界膜組織、角膜組織、布魯赫膜組織、羊膜組織、漿膜組織、粘膜組織和神經(jīng)組織所組成。
46.一種用顯微構(gòu)建方法做成的膜組織，其組織表面有在所述的組織表面上生長的細(xì)胞，它包含有一個模板，它具有被顯微構(gòu)建加工而成的通道模型(pattern)，通道貼壁于所述的膜組織的組織表面，所述的組織表面有部分通過印模板通道被暴露，并且，所述的細(xì)胞生長在所述的被暴露的部分。
47.用顯微構(gòu)建方法加工成的組織，它具有權(quán)利要求46的細(xì)胞，其中，細(xì)胞包含有選自一個組的細(xì)胞，該組是由IPE細(xì)胞、RPE細(xì)胞和干細(xì)胞所組成。
48.用顯微構(gòu)建方法加工成的膜組織，它具有一種組織表面，包含有一個在所述膜組織的所述組織表面上的模型(pattern)，該膜組織是通過所述組織表面與導(dǎo)引自微觀流網(wǎng)絡(luò)的溶液之間的接觸而形成的所述膜組織的組織表面上的一個模型。
49.權(quán)利要求48的用顯微構(gòu)建方法做成的膜組織，其中，膜組織包含有選自一個組的膜組織，該組是由晶狀體囊組織、內(nèi)界膜組織、角膜組織、布魯赫膜組織、羊膜組織、漿模組織、粘膜組織和神經(jīng)組織所組成。
50.一種用顯微構(gòu)建做成的膜組織，它帶有一組織表面，該表面具有在其組織表面上生成的細(xì)胞，所述的細(xì)胞在一個通過所述組織表面與導(dǎo)引自微觀流網(wǎng)絡(luò)的溶液之間相接觸來導(dǎo)引的模型里生長。
51.采用顯微構(gòu)建做成的具有權(quán)利要求50的細(xì)胞，其中，細(xì)胞包含有選自一個組的細(xì)胞，該組是由IPE細(xì)胞、RPE細(xì)胞和干細(xì)胞組成。
52.在被修飾過的如權(quán)利要求24的膜組織上生長細(xì)胞之方法，其中，施布細(xì)胞到修飾過的膜組織上，它包含有離心方法。
全文摘要
本發(fā)明提供膜組織修飾方法和設(shè)備，可將修飾組織上生長的細(xì)胞進(jìn)行移植。特別是應(yīng)用于修飾晶狀體囊膜組織和內(nèi)界膜組織，并使虹膜色素上皮細(xì)胞(IPE)，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)，干細(xì)胞以及其它細(xì)胞在修飾膜組織上生長。另外討論生物可降解復(fù)合物基底的應(yīng)用。膜表面可以用印記接觸，用印模板(stencil)覆蓋的方法進(jìn)行修飾，印模板具有可以接觸到膜表面的通道。膜組織修飾方法可用印記(stamp)這樣的接觸表面接觸使膜組織上留下生物分子的顯微模格(micropatterns)，另外還可用機(jī)械切除，光切除，離子束切除，以及蛋白分解酶的作用進(jìn)行膜組織的修飾。用生物可吸收材料包括已修飾的膜組織有助于膜組織移植到動物體內(nèi)。通過膜組織原位印模板放置技術(shù)或用顯微接觸印記原位(in situ)接觸技術(shù)，膜組織可以在完整的動物體內(nèi)進(jìn)行修飾。
文檔編號C12N5/06GK1512856SQ02810810
公開日2004年7月14日 申請日期2002年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月1日
發(fā)明者哈維·A·菲什曼, 馬克·布魯門克拉恩茨, 斯戴茜·福朗西尼·本特, 克里絲廷·李, 菲利普·Jr·修爾, 戴尼爾·V·帕蘭克, 卡拉場·V·比爾堡, Jr 修爾, V 帕蘭克, V 比爾堡, 福朗西尼 本特, 哈維 A 菲什曼, 布魯門克拉恩茨, 廷 李 申請人:利蘭·斯坦福初級大學(xué)董事會, 利蘭 斯坦福初級大學(xué)董事會