專利名稱：：標(biāo)記和片段化dna的方法
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及片段化和標(biāo)記DNA的方法，以及該方法的應(yīng)用，特別是在診斷領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。現(xiàn)有技術(shù)的描述通過調(diào)查本領(lǐng)域的已有技術(shù)發(fā)現(xiàn)有很多的方法可以用于標(biāo)記核酸。第一種方法是將標(biāo)記物附著于天然堿基或修飾上。第二種方法計(jì)劃將標(biāo)記物附著于糖基上，同樣該堿基可以是天然的也可以是經(jīng)過修飾的。第三種方法的目的在于把標(biāo)記物附著于磷酸基上。堿基的標(biāo)記主要用于通過摻入直接標(biāo)記的核苷酸來標(biāo)記核酸。糖基的標(biāo)記常用于標(biāo)記化學(xué)合成的寡核苷酸。磷酸的標(biāo)記常用于引入已被功能化的連接臂以及在化學(xué)合成寡核苷酸時(shí)引入標(biāo)記物。事實(shí)上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在標(biāo)記核苷酸、核苷酸類似物或核酸時(shí)，，更傾向于在堿基或糖基上附著標(biāo)記物，因?yàn)檫@樣更方便而且可以有更多的選擇。事實(shí)上這些方法在許多文獻(xiàn)的試驗(yàn)中都有描述，如與標(biāo)記堿基有關(guān)的EP-A-0,329,198，EP-A-0,302,175；EP-A-0,097,373；EP-A-0,063,879；US-A-5,449,767；US-A-5,328,824；WO-A-93/16094；DE-A-3,910,151；EP-A-0,567,841，或與標(biāo)記糖基有關(guān)的EP-A-0,286,898。在磷酸上附著標(biāo)記物的技術(shù)要比功能化堿基或糖基的技術(shù)復(fù)雜，現(xiàn)在被使用的已經(jīng)少多了，主要是因?yàn)榱姿岬牡头磻?yīng)性(見JencksW.P.等，J.Amer.Chem.Soc.，82，1778-1785，1960)。而且，在O’Donnel和McLaughlin的綜述(“分析核酸的報(bào)告基團(tuán)”，216-243頁，《生物有機(jī)化學(xué)核酸》，HechtS.M.編，OxfordUniversityPress，1996)中，關(guān)于將探針引入寡核苷酸片段的方法，核苷間磷酸二酯鍵的有效烷基化被認(rèn)為是不可能的。第二個(gè)問題在于標(biāo)記核酸，特別是大片段的核酸，也就是說超過核苷酸的核酸時(shí)將不得不與核酸探針雜交。這個(gè)問題與空間位阻或與核酸和核探針之間缺乏特異性有關(guān)。這將導(dǎo)致檢測靈敏度下降。空間位阻現(xiàn)象的出現(xiàn)可能不僅是由于核酸的長度，而且可能與二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在和保持也有關(guān)系。片段化可以使破壞這些結(jié)構(gòu)成為可能，從而使雜交達(dá)到最優(yōu)化。這種空間位阻在表面含有高密度的捕獲探針的雜交中扮演特別重要的角色，例如有Affymetrix公司開發(fā)的DNA芯片(AccessingGeneticInformationwithHigh-DensityDNAarrays″，M.Shee等，Science，274，610-614.″Light-generatedoligonucleotidearraysforrapidDNAsequenceanalysis″，A.CavianiPease等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，5022-5026)。關(guān)于核酸的片段化，本領(lǐng)域已有很多方法。首先，片段化可以用酶催化的方法，就是說核酸的片段化可以用核酸酶(DNases)實(shí)現(xiàn)。其次，片段化可以用化學(xué)的方法。例如，DNA的片段化可以通過DNA的脫嘌呤或脫嘧啶作用，然后通過一種所謂的“β-消除”機(jī)制實(shí)現(xiàn)。除此之外，DNA的片段化還可以通過氧化、烷化和添加自由基等機(jī)制而實(shí)現(xiàn)。最后，可以用物理的方法片段化，比如用超聲降解法或光化學(xué)的方法。難點(diǎn)是如何把片段化和標(biāo)記這兩步結(jié)合起來。專利申請(qǐng)WO-A-99/65926描述了一種標(biāo)記合成的或自然的核糖核酸(RNA)的方法，包括片段化RNA和在末端磷酸基標(biāo)記。這份文獻(xiàn)描述了大量能用于把標(biāo)記和片段化結(jié)合起來的活波功能基團(tuán)。這些功能基團(tuán)可以標(biāo)記RNA，但為了有效的標(biāo)記，必須把片段化的步驟與之相結(jié)合，因?yàn)樵谄位^程中被釋放出來的磷酸基團(tuán)是標(biāo)記的位點(diǎn)。此外，為獲得有效的標(biāo)記必須加入相對(duì)于RNA過量的標(biāo)記試劑，這就會(huì)出現(xiàn)由于過量標(biāo)記物的存在而產(chǎn)生背景噪音的問題。最后，這種方法并不適用于雙鏈DNA。因此就需要有一種簡單而有效的DNA標(biāo)記技術(shù)以達(dá)到良好的標(biāo)記率，因而有良好的敏感性，具有標(biāo)記位點(diǎn)特異性，而且不影響通過氫鍵形成的雙螺旋內(nèi)堿基的雜交特性，最后還可以將DNA片段化以使這些標(biāo)記的DNA片段雜交到核酸探針上，特別是吸附在固相支持物的核酸探針上。發(fā)明概述本發(fā)明描述的是標(biāo)記和片段化單或雙鏈脫氧核糖核酸(DNA)的方法，包括以下步驟—通過在所述DNA上制造至少一個(gè)脫堿基位點(diǎn)而使DNA片段化，—通過標(biāo)記試劑的方式將標(biāo)記物連接到至少一個(gè)片段上，所述試劑主要是共價(jià)偶聯(lián)到所述片段的至少一個(gè)磷酸基上。片段化和標(biāo)記可以在一步或兩步內(nèi)完成，標(biāo)記可以在片段化之前、之后或是同時(shí)進(jìn)行。優(yōu)選的標(biāo)記和/或片段化是在實(shí)質(zhì)為均一的水溶液中進(jìn)行。優(yōu)選同時(shí)進(jìn)行片段化和標(biāo)記，也就是說這兩步所需的試劑與核酸都混合到水溶液中。這種方式特別適于化學(xué)法和酶催化法進(jìn)行的片段化過程中。對(duì)于用物理方式進(jìn)行的機(jī)械片段化來說，標(biāo)記和片段化同時(shí)進(jìn)行意味著這種物理方法應(yīng)用的溶液中至少包含有核酸和標(biāo)記試劑。所謂的實(shí)質(zhì)為均一的水溶液可以被理解為溶液中至少含有50％的水。較好的這種溶液是含有鹽的，如緩沖液。均一的溶液可以被理解為單相溶液，如水/DMSO溶液，與之對(duì)應(yīng)的是兩相溶液如水/氯仿溶液。通過創(chuàng)造一個(gè)脫堿基位點(diǎn)片段化DNA可以用酶、化學(xué)或物理的方法進(jìn)行。利用化學(xué)途徑進(jìn)行DNA片段化是指通過將核酸與化學(xué)試劑接觸而獲得脫堿基位點(diǎn)。通過DNA的脫堿基位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)片段化的條件見文獻(xiàn)G.Pratviel等，Angew.Chem.Int.Engl.編，34，746-769頁，1995；G.Pratviel等，Adv.Inorg.Chem.，45，251-312頁，1998；D.S.Sigman等，Chem.Rev.，93，2295-2316頁，1993；J.Lhomme等，Biopolymers(NucleicAcidSciences)，52，65-83頁，1999的描述。連接修飾的堿基和脫氧核糖的N-糖苷鍵被水解，同時(shí)完整地保留磷酸酯鍵，這就創(chuàng)造了一個(gè)脫堿基的位點(diǎn)。這種現(xiàn)象被稱為脫嘌呤(對(duì)于嘌呤來說)或者脫嘧啶(對(duì)于嘧啶來說)。脫嘌呤的頻率要遠(yuǎn)高于脫嘧啶?；瘜W(xué)試劑如酸性pH、氧化劑或烷化劑都能誘導(dǎo)脫嘌呤現(xiàn)象，從而形成脫堿基位點(diǎn)。這些烷化劑的親電子基團(tuán)可與DNA片段上的親核位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)，鳥嘌呤7-位上的氮原子是DNA烷基化的首要位點(diǎn)。除了使嘌呤質(zhì)子化之外，烷基化是一種能夠使N-糖苷鍵變得更不穩(wěn)定的化學(xué)修飾。脫堿基位點(diǎn)DNA的氧化也可以產(chǎn)生所謂的“堿性作用”的脫堿基損害導(dǎo)致DNA在特定位點(diǎn)的片段化。舉個(gè)例子，羥基(OH)與Cl’碳的反應(yīng)可以導(dǎo)致核糖內(nèi)酯(ribonolactone)殘基。核糖內(nèi)酯脫堿基位點(diǎn)是非常不穩(wěn)定的。在醛式結(jié)構(gòu)中，吸附在3’-位置的磷酸二酯很容易發(fā)生β-消除，從而導(dǎo)致DNA鏈的片段化。脫嘌呤在生理?xiàng)l件下(pH7.4，37℃)可以自發(fā)進(jìn)行，但反應(yīng)發(fā)生率很低，大約每秒3×10-11次脫嘌呤作用，也就是說不適合于有效的片段化。為提高反應(yīng)速度，可使N-糖苷鍵變脆的烷化試劑和諸如DNA糖基化酶都可被采用。片段化的優(yōu)選實(shí)施方式是在酸性pH條件進(jìn)行，也就是說PH要低于5，更優(yōu)選的pH大約為3。按照本發(fā)明的方法，pH為3的甲酸鈉緩沖液就可以使核酸有效片段化。該緩沖液與一步標(biāo)記的反應(yīng)條件相一致，這在實(shí)施例中將被證實(shí)。更好的反應(yīng)是在酸性介質(zhì)(HCl，碳酸鹽，H2SO4)中進(jìn)行。在本發(fā)明的某些特定實(shí)施方式中，為了進(jìn)一步提高片段化的效率，所用的脫氧核糖核酸至少含有一個(gè)能更容易產(chǎn)生脫堿基位點(diǎn)的修飾堿基。各種修飾堿基都可以被采用，如N7-烷基嘌呤，N3-烷基嘌呤，O6-烷基嘌呤，8-溴嘌呤，8-硫代嘌呤，8-烷基硫代嘌呤，8-疊氮基嘌呤或8-烷基磺酰基嘌呤這樣的。在用酶催化擴(kuò)增技術(shù)如PCR制備標(biāo)記核酸的實(shí)施例中，使用8-溴嘌呤可以使所述核苷在擴(kuò)增過程中有效摻入成為可能，從而可以在保持酶擴(kuò)增步驟的高敏感性的同時(shí)相應(yīng)地改善本發(fā)明的片段化和標(biāo)記方法。8-甲硫基嘌呤也可被摻入而不影響PCR擴(kuò)增和摻入的效率。修飾堿基被摻入以后，硫醚堿基被過酸或單過硫酸鹽衍生物如過氧單硫酸鉀氧化成相應(yīng)的不穩(wěn)定的磺?；?。已證實(shí)，水解一個(gè)8-甲磺酰鳥嘌呤核苷的半壽期少于兩分鐘，其天然同源物的半壽期是1000個(gè)小時(shí)。所謂的標(biāo)記物可以被理解為至少有一個(gè)標(biāo)記物能直接或間接產(chǎn)生可檢測的信號(hào)。這些標(biāo)記物包括而不限于·通過比色法、熒光法、激發(fā)光法能產(chǎn)生可檢測信號(hào)的酶，如山葵過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，·發(fā)色團(tuán)如熒光、激發(fā)光或色素混合物，·可通過電子顯微鏡檢測電子密度或通過其電子特性如傳導(dǎo)性、電流分析法、伏安測量法、阻抗等而被檢測的基團(tuán)，·可檢測的基團(tuán)，例如分子有足夠的尺寸來誘導(dǎo)它們的物理或化學(xué)特征產(chǎn)生可檢測的修飾，這類檢測可用光學(xué)法如衍射、細(xì)胞質(zhì)基因組的表面共振、表面變化、接觸角度變化或物理方法如原子力分光鏡檢查，隧道效應(yīng)，·放射性同位素如32P、35S或125I。優(yōu)選沒有放射性的標(biāo)記物，以避免與這些標(biāo)記物有關(guān)的安全問題。在本發(fā)明的某些特定實(shí)施方式中，標(biāo)記物可用電化學(xué)方法檢測，尤其在標(biāo)記物是一種鐵復(fù)合物的衍生物如二茂鐵時(shí)。間接的方法也可被采用，例如，能與抗配基反應(yīng)的配體。配基和抗配基對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如以下的配對(duì)生物素/鏈親和素，半抗原/抗體，抗原/抗體，肽/抗體，糖/凝集素，多聚核苷酸/多聚核苷酸的互補(bǔ)鏈。在這些例子中，它是帶有活波功能基團(tuán)的配基?？古浠梢酝ㄟ^上述段落里描述的標(biāo)記物直接檢測出來，也可以通過另一個(gè)配體/抗配體對(duì)被檢測。間接系統(tǒng)的另一個(gè)例子采用配基和抗配基之間的特異性共價(jià)鍵，例如甲基酮和烷氧基胺。專利申請(qǐng)WO-A-00/40590和WO-A-98/05766描述了這種檢測系統(tǒng)。在本發(fā)明的方法種，標(biāo)記試劑和核苷酸之間的連接是共價(jià)的，但非共價(jià)的相互作用也被用于某些特定的堆集系統(tǒng)或標(biāo)記物被間接檢測的例子里。因而術(shù)語“附著”涵蓋了各種可能性。在某些特定的條件下這種間接檢測可能導(dǎo)致信號(hào)的放大，參見前述的專利申請(qǐng)WO-A-00/07982，WO-A-01/92361和WO95/08000使用聚合物進(jìn)行化學(xué)擴(kuò)增的實(shí)施例或?qū)＠暾?qǐng)WO-A-01/44506所用的堆集化學(xué)擴(kuò)增系統(tǒng)的實(shí)施例。在信號(hào)放大的某些特定實(shí)施方式中，標(biāo)記試劑至少含有兩種標(biāo)記物。在本發(fā)明的優(yōu)選特定實(shí)施方式中，示蹤劑是一種低空間位阻的熒光化合物，如熒光素，DANSYL，IR形式(Li-CORInc.，LincolnNE，USA)的發(fā)色團(tuán)，青色素的衍生物如Cy5和Cy3(RandolphJ.B.等，NucleicAcidsRes.，25(14)，2923-2929頁，1997)，特別是Cy5的衍生物，示蹤劑也可以是一種低空間位阻的半抗原如生物素或者松香烷的衍生物(見專利申請(qǐng)WO-A-00/07982)。低空間位阻的意思也可以理解為分子重量低于1000g/mol。在熒光發(fā)色團(tuán)的例子中，優(yōu)選激發(fā)波長超過450nm的熒光發(fā)色團(tuán)，超過600nm的更為適宜。在示蹤劑是半抗原的案例中，半抗原自身不產(chǎn)生信號(hào)，例如生物素，其檢測是通過與上述的抗配基的反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。在生物素的案例中，鏈親和素或一個(gè)抗生物素抗體結(jié)合到一個(gè)熒光復(fù)合物上，優(yōu)選熒光素，Cy5或藻紅蛋白。在松香烷的案例中，采用的是如WO-A-00/07982所描述的單克隆抗體。術(shù)語“脫氧核糖核酸”或DNA是指至少含有2個(gè)脫氧核糖核苷酸的連續(xù)序列，并且至少有一個(gè)修飾的核苷酸，例如至少有一個(gè)核苷酸含有修飾堿基，如次黃嘌呤核苷，甲基-5-脫氧胞苷，二甲氨基-5-脫氧尿嘧啶核苷，脫氧尿嘧啶核苷，二胺-2，6-嘌呤，溴-5-脫氧尿嘧啶核苷或其它可交的修飾堿基。DNA也可以在核苷內(nèi)鍵的水平上修飾，如phosphorothioates，H-磷酸基，烷基磷酸基，或在主鏈水平例如α-寡核苷酸(FR-A-2607507)或PNAs(M.Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，114，1895-1897，1992)。DNA可以是天然的，也可以是人工合成的，和/或是一個(gè)片段的形式。DNA可以是單鏈或雙鏈。在某些特定情況下DNA可以通過酶催化擴(kuò)增技術(shù)制備，如·PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，在專利US-A-4683195，US-A-4683202和US-A-4800159中有描述，及其衍生出的RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-PCR)，特別適用于一步法，如專利申請(qǐng)EP-A-0569272所描述的?！CR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，例如專利申請(qǐng)EP-A-0201184所描述?！CR(修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，專利申請(qǐng)WO-A-90/01069中有描述。術(shù)語擴(kuò)增子用于定義用酶催化擴(kuò)增技術(shù)所制備的DNA。DNA也可以含有少量的核糖核苷酸，例如低于10％。這些修飾方法可以結(jié)合使用，只要DNA中至少含有一個(gè)磷酸基。標(biāo)記試劑含有作為活波功能基團(tuán)的基序，這些基序選自疊氮甲基，烷基鹵化物，亞硝基脲，螺旋環(huán)丙烷，氮丙啶，環(huán)氧化物，三氟血清甲磺酸鹽。反應(yīng)功能基團(tuán)描述如下重氮甲基亞硝基脲鹵代烷基-CH2X螺環(huán)丙烷環(huán)氧化物氮丙啶三氟甲烷磺酸鹽烷基鹵化物活波功能基團(tuán)X可以是Br，Cl或I。優(yōu)選的標(biāo)記試劑是5-(溴甲基)熒光素。亞硝基脲活波功能基團(tuán)R5是一個(gè)烷基或H。疊氮甲基功能基團(tuán)已經(jīng)被用于磷酸基團(tuán)的烷基化作用，但是存在一些問題。其一，通常疊氮衍生物自身是不穩(wěn)定的，用其作為標(biāo)記試劑盒的標(biāo)記試劑就會(huì)出現(xiàn)問題，其二，偶合產(chǎn)物是不穩(wěn)定的，如果用標(biāo)記產(chǎn)物來檢測樣品中是否存在生物靶分子，或者要檢測的是標(biāo)記靶位，則可排除用其作為標(biāo)記試劑的可能性。最后，帶有疊氮甲基功能基團(tuán)的衍生物是不溶于水的，這就需要采用雙相的條件來結(jié)合只在水或水性緩沖液中溶解和穩(wěn)定的核酸，但是這些條件減慢了反應(yīng)速度因此阻礙了結(jié)合的效率。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，標(biāo)記試劑選自具有結(jié)構(gòu)式(1)的化合物其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，以及·Z代表一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，Z和/或R1的選擇是為了穩(wěn)定疊氮甲基功能基團(tuán)，也就是說兩個(gè)基團(tuán)中至少有一個(gè)含有苯核。標(biāo)記試劑優(yōu)選具有結(jié)構(gòu)式(2)的化合物其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，·R2是一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1，以及·Z選自以下基團(tuán)或或或其中·R3和R4分別代表H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，R＝烷基或芳基，以及·-Y-X-代表-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。在結(jié)構(gòu)式(1)的某些特定實(shí)施方式中，Z有以下結(jié)構(gòu)在這個(gè)案例中，以及如果R2是H，標(biāo)記試劑是1-芘基疊氮甲烷(PDAM)。雖然這個(gè)標(biāo)記物是熒光物質(zhì)，但其激發(fā)波長太接近核酸了。一種采用抗芘基序的單克隆抗體進(jìn)行間接檢測是較好的。制備這種抗體的方法是本領(lǐng)域技人員所熟知的(如專利申請(qǐng)WO-A-00/07982)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，標(biāo)記試劑是具有結(jié)構(gòu)式(3)化合物其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，·R2是一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1，·R3和R4分別代表H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，R＝烷基或芳基，以及·-Y-X-代表-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。較好的標(biāo)記試劑是具有結(jié)構(gòu)式(4)的化合物其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，·R2是一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1，·R3和R4分別代表H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，R＝烷基或芳基，以及·-Y-X-代表-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。較好的標(biāo)記試劑是具有結(jié)構(gòu)式(5)的化合物其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，·R2是一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1，·R3和R4分別代表H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，R＝烷基或芳基，以及·-Y-X-代表-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。較好的標(biāo)記試劑是具有結(jié)構(gòu)式(6)的化合物其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，·R2是一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1，·R3和R4分別代表H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，R＝烷基或芳基，以及·-Y-X-代表-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。在上述結(jié)構(gòu)式(3)到(6)中，R3和R4分別優(yōu)選H，NO2，OCH3。因此，結(jié)構(gòu)式(6)相應(yīng)的優(yōu)選化合物是具有結(jié)構(gòu)式(6’)的化合物其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，·R2是一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1。結(jié)構(gòu)式(4)相應(yīng)的優(yōu)選化合物是具有結(jié)構(gòu)式(4’)的化合物其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，·R2是一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1。在本發(fā)明的某些特定實(shí)施方式中，希望信號(hào)被放大，因此在標(biāo)記試劑里至少含有兩個(gè)標(biāo)記物。因此本發(fā)明能夠?qū)⑿盘?hào)放大的試劑具有如結(jié)構(gòu)式(7)的R2-(L)n-結(jié)構(gòu)其中·R2代表一個(gè)可檢測標(biāo)記物?！是一個(gè)1到100的整數(shù)，優(yōu)選1到20，·p是一個(gè)1到10的整數(shù)，優(yōu)選2到6，最優(yōu)選4。這個(gè)R2-(L)n結(jié)構(gòu)與上述結(jié)構(gòu)(2)到(6)在應(yīng)用上沒有差別。其它優(yōu)選的具有信號(hào)放大功能的試劑是具有結(jié)構(gòu)式(8)的試劑其中·R2代表一個(gè)可檢測標(biāo)記物，·R3代表H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，R＝烷基或芳基，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1，·-Y-X-代表-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2-。較好的具有信號(hào)放大功能的試劑是具有結(jié)構(gòu)式(9)的試劑其中·R2代表一個(gè)可檢測標(biāo)記物，·R3代表H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，R＝烷基或芳基，R3優(yōu)選H，NO2或OCH3，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1，·-Y-X-代表-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2-。本發(fā)明的其他一些優(yōu)選試劑有a)具有結(jié)構(gòu)式(10)的試劑其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，·R2是一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1。b)具有結(jié)構(gòu)式(11)的試劑其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，·R2是一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1。c)具有結(jié)構(gòu)式(12)的試劑其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，·R2是一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1。優(yōu)選的標(biāo)記試劑含有a)結(jié)構(gòu)其中，R1代表一個(gè)甲基或一個(gè)苯基，或b)結(jié)構(gòu)其中，R1代表一個(gè)甲基或一個(gè)苯基，或c)結(jié)構(gòu)其中，R1代表一個(gè)甲基或一個(gè)苯基。本發(fā)明的其他優(yōu)選試劑具有結(jié)構(gòu)式(13)其中·R2代表一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1。在本發(fā)明的某些特定實(shí)施方式中，標(biāo)記試劑溶于水溶性的極性試劑如DMF，DMSO，CH3CN，THF，DMA(二甲乙酰胺)，NMP(N-甲基吡咯烷酮)，DME(二甲氧基乙烷)。優(yōu)選的標(biāo)記試劑是可溶于DMSO或水中的。所謂的水溶性溶劑可以理解為是至少可以5％的體積比溶與水或含鹽的水性緩沖液混合的溶劑。在前述結(jié)構(gòu)式中，優(yōu)選的L臂含有一個(gè)乙烯甘油或聚乙烯甘油基序以增加試劑在水中的溶解度。因此這些試劑可以與勻相溶液中的核酸結(jié)合，勻相溶液是含有實(shí)質(zhì)為水溶性的溶液，也就是說，至少含有50％的水。本發(fā)明的目的之一是描述一種檢測單鏈或雙鏈靶脫氧核糖核酸(DNA)的方法，該方法包括a)按照上面所述任一方法片段化和標(biāo)記所述DNA，b)用至少一個(gè)能與靶核酸高效特異結(jié)合的核酸探針與標(biāo)記片段雜交，c)用標(biāo)記物檢測形成的雜交物。在實(shí)施例中已證實(shí)，DNA雜交前變性可以提高敏感性。變性的步驟在片段化和標(biāo)記后進(jìn)行。在本方法的特定實(shí)施方式中，酶催化擴(kuò)增步驟是在片段化和標(biāo)記之前。酶催化擴(kuò)增步驟可以從一個(gè)靶DNA核酸也可以從一個(gè)靶RNA核酸如信使RNA，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA或核糖體RNA中制備DNA擴(kuò)增子。例如，已知的RT-PCR技術(shù)就是用于擴(kuò)增RNA的。優(yōu)選的片段化、標(biāo)記和雜交步驟是同時(shí)進(jìn)行的，模板可以是天然的核酸，也可以是通過酶催化擴(kuò)增技術(shù)制備的核酸。通過產(chǎn)生脫堿基位點(diǎn)而進(jìn)行的片段化會(huì)導(dǎo)致一個(gè)堿基的丟失。在檢測靶核酸的方法中，特別是在基因分型的方法，即靶核酸序列呈現(xiàn)多態(tài)性的方法中，需要鑒別序列的多種修飾，其中的一些修飾是靶核酸與核酸探針之間的單個(gè)堿基修飾，該核酸探針用于檢測這種修飾(捕獲探針)。因此本文中特異性是最基本的。令人驚訝的是，本發(fā)明證實(shí)單個(gè)堿基的丟失對(duì)根據(jù)本發(fā)明的方法制備的標(biāo)記和片段化的核酸的雜交特異性無任何影響。本發(fā)明還涉及一種檢測靶核酸在預(yù)先確定或非預(yù)先確定位置上多態(tài)性分布的方法，該方法是通過檢測所述靶核酸序列相對(duì)于所謂參考序列所具有的缺失和/或插入和/或突變，包括下列步驟a)制備一種含有整個(gè)所要研究的多態(tài)性的靶DNA，所述DNA可隨意選擇一種酶催化擴(kuò)增技術(shù)制備。b)按照權(quán)利要求1到17所述的任何一種方法標(biāo)記和片段化所述DNA，c)將所述的片段與多種被稱為捕獲探針的核酸探針雜交，這些捕獲探針是被附著在固體支持物上，并且完全涵蓋了所要研究核酸的多態(tài)性，d)用標(biāo)記物檢測標(biāo)記片段與至少一部分核酸探針形成的雜交物，從而推斷出靶DNA的多態(tài)性。前面指出，片段化和標(biāo)記步驟之后的變性步驟可能提高方法的敏感性，因此優(yōu)選的是這一步與標(biāo)記和片段化同時(shí)進(jìn)行。本發(fā)明的片段化和標(biāo)記方法特別適用于與一段核酸雜交的標(biāo)記和片段化的DNA，尤其是寡核苷酸，這些核酸吸附在固體支持物的預(yù)定位置上以構(gòu)成DNA芯片。術(shù)語“DNA”芯片可以理解為在預(yù)定位置上的吸附有各種捕獲探針的小尺寸固相載體。術(shù)語“各種”可以理解為一個(gè)固相載體上吸附有至少十個(gè)具有不同序列的核酸探針，較好的為至少400個(gè)，更好的為至少1000個(gè)。吸附在固相載體上的核酸的密度確實(shí)是雜交過程中的一個(gè)主要位阻因素，因而片段化有助于改善雜交步驟的效果。這些DNA芯片的實(shí)施例在系列文獻(xiàn)中有描述，如，G.Ramsay，NatureBiotechnology，16，40-44頁，1998；F.Ginot，HumanMutation，10，1-10，1997頁；J.Cheng等，Moleculardiagnosis，1(3)~183-200頁，1996；T.Livache等，NucleicAcidsResearch，22(15)，2915-2921頁，1994；J.Cheng等，NatureBiotechnology，16，541-546頁，1998。本文所用的術(shù)語“固相載體”包括各種能夠吸附核酸的材料。固相載體可以是微量滴定板、膜、微?；?qū)嵸|(zhì)平板。本發(fā)明涉及標(biāo)記DNA應(yīng)用，如前所述，可以用作檢測靶核酸的探針。為了檢測和/或定量和/或純化靶核酸，標(biāo)記DNA應(yīng)該能夠與核酸探針形成雜交復(fù)合物。經(jīng)由實(shí)施例證實(shí)，標(biāo)記核酸與靶DNA充分互補(bǔ)以形成特異性雜交復(fù)合物依賴于反應(yīng)的條件，特別是溫度和反應(yīng)介質(zhì)的鹽濃度。檢測方法適用于序列分析，信使RNA的表達(dá)譜或以研究為目的的突變篩選和制藥企業(yè)的藥物篩選，傳染性疾病(細(xì)菌學(xué)，病毒學(xué)和寄生蟲學(xué))或基因疾病的診斷，食品或工業(yè)質(zhì)量控制。許多文獻(xiàn)描述了這類應(yīng)用AntoinedeSaizieu等，NatureBiotechnology，16，44-48頁，1998；ThomasR.Gingeras等，GenomeResearch，8，435-448頁，1998；DavidJ.Lockhart等，NatureBiotechnology，14，1675-1680頁，1996；DanielD.Shoemaker等，NatureGenetics，Vol.14，450-456頁，1996；R.J.Lipshutz等，BioTechniques，19(3)，442-447頁，1995；DavidG.Wang等，Science，280，1077-1082頁，1998；KevinL.Gunderson等，GenomeResearch，8，1142-1152頁，1998；JosephG.Hacia0360等，NatureGenetics，Vol.14，441-447頁，1996。診斷領(lǐng)域的趨勢，特別是傳染性疾病(如AIDS和結(jié)核病)，要把檢測的敏感性提高？到從幾毫升如血、尿和腦脊液這樣的液體樣本中檢測出一個(gè)單分子的水平。只有所有的步驟，從樣本的采集到結(jié)果的發(fā)布都達(dá)到最優(yōu)化才能得到這樣的敏感性水平。特別是在需要用酶催化擴(kuò)增步驟來獲得必須的敏感性的例子(病毒或細(xì)菌性傳染病如HIV，HCV或結(jié)核病)中，本發(fā)明的標(biāo)記和/或片段化方法不會(huì)影響擴(kuò)增技術(shù)的敏感性，因?yàn)椴恍枰〈诿复呋瘮U(kuò)增技術(shù)中的脫氧核糖核酸，或者摻入的脫氧核糖核酸不會(huì)影響敏感性。另外的信息可以從申請(qǐng)者于2001年5月4日提交的注冊(cè)號(hào)為FR01/06040的另一個(gè)專利申請(qǐng)，以及在與本發(fā)明同一天提交的的國際專利申請(qǐng)中可以找到。附圖簡述將附圖與實(shí)施例結(jié)合描述只是代表了某些特定的實(shí)施方式，并不意味著對(duì)本發(fā)明范圍的限制。圖1顯示的是本發(fā)明中使用的各種試劑的結(jié)構(gòu)式及其名稱縮寫(o-代表鄰位，m代表間位，以及p代表對(duì)位)。圖2A到2I顯示的是時(shí)間對(duì)按照實(shí)施例6.1描述的方法進(jìn)行的攜帶疊氮甲基功能基團(tuán)的試劑與尿嘧啶3’-單磷酸共價(jià)偶合的影響，所用的分析方法是毛細(xì)管電泳。其中的試劑如下·PDAM，見圖2A，·DPQAM，2mM(毫摩爾每升)，見圖2B，·DPDAM，20mM，見圖2C，·PMDAM，見圖2D，·NPDAM，見圖2E，·BioDPDAM，見圖2F，·間-BioPMDAM，見圖2G，·對(duì)-BioPMDAM，見圖2H，·鄰-BioPMDAM，見圖2I。圖3A到3D顯示的是時(shí)間對(duì)按照實(shí)施例6.2描述的方法進(jìn)行的攜帶疊氮甲基功能基團(tuán)的試劑與四種核苷3’-單磷酸共價(jià)偶合的影響，所用的分析方法是毛細(xì)管電泳。其中的核苷酸如下·核糖核苷酸中的3’-CMP，見圖3A，·核糖核苷酸中的3’-AMP，見圖3B，·核糖核苷酸中的3’-GMP，見圖3C，·脫氧核糖核苷酸中的3’-TMP，見圖3D。圖4顯示的是時(shí)間對(duì)按照實(shí)施例6.3描述的方法進(jìn)行的間-BioPMDAM試劑二核苷5’-ApUp反應(yīng)的影響，所用的分析方法是毛細(xì)管電泳。圖5A到5D顯示的是實(shí)施例6.4中間-BioPMDAM試劑與四種核糖核苷3’-單磷酸之間各種連接的D2O中的質(zhì)子NMR光譜。其中的核糖核苷酸如下·3’-GMP，見圖5A，·3’-AMP，見圖5B，·3’-CMP，見圖5C，以及·3’-UMP，見圖5D。圖6顯示的是一種標(biāo)記試劑的合成流程，該試劑攜帶兩種用于信號(hào)化學(xué)放大的生物素。圖7顯示在酸性介質(zhì)中通過形成一個(gè)脫堿基位點(diǎn)而片段化的機(jī)制。圖8顯示是各種修飾核苷(8-溴-2’-脫氧腺苷(8-BrdA)和5-溴-2’-脫氧胞苷(5-BrdC)以及四種天然核苷(dA，dC，dG和dT)在酸性PH條件下的降解動(dòng)力學(xué)，如實(shí)施例8.1所述。結(jié)果用起始核苷的水解百分率(Y軸)與以分鐘計(jì)的反應(yīng)時(shí)間(X軸)之間的關(guān)系表示。圖9顯示的是在溫度為60℃的條件下，時(shí)間對(duì)PDAM試劑標(biāo)記合成的ODN5’-磷酸動(dòng)力學(xué)的影響，如實(shí)施例11.2所描述。結(jié)果用標(biāo)記百分率(Y軸)與以分鐘計(jì)的反應(yīng)時(shí)間(X軸)之間的關(guān)系表示。圖10顯示的是反應(yīng)溫度對(duì)標(biāo)記百分率的影響，如實(shí)施例11.3所描述，。結(jié)果如圖10所顯示，標(biāo)記百分率在Y軸上，反應(yīng)溫度(℃)在X軸上。圖11描述的是利用商用5-硝基香草醛合成具有結(jié)構(gòu)式4`的試劑的路線。醛功能基團(tuán)是疊氮甲基功能基團(tuán)的前體。優(yōu)選實(shí)施方式的描述實(shí)施例1用生物素合成試劑普通合成流程D-生物素1aR＝CH3，間位取代1bR＝CH3，對(duì)位取代1cR＝CH3，鄰位取代1dR＝Ph，間位取代3aR＝CH3間位取代2aR＝CH3間位取代3bR＝CH3對(duì)位取代2bR＝CH3對(duì)位取代3cR＝CH3鄰位取代2cR＝CH3鄰位取代3dR＝Ph，間位取代2dR＝Ph，間位取代實(shí)施例1.1間-BioPMDAM的合成·化合物生物素間-苯乙酮1a將D-生物素(1.0克(g)，4.1毫摩爾mmol))溶解到45毫升(ml)預(yù)加熱的無水DMF中。氬氣下混合物冷卻至0℃，然后相繼加入N-甲基嗎啉(590微升(μl)，5.33mmol)和異丁基氯甲酸鹽(840μl，6.60mmol)。混合物持續(xù)攪拌30分鐘(min)，然后加入溶于10mlDMF的3-氨基苯乙酮(824mg，6.10mmol)和N-甲基嗎啉(480μl，4.35mmol)。溶液在0℃持續(xù)攪拌2小時(shí)(h)，然后蒸發(fā)干燥。殘留物收集到3mlMeOH中，然后加入50ml水。過濾獲得沉淀，用水、CH2Cl2和乙醚洗滌，得到1.2g(80％)粗產(chǎn)物1a，從MeOH-H2O對(duì)中重結(jié)晶得到白色粉末狀產(chǎn)物1a(1.01g，70％)。熔點(diǎn)145℃-IR(KBr)3280，2931，2857，1691，1590，1540，1487，1434，1298，1266cm-1。-1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝1.3-1.7(m，6H)；2.33(t，J＝8Hz，2H)；2.55(s，3H)；2.58；(d，J＝12Hz，IH)；2.83(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.13(m，1H)；4.15(m，1H)；4.31(m，1H)；6.34(s，1H)；6.41(s，1H)；7.44(t，J＝8Hz，1H)；7.64(d，J＝8Hz，IH)；7.85(d，J＝8Hz，1H)；8.17.(s，1H)；10.05(s，1H).-MS(FAB/甘油)，m/z362[M+H]+?；衔镩g-腙2a將1a(500mg，1.38mmol)和溶于無水乙醇(8ml)中的一水合肼(200μl，4.15mmol)混和后回流加熱2h。冷卻至室溫后，過濾得到白色沉淀物，沉淀物先用水洗滌，然后用乙醚洗滌并干燥。從而得到385mg(74％)白色粉末狀產(chǎn)物2a。熔點(diǎn)185℃-IR(KBr)3298，2931，2857，1698，1665，1626，1541，1494，1470，1446，1330，1265cm-1.-1HNMI{(300MHz，DMSO-d6)δ＝1.3-1.7(m，6H)；1.98(s，3H)；2.26(t，J＝8Hz，2H)；2.56(d，J＝12Hz，1H)；2.81(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.11(m，IH)；4.13(m，1H)；4.29(m，1H)；6.39(s，3H)；6.42(s，1H)；7.22(m，2H)；7.50(d，J＝8Hz，iH)；7.84(s，1H)；9.82(s，1H).-MS(FAB/甘油)，m/z376[M+H]+化合物間-重氮甲烷3a2a(180mg，0.48mmol)溶于2mlDMF中，然后加入MnO2(340mg，3.9mmol)。室溫下攪拌30分鐘后，混合物用含硅藻土(厚度0.5cm)和3分子篩(0.5cm)的燒結(jié)的漏斗過濾。反應(yīng)混合物濃縮到0.5ml，然后加入5ml乙醚。過濾后得到沉淀物，沉淀物用水洗滌然后干燥。得到粉紅色粉末狀化合物3a(170mg，95％)。熔點(diǎn)160℃-IR(KBr)3278，2935，2859，2038，1704，1666，1605，1577，1536，1458，1430，1263cm-1.-1HNMR(300MHz)δ＝1.3-1.7(m，6H)；2.11(s，3H)；2.28(t，J＝8Hz，2H)；2.57(d，J＝12Hz，1H)；2.81(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.11(m，1H)；4.13(m，1H)；4.29(m，1H)；6.33(s，1H)；6.41(s，1H)；6.60(m，1H)；7.25(m，3H)；9.84(s，1H)。實(shí)施例1.2對(duì)-BioPMDAM的合成·化合物生物素對(duì)-乙酰苯1b將D-生物素(1g，4.1mmol)溶于45ml預(yù)熱的無水DMF中?；旌衔镌跉鍤庀吕鋮s至0℃，然后相繼加入N-甲基嗎啉(590μl，5.33mmol)和氯甲酸異丁酯(840μl，6.60mmol)?；旌衔锍掷m(xù)攪拌30分鐘，然后加入4-氨基乙酰苯(824mg，6.10mmol)。溶液在0℃下持續(xù)攪拌2h，然后蒸發(fā)干燥。殘留物收集到50ml水中。過濾得到沉淀物，先水洗滌，然后用50ml預(yù)熱的MeOH洗滌。將得到的白色沉淀物邊加熱邊溶于DMF，然后將得到的溶液過濾并用MeOH洗滌。回收過濾物蒸發(fā)干燥得到888mg1b(2.46mmol，60％)。熔點(diǎn)260℃-IR(KBr)3260，2930，2358，1706，1673，1610，1526，1401，1380，1322，1257，1150cm-1.-1HNMI{(200MHz，DMSO-d~)δ＝8.82(s，1H，NH-CO)；’7.57(d，2H，J＝9Hz，Ar-H)；6.83(d，2H，J＝9Hz，Ar-H)；6.40(寬(broad)s，1H，NH-CO-NH)；6.32(寬s，1H，NH-CO-NH_)；4.28(m，1H，CH2-CH_-NH)；4.12(m，1H，CH-CH_-NH)；3.11(m，1H，CH-S)；2.80和2.55(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5HZ，3JAx＝12HZ，3Jsx＝0HZ，CH2-S)；2.35(t，2H，J＝8HZ，CH2-CO)；2.10(S，3H，CH3)；1.60-1.34(m，6H，(CH2)3)·化合物對(duì)-腙2b將化合物1b(870mg，2.4mmol)溶于預(yù)熱的乙醇(99％，8ml)中，然后加入一水合肼(995μl，19.5mmol)。溶液回流加熱3h。將得到的白色沉淀物過濾并用冰水洗滌。從而得到820mg(90％)白色粉末狀的產(chǎn)物2b。熔點(diǎn)305℃-IR(KBr)3281，3183，2930，2857，1698，1658，1593，1521，1459，1401，1325，1263，1187cm-1.-1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝9.68(s，1H，NH-CO)；7.52(s，4H，J＝9Hz，Ar-H)；6.43(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.21(s，2H，NH2)；4.29(m，1H，CH2-CH-NH)；4.12(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，1CH-S)；2.81和2.56(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5HZ，3Jax＝12HZ，3JBx＝0HZ，CH2-S)；2.32(t，2H，J＝8HZ，CH2-CO)；1.97(s，3H，CH3)；1.63-1.36(m，6H，(CH2)3)?！せ衔飳?duì)-重氮甲烷3b2b(200mg，0.53mmol)溶于10mlDMF中。然后加入800mgMnO2。攪拌10分鐘后，用硅藻土(0.5cm)-分子篩(0.5cm粉狀形式)的混合層過濾。反應(yīng)混合物蒸發(fā)干燥，然后用乙醚洗滌并干燥。得到粉紅色粉末狀化合物3b(190mg，96％)。熔點(diǎn)180℃-IR(dec)3257，2930，2857，2032，1698，1597，1524，1510，1455，1404，1307，1259，1180cm-1.-1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.18(s，1H，NH-CO)；7.88(d，2H，J＝6Hz，Ar-H)；7.7(d，2H，J＝6Hz，Ar-H)；6.41(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.34(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.28(m，IH，CH2-CH-NH)；4.12(m，1H，CH-CH-NH)；3.11(m，1H，CH-S)；2.80和2.55(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5HZ，3Jax＝12HZ，3JBx＝0HZ，CH2-S)；2.35(t，2H，J＝8HZ，CH2-CO)；2.10(S，3H，CH3)；1.60-1.34(m，6H，(CH2)3)。實(shí)施例1.3鄰-BioPMDAM的合成·化合物生物素鄰-乙酰苯1c將D-生物素(1g，4.1mmol)溶于45ml預(yù)熱的無水DMF中。氬氣環(huán)境下將混合物冷卻至0℃。然后連續(xù)加入N-甲基嗎啉(590μl，5.33mmol)和異丁基氯甲酸酯(840μl，6.60mmol)?；旌衔锍掷m(xù)攪拌30分鐘后，加入2-氨基乙酰苯(824mg，6.10mmol)。溶液在室溫下持續(xù)攪拌3h30min，然后蒸發(fā)干燥。殘留物收集到50ml水中。過濾得到沉淀物，先用水洗滌，然后用50ml預(yù)熱的MeOH洗滌。過濾得到沉淀物，用水洗滌。將產(chǎn)物溶于預(yù)熱的MeOH中使之重結(jié)晶，然后加入水使之重新沉淀。過濾得到沉淀物，先用水洗滌后再用乙醚洗滌，得到1.1g(2.95mmol，72％)粗產(chǎn)物1c。熔點(diǎn)150℃-IR(KBr)3248，2930，2857，2359，1691，1669，1651，1582，1528，1448，1354，1310，1245，1161cm-1.-1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝11.24(s，1H，NH-CO)；8.33(d，1H，J＝8.5Hz，Ar-H)；7.97(d，2H，J＝8Hz，Ar-H)；7.57(t，1H，J＝7Hz，Ar-H)；7.18(t，IH，J＝7Hz，Ar-H)；6.44(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.30(m，1H，CH2-CH-NH)；4.14(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.80和2.55(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.61(s，3H，CH3)；2.37(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.62-1.38(m，6H，(CH2)3)?！せ衔镟?腙2c將化合物1c(500，1.38mmol)溶于預(yù)熱的乙醇(99％，8ml)中，然后加入一水合肼(572μl，11.1mmol)。溶液回流加熱50分鐘。然后將溶液蒸發(fā)干燥。過濾得到白色沉淀物，用水洗滌后用乙醚干燥。得到416mg(11.1mmol，80％)白色粉末狀產(chǎn)物2c。熔點(diǎn)161℃-IR(KBr)3412，3240，2930，2857，2351，1706，1677，1604，1590，1531，1463，1444，1372，1303，1270，1169cm-1.-1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝11.97(s，1H，NH-CO)；8.35(d，IH，J＝8Hz，Ar-H)；7.45(d，IH，J＝7Hz，Ar-H)；7.19(t，1H，J＝7.5Hz，Ar-H)；7.04(t，1H，J＝7Hz，Ar-H)；6.61(s，2H，NH2)；6.42(寬s，IH，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.32(m，1H，CH2-CH-NH)；4.14(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.81和2.56(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5HZ，3JAx＝12HZ，3JBX＝0HZ，CH2-S)；2.31(t，2H，J＝8HZ，CH2-CO)；2.09(S，3H，CH3)；1.63-1.36(m，6H，(CH2)3)·化合物鄰-重氮甲烷3c將2c(200mg，0.53mmol)溶于10mlDMF中。然后加入800mgMnO2。攪拌15分鐘后，用硅藻土(0.5cm)-分子篩(0.5cm粉狀形式)的混合層過濾混合物。反應(yīng)混合物蒸發(fā)干燥，然后用乙醚洗滌并干燥。獲得粉紅色粉末狀化合物3c(130mg，65％)。熔點(diǎn)110℃-IR(KBr)3248，2930，2857，2367，2342，2038，1699，1521，1456cm-1.-1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝9.37(s，1H，NH-CO)；7.26-7.00(m，4H，Ar-H)；6.43(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.30(m，1H，CH2-CH-NH)；4.15(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.82和2.54(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5HZ，3JAx＝12HZ，3JBx＝0HZ，CH2-S)；2.24(t，2H，J＝8HZ，CH2-CO)；2.12(S，3H，CH3)；1.63-1.37(m，6H，(CH2)3)。實(shí)施例1.4間-BioDPDAM的合成·化合物間-苯甲酮1d將D-生物素(50mg，2.05mmol)溶于23ml預(yù)熱的無水DMF中。混合物在氬氣下冷卻至0℃，然后加入連續(xù)加入N-甲基嗎啉(295μl，2.67mmol)和異丁基氯甲酸酯(420μl，3.28mmol)?；旌衔锍掷m(xù)攪拌30min，然后加入7ml含3-氨基二苯酮(605mg，3.07mmol)和N-甲基嗎啉(240μl，2.17mmol)的DMF。溶液在0℃持續(xù)攪拌2h，然后蒸發(fā)干燥。殘留物收集到1mlMeOH中，然后加入25ml水。過濾得到沉淀物，先用水洗滌然后用乙醚洗滌得到810mg(93％)粗產(chǎn)物1d，用MeOH-H2O對(duì)重結(jié)晶得到白色粉末狀的1d(630mg，72％)。1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.10(s，1H，NH-CO)；8-7.39(m，9H，Ar-H)；6.43(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.27(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.84和2.55(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.31(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.59-1.36(m，6H，(CH2)3)?！せ衔镩g-腙2d將1d(350mg，0.83mmol)溶于5.5ml無水乙醇中，然后加入一水合肼(140μl，2.48mmol)。溶液回流加熱過夜。蒸發(fā)后，產(chǎn)物收集到1ml乙醇和水中。將白色沉淀物重結(jié)晶將沉淀物溶于最少量的預(yù)熱乙醇中，然后加入水直到有薄絮狀的沉淀出現(xiàn)。冷卻后，得到的沉淀物用水洗滌，然后用乙醚干燥。得到264mg(73％)白色粉末狀產(chǎn)物2d。1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝9.99(s，1H，NH-CO)；9.80(s，2H，NH2)；7.54-6.88(m，9H，Ar-H)；6.26(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.21(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.28(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.78和2.59(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5HZ，3Jax＝12HZ，3JBX＝0HZ，CH2-S)；2.27(t，2H，J＝8HZ，CH2-CO)；1.57-1.36(m，6H，(CH2)3)?！せ衔镩g-diazodiphenyl3d將3d(500mg，0.53mmol)溶于1mlTHF中。然后加入80mg活化的MnO2。室溫下攪拌5分鐘后，用硅藻土(0.5cm)-分子篩(0.5cm粉狀形式)的混合層過濾混合物。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)干燥。獲得紫色油狀的化合物3d(47mg，100％)。1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝9.95(s，1H，NH-CO)；7.60-6.9(m，9H，Ar-H)；6.42(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.28(m，1H，CH2-CH-NH)；4.14(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，H，CH-S)；2.83和2.59(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3Jax＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.27(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.58-1.35(m，6H，(CH2)3)。實(shí)施例2含Cy5的標(biāo)記試劑Cy5-PMDAM·化合物2-[4-(N-乙?；?N-苯基氨基)丁-1，3-二烯基]-1，2，3，3-四甲基[3H]碘咯碘化物6(2-[4-(N-acetyl-N-phenylamino)buta-1，3-dienyl]-1，2，3，3-四甲基[3H]碘咯碘化物6)將乙酸酐(75ml)中丙醛二(苯基亞胺)單鹽酸5(18.3g，70.0mmol)，NaOAc(9.0g，110mmol)和1，2，3，3-四甲基[3H]碘咯碘化物(碘咯碘化物)4(4.25g；14.1mmol)的混合物在110℃加熱20分鐘。冷卻后，加入醚(350ml)，然后將沉淀的棕色固體過濾，用醚洗滌(3×100ml)。將此固體溶于150mlCH2Cl2，過濾(除去無機(jī)鹽)然后蒸發(fā)得到棕色固體(6.0g，90％)。1HNMR(CDCl3)δ＝8.64(d，1H，J＝12Hz，1-H)；8.14(t，1H，J＝16，12Hz，3-H)；7.63-7.19(m，9H)；6.90(d，1H，J＝15Hz，4-H)；5.82(t，1H，J＝12，13Hz，2-H)；4.06(s，3H，NCH3)；2.16(s，3H，-COCH3)；1.74(s，6H，CH3)?！せ衔?-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基[3H]碘咯碘化物9將2，3，3-三甲基吲哚7(10.0g，62.8mmol)和6-溴己酸8(12.3g，62.8mmol)不加溶劑混合，在氬氣下110℃加熱12h。紫紅色粘性反應(yīng)混合物先用醋酸乙酯洗滌(2×60ml，粘性物用藥刀研磨，棄去上清)，然后用丙酮洗滌(50ml，固化粘性物)。將粉紅色固體過濾，然后真空干燥(16.0g；73％)。·化合物Cy5COOH10將碘化物6(6.0g，12.7mmol)，溴化物9(4.5g，12.7mmol)和NaOAc(2.6g，32mmol)溶于乙酸酐(35ml)中，混和物在110℃加熱20min。冷卻后，加入乙醚(150ml)，將沉淀物過濾并用乙醚(3×50ml)洗滌。固體溶于100mlCH2Cl2，過濾，SiO2柱色譜純化，(洗脫液MeOH5-10％/CH2Cl2)，得到3.4g(44％)產(chǎn)物10。1HNMR(CDCl3)δ＝8.03(t，2H，J＝10，11Hz，2-H，4-H)；7.38-6.91(m，9H，Ar-H，3-H)；6.41(d，1H，J＝14Hz，I-H)；6.31(d，1H，J＝13Hz，5-H)；4.07(t，2H，J＝7，7Hz，α-CH2)；3.68(s，3H，NCH3)；2.47(t，2H，J＝7，7Hz，ε-CH2)；1.71(m，18H，CH3，β，γ和δ-CH2)。·3-氨基苯乙酮偶合Cy5COOH10的化合物(產(chǎn)物11)將N-甲基嗎啉(360μl，3.2mmol)加入到12ml含Cy5COOH10(1.19g，1.9mmol)的CH2Cl2溶液中。溶液置于冰浴中冷卻，然后加入異丁基氯甲酸酯(480μl，3.7mmol)。攪拌5min，加入3-氨基乙酰苯(488mg，3.6mmol)。室溫下攪拌3h。加入250ml乙醚后得到粘性固體。攪拌后固體黏附在圓底燒瓶的瓶底，將上清棄去。再加入50ml乙醚，用藥刀研磨介質(zhì)得固體物質(zhì)。將固體過濾，用水和乙醚洗滌后真空干燥。然后將產(chǎn)物(碘化物)溶于乙醇，過離子交換樹脂IRA900(Cl-；15g)柱?；厥找掖既芤?，蒸發(fā)干燥后過SiO2柱，得到0.93g(77％)藍(lán)色固體?！せ衔顲y5-腙12在一水合肼(180μl，3.1mmol)加入到5ml含苯乙酮(0.93g，1.46mmol)的無水乙醇溶液中，室溫下攪拌7h。然后加入50ml乙醚，過濾沉淀物，并用乙醚洗滌。粗產(chǎn)物溶于50mlCH2Cl2中，將溶液過濾后濃縮到10ml。加入100ml乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾，用乙醚洗滌，真空干燥。得到540mg(57％)產(chǎn)物12?！せ衔顲y5PMDAM12a將300mgMnO2加入到2ml含100mg腙12的DMF中，混合物劇烈攪拌10min。上清液通過一層硅藻土過濾，用DMF(3×500μl)洗滌。加入50ml乙醚，油性沉淀物用藥刀研磨，上清液棄去。用25ml乙醚重復(fù)洗3次。將得到的固體過濾并干燥。得到65mg(65％)產(chǎn)物12a。產(chǎn)物的純度大約為80-85％(1HNMR)。實(shí)施例3其它試劑的合成實(shí)施例3.1對(duì)-硝基苯基疊氮甲烷(NPDAM)4-硝基苯甲醛腙是商品化的(參見28，118-2，Aldrich，F(xiàn)rance)。將600mg(3.64mmol)4-硝基苯甲醛腙溶于9mlTHF中。溶液持續(xù)攪拌5min，然后小心加入1.26g(4價(jià)物，14.56mmol)MnO2?；旌衔锍掷m(xù)攪拌l0min，然后過濾。將回收的過濾物蒸發(fā)干燥。用戊烷洗滌，得到亮橙色粉狀的對(duì)-硝基苯基疊氮甲烷(468mg，2.87mmol)，產(chǎn)率為79％。熔點(diǎn)80-82℃.-1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝8.11(d，2H，J＝9Hz，Ar-H_/3)；7.18(d，2H，J＝9Hz，Ar-H2)；6.06(s，1H，CH1-N2)。實(shí)施例3.2苯甲基疊氮甲烷的合成(PMDAM)乙酰苯腙苯乙酮(2.0g，16mmol)用16ml無水乙醇稀釋，然后加入肼(2.3ml，48mmol)?；旌衔锛訜岬交亓鳒囟?。2h后，溶劑蒸發(fā)，殘留物收集到乙醚(150ml)中。溶液用水洗滌(100ml)。用Na2SO4干燥后，將乙醚蒸發(fā)掉。得到淡黃色油狀物(1.5g，11mmol，69％)。苯甲基疊氮甲烷(PMDAM)將腙(150mg，1.1mmol)溶于3mlTHF中。加入MnO2(480mg，5.5mmol)。溶液在室溫下攪拌30分鐘后變?yōu)榧t色。將溶液過濾然后將溶劑蒸發(fā)。得到紅色油狀物(145mg，100％)。此試劑不需純化。實(shí)施例3.3聯(lián)苯疊氮甲烷的合成(DPDAM)苯甲酮腙是從市場上購買的(參見B960-2Aldrich，F(xiàn)rance)。將196mg苯甲酮腙溶于5mlTHF中。加入435mg(5eq，5.0mmol)MnO2?；旌衔锍掷m(xù)攪拌10min，然后過濾?；厥盏倪^濾物蒸發(fā)干燥。得到193mg(0.99mmol)產(chǎn)物。此試劑不需純化。實(shí)施例3.4NVDAM的合成按照上述步驟從6-硝基亞藜蘆醛(Aldrich，reference27，960-9)進(jìn)行合成。實(shí)施例4合成the生物素化的衍生物fromNPDAMM.E.Wall等，J.Med.Chem.，1993，36，2689.2-氨基-4-硝基苯甲醛衍生物按照上述MEWall等人的方法制備。疊氮甲烷NPDAM的制備方法與上述的實(shí)施例3.1相同。實(shí)施例5DNA核酸的制備用PCR從16S結(jié)核分支桿菌基因組DNA靶位中擴(kuò)增DNA，所用的試劑為Roche的FastStart試劑盒，每種脫氧核糖核苷酸0.2mM(d-ATP，d-CTP，d-GTP，d-TTP)，引物0.3μM和酶0.4μl。PCR設(shè)定參數(shù)如下-95℃4min，然后35個(gè)循環(huán)(95℃30sec；55℃30sec；72℃30sec)，最后到4℃。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳(1.5％，TBE0.5×)分析。上樣體積為5μl，在100伏(V)電壓下遷移20min。用溴化乙啶染色后可在紫外燈下觀察到PCR產(chǎn)物。細(xì)菌培養(yǎng)的條件、分支桿菌的提取方法和擴(kuò)增所用的引物在專利申請(qǐng)WO-A-99/65926中已有描述。實(shí)施例6標(biāo)記試劑在模板核酸上的反應(yīng)性標(biāo)記試劑的合成見實(shí)施例1至4的描述。本發(fā)明所描述的PDAM已經(jīng)商品化(參見《分子探針》(MolecularProbes)1405頁，Eugene，OR)。實(shí)施例6.1單體UMP3’-磷酸的標(biāo)記為了控制反應(yīng)的特異性，研究了攜帶疊氮甲基功能基團(tuán)的標(biāo)記試劑的反應(yīng)性。設(shè)計(jì)出了一種實(shí)驗(yàn)方案，該方案包括用毛細(xì)管電泳研究模型化合物3’-UMP(3’-單磷酸尿嘧啶核苷，參見U1126，Sigma)在下列標(biāo)準(zhǔn)條件下的反應(yīng)性3’-UMP0.04mM；H3BO32.0mM；2.0mM標(biāo)記物[添加適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑(THF，AcOEt或DMSO)]；溶劑H2O-CH3CN-有機(jī)溶劑(比例1/3/1)。溶液分成10份，每份250μl，加熱到60℃。經(jīng)過一段固定的時(shí)間，每份溶液都用250μl二氯甲處理。攪拌后去除有機(jī)相(底層相)。離心(5min，5000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm))后用毛細(xì)管電泳分析水相。毛細(xì)管電泳(CE)的條件如下CE所用的儀器為BeckmanP/ACE5000。所用的毛細(xì)管為未處理的熔合硅毛細(xì)管(75μm50cm)。所用的電壓為30kv(正常極性)，毛細(xì)管的溫度維持在23℃。記錄254n處的電泳圖。硼酸鹽緩沖液(0.1M，pH8.3)用硼酸制備，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，然后用0.2μm的濾膜過濾。樣品加壓注射到毛細(xì)管中(0.5psi，5sec)。每次分析前通過連續(xù)用NaOH溶液(0.1M，2min)、水(2min)和硼酸鹽緩沖液(2min)加壓(20psi)洗滌毛細(xì)管使其再生。如每幅圖中所示，反應(yīng)所用的時(shí)間從0到4小時(shí)不等，每一種試劑所得到的結(jié)果都顯示在圖2A到圖2I中，每種試劑的濃度也標(biāo)示在圖中。反應(yīng)時(shí)間都標(biāo)示在每一幅電泳圖中。所實(shí)驗(yàn)的所有試劑都得到了過量的單烷基化產(chǎn)物，說明了反應(yīng)的特異性。反應(yīng)性可以用試劑與3’-UMP反應(yīng)完成一半時(shí)所需要的時(shí)間來表示，因此可以通過比較峰的高度來計(jì)算反應(yīng)性，其結(jié)果列在下面的表中(如上所述的標(biāo)準(zhǔn)條件)*用o-BioPMDAM時(shí)，反應(yīng)時(shí)間是估計(jì)的，因?yàn)樵跇?biāo)記試劑的濃度為2mM的條件下反應(yīng)在5min內(nèi)就完成了。因此圖2I所用的濃度為0.2mM。表1試劑的反應(yīng)性(反應(yīng)一半所用的時(shí)間)然而需要強(qiáng)調(diào)的是由于反應(yīng)是非常特異的并且所有的試劑都不產(chǎn)生副產(chǎn)品，因此從選擇性的觀點(diǎn)來看？增加標(biāo)記試劑的濃度對(duì)標(biāo)記可能不會(huì)造成影響。因此，如果將DPDAM的濃度增加到20mM(見圖2C)，反應(yīng)性(反應(yīng)一半所需時(shí)間)是2h。BioDPDAM(圖2F)也得到同樣的結(jié)果，在濃度為30mM時(shí)反應(yīng)性是45min。實(shí)施例6.2各種3’-單磷酸核苷的檢測為了避免出現(xiàn)任何解釋的錯(cuò)誤，對(duì)間-BioPMDAM做了附加的試驗(yàn)，作為一個(gè)有意義的實(shí)施例與其他3’-單磷酸核苷一起進(jìn)行。所檢測的核苷如下3’-AMP(參見85，194-9Aldrich)，3’-GMP(參見151214，ICN)，3’-CMP(參見C1133，Sigma)，3’-TMP(脫氧核糖系列)(參見T1008，Sigma)。各種核苷所得到的電泳圖顯示在圖3A到圖3D中。圖3A所顯示的反應(yīng)時(shí)間與圖3B到3D所顯示的是一致的。不論從何種核苷開始(核糖核苷或脫氧核糖核苷系列)，在60℃條件下反應(yīng)130min都可以觀察到過量的和完全的烷基化產(chǎn)物形成。需要強(qiáng)調(diào)的是如果用鳥嘌呤(與常用烷化劑反應(yīng)最活波的堿基)，其產(chǎn)物只有磷酸被烷基化，說明反應(yīng)具有極高的選擇性。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)反應(yīng)的速率不依賴于所使用的核苷底物的性質(zhì)。實(shí)施例6.3雙核苷試驗(yàn)用間-BioPMDAM進(jìn)行雙核苷ApUp(參見A4298，Sigma)的烷基化以證實(shí)反應(yīng)的選擇性是在末端磷酸上而不是在核苷內(nèi)的磷酸上。反應(yīng)的電泳監(jiān)測結(jié)果顯示在圖4中。反應(yīng)條件是實(shí)施例6.1所描述的標(biāo)準(zhǔn)條件?？梢杂^察到產(chǎn)生了過量的單一產(chǎn)物，說明間-BioPMDAM具有良好的反應(yīng)選擇性，反應(yīng)位點(diǎn)是在末端磷酸上而不是在核苷內(nèi)的磷酸上。實(shí)施例6.4與4種3’-單體磷酸核苷加合物的特征為了確保所得到的產(chǎn)物確實(shí)來自于磷酸的烷基化，合成了單體磷酸3’-UMP，3’-CMP，3’-GMP和3’-AMP于間-BioPMDAM試劑的加合物。烷基化反應(yīng)是以如下的制備規(guī)模進(jìn)行的。加合物的產(chǎn)率為70％，產(chǎn)物純化后進(jìn)行質(zhì)子NMR研究或磷NMR研究。制備操作規(guī)程3’-UMP(以二鈉鹽的形式存在，9.3mg，21.1μmol)溶于2ml0.1M的H3BO3水溶液中，然后相繼加入2mlCH3CN和6mlMeOH，最后加入間-BioPMDAM(75mg，0.20mmol)。在室溫下反應(yīng)2.5小時(shí)。用毛細(xì)管電泳監(jiān)測。加入3ml水，然后用CH2Cl2萃取以去除多余的試劑。將水相蒸發(fā)掉，殘留物溶于少量水中，然后用反相硅膠柱(LichroprepRP-18，Merck，洗脫液為MeOH/H2O(20/80))純化。可以得到10g(69％)3’-UMP的加合物。所得到的3’-NMP(N＝G，U，C，A)加合物的質(zhì)子NMR譜顯示在圖5A到5D中。加合物的鑒定是通過雙-二維1H/1HNMR試驗(yàn)(COSY)。這些加合物的兩個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體以1/1的比例顯示。磷NMR只在0ppm(300MHz，D2O)附近出現(xiàn)一個(gè)峰。這些試驗(yàn)說明反應(yīng)確實(shí)是特異性的，只觀察到一種加合物，標(biāo)記確實(shí)發(fā)生在磷上。在堿基上沒有烷基化副反應(yīng)發(fā)生。因此標(biāo)記的產(chǎn)物特別適合用于雜交。實(shí)施例7溫度穩(wěn)定性研究上述實(shí)施例6.1中表1所描述的所有重氮甲烷衍生物以固體狀態(tài)在-20℃冰箱中保存至少3個(gè)月其反應(yīng)性不會(huì)丟失。兩種試劑NPDAM和間-BioPMDAM在室溫下放置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上的穩(wěn)定性用1HNMR確定。我們發(fā)現(xiàn)將NPDAM放置于無警告標(biāo)志的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上1個(gè)月也不會(huì)出現(xiàn)分解。而間-BioPMDAM在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放置25天時(shí)就會(huì)降解掉50％。標(biāo)記試劑對(duì)溫度的穩(wěn)定性是一個(gè)基本特征。事實(shí)上，這種試劑在工業(yè)應(yīng)用上的最終目的是標(biāo)記試劑盒。在-20℃條件下15天內(nèi)，最好是1個(gè)月內(nèi)就會(huì)不穩(wěn)定的試劑是沒有市場前景的。即使在-110℃條件下儲(chǔ)存和運(yùn)輸，-110℃和-20℃的穩(wěn)定性存在相關(guān)關(guān)系，這就是為什么在-20℃條件下至少要穩(wěn)定15天，最好是1個(gè)月是工業(yè)化的最低限度。如果是-110℃以下，從使用者和制造商的角度看實(shí)驗(yàn)室缺乏必要的冷凍設(shè)備(冰箱)，并且從制造商的角度看也沒有一種簡單的利用干冰運(yùn)輸這些試劑的方式。至于室溫下的穩(wěn)定性，穩(wěn)定數(shù)小時(shí)，最好是1天就足以使使用者完成標(biāo)記操作。實(shí)施例8DNA片段化研究實(shí)施例8.1各種核苷在酸性介質(zhì)中的水解本試驗(yàn)的目的在于證明天然核苷、修飾核苷以及嘌呤核苷和嘧啶核苷之間在酸性pH條件下穩(wěn)定性的差異。本試驗(yàn)也可以使我們通過考慮DNA的堿基組成而更好地控制其片段化。兩種修飾核苷，8-溴-2’-脫氧腺苷(8-BrdA)和5-溴-2’-脫氧胞苷(5-BrdC)以及4種天然核苷(dA，dC，dG和dT)用于本試驗(yàn)中。每種核苷取50nmol培養(yǎng)到95℃、pH為3的50mM甲酸鹽中，培養(yǎng)時(shí)間從0到45min。真空干燥后加入20μl純水，取10nmol樣品用反相HPLC分析。結(jié)果以起始核苷的水解百分率(y軸)與以分鐘計(jì)的培養(yǎng)時(shí)間(x軸)的關(guān)系表示，見圖8。圖8的曲線顯示當(dāng)腺苷在8位上用溴原子修飾時(shí)其穩(wěn)定性與天然核苷相比下降。然而，結(jié)果顯示在相同的條件下，去嘌呤作用要遠(yuǎn)強(qiáng)于去嘧啶作用。本試驗(yàn)說明去嘌呤作用或去嘧啶作用而使DNA片段化可以通過優(yōu)化水解的條件或通過摻入比天然堿基穩(wěn)定性低的修飾堿基或者在摻入后可以被修飾和水解的堿基來控制。實(shí)施例8.2摻入修飾核苷或其他物質(zhì)的雙鏈DNA的片段化以16S結(jié)核分支桿菌基因組DNA為模板(10+4個(gè)起始拷貝)，用Roche的FastStart試劑盒，加入0.2mM4種脫氧核糖核苷酸(d-ATP，d-CTP，d-GTP，d-TTP)，0.3μM引物和0.4μl酶平行進(jìn)行3組PCR擴(kuò)增。PCR參數(shù)與實(shí)施例5相同。第一組PCR所用的條件為所謂的天然PCR。第二組PCR所用的條件加以修改，是為了得到加入30％8Br-dATP后的PCR產(chǎn)物。加入0.2mM的d-CTP，d-GTP和d-TTP，以及0.14mM的d-ATP和0.06mM的8-BrdATP。(8-BrdATP是市場上買到的(參見N-2005-1，TriLinkBiotechnologies，SanDiegoCA)。第二組PCR所用的條件加以修改，是為了得到加入50％8Br-dATP后的PCR產(chǎn)物。加入0.2mM的d-CTP，d-GTP和d-TTP，以及0.1mM的d-ATP和0.1mM的8-BrdATP。這些擴(kuò)增子的單獨(dú)片段化試驗(yàn)按照上面所描述的條件進(jìn)行50mM甲酸鈉，pH為3，95℃。PCR產(chǎn)物的分析用溴化乙啶染色的變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行(8％聚丙烯酰胺，7M尿素，1×TBE)。在pH＝3的50mM的甲酸鈉中95℃培養(yǎng)15min后，沒有觀察到三個(gè)PCR產(chǎn)物出現(xiàn)差異。所有的PCR擴(kuò)增子都已完全片段化。PCR擴(kuò)增子的去嘌呤作用也可以在不同的pH值、不同的溫度和不同的培養(yǎng)時(shí)間下進(jìn)行。在上述的條件下進(jìn)行凝膠分析表明當(dāng)pH＝3時(shí)在95℃培養(yǎng)10min片段化就可以完成。在此pH條件下，60℃培養(yǎng)30min也可以完成片段化。在pH＝4時(shí)，即使在95℃的條件下也需要30min的培養(yǎng)才能完成DNA擴(kuò)增子的片段化。這一結(jié)果非常重要，說明在酸性pH條件下產(chǎn)生的脫堿基位點(diǎn)是不穩(wěn)定的，因而即使不經(jīng)過特別的處理也會(huì)導(dǎo)致DNA鏈的片段化。實(shí)施例9以兩個(gè)步驟標(biāo)記和片段化帶有間-bioPMDAM衍生物(3a)的DNA間-bioPMDAM衍生物(3a)來自于實(shí)施例1.1所描述的反應(yīng)。DNA擴(kuò)增子的制備是按照實(shí)施例5描述的試驗(yàn)方案進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的。標(biāo)記將10μlPCR產(chǎn)物，38μl純水(Sigma)和50μl甲酸鈉(100mM，溶于純水中)混和，60℃培養(yǎng)30min。然后加入2μl間-bioPMDAM(100mMDMSO)。溶液劇烈振蕩，然后60℃再培養(yǎng)15min。試驗(yàn)作兩份以便能在凝膠上分析DNA的片段化同時(shí)通過DNA芯片的雜交和閱讀來分析標(biāo)記的效率。純化純化用QIAQUICKTM柱(核苷去除試劑盒，Qiagen，Hilden，Germany)進(jìn)行。所用的純化方案是廠家推薦的。純化后洗脫下來的物質(zhì)轉(zhuǎn)到一個(gè)含有400μl雜交緩沖液(1.75ml20×SSPE；2.9ml5M甘氨酸三甲內(nèi)鹽；290μl0.1MDTAB；10μl消泡劑30％)的干凈試管中。這些物質(zhì)參見如下·甘氨酸三甲內(nèi)鹽參見B-2754Sigma，·DTAB參見D-5047Sigma。溶液劇烈振蕩，95℃培養(yǎng)10min以使在片段化的標(biāo)記步驟(變性步驟)沒有分開的DNA雙鏈分開。然后在與DNA芯片雜交前將試管浸潤到0℃的冰-水中。與DNA芯片雜交經(jīng)過片段化的標(biāo)記步驟后，將所得到的片段與DNA芯片雜交，該芯片是專門設(shè)計(jì)用于分析結(jié)核桿菌16SRNA“Genbank”M20940序列的213-215區(qū)的。這種芯片在文獻(xiàn)A.Troesch等，J.Clin.Microbiol.，37(1)49-55，1999中有描述。雜交步驟是在液體狀態(tài)下進(jìn)行(Affymetrix，SantaClara，CA)，所用的雜交方法和緩沖液見文獻(xiàn)A.Troesch等，J.Clin.Microbiol.，37(1)49-55，1999。需附加步驟以使生物素顯色(間接檢測)。雜交的顯色是通過結(jié)合標(biāo)記藻紅蛋白(PE)的鏈親和素，PE可與間-BioPMDAM上的生物素相互作用，反應(yīng)條件如下300μl純水；300μl100mM的Tris緩沖液(pH7/1MNaCl/0.05％Tween/0.005％消泡劑)；6μlBSA(50mg/ml)；6μl鏈親和素-PE(300μg/ml)。這些物質(zhì)參見·鏈親和素-藻紅蛋白參見R0438，Dako，Denmark，·鏈親和素-CY5參見C0050，Dako，Denmark，·消泡劑參見M5-575，UltraAdditivesInc.，以及·Tween參見P-7949，Sigma。DNA芯片的閱讀標(biāo)記和雜交后DNA芯片表面發(fā)射的熒光以及信號(hào)強(qiáng)度和同源性百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)用Affymetrix所提供的閱讀系統(tǒng)及其分析軟件(GeneChipInstrumentSystem和GeneChipInformationSystem，SantaClaraCA)進(jìn)行閱讀和分析。閱讀系統(tǒng)所提供的信號(hào)強(qiáng)度和背景噪音強(qiáng)度用rfu(相對(duì)熒光單位)表示。同源性百分?jǐn)?shù)是指與參考序列的一致性，本試驗(yàn)是指結(jié)核桿菌序列。以平均強(qiáng)度所表示的信號(hào)(I)、背景噪音(B)和同源性百分?jǐn)?shù)(％)見下面表2所列出的。一般來說，同源性百分?jǐn)?shù)大于90％就可以認(rèn)為是比較滿意的結(jié)果了，雖然大于95％的結(jié)果也常常出現(xiàn)。如果是95％以上，這個(gè)值就不能說明問題了，因?yàn)檫@在分支桿菌DNA芯片上是沒有意義的。高強(qiáng)度、低背景噪音是在下面的例子中所看到的第二個(gè)結(jié)果。在所有的結(jié)果中，背景噪音B是由平均強(qiáng)度I推算出來的。聚丙烯凝膠分析打算在凝膠上分析的樣品需要真空干燥，加入10μl純水和10μl2×甲酰胺藍(lán)。電泳是用8％的乙酰胺凝膠，電泳緩沖液是1×TBE，150V遷移1小時(shí)。酸性pH用于DNA的片段化。事實(shí)上，在此pH條件下，去嘌呤現(xiàn)象會(huì)產(chǎn)生極不穩(wěn)定的脫堿基位點(diǎn)，導(dǎo)致DNA序列在高溫下迅速片段化。這種片段化產(chǎn)生的是DNA-5’磷酸片段。凝膠分析表明PCR擴(kuò)增子在60℃的甲酸鹽緩沖液(50mM，pH3)中培養(yǎng)30min可以使其完全片段化。這就使我們可以評(píng)價(jià)在間-bioPMDAM存在的情況下DNA擴(kuò)增子片段化期間的標(biāo)記效果。DNA擴(kuò)增子片段化期間的標(biāo)記結(jié)果以同源性百分率、信號(hào)及背景噪音的強(qiáng)度這三個(gè)指標(biāo)列示在下面的表2中。表2以同源性百分率、信號(hào)(I)及背景噪音(B)的強(qiáng)度表示的DNA擴(kuò)增子標(biāo)記和片段化。本實(shí)施例說明本發(fā)明的衍生物可用于標(biāo)記以兩步法酶催化擴(kuò)增的DNA片段。也可用于標(biāo)記非擴(kuò)增的天然DNA。實(shí)施例10含有Cy5-PMDAM衍生物(12a)的DNA的標(biāo)記含有新型標(biāo)記物的DNA標(biāo)記效果的評(píng)價(jià)是用合成的DNA片段，這種新型標(biāo)記物攜帶重氮甲基功能基團(tuán)。Cy5-PMDAM(12a)標(biāo)記試劑Cy5-PMDAM(12a)是根據(jù)實(shí)施例2所描述的方法制備的。按照所謂的亞磷酰胺方法制備一種20mer的寡脫氧核糖核苷(ODN)。用標(biāo)準(zhǔn)磷酸化試劑將一個(gè)磷酸基引入到5’末端，該磷酸化試劑與亞磷酰胺化學(xué)一致。這種ODN的序列含有DNA的所有天然堿基(ODN的序列5’-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3’)。這個(gè)序列與所謂的“模型”DNA芯片上的捕獲序列互補(bǔ)，DNA芯片上的捕獲序列是根據(jù)Affymetirx的技術(shù)合成的。這種DNA芯片含有捕獲探針，該探針在序列上是一致的，作為一種可檢測物位于芯片的表面。通過讀取DNA芯片可以得到信息，因此可以根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度而不是同源性的結(jié)果了解標(biāo)記的效果。標(biāo)記將10μl的Cy5-PMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到50pmol的ODN中。最終的體積是100μl。混和均勻后60℃培養(yǎng)30min。純化和閱讀為了去除多余的標(biāo)記試劑，需要按照實(shí)施例9的方法進(jìn)行純化。DNA芯片的閱讀是按照實(shí)施例17的方法進(jìn)行。結(jié)果從DNA芯片上讀取的平均標(biāo)記強(qiáng)度(I)是16644rfu，背景噪音(B)是450rfu。這一強(qiáng)度水平是很高的，說明標(biāo)記試劑Cy5-PMDAM(12a)可完全適用于標(biāo)記DNA片段上的磷酸基團(tuán)。實(shí)施例11用PDAM試劑標(biāo)記和片段化DNA實(shí)施例11.1以1-芘基疊氮甲烷(PDAM)標(biāo)記1-芘基疊氮甲烷PDAM從MolecularProbes(Eugene，OR)獲得，可溶于無水DMSO中。兩種20mer的ODN作為DNA模板一種ODN含有5’-羥基，另一種在其5’末端含有一個(gè)磷酸基團(tuán)。ODN的序列在實(shí)施例10中有描述。標(biāo)記反應(yīng)是在一種含有50％DMSO和1.5mM1-芘基疊氮甲烷(PDAM)的混合物中進(jìn)行，60℃反應(yīng)30min或1h。標(biāo)記效率用薄層色譜(正相)評(píng)價(jià)，洗脫液為異丙醇/氨水/水(60/10/30)。30min后在ODN5’-磷酸上的偶合反應(yīng)就可以完成。部分偶合到ODN5’-羥基上的時(shí)間需要1h，就是說大約50％。實(shí)施例6的結(jié)果在含有20個(gè)堿基的模型序列上得到證實(shí)，即末端磷酸上攜帶疊氮甲基功能基團(tuán)的試劑極易標(biāo)記。在核苷中間磷酸上標(biāo)記是不方便的，因?yàn)榭赡苡捎谠诤怂崞紊弦攵鄠€(gè)標(biāo)記物而導(dǎo)致敏感性升高。這就使核酸與互補(bǔ)序列雜交時(shí)具有高度的敏感性同時(shí)又有良好的雜交特異性。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以通過優(yōu)化反應(yīng)的條件來控制標(biāo)記的特異性，例如通過改變標(biāo)記試劑的種類，反應(yīng)時(shí)間和溫度達(dá)到只在末端磷酸上標(biāo)記的目的。實(shí)施例11.2用PDAM進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)研究本研究用20mer的ODN5’-磷酸在上述條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間加以改變。標(biāo)記效率通過反相高壓液相色譜(HPLC)進(jìn)行分析，條件如下5μm，220×4.6mm的反相色譜柱Spheri-5RP-15(PerkinElmer)。緩沖液和洗脫梯度如下·緩沖液A0.1MTEAA；緩沖液B＝50％緩沖液A+50％CH3CN，以及·洗脫梯度從10％到50％的緩沖液B，30min，1ml/min，室溫。結(jié)果見圖9，其中x軸是以分鐘表示的反應(yīng)時(shí)間，y軸是標(biāo)記百分率。60℃僅培養(yǎng)10min產(chǎn)率就接近90％。實(shí)施例11.3溫度對(duì)PDAM標(biāo)記的影響用20mer的ODN5’-磷酸在上述條件下進(jìn)行標(biāo)記，培養(yǎng)溫度加以改變，培養(yǎng)時(shí)間都是10min。標(biāo)記產(chǎn)率通過反相HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果見圖10，其中y軸是標(biāo)記百分率，x軸是以℃表示的反應(yīng)穩(wěn)定。需要強(qiáng)調(diào)的是即使在室溫下(25℃)也可以觀察到有ODN的標(biāo)記。25℃培養(yǎng)10分鐘后，標(biāo)記的產(chǎn)率大約為25％。溫度高于50℃，得到的產(chǎn)率大于80％。這說明用攜帶疊氮甲基功能基團(tuán)的試劑標(biāo)記DNA是高效的而且是靈活的。實(shí)施例12用標(biāo)記試劑間-bioPMDAM(3a)標(biāo)記和片段化PCR方法得到的DNA擴(kuò)增子間-bioPMDAM(3a)衍生物是按照實(shí)施例1.1描述的反應(yīng)條件制備的。DNA擴(kuò)增子是按照實(shí)施例5描述的試驗(yàn)方法通過PCR擴(kuò)增制備的。實(shí)施例12.1比較片段化和未片段化DNA的標(biāo)記效果a在片段化條件下的標(biāo)記將50μl甲酸鈉(pH3，50mM)和2μl間-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μlPCR產(chǎn)物中。體積調(diào)整到100μl。溶液在60℃培養(yǎng)30min。b未經(jīng)片段化的標(biāo)記將2μl間-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μlPCR產(chǎn)物中。體積調(diào)整到100μl。溶液在60℃培養(yǎng)30min。其他試驗(yàn)方法與實(shí)施例9相同。結(jié)果表3片段化和未片段化DNA標(biāo)記效果的比較上面表3中的結(jié)果說明未片段化的平均強(qiáng)度與背景噪音處于同一水平(500rfu)。而片段化后得到的標(biāo)記效果(大約4000rfu)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未片段化的，并且具有很高的同源性百分率。兩個(gè)步驟結(jié)合以后以后確實(shí)可以明顯改善大于100核苷的核酸片段的檢測。實(shí)施例12.2與DNA芯片雜交前進(jìn)行變性的影響分別在兩個(gè)試管中平行進(jìn)行兩個(gè)標(biāo)記反應(yīng)，方法如下將50μl甲酸鈉(pH3，50mM)和2μl間-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μlPCR產(chǎn)物中。總體積調(diào)整到100μl，溶液在60℃培養(yǎng)30min。在色譜柱上純化后，第一管所得到的溶液在95℃培養(yǎng)10min(為了打開DNA雙鏈)，然后將在試管浸潤到0℃的冰-水中直到與DNA芯片雜交。第二管所得到的溶液不進(jìn)行預(yù)先變性而直接與DNA芯片雜交。與DNA芯片表面的捕獲探針雜交的生物素化的片段通過加入標(biāo)記PE的鏈親和素顯示，反應(yīng)條件如實(shí)施例9所描述。結(jié)果表4與DNA芯片雜交前進(jìn)行變性的影響所得到的結(jié)果列在表4中，雜交前變性所得到的結(jié)果要高于未變性的。這說明DNA變性是必須的，可以得到較高的信號(hào)強(qiáng)度。通過脫堿基位點(diǎn)進(jìn)行片段化是一種促進(jìn)雙鏈DNA變性的方式，可以增強(qiáng)DNA與捕獲探針的雜交能力。為了檢驗(yàn)其他標(biāo)記試劑和考慮到用上述各種條件所得到的結(jié)果，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)參考試驗(yàn)方案，其中包括用甲酸鈉緩沖液(pH3，50mM)片段化以及一步雜交前變性。實(shí)施例13用生物素化的試劑通過一步標(biāo)記和片段化PCR擴(kuò)增子按照實(shí)施例1.1，1.2和1.3描述的試驗(yàn)方案分別制備間-bioPMDAM、鄰-bioPMDAM和對(duì)-bioPMDAM。它們都可溶于無水DMSO中，濃度為100mM。試驗(yàn)方案與上述實(shí)施例12.2所描述的相同(經(jīng)過雜交前的變性后一步標(biāo)記和片段化)。結(jié)果表5用生物素化的試劑通過一步標(biāo)記和片段化PCR擴(kuò)增子用優(yōu)化的試驗(yàn)方案通過一個(gè)步驟進(jìn)行片段化和標(biāo)記就可以得到極佳的結(jié)果，含有活波疊氮甲基功能基團(tuán)的各種標(biāo)記試劑所得到的結(jié)果都很好，如表5中所顯示的。實(shí)施例14用BioDPDAM標(biāo)記和片段化DNA按照實(shí)施例5所描述的方法通過PCR擴(kuò)增制備DNA擴(kuò)增子。標(biāo)記試劑的合成見實(shí)施例1的描述。試驗(yàn)方案與實(shí)施例12.2的相同，包括在雜交前95℃變性。結(jié)果表6用BioDPDAM標(biāo)記和片段化DNA表6所顯示的結(jié)果說明用與苯基同樣重要的基團(tuán)替代也可用于優(yōu)化攜帶疊氮甲烷功能基團(tuán)標(biāo)記試劑的反應(yīng)性。實(shí)施例15用5-(溴甲基)熒光素標(biāo)記和片段化DNA按照實(shí)施例5所描述的方法通過PCR擴(kuò)增制備DNA擴(kuò)增子。將50μl甲酸鈉(pH3，50mM)和2μl5-(溴甲基)熒光素(Molecularprobes，Eugene，OR)(100mM，溶于DMSO中)加入到10μlPCR產(chǎn)物中。體積調(diào)整到100μl，溶液在60℃培養(yǎng)30min。純化條件與實(shí)施例9的相同。變性步驟按實(shí)施例12.2描述的方案進(jìn)行。雜交和閱讀的其他條件與文獻(xiàn)A.Troesch等，J.Clin.Microbiol.，37(1)49-55，1999描述的一致。熒光素可以在閱讀系統(tǒng)上直接檢測。表7用5-(溴甲基)熒光素標(biāo)記和片段化DNA表7所顯示的結(jié)果說明通過制造脫堿基位點(diǎn)而產(chǎn)生的DNA片段化完全適用于用攜帶活波鹵烷基功能基團(tuán)的標(biāo)記試劑標(biāo)記。試驗(yàn)只需要一個(gè)步驟就可以完成(片段化和標(biāo)記)，但是其標(biāo)記的強(qiáng)度要比用攜帶疊氮甲基功能基團(tuán)的標(biāo)記物要低。實(shí)施例16在另一種衍生于菲繞啉的化學(xué)片段化試劑存在的情況下標(biāo)記和片段化DNA擴(kuò)增子按照實(shí)施例5所描述的方法通過PCR擴(kuò)增制備DNA擴(kuò)增子。所使用的試驗(yàn)條件有兩種條件a將20μl菲繞啉-FeSO4(25mM)和2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μlPCR產(chǎn)物中?？傮w積調(diào)整到100μl，混合物在95℃培養(yǎng)60min。條件b將50μl甲酸鈉緩沖液(pH3，100mM溶于純水中)和2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μlPCR產(chǎn)物中。總體積調(diào)整到100μl，混合物在95℃培養(yǎng)60min。其他條件與實(shí)施例9一致。表8在菲繞啉存在的情況下標(biāo)記和片段化DNA擴(kuò)增兩種片段化的條件都得到了滿意的結(jié)果，如表8所示。最好的結(jié)果是用在酸性pH下片段化的條件(b)得到的。實(shí)施例17通過摻入d-UTP-熒光素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增子的片段化標(biāo)記核苷的摻入按照下面的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增以得到有熒光素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增子(標(biāo)記在堿基上)。以16S結(jié)核桿菌基因組DNA(10+4拷貝)為起始模板，用Roche的FastStart試劑盒進(jìn)行PCR，加入0.2mM的脫氧核糖核苷d-ATP、d-CTP和d-GTP，以及0.14mM的d-TTP和0.06mM的dUTP-12-熒光素，0.3μM的引物和0.4μl的酶。標(biāo)記核苷占其天然同源核苷的30％。這個(gè)比例一般用于通過摻入標(biāo)記核苷來標(biāo)記擴(kuò)增子的反應(yīng)。dUTP-12-熒光素是從RocheDiagnostics購買的，參見1373242，Mannheim，Germany。PCR的參數(shù)與實(shí)施例5相同。a.用30％dUTP-12-熒光素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增子的片段化將50μl甲酸鈉緩沖液(pH3，50mM)加入到10μlPCR產(chǎn)物中。體積調(diào)整到100μl，溶液在60℃培養(yǎng)30min。b.含30％dUTP-12-熒光素的PCR擴(kuò)增子片段化期間的標(biāo)記將50μl甲酸鈉緩沖液(pH3，50mM)和2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μlPCR產(chǎn)物中。體積調(diào)整到100μl，然后將溶液在60℃培養(yǎng)30min。這個(gè)試驗(yàn)與參考試驗(yàn)方案一致，因此有可能通過省卻由于擴(kuò)增步驟不同而造成的差異來比較各種標(biāo)記策略。所有試驗(yàn)組在色譜柱上的純化步驟和變性步驟都與實(shí)施例9一致。試驗(yàn)方案(a1)d-UTP-12-熒光素標(biāo)記的擴(kuò)增子經(jīng)片段化后得到的核酸(條件a)與DNA芯片雜交，首先通過直接讀取熒光素發(fā)出的熒光信號(hào)檢測，如實(shí)施例15所描述的。試驗(yàn)方案(a2)信號(hào)放大步驟用于提高標(biāo)記的敏感性。信號(hào)的放大通過在在雜交步驟摻入生物素活化的抗熒光素抗體(參見216-065-084，JacksonImmunoResearch)，然后加入PE標(biāo)記的鏈親和素，所用的連續(xù)反應(yīng)條件如下·300μl純水，·300μl100mMTris緩沖液pH7/1MNaCl/0.05％Tween/0.005％消泡劑，2.4μlBSA(50mg/ml)，1.2μl生物素化的抗熒光素抗體(1mg/ml)，·300μl純水，以及·300μl100mMTris緩沖液pH7/1MNaCl/0.05％Tween/0.005％消泡劑；6μlBSA(50mg/ml)；6μl鏈親和素-PE(300μg/ml)。在本試驗(yàn)方案中，熒光素是作為半抗原(可用標(biāo)記抗體間接檢測的示蹤劑)而不是熒光物質(zhì)。試驗(yàn)方案(b)與DNA芯片雜交的生物素化的片段(條件b)通過加入標(biāo)記PE的鏈親和素顯示，所用條件如下·300μl純水，·300μl100mMTris緩沖液pH7/1MNaCl/0.05％Tween/0.005％消泡劑；6μlBSA(50mg/ml)，6μl標(biāo)記的鏈親和素-PE(300μg/ml)。標(biāo)記和雜交后DNA芯片表面發(fā)射的熒光以及信號(hào)強(qiáng)度和同源性百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)用Affymetrix所提供的閱讀系統(tǒng)及其分析軟件(GeneChipInstrumentSystem和GeneChipInformationSystem，SantaClaraCA)進(jìn)行閱讀和分析。在此需要注意的是所用的閱讀系統(tǒng)含有兩個(gè)過濾裝置，因此可以直接檢測·按照試驗(yàn)方案a1或其他方法單獨(dú)標(biāo)記d-UTP-熒光素的擴(kuò)增子檢測熒光素·如果擴(kuò)增子按照下列方法標(biāo)記則檢測PE—按照試驗(yàn)方案a2用d-UTP-熒光素標(biāo)記放大信號(hào)，或—按照試驗(yàn)方案b在片段化期間用間-bioPMDAM標(biāo)記。在兩種情況下顯影都是用的PE，使用濾膜可以使熒光素產(chǎn)生的信號(hào)被去除，確保被檢測到的是PE信號(hào)。結(jié)果*Flu＝熒光素，PE＝藻紅蛋白表9通過加入d-UTP-熒光素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增子的片段化上面表9所顯示的結(jié)果表明利用制造脫堿基位點(diǎn)的方法進(jìn)行的化學(xué)片段化適用于DNA擴(kuò)增子的酶催化標(biāo)記，標(biāo)記可在片段化前進(jìn)行。通過酶催化摻入熒光物質(zhì)而得到的信號(hào)強(qiáng)度水平和同源性百分率要低于在片段化期間用含有疊氮甲基功能基團(tuán)的標(biāo)記試劑如間-bioPMDAM(條件b)標(biāo)記而得到的信號(hào)強(qiáng)度水平和同源性百分率要達(dá)到與間-bioPMDAM衍生物標(biāo)記同樣的信號(hào)強(qiáng)度就需要進(jìn)行信號(hào)放大(條件a2)。結(jié)果顯示疊氮甲基活波功能基團(tuán)的效率確實(shí)與傳統(tǒng)的摻入修飾堿基如d-UTP-熒光素(參見試驗(yàn)方案(b))所達(dá)到的效率相同。實(shí)施例18超聲法使雙鏈DNA片段化按照實(shí)施例5所描述的方法制備DNA擴(kuò)增子。在標(biāo)記物存在和缺失的情況下用超聲法將這些擴(kuò)增子片段化。a.超聲期間標(biāo)記DNA擴(kuò)增子將2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μlPCR產(chǎn)物中。用純水將體積調(diào)整到100μl，pH調(diào)節(jié)到6.5?；旌衔镌诔暼萜?頻率35kHz，modelT460-H，Bioblock，F(xiàn)rance)中60℃培養(yǎng)30min。b.存PCR擴(kuò)增子化學(xué)片段化期間標(biāo)記(一步法參考方案)將50μl甲酸鈉緩沖液(pH3，50mM)和2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μlPCR產(chǎn)物中。體積調(diào)整到100μl，溶液在60℃培養(yǎng)30min。試驗(yàn)分兩份平行進(jìn)行以便能在凝膠上分析DNA的片段化同時(shí)通過DNA芯片的雜交和閱讀來分析標(biāo)記的效率，如上面所描述的(實(shí)施例9中PE的檢測)。凝膠分析分析所用的是溴化乙啶染色的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(8％聚丙烯酰胺，7M尿素，1×TBE)。凝膠分析結(jié)果表明經(jīng)過60℃超聲處理后DNA擴(kuò)增子已經(jīng)被片段化。結(jié)果表10超聲法使雙鏈DNA片段化表10的結(jié)果說明通過超聲片段化后的標(biāo)記(條件a)是令人滿意的。這說明通過超聲將DNA進(jìn)行物理片段化也適于用攜帶疊氮甲基功能基團(tuán)的標(biāo)記試劑標(biāo)記。本試驗(yàn)中出現(xiàn)較弱的標(biāo)記結(jié)果可能是由于超聲的作用而導(dǎo)致標(biāo)記物降解。而通過酸性pH的作用產(chǎn)生脫氨基位點(diǎn)而造成的片段化結(jié)果更好。實(shí)施例19一步法標(biāo)記、片段化及變性DNA按照實(shí)施例5所描述的方法通過PCR擴(kuò)增制備DNA擴(kuò)增子。兩種標(biāo)記反應(yīng)如下a.在95℃條件下通過一步法標(biāo)記、片段化和變性將50μl甲酸鈉緩沖液(pH3，50mM)和2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μlPCR產(chǎn)物中?？傮w積調(diào)整到100μl，溶液在95℃培養(yǎng)30min。本試驗(yàn)中反應(yīng)混合液不經(jīng)過預(yù)先變性就與DNA芯片雜交。b.60℃條件下標(biāo)記和片段化將50μl甲酸鈉緩沖液(pH3，50mM)和2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μlPCR產(chǎn)物中。總體積調(diào)整到100μl，溶液在60℃培養(yǎng)30min。反應(yīng)混和液按照上面所描述的方法純化。在本試驗(yàn)中DNA片段在與DNA芯片雜交前先按照實(shí)施例12.2描述的方法變性。結(jié)果表11一步法標(biāo)記、片段化及變性DNA實(shí)施例12.2證明了變性對(duì)于雙鏈DNA檢測敏感性的重要性。表11中的結(jié)果表明通過制造脫堿基位點(diǎn)產(chǎn)生片段化，DNA的標(biāo)記、片段化和變性可以在一步中完成，從簡易性及節(jié)約操作者時(shí)間的觀點(diǎn)來看這是一個(gè)值得注意的進(jìn)步，并且不會(huì)影響檢測的敏感性。實(shí)施例20對(duì)-Bio-EG3-PDAM的合成4-羧基苯甲醛的保護(hù)4-羧基苯甲醛是從市場上購買的。將其溶于100ml三甲基甲硅烷基氯(10g；20mmol)的MeOH溶液中?；旌衔镌谑覝叵鲁掷m(xù)攪拌40h。蒸發(fā)后留下白色固體為4-甲氧基羧基苯甲醛24，用NMR確證其結(jié)構(gòu)，然后用于下一步的反應(yīng)。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝10.07(s，1H，-CHO)；8.17(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)，7.92(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；3.93(s，3H，CO-O-CH2)。4-甲氧基羧基苯甲醛的保護(hù)4-甲氧基羧基苯甲醛(3.35g；20mmol)溶于含有Dowex50WX8-100(1g)的三甲基原甲酸鹽(4.8g；40mmol)?；旌衔镌诨亓鳁l件下加熱2h，然后過濾并蒸發(fā)。經(jīng)過重結(jié)晶試驗(yàn)后，NMR分析，結(jié)果表明反應(yīng)是不完全的，因此從新在30mlMeOH，30mlCH(Ome)3和1gDowex50WX8-100中室溫下反應(yīng)。然后再過濾和蒸發(fā)得到3.55g(16.89mmol，84％)的產(chǎn)物25。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.01(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.50(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；5.41(s，1H，CH)；3.93(s，3H，-CO-O-CH3)；3.29(s，6H，-O-CH3)?；衔?6化合物25(3.1g；14.8mmol)溶于16ml(73mmol)4，7，10-三氧-1，13-三癸二胺中。溶液在140-150℃加熱2h。然后將混合物溶解到100mlDCM(二氯甲烷或CH2Cl2)，用10ml水洗滌6次。有機(jī)相通過MgSO2干燥，然后蒸發(fā)直到得到油性物質(zhì)。將這種油性物質(zhì)用傾瀉法連續(xù)以戊烷洗滌3次，然后用DCM和水抽提。經(jīng)過MgSO2干燥和蒸發(fā)后分離出產(chǎn)物26，產(chǎn)率為63％(9.27mmol)。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.78(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.46(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；5.39(s，1H，CH)；3.62-3.47(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5‘，13’和H3‘)；3.29(s，6H，-O-CH3)；2.72(m，2H，H15’)1.87(m，2H，H4’)；1.64(m，2H，H14’)；1.30(寬s，2H，NH2)。化合物27的生物素化將生物素(500mg；2.05mmol)懸于10mlDMF，然后鍵入365mg(2.25mmol)CDI。溶液在室溫下持續(xù)攪拌30min。將化合物26(900mg；2.26mmol)溶于1mlDMF中，然后一點(diǎn)一點(diǎn)地加入到上述溶液中，混合物在室溫下持續(xù)攪拌1h。蒸發(fā)后通過急驟層析純化，所用的色譜柱為20mm直徑，洗脫液為250mlMeOH-DCM6％，然后是200mlMeOH-DCM7％，最后是200mlMeOH-DCM8％。產(chǎn)物27的相應(yīng)組分混和后蒸發(fā)干燥，得到1.00g油性物質(zhì)，產(chǎn)率約為50％。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝9.50(寬s，1H，NH咪唑)；7.80(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.64(s，1H，H咪唑)；7.46(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5和1H，NH2‘)；7.05(S，2H，H咪唑)；6.76(t，1H，NH16)，6.20(寬s，1H，NHB1)；5.44(寬s，1H，NHB3)；5.37(s.1H，CH)；4.42(m，1H，HB6a)；4.24(m，1H，HB3a)；3.59-3.44(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3’)；3.29(m，8H，H15’和2-O-CH3)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.66(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.13(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.85(m，2H，H4’)；1.66(m，2H，H14’)；1.40-1.37(m，6H，HB7，B8，B9)。醛化合物28乙縮醛27溶于50ml氯仿中，然后加入20ml2NHCl。兩相混和物劇烈攪拌15min。有機(jī)相回收，用無水NaHCO3干燥。過濾并蒸發(fā)后得到膏狀化合物28(495mg；0.855mmol)，根據(jù)生物素計(jì)算總產(chǎn)率為42％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝10.05(s，1H，CHO)；7.98(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.92(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.58(t，1H，NH2)；6.46(t，1H，NH16)，6.02(寬s，1H，NHB1)；5.19(寬s，1H，NHB3)；4.46(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；3.66-3.56(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.50-3.29(m，4H，H3’，13’)；3.28(m，2H，H15’)；2.95(m，1H，HB4)；2.84和2.71(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.15(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.89(m，2H，H4’)；1.72-1.63(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.23(m，2H，HB8)。腙化合物29將醛化合物18(495mg；0.855mmol)溶于10ml無水乙醇中。加入肼(350μl；7.20mmol)，然后將反應(yīng)混合物在回流條件下加熱1h。蒸發(fā)后得到的油性物質(zhì)溶于無水乙醇中以便再次蒸發(fā)。用戊烷研磨后得到泡狀物質(zhì)。膏狀產(chǎn)物29(511mg；0.862mmol)的產(chǎn)率為100％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.76(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.72(s，1H，CH)；7.56(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)7.34(t.1H，NH2’)；6.45(t，1H，NH16)；5.98(寬s，1H，NHB1)；5.78(寬s，2H，NH2)；5.18(寬s，1H，NHB3)；4.44(m，1H，HB6a)；4.26(m，1H，HB3a)；3.62-3.56(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.48-3.45(m，4H，H3’，13’)；3.27(m，2H，H15’)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.68(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.11(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.86(m，2H，H4’)；1.72-1.59(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.21(m，2H，HB8)。重氮基化合物30將腙化合物29(357mg；0.602mmol)溶解到17.5mlDMF中，然后加入MnO2(700mg；7.7mmol)，室溫下攪拌12min后將混合物用含有硅藻土(厚度2cm)和3(0.5cm)粉狀分子篩的微孔過濾，反應(yīng)混合物蒸發(fā)干燥。得到的殘留油性物質(zhì)用乙醚連續(xù)洗三次?？梢缘玫降奂t色固體化合物30(290mg，0.491mmol)，產(chǎn)率為82％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝8.28(t，1H，NH2’)；7.77(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.74(t，1H，NH16’)；7.00(d，2H.J＝8HZ，Ar-H3，5)；6.38(寬S，1H，NHB1)，6.32(寬s，1H，NHB3)；5.80(s，1H，CH-N2)；4.27(m，1H，HB6a)；4.11(m，1H，HB3a)；3.51-3.44(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.37(m，2H，H15’)；3.32(m，4H，H3’，13’)；3.05(m，1H，HB4)；2.79和2.58(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.02(t，2H，J＝8HZ，HB10)；1.69(m，2H，H4’)；1.59-1.48(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.25(m，2H，HB8)?；衔?0的反應(yīng)性用尿嘧啶3’-單磷酸鑒定，用毛細(xì)管電泳監(jiān)測。分析條件與實(shí)施例6.1相同。結(jié)果顯示化合物的半衰期是45分鐘。試劑在-20℃條件下至少可以保存1個(gè)月。實(shí)施例21用標(biāo)記試劑對(duì)-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記和片段化DNA擴(kuò)增子這種類型的分子，也就是攜帶聚乙二醇連接臂的PDAM衍生物所具有的主要優(yōu)點(diǎn)在于其可以使疊氮功能幾天和生物素保持分離，因而增加了其可溶性，并且在最后的分析中這些分子的反應(yīng)性得到提高。對(duì)-Bio-EG3-PDAM衍生物30是按照實(shí)施例20的方法制備的。DNA擴(kuò)增子是按照實(shí)施例5描述的方法制備的。兩種標(biāo)記反應(yīng)方法如下。a.對(duì)-Bio-EG3-PDAM試劑將10μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM(100mM，溶于DMSO中)和77μl無DNA酶和RNA酶的水加入到10μlPCR產(chǎn)物中。溶液混勻后沒有出現(xiàn)沉淀。將溶液在95℃培養(yǎng)10min，然后加入3μl0.1MHCl再于95℃培養(yǎng)10min。試驗(yàn)方法的其他步驟與實(shí)施例8相同。b.用間-BioPMDAM試劑標(biāo)記將10μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM(100mM，溶于DMSO中)和77μl無DNA酶和RNA酶的水加入到10μlPCR產(chǎn)物中。這種產(chǎn)物的合成在實(shí)施例1.1中已經(jīng)提及。溶液出現(xiàn)輕微沉淀。將溶液在95℃培養(yǎng)10min，然后加入3μl0.1MHCl再于95℃培養(yǎng)10min。試驗(yàn)方法的其他步驟與實(shí)施例8相同。結(jié)果表12用對(duì)-Bio-EG3-PDAM和間-BioPMDAM標(biāo)記和片段化DNA擴(kuò)增子的比較研究表12中顯示的信號(hào)強(qiáng)度是令人滿意的，同源性百分率也是很高的。結(jié)果說明將聚乙二醇臂引入到疊氮標(biāo)記分子上可以增加試劑的水溶性。因此試驗(yàn)比較均一。而且溶解度的增加可以提高標(biāo)記物的反應(yīng)性。實(shí)施例22其他含有聚乙二醇連接臂的PDAM衍生物的合成實(shí)施例22.1間-Bio-EG3-PDAM的合成合成步驟D-生物素化合物683-氨基苯乙酮(14.5g，107mmol)溶于50ml無水DMF中。加入琥珀酐(10.7g，107mmol)，混合物在室溫下通氬氣持續(xù)攪拌。6h后將溶液抽真空濃縮，加入50ml甲醇。得到的沉淀物過濾并用甲醇和乙醚洗滌。因而得到粉末狀的19.4g(81％產(chǎn)物68，其顏色為摻著少量灰黃顏色的白色。1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝2.5-2.6(m，7H)；7.45(t，1H)；7.64(d，1H)；7.83(d，1H)；8.19(s，1H)；10.16(S，1H)；12.12(s，1H)?；衔?9將5.07g(22mmol)化合物68溶于10ml無水DMF中，通氬氣?；旌衔镏糜诒希尤?.00g(32mmol)羰基二咪唑。20min后，緩慢加入20ml(94.6mmol)4，7，10-三氧三癸二胺(EG3)，室溫下反應(yīng)3小時(shí)，將DMF蒸發(fā)掉，殘留物收集到100mlCH2Cl2中。用飽和NaHCO3和水抽提，然后用無水Na2SO4干燥有機(jī)相，溶劑被蒸發(fā)掉。因此得到4.34g(46％)產(chǎn)物69。1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝1.59(m，2H)；1.87(m，2H)；2.16(S，3H)；2.40(m，2H)；2.55(m，2H)；3.08(m，2H)；3.45(m，16H)；7.30(t，1H)；7.42(d，1H)；7.70(d，1H)；7.83(t，1H)；7.97(s，1H)；10.00(s，1H)。生物素化的化合物70在氬氣下將D-生物素(1.0g，4.1mmol)溶于10ml無水DMF中，混合物在冰上冷卻，加入溶于10ml無水DMF中的羧基二咪唑(CDI)(0.665g，4.1mmol)。15min后，加入溶于2mlDMF中的化合物69(1.8g，4.1mmol)。在35℃下反應(yīng)3h，然后蒸發(fā)掉DMF，殘留物收集到100mlCH2Cl2中。用飽和NaHCO3和水抽提，然后用無水Na2SO4干燥有機(jī)相，溶劑被蒸發(fā)掉。產(chǎn)物的NMR特征表明所得到的是產(chǎn)物70和游離EG3的混合物。在繼續(xù)合成前要作進(jìn)一步的純化。按照實(shí)施例1描述的方法經(jīng)過兩個(gè)合成步驟就得到了最終的化合物間-Bio-EG3-PMDAM。本合成方法的優(yōu)勢有兩個(gè)。其一，只需兩步就可以得到產(chǎn)物69；這個(gè)產(chǎn)物可以作為疊氮基的前體通過末端的胺基連接到不同性質(zhì)的可檢測分子上。通過這個(gè)基團(tuán)也可以將化合物69嫁接到固相支持物上。其二，化合物71與間-Bio-PMDAM(我們的參照分子)具有相同的活性中心，這就使乙烯甘油(EG3)臂的連接更容易，具有檢測優(yōu)勢。本試劑在-20℃條件下至少能穩(wěn)定1月。實(shí)施例22.2間-Bio-EG-4-PMDAM的合成合成方案3-硝基苯乙酮13的保護(hù)將33g(0.20mol3硝基苯乙酮溶于400ml甲苯中，然后加入40ml(0.717mol)乙烯甘油和600mg(3.15mmol)旁-甲苯磺酸(PTSA)。用DeanStarksystem計(jì)數(shù)。溶液在130℃加熱3h。溶液的穩(wěn)定降到室溫時(shí)，加入400ml乙酸乙酯，然后用8ml飽和NaHCO3溶液洗滌。有機(jī)相用MgSO4干燥。蒸發(fā)后得到暗黃色固體13(39.72g；0.190mol)，產(chǎn)率為95％。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.11(t，1H，J＝8Hz.Ar-H)；6.87-6.78(m，2H，Ar-H)；6.59(dd，1H，J＝6.5Hz，Ar-H)；4.00(m，2H，H2C羧醛)；3.79(m，2H，H2C羧醛)；1.61(S，3H，CH3)。胺14的制備將化合物13(39.7g；0.190mol)溶于500ml乙醇中，然后加入1g10％的附在碳上的鈀?；旌衔锛訜嵋允蛊渫耆芙?，然后使溶液降到室溫。抽真空后將液體置于H2中，持續(xù)劇烈攪拌5h。然后將溶液在熱的狀態(tài)下過濾冰蒸發(fā)。產(chǎn)物14用戊烷洗滌，分離出固體形式的產(chǎn)物(34g；0.189mol)，產(chǎn)率為99％。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.14(t，1H，J＝8Hz，Ar-H)；6.85(m，2H，J＝7.5Hz，Ar-H)；6.79(s，1H，Ar-H)；6.59(dd，1H，J＝6.5Hz，Ar-H)；4.00(m，2H，H2C羧醛)；3.77(m，2H，H2C羧醛)；1.61(S.3H，CH3)。溴化化合物15胺14(12.3g；68.7mmol)和三乙胺(7g；69mmol)在氬氣下溶于150mlDCM。在-5℃下滴加溶于150mlDCM中的13.8g(60mmol)溴乙基溴化物溶液。在滴加的最后加入100ml1NNaHCO3水溶液。有機(jī)相用NaHCO3水溶液連續(xù)洗滌兩次然后用MgSO4干燥。蒸發(fā)干燥后得到22.6g褐色油性物質(zhì)，就是化合物15，用于下一步的反應(yīng)。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.29(寬s，1H，NH)；7.62(dt，1H4，J＝5Hz，Ar-H)；7.47(s，1H，Ar-H2)；7.38-7.19(m，2H，Ar-H5，6)；4.00(m，2H，Br-CH2)；3.75(m.4H，H2C-H2C羧醛)；1.61(s，3H，CH3)。乙醇化合物16氫化鈉(3.3g；82.5mmol)用戊烷洗滌三次，然后懸于150mlTHF中，在室溫下加入四乙烯甘油(50ml；0.29mol)。溶液持續(xù)攪拌15min，然后冷卻到-5℃。將化合物15預(yù)先滴加稀釋到25mlTHF中。混合物持續(xù)攪拌30min以使其降到室溫。將溶液濃縮到100ml然后稀釋到500mlCHCl3中。有機(jī)相用250ml1N的NaHCO3水溶液連續(xù)洗滌三次次然后用MgSO4干燥。產(chǎn)物在二氧化硅柱(柱徑65mm)上通過急驟層析純化，洗脫液為1.51MeOH-DCM5％，然后是500mlMeOH-DCM7％，最后是500mlMeOH-DCM10％?；衔?6相應(yīng)的組分混和在一起蒸發(fā)干燥，得到17.4g(42.1mmol)產(chǎn)物，產(chǎn)率為61％。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.86(寬s，1H，NH)；7.71(d，1H，J＝7.5Hz，Ar-H4)；7.51(s，1H，Ar-H2)；7.29-7.24(m，2H，Ar-H5，6)；4.09(m，2H，CO-CH2-O)；3.99(m，2H，H2C羧醛)；3.72-3.53(m，20H，O-CH2-CH2-O，H2C羧醛和HO-CH2)；1.61(s，3H，CH3)。甲苯磺酸鹽化合物17將乙醇16(4.13g；10.0mmol)溶于5ml吡啶中。然后在室溫下2.0g(10.5mmol)甲苯磺酰氯?；旌臀锵職鍤庵袛嚢?0h。溶液用100mlDCM稀釋，有機(jī)相用20ml1N的NaHCO3水溶液洗滌三次，然后在與甲苯共同蒸發(fā)前用MgSO4干燥。產(chǎn)物通過急驟層析純化，色譜柱徑50mm，洗脫液為500mlMeOH-DCM2％，然后是500mlMeOH-DCM3％，最后是500mlMeOH-DCM4％。產(chǎn)物17的相應(yīng)組分混和后蒸發(fā)干燥，得到3.68g(6.48mmol)油性物質(zhì)，產(chǎn)率約為65％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.86(寬s，1H，NH)；7.76(d，4H，J＝5.5Hz，Ar-H甲苯磺酰)；7.60(d，1H，J＝7.5Hz，Ar-H4)；7.50(s，1H，Ar-H2)；7.32-7.22(m，2H，Ar-H5，6)；4.10(m，2H，CO-CH2-O)；4.00(m，2H，HaC羧醛)；3.73-3.54(m，20H，O-CH2-CH2-O，H2C羧醛和HO-CH2)；2.42(s，3H，Ar-CH3)；1.61(s，3H，CH3)。鄰苯二甲酰亞胺化合物18甲苯磺酸鹽化合物17(3.68g；6.48mmol)用1.52g(10.0mmol)DBU(1，8-疊氮二環(huán)[5.4，0]十一碳烯)溶解，然后加入鄰苯二甲酰亞胺(1.47g；10mmol)。所得到的溶液在85-90℃加熱17h，然后蒸發(fā)。產(chǎn)物在二氧化硅柱(柱徑65mm)上通過急驟層析純化，洗脫液為1l丙酮-DCM15％，然后是1l丙酮-DCM20％。化合物18相應(yīng)的組分混和在一起蒸發(fā)干燥，得到3.15g(5.8mmol)產(chǎn)物，產(chǎn)率為90％。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.73(寬S，1H，NH)；7.79(m，2H，Ar-H鄰苯(phtha))；7.99(m，2H，Ar-H鄰苯(phtha)和Ar-H4)；7.49(s，1H，Ar-H2)；7.27-7.18(m，2H，Ar-H5，6)；4.10(m，2H，CO-CH2-O)；4.00(m，2H，H2C羧醛)；3.69-3.56(m，20H，O-CH2-CH2-O，H2C羧醛和N鄰苯(phtha)-CH2)；1.61(s，3H，CH3)。氨基化合物19產(chǎn)物18在75-80℃回流加熱下溶于20ml無水乙醇中。然后加入肼(1.07ml；22.1mmol)，混合物持續(xù)攪拌1h15min。沉淀物在燒結(jié)玻璃上過濾并蒸發(fā)掉乙醇相。然后用DCM洗滌白色沉淀物并蒸發(fā)掉DCM相。得到的黃色油性物質(zhì)(2.3g；5.57mmol)直接用于下一步的反應(yīng)，即使含有咪唑也可以在下面乙縮醛去保護(hù)步驟去除。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.83(寬s，1H，NH)；7.69(d，1H，J＝7.5HZ，Ar-H4)；7.51(s，1H，Ar-H2)；7.30-7.19(m，2H，Ar-H5，6)；4.10(m，2H，CO-CH2-O)；4.00(m，2H，H2Cactal)；3.69-3.56(m，20H，O-CHw-CHw-O，H2C羧醛和H2N-CH2)；1.61(s，3H，CH3)。生物素化的化合物20將D-生物素(1.05g；4.32mmol)溶于10ml無水DMF中。在氬氣中加入790mg(4.87mmol)羧基二咪唑(CDI)。攪拌10min后將稀釋在5mlDMF中的氨基19加入。溶液持續(xù)攪拌40min，然后在通過急驟層析純化前蒸發(fā)。所用色譜柱徑為50mm，洗脫液為500mlMeOH-DCM5％，然后是500mlMeOH-DCM10％，最后是500mlMeOH-DCM15％?；衔?0相應(yīng)的組分混和在一起蒸發(fā)干燥，得到3.黃色油性物質(zhì)(1.66g；2.6mmol)。根據(jù)NMR譜可知，得到的黃色油性物質(zhì)(2.4g)含有重量百分比為30％的咪唑。由此可以推斷出產(chǎn)物20的產(chǎn)率相對(duì)于起始生物素來說是60％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.80(寬s，1H，NH)；7.66(m，3H，Ar-H4和H咪唑)；7.54(s，1H，Ar-H2)；7.28-7.24(m，2H，Ar-H5，6)；7.07(s，2H，H咪唑)，6.59(t，1H，NH15’)；6.06(寬s，1H，NHB1)；5.19(寬s，1H，NHB3)；4.45(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；4.10(s，2H，H3’)，4.00(m，2H，H2C羧醛)；3.75-3.49(m，18H，O-CH2-CH2-O和H2C羧醛)；3.36(m，2H，H14’)；3.09(m，1H，HB4)；2.85和2.66(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.16(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.61(S，3H，CH3)；1.59-1.3(m，6H，HB9，B8，B7)。酮化合物21將乙縮醛化合物20溶于80ml氯仿中，然后加入30ml2NHCl?；旌衔锍掷m(xù)劇烈攪拌45min。有機(jī)相回收然后用無水NaHCO3干燥。過濾后將溶液蒸發(fā)，得到的油性物質(zhì)用戊烷洗滌得到產(chǎn)物21(1.48g；2.48mmol)，產(chǎn)率為99％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.99(寬s，1H，NH)；8.07(s，1H，Ar-H2)；7.98(d，2H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.66(d，2H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.42(t，2H，J＝8Hz，Ar-H5)；6.38(t，1H，NH15’)；5.78(寬s，1H，NHB1)；4.96(寬s，1H，NHB3)；4.47(m，1H，HB6a)；4.29(m，1H，HB3a)；4.13(s，2H，H3’)；3.76-3.37(m，16H，O-CH2-CHa-O)；3.32(m，2H，H14’)；3.11(m，1H，HB4)；2.89和2.75(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.59(s，3H，CH3)；2.16(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.64-1.40(m，6H，HB9，B8，B7)。腙化合物22將酮21溶于20ml無水乙醇中?；旌衔镌?5-80℃下回流加熱。然后加入肼(816μl；16.81mmol)，混合物持續(xù)攪拌3h。過濾后將混合物蒸發(fā)干燥，殘留物從新溶解到乙醇中直到出現(xiàn)厚厚的白色泡沫。在第二個(gè)例子中，將此泡沫溶解到50ml氯仿中，然后加入20mlNaHCO3溶液。混合物完全洗滌后回收有機(jī)相。用無水Na2CO2干燥，過濾蒸發(fā)干燥后得到新的黏性泡沫。后者就是產(chǎn)物22(842mg；1.38mmol)，產(chǎn)率為66％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.81(寬s，1H，NH)；8.82(s，1H，Ar-H2)；7.64(d，2H.J＝8Hz，Ar-H4)；7.32(m，4H，Ar-H5，6)；6.43(t，1H，NH15’)；5.89(寬s，1H，NHB1)；5.46(寬s，2H，NH2)；4.99(寬s，1H，NHB3)；4.44(m，1H，HB6A)；4.27(m，1H，HB3a)；4.11(s，2H，H3’)；3.70-3.37(m，16H，O-CH2-CH2-O)；3.32(m，2H，H14’)；3.08(m，1H，HB4)；2.87和2.67(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.11(m，5H，CH3和HB10)；1.64-1.40(m，6H，HB9，B8，B7)。疊氮化合物23將腙化合物22(100mg；0.164mmol)在氬氣下溶解到1mlDMF中。加入80mg活化的MnO2，混合物持續(xù)劇烈攪拌30min?；旌衔锿ㄟ^塞里塑料(3cm)-粉狀分子篩(1cm)復(fù)合層過濾。然后將溶液蒸發(fā)干燥。在蒸發(fā)結(jié)束時(shí)得到的油性物質(zhì)磨碎直到得到粉紅色粉末，該粉末就是化合物23(78mg；0.128mmol；78％)。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝9.60(寬s，1H，NH)；7.89(S，1H，Ar-H2)；7.76(t，1H，NH15’)；7.35-7.25(m，4H，Ar-H5，6)；6.64(d，2H，J＝8Hz，Ar-H4)；6.36(寬s，1H，NHB1)；6.32(寬s，1H，NHB3)；4.28(m，1H，HB6a)；4.08(m，1H，HB3a)；4.06(s，2H，H3’)；3.55-3.31(m，16H，O-CH2-CH2-O)；3.17(m，2H，H14’)；3.08(m，1H，HB4)；2.80和2.59(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.13(m，5H，CH3)；2.13(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.99-1.30(m，6H，HB9，B8，B7)。檢測化合物23在尿嘧啶3’-單磷酸上的反應(yīng)性并用毛細(xì)管電泳監(jiān)測。分析條件與實(shí)施例6.1一致。結(jié)果顯示其半衰期是30min。該試劑在-20℃的穩(wěn)定性大于1月。實(shí)施例22.3對(duì)-Bio-EG3-PMDAM的合成合成流程·4-乙酰苯甲酸的保護(hù)將4-乙酰苯甲酸(1g；6.1mmol)溶解到5mlMeOH配制的三甲基甲硅烷基氯化物溶液(TMSCl，10g；92mmol)中?；旌衔?0℃加熱過夜。蒸發(fā)后得到白色固體化合物31(1.21g；5.75mmol)。通過NMR鑒定其特征并用于下一步的反應(yīng)。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.08(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.59(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；3，18(s，6H，-O-CH3)；1.53(s，3H，CH3)?；衔?2將化合物31(1.21g；5.75mmol)溶解到5ml含有Dowex50WX8-100(0.3g)的三甲基正甲酸鹽中?；旌衔?0℃加熱過夜，然后過濾蒸發(fā)得到化合物32(1.19g；5.3mmol)，產(chǎn)率為87％。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.00(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.54(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；3.89(s，1H，CO-O-CH3)；3.16(8，6H，-O-CH3)；1.51(s，3H，CH3)?；衔?3將化合物32(1.17g；5.22mmol)溶于5ml(22.7mmol)4，7，10-三氧-1，13-三癸二胺中。得到的溶液140℃加熱4h。然后將混合物溶解到30mlDCM中，用10ml水洗滌三次。有機(jī)相通過MgSO4干燥，然后蒸發(fā)直到得到油性產(chǎn)物33(1.44g；3.49mmol)，產(chǎn)率為67％。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.76(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.51(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；3.62-3.47(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3’)；3.15(s，6H，-O-CH3)；2.73(m，2H，H15’)1.88(m，2H，H4’)；1.65(m，2H，H14’)；1.38(寬s，2H，NH2)。生物素化的化合物34將生物素(780mg；3.19mmol)懸于13mlDMF中。然后加入590mg(3.60mmol)CDI。溶液在室溫下持續(xù)攪拌30min?；衔?3溶于1mlDMF中，然后將前面的溶液一點(diǎn)一點(diǎn)的加入。得到的混合物在室溫下持續(xù)攪拌1h。蒸發(fā)掉DMF后，通過急驟層析純化，所用的色譜柱徑為35mm，所用洗脫液為500mlMeOH-DCM6％，然后是250mlMeOH-DCM8％，最后是250mlMeOH-DCM8％。產(chǎn)物34相應(yīng)的組分混和后蒸發(fā)干燥，得到1.05g油性物質(zhì)，產(chǎn)率約為30％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.49(寬s，1H，NH咪唑)；7.79(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.66(s，1H，H咪唑)；7.50(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.38(t，1H，NH2’)；7.11(S，2H，H咪唑)；6.67(t，1H，NH16’)；5.99(寬s，1H，NHB1)；5.15(寬s，1H，NHB3)；4.46(m，1H，HB6A)；4.27(m，1H，HB3a)；3.61-3.45(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3’)；3.28(m，2H，H15’)；3.15(s，6H，-OCH3)；2.85(m，1H，HB4)；2.85和2.69(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.14(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.86(m，2H，H4’)；1.69(m，2H，H14’)；1.49(s，3H，CH3)；1.42-1.39(m，6H，HB7，B8，B9)?；衔?5乙縮醛化合物34溶于45ml氯仿中，然后加入10ml2N的HCl。兩相混合物劇烈攪拌5min?；厥沼袡C(jī)相，用無水NaHCO2干燥。過濾、蒸發(fā)后得到淡黃色固體形態(tài)的化合物35(504mg；0.87mmol)，按照生物素計(jì)算產(chǎn)率為27％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.97(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.91(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.51(t，1H，NH2‘)；6.50(t，1H，NH16’)，6.05(寬s，1H，NHB1)；5.23(寬s，1H，NHB3)；4.45(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；3.62-3.56(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.48-3.46(m，4H，H3’，13’)；3.27(m，2H，H15’)；3.10(m，1H，HB4)；2.85和2.71(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.60(s，3H，CH3)；2.14(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.89(m，2H，H4’)；1.72-1.61(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.40(m，2H，HB8)。腙化合物36將酮化合物35(500mg；0.864mmol)溶解到11ml無水乙醇中。加入肼(335μl；6.911mmol)，然后將反應(yīng)混合物回流加熱1h。蒸發(fā)后得到的油性物質(zhì)溶于無水乙醇中以便再次蒸發(fā)。得到黏性泡沫狀產(chǎn)物(488mg；0.823mmol)，產(chǎn)率為95％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.76(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.67(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.29(t，1H，NH2’)；6.46(t，1H，NH16’)，5.98(寬s，1H，NHB1)；5.55(寬s，2H，NH2)；5.14(寬s，1H，NHB3)；4.45(m，1H，HB6a)；4.24(m，1H，HB3a)；3.62-3.51(m，10H，H7’，，8’，10’，11’和H5’)；3.47-3.45(m，4H，H3’，13’)；3.27(m，2H，H15’)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.69(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.11(t，2H，J＝8Hz，HB10和s，3H，CH3)，1.86(m，2H，H4’)；1.72-1.59(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.21(m，2H，HB8)。疊氮化合物37將腙化合物36(200mg；0.337mmol)溶于5mlDMF中。加入MnO2(450mg；5.17mmol)。室溫下攪拌15min后將混合物通過含有硅藻土(厚度2cm)和3(0.5cm)粉末狀分子篩的微孔過濾。反應(yīng)混合物蒸發(fā)干燥。得到的殘留油性物質(zhì)用乙醚連續(xù)洗三次，直到得到粉末狀物質(zhì)。得到的化合物37(290mg，0.491mmol)呈粉紅色固體狀態(tài)，產(chǎn)率為93％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝8.33(t，1H，NH2’)；7.83(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.73(t，1H，NH16’)；6.98(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；6.39(寬s，1H，NHB1)；6.33(寬s，1H，NHB3)；4.30(m，1H，HB6a)；4.12(m，1H，HB3a)；3.51-3.45(m，16H，H7’，8’，10’，11’和H5’和H15’和H3’，13’)；3.07(m，1H，HB4)；2.79和2.58(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.14(s，3H，CH3)；2.04(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.77(m，2H，H4’)；1.62-1.48(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.31(m，2H，HB8)。檢測化合物37在尿嘧啶3’-單磷酸上的反應(yīng)性并用毛細(xì)管電泳監(jiān)測。分析條件與實(shí)施例6.1一致。結(jié)果顯示其半衰期是60min。該試劑在-20℃的穩(wěn)定性至少為1月。實(shí)施例22.4間-Bio-EG3-PDAM的合成合成流程甲基3-甲酰苯甲酸鹽38的保護(hù)將Dowex50WX8-100樹脂(2g)H2N-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-溶于25mlMeOH和25ml三甲基oCH2-NH2中，持續(xù)攪拌15min。潷析后用20mlMeOH連續(xù)洗滌樹脂兩次。然后將樹脂置于100mlMeOH內(nèi)，然后加入50mlCH(OMe)3和7.12g(43.4mmol)甲基3-甲酰苯甲酸鹽。溶液持續(xù)攪拌15min，然后在蒸發(fā)前用折疊的濾紙過濾。分離出淡黃色液體狀產(chǎn)物39(9g；43.1mmol)，產(chǎn)率為99％。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.10(s，H，Ar-H2)；7.9(d，H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.63(d，H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.42(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；5.40(s，1H，CH)；3.90(s，3H，-CO-O-CH3)；3.31(s，6H，-O-CH3)?；衔?0將化合物39(2g；9.5mmol)溶于10.4ml(47.6mmol)4，7，10-三氧-1，1，3-三癸二胺中。得到的溶液在165℃下加熱2h。然后將混合物溶解到80mlDCM中，用20ml水洗滌4次。用MgSO4干燥和蒸發(fā)后分離出產(chǎn)物40(2.27g；5.69mmol)。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.84(s，H，Ar-H2)；7.75(d，H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.53(d，H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.39(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；5.38(s，1H，CH)；3.64-3.43(m.14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3‘)；3.29(s，6H，-O-CH3)；2.72(m，2H，H15’)；1.87(m，2H，H4’)；1.64(m，2H，H14’)；1.30(寬s，2H，NH2)。生物素化的化合物41將D-生物素(344mg；1.40mmol)懸于4mlDMF中。然后加入250mg(1.54mmol)CDI。溶液在室溫下持續(xù)攪拌30min?；衔?0溶于2mlDMF中，然后將前面的溶液一點(diǎn)一點(diǎn)的加入。得到的混合物在室溫下持續(xù)攪拌50min。蒸發(fā)后，通過急驟層析純化，所用的色譜柱徑為30mm，所用洗脫液為750mlMeOH-DCM10％，然后是250mlMeOH-DCM15％。產(chǎn)物41相應(yīng)的組分混和后蒸發(fā)干燥，得到740mg油性物質(zhì)，產(chǎn)率約為50％。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.87(s，H，Ar-H2)；7.78(d，H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.65(s，1H，H咪唑)；7.53(d，H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.39(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；7.07(s，2H，H咪唑)；6.65(t，1H，NH16’)；5.95(寬s，1H，NHB1)；5.38(s，1H，CH)；5.15(寬s，1H，NHB3)；4.43(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；3.59-3.44(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3’)；3.29(m，8H，H15’和2-O-CH3)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.66(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.13(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.85(m，2H，H4’)；1.66(m，2H，Hn.)；1.40-1.37(m，6H，HB7，B8，B9)。醛化合物42將乙縮醛化合物41溶于20ml氯仿中，然后加入5ml2NHCl。兩相混合物持續(xù)劇烈攪拌15min。有機(jī)相回收然后用無水NaHCO3干燥。過濾后將溶液蒸發(fā)，得到淡黃色油性狀態(tài)的化合物42(593mg；1.02mmol)，產(chǎn)率為87％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝10.04(s，1H，CHO)；8.34(s，H，Ar-H2)；8.16(d，H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.96(d，H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.72(t，1H，NH2’)；7.39(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；6.51(t，1H，NH16’)；6.00(寬s，1H，NHB1)；5.30(寬s，1H，NHB3)；4.46(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；3.66-3.56(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.50-3.29(m，4H，H3’，13’)；3.28(m，2H，H15’)；2.95(m，1H，HB4)；2.84和2.71(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.15(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.89(m，2H，H4’)；1.72-1.63(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.23(m，2H，HB8)。腙化合物43將醛化合物42(593mg；1.02mmol)溶解到10ml無水乙醇中。加入肼(400μl；8.19mmol)，然后將反應(yīng)混合物回流加熱50min。蒸發(fā)后得到的黃色油性物質(zhì)用乙醚磨碎直到得到淺褐色粉末狀產(chǎn)物43(404mg；0.68mmol)，產(chǎn)率為66％。通過急驟層析純化，所用的色譜柱徑為15mm，上樣量為150mg，所用洗脫液為200mlMeOH-DCM20％。各組分混和后蒸發(fā)干燥，得到144mg產(chǎn)物43，產(chǎn)率為76％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.95(s，H，Ar-H2)；8.16(d，H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.76(s，1H，CH)；7.96(d，H，J＝8HZ，Ar-H6)；7.38(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；6.45(t，1H，NH16’)；5.98(寬s，1H，NHB1)；5.72(寬s，2H，NH2)；5.18(寬s，1H，NHB3)；4.44(m，1H，HB6a)；4.26(m，1H，HB3a)；3.62-3.56(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.48-3.45(m，4H，H3’，13’)；3.27(m，2H，H15’)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.68(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.11(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.86(m，2H，H4’)；1.72-1.59(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.21(m，2H，HB8)。疊氮化合物44將腙化合物43(100mg；0.187mmol)溶于4mlDMF中。加入MnO2(200mg；2.3mmol)。室溫下攪拌13min后將混合物通過含有硅藻土(厚度2cm)和3(0.5cm)粉末狀分子篩的微孔過濾。反應(yīng)混合物蒸發(fā)干燥。得到的殘留油性物質(zhì)用乙醚連續(xù)洗三次，得到橙色固體化合物44(290mg，0.491mmol)呈粉紅色固體狀態(tài)，產(chǎn)率為83％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝8.39(t，1H，NH2’)；7.78(t，1H，NH16’)；7.39-7.34(m，Ar-H)；7.09(d，Ar-H)；6.38(寬s，1H，NHB1)；6.32(寬s，1H，NHB3)；5.78(s，1H，CH-N2)；4.27(m，1H，HB6a)；4.11(m，1H，HB3A)；3.51-3.44(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.37(m，2H，H15)；3.32(m，4H，H3’，13’)；3.05(m，1H，HB4)；2.79和2.58(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.02(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.69(m，2H，H4’)；1.59-1.48(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.25(m，2H，HB8)。產(chǎn)物在-20℃條件下穩(wěn)定性大于1月。實(shí)施例23對(duì)-Cy5-EG3-PDAM的合成如實(shí)施例2所提及的，生物素可以被其他標(biāo)記物如Cy5替代。本實(shí)施例說明PDAM攜帶的疊氮功能基團(tuán)也可以通過一個(gè)聚乙二醇連接臂連接到這種Cy5標(biāo)記物上。合成流程抗衡離子I-不存在于結(jié)構(gòu)式46，47，50’和51中。2-[4-(N-乙?；?N-苯基胺基)丁-1，3-二烯]-1，2，3，3-四甲基[3H]碘咯碘化物47將溶于乙酸酐(50ml)的丙醛二(苯基亞氨基)一鹽酸45(13g；50.2mmol)、NaOAc(6.0g；69.7mmol)和1，2，3，3-四甲基[3H]碘咯碘化物46(3.01g；10mmol)的混合物在100℃精確加熱20min。冷卻后加入乙醚(350ml)，然后將沉淀下來的棕色固體過濾，用乙醚(3×100ml)洗滌。固體重新溶解到150mlCH2Cl2中，過濾(去除有機(jī)鹽)，然后用350ml乙醚沉淀得到棕色固體(3.54g，54％)。1HNMR(CDCl3)δ＝8.64(d；1H；J＝12Hz；1-H)；8.14(t；1H；J＝16；12Hz；3-H)；7.63-7.19(m；9H)；6.90(d；1H；J＝15Hz；4-H)；5.82(t；1H；J＝12；13Hz；2-H)；4.06(s；3H；NCH3)；(2.16(s；3H；-COCH3)；1.74(s；6H；CH3)。1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基[3H]碘咯碘化物502，3，3-三甲基吲哚48(10.0g；62.8mmol)和6-溴己酸49(12.3g；62.8mmol)不加溶劑混和，在氬氣下110℃加熱12h。紫紅色的漿糊狀混合物用乙酸乙酯(2×60ml，漿糊狀物質(zhì)用軟膏刀研磨，傾析出上清)洗滌，然后用丙酮(50ml，漿糊狀物質(zhì)固化)洗滌。將粉紅色固體過濾并在真空下干燥(16.0g；73％)。Cy5COOH化合物51溶于乙酸酐(11ml)中的碘化物47(2.5g；5.3mmol)、溴50(1.87g；5.3mmol)和NaOAc(1.08g；12.1mmol)的混合物120℃加熱25min。冷卻后加入乙醚(200ml)，沉淀物過濾并用乙醚(3×50ml)洗滌。與產(chǎn)物50’對(duì)應(yīng)的固體溶于100mlCH2Cl2中，然后蒸發(fā)。然后將其溶解到15ml醋酸中，120℃攪拌30min。加入200ml乙醚并在燒結(jié)玻璃上過濾后得到產(chǎn)物51相應(yīng)的沉淀物(2.71g；4.44mmol)，產(chǎn)率為84％。1HNMR(CDCl3)δ＝8.03(t；2H；J＝10；11Hz，2-H，4-H)；7.38-6.91(m；9H；Ar-H，3-H)；6.41(d；1H；J＝14Hz；1-H)；6.31(d；1H；J＝13Hz；5-H)；4.07(t；2H，J＝7；7Hz；α-CH2)；3.68(s；3H；NCH3)；2.47(t；2H，J＝7；7Hz；ε-CH2)；1.71(m；18H；CH3，β，γ和δ-CH2)?；衔?6與Cy5COOH51的偶合(產(chǎn)物52)N-甲基嗎啉(NMM，405μl，3.68mmol)加入到溶于15mlCH2Cl2的Cy5COOH51(1.5g；2.46mmol)溶液中。溶液在冰浴中冷卻，放置于氬氣中，然后加入異丁基氯甲酸鹽(494μl，3.81mmol)。攪拌10min后，加入稀釋于8mlCH2Cl2中的氨基26(1.86mg；4.67mmol)。混合物在室溫下持續(xù)攪拌1h30min。加入20mlCH2Cl2，混合物用25ml的NaHCO3(1N)連續(xù)洗滌3次。用Na2CO3干燥后過濾以回收蒸發(fā)的二氯甲烷相。通過急驟層析純化，所用色譜柱徑為45mm，20ml組分。洗脫液為MeOH-DCM10％。產(chǎn)物52相應(yīng)的組分混和后蒸發(fā)干燥得到藍(lán)色固體，將其溶于CH2Cl2。產(chǎn)物52沉淀下來，用乙醚洗滌后得到藍(lán)色產(chǎn)物(1.45g；1.77mmol)，產(chǎn)率為72％。將產(chǎn)物52溶于54ml甲醇中，然后通過安珀萊特IRA900柱(Cl-；15g)?；厥盏募状既芤赫舭l(fā)干燥后得到黏性油狀物，將其溶于CH2Cl2中。蒸發(fā)后可以得到產(chǎn)物52’，產(chǎn)率為87％。醛53乙縮醛化合物52’溶于10mlDCM中，然后加入10ml2N的HCl。溶液劇烈攪拌3h30min。加入20mlDCM后，回收二氯甲烷相，然后用NaHCO2干燥。蒸發(fā)后得到的產(chǎn)物用乙醚洗滌，得到醛53(1.18g；1.46mmol)，產(chǎn)率為90％。腙54將醛化合物53(200mg；0.247mmol)溶解到1ml無水乙醇中，加入一水合肼(15.6μl；0.321mmol)，溶液在室溫下加熱30min。加入8ml乙醚；混合物通過潷析用乙醚連續(xù)洗滌三次，然后在真空下干燥。得到172mg肼54(0.209mmol；85％產(chǎn)率)，儲(chǔ)存在冰箱中。疊氮55將100mgMnO2加入到溶于2mlDMF中的20mg(0.243mmol)腙化合物54溶液中，混合物在室溫下通氬氣劇烈攪拌5min。懸液通過一層硅藻土(厚度2cm)和3(0.5cm)粉末狀分子篩過濾，然后用DMF洗滌。溶液蒸發(fā)后殘留物用乙醚磨碎，將得到的固體干燥，就得到了18mg(0.185mmol；76％)疊氮55。試劑在-20℃條件下穩(wěn)定性大于1月。實(shí)施例24間-氟-EG3-PMDAM的合成如實(shí)施例23所提及的，生物素可以被其他標(biāo)記物替代。本實(shí)施例說明PDAM攜帶的疊氮功能基團(tuán)也可以通過一個(gè)聚乙二醇連接臂連接到這種熒光標(biāo)記物上。合成流程化合物72在通氬氣條件下將異硫氰酸熒光素(250mg，0.64mmol)溶于1.6ml含2％吡啶的無水DMF中。然后將溶于1.6ml無水DMF中的產(chǎn)物69(0.356g，0.81mmol)加入溶液中?；旌衔镌谑覝叵路磻?yīng)3.5h，然后將DMF蒸發(fā)掉，殘留物溶于25ml水中。然后用50mlCH2Cl2抽提三次，蒸發(fā)掉水相。得到255mg(48％)產(chǎn)物72。間-氟-EG3-腙-甲苯磺酰化合物75在回流狀態(tài)下將化合物72(255mg，0.31mmol)溶于1.5ml乙醇中。加入溶于1.5ml乙醇中的對(duì)-甲苯磺酰-肼(69.2mg，0.37mmol)，混合物反應(yīng)6h。將混合物蒸發(fā)干燥，固體用CH2Cl2，水和乙醚洗滌。得到18.5mg(74％)橙色粉末狀產(chǎn)物75。1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝1.6-1.8(m，4H)；2.13(s，1H)；2.28(s，1H)；2.36(s，1H)；2.80(m，1H)；3.07(m，2H)；3.46(m，12H)；6.5-6.7(m，6H)；7.1-8.3(m，9H)。間-氟-EG3-PMDAM化合物74將腙75(176mg，0.18mmol)溶于720μl10％KOH無水甲醇溶液中。溶液在回流中保持3h。等溶液冷卻后出現(xiàn)沉淀，將溶液過濾并蒸發(fā)干燥。殘留物用乙醚洗滌并干燥。NMR分析結(jié)果表明在2.36和2.13ppm(分別對(duì)應(yīng)于甲苯磺酰和腙的甲基)處信號(hào)消失，而在1.96ppm(對(duì)應(yīng)于疊氮的甲基)處出現(xiàn)一個(gè)峰。實(shí)施例25制備疊氮甲基中間體以進(jìn)行下一步的標(biāo)記不用攜帶標(biāo)記物R2的疊氮甲基標(biāo)記試劑直接標(biāo)記而是分兩個(gè)階段間接標(biāo)記可能更有優(yōu)勢。在這種情況下，含有疊氮甲基功能基團(tuán)的標(biāo)記試劑是被預(yù)先功能化了的，就是說其含有能進(jìn)一步與直接或間接標(biāo)記物反應(yīng)的化學(xué)功能基團(tuán)。預(yù)先功能化可以通過將一個(gè)活波的共價(jià)功能基團(tuán)引入到標(biāo)記試劑上，該標(biāo)記試劑可以與抗直接或間接標(biāo)記物的活波共價(jià)功能基團(tuán)抗體反應(yīng)。這些功能基團(tuán)包括親電子的有機(jī)化學(xué)功能基團(tuán)和親核的有機(jī)化學(xué)功能基團(tuán)，或者相反。這種標(biāo)記策略的一個(gè)實(shí)施例在下面的試驗(yàn)方案中進(jìn)行了闡釋其中除了疊氮功能基團(tuán)外，標(biāo)記試劑還含有一個(gè)親電子或親核的功能基團(tuán)W1，該基團(tuán)可與含有功能基團(tuán)W2的標(biāo)記物R2反應(yīng)，W2與W1互補(bǔ)。例如，如果W1是甲基酮或醛功能基團(tuán)，W2就是烷氧氨基功能基團(tuán)。在一種標(biāo)記生物分子如核酸的方法中，先將核酸與含有疊氮甲基功能基團(tuán)的標(biāo)記試劑反應(yīng)，然后標(biāo)記物W2-R2通過功能基團(tuán)W1與核酸反應(yīng)。這種標(biāo)記方法可用于擴(kuò)增一段核酸序列分方法中或進(jìn)行信號(hào)放大的方法中。這種類型的標(biāo)記的其他信息見專利申請(qǐng)WO-A-98/05766，其優(yōu)先申請(qǐng)日為1996年8月2日，以及專利申請(qǐng)WO-A-00/40590，其優(yōu)先申請(qǐng)日為1999年1月5日。實(shí)施例25.1MeCO-PMDAM的合成合成流程產(chǎn)物85，其合成方法已在本實(shí)施例中描述，可以使其通過疊氮甲基功能基團(tuán)與磷酸基團(tuán)的反應(yīng)性來標(biāo)記天然核酸，因此可以引入甲基酮功能基團(tuán)，該基團(tuán)在下一步可用于引入一種含有烷氧氨基基團(tuán)的可檢測分子(熒光素，生物素)。該合成是基于化學(xué)中常用的已知方法。起始材料與標(biāo)記物71和74合成所用的材料相同。第一步包括用芴甲基甲酸酯(Fmoc，99)保護(hù)末端氨基。所以選擇這個(gè)保護(hù)基團(tuán)是基于其穩(wěn)定性和裂解條件的考慮。用前面所述的方法(間-氟-EG3-PMDAM實(shí)施例)制備出被保護(hù)的腙82后，末端氨基的保護(hù)在溫和堿性條件下進(jìn)行以確保腙化合物的穩(wěn)定性。甲基乙酰乙酸用于產(chǎn)生甲基酮功能基團(tuán)，通過末端氨基的乙?；磻?yīng)(見化合物26和36的合成)。疊氮甲基的形成是按照上面所描述的方法進(jìn)行的。實(shí)施例25.2H2NO-PMDAM的合成合成流程產(chǎn)物88，其合成方法已在本實(shí)施例中描述，可以使其通過疊氮甲基功能基團(tuán)與磷酸基團(tuán)的反應(yīng)性來標(biāo)記天然核酸，因此可以引入烷氧氨基功能基團(tuán)，該基團(tuán)在下一步可用于引入一種含有甲基酮基團(tuán)的可檢測分子(熒光素，生物素)。本合成方法是基于前面所述的合成流程，就是說使用前體69；Fmoc的氨基保護(hù)以及甲苯磺酰的腙保護(hù)。烷氧氨基功能基團(tuán)(化合物86)的引入是通過用Fmoc功能基團(tuán)(E.TrévisiolThesis，LEDSSGrenoble，1999)來保護(hù)羧基甲氧基胺(市售的)來實(shí)現(xiàn)的。最后去保護(hù)(化合物88)的條件是溫和的，并且在疊氮甲基形成后立即進(jìn)行。實(shí)施例26PDAM衍生物的制備以放大信號(hào)實(shí)施例26.1雙生物素化標(biāo)記物如[Bio-EG3]2-PDAM的合成合成流程三甲基1，3，5-苯三羧化物56降解成乙醇57將三酯56(12.6g；50.0mmol)溶于100mlTHF中，然后在室溫下加入1.1g(50.5mmol)LiBH4。紅色溶液在氬氣中40-45℃加熱1h。冷卻后(冰上)，通過加入水(200ml)和2NHCl(30ml)小心地破壞氫化物(釋放出氫氣)?？梢杂^察到顏色變成淡黃色。溶液用CH2Cl2(100ml洗一次，然后用50ml洗三次)，有機(jī)相用無水NaHCO3洗滌，用MgSO4干燥，然后將溶劑蒸發(fā)直到獲得油性物質(zhì)(11.1g)。利通過急驟層析在硅色譜柱(直徑＝40mm，洗脫液乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1)上純化得到乙醇57(6.38g，57％)。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.53(t，1H，J＝2Hz)；8.18(d，2H，J＝2Hz)；4.76(s，2H)；3.91(s，6H)，2.30(s，1H)。乙醇57氧化成醛58將乙醇57(5.86g；26.1mmol)溶解到100mlTHF中，然后在室溫下用超過5min的時(shí)間緩慢加入40.0gMnO2。溶液在氬氣下持續(xù)攪拌過夜。溶液通過具有一層硅藻土545的布氏漏斗過濾，用CH2Cl2洗滌，然后將溶劑蒸發(fā)。粗產(chǎn)物固體(4.4g)通過急驟層析純化在硅色譜柱(直徑＝50mm，洗脫液乙酸乙酯/環(huán)己烷＝3/7)純化。得到3.44g(59％)醛化合物58。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝10.11(s，1H)；8.89(t，1H，J＝1Hz)；8.69(d，2H，J＝1Hz)；3.98(s，6H)。乙縮醛59的形成將醛58(3.21g；14.4mmol)溶于30ml甲醇中，然后加入6.0mlTMSC1。溶液在室溫下通氬氣持續(xù)攪拌1h。溶液用200mlCH2Cl2稀釋，加入1MNaHCO3(100ml)攪拌(小心CO2散發(fā))。兩相分離后用CH2Cl2(25ml)洗滌水相三次，有機(jī)相混和后用用MgSO4干燥，然后將溶劑蒸發(fā)。得到3.55g(92％)醛乙縮醛59。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.63(t，1H，J＝2Hz)；8.29(d，2H，J＝2Hz)；5.45(s，2H)；3.93(s，6H)；3.32(s，6H)。二酯59水解成二酸60二酯59(3.18g；11.9mmol)溶解到10mlTHF中，然后加入溶于10ml甲醇中的KOH(2.0g，丸狀占85％)溶液中。置于室溫中15min后將溶劑蒸發(fā)。殘留物溶于水中(50ml)。加入磷酸(大約2.5ml，85％)將pH調(diào)整到3，出現(xiàn)的白色沉淀物在燒結(jié)玻璃(#3)上過濾，用水洗滌冰在真空中干燥。得到2.59g(91％)二酸60。1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝8.43(t，1H，J＝1Hz)；8.15(d，2H，J＝1Hz)；5.53(s，1H)；3.27(s，6H)。三氟乙酰胺62二胺61(66g；0.30mol)溶解到250mlCH2Cl2中，然后滴加乙酰三氟乙酸鹽(11.8ml，0.10mol)，在10℃條件下通氬氣邊攪拌邊加入，滴加時(shí)間要大于5min。在室溫下靜置15min后將溶液轉(zhuǎn)移到分離漏斗中，用水(3×100ml)洗滌，MgSO4干燥，然后將溶劑蒸發(fā)。得到的單胺62的純度大約為85％(19FNMR確定)將化合物儲(chǔ)存在-20℃，不經(jīng)純化就可以使用。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝3.5-3.6(m，12H)；3.42(t，2H，J＝6Hz)；2.75(t，2H，J＝6Hz)；1.81(量化(quantiplet)，2H，J＝6Hz)；1.67(量化，2H，J＝6Hz)；1.30(寬s，2H)。19FNMR(190MHz，CDCl3)δ＝-76.3?；衔?3將羰基二咪唑(CDI，6.32g，80％，31.2mmol)加入到溶于50mlDMF中的D-生物素(6.39g；26.2mmol)懸液中?；旌衔镌?5-60℃通氬氣邊攪拌邊加熱30min。加入的物質(zhì)開始可完全溶解，然后聚集成一團(tuán)白色固體沉淀物(CO2散發(fā)出)。在5mlCH2Cl2的幫助下加入胺(油性)以便漂洗?；旌衔镌?5-60℃加熱3h。在真空(＜1mmHg)中蒸發(fā)掉DMF，殘留物用CH2Cl2(700ml)和2NHCl(100ml)攪拌。兩相通過一層硅藻土545過濾后分離，水相用CH2Cl2(15×100ml)抽提，有機(jī)相混和后用無水NaHCO3和MgSO4干燥，然后將溶劑蒸發(fā)。油性殘留物用150ml乙醚研磨獲得懸液。粘性固體難以過濾。將上清傾析掉，然后用乙醚重復(fù)洗滌。真空干燥后得到9.13g(64％)化合物63。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝3.5-3.6(m，12H)；3.42(t，2H，J＝6Hz)；2.75(t，2H，J＝6Hz)；1.81(量化，2H，J＝6Hz)；1.67(量化，2H，J＝6Hz)；1.30(寬s，2H)?；衔?4將溶于氨水(100ml，22％的水)中的化合物63加入到一個(gè)250ml的帶有隔膜的圓底燒瓶中于55-60℃加熱2h。冷卻后將溶劑蒸發(fā)。殘留物溶于甲醇(20ml)中，通過一個(gè)裝有Dowex21K陰離子樹脂的柱子高度12cm×直徑，通過預(yù)先用1NNaOH(1.5l)，然后是水(1.5l)，最后是甲醇(1.5l)洗滌調(diào)整好OH-的排列]。不含三氟乙酸鹽離子的化合物64最先和200ml甲醇一起通過柱子為第一組分。將其蒸發(fā)后殘留物用50ml乙醚研磨并將上清傾析掉，然后用乙醚連續(xù)洗滌5次。干燥后得到化合物64(6.43g，86％)。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝6.77(t，1H，J＝4Hz)；6.32(s，1H)；5.52(s，1H)4.45(m，1H)；4.28(m，1H)，3.50-3.68(m，12H)；3.30(m，2H)，3.11(m，1H)；2.86(dd，1H，J＝13和5Hz)，2.75(t，2H，J＝13Hz)，2.68(d，1H，J＝13Hz)；2.16(t，2H，J＝7Hz)；1.60-1.85(m，8H)；1.41(m，2H)。2-乙縮醛65將羰基二咪唑(225mg，90％，1.25mmol)加入到溶于二氯乙烷的二酸60(120mg；0.500mmol)懸液中，混合物在55-60℃加熱30min，在氬氣下攪拌。加入胺64(550mg；1.23mmol)，溶液在55-60℃加熱6h。蒸發(fā)后殘留物通過硅柱(直徑25mm，洗脫液甲醇15-30％溶于CH2Cl2中)。得到413mg(75％)化合物65。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.34(s，1H)；8.06(s，2H)；7.87(m，2H)；6.85(m，2H)；6.60(s，2H)；5.93(s，2H)5.40(s，1H)；4.45(m，2H)；4.27(m，2H)，3.43-3.68(m，24H)；3.31(s，6H)；3.25(m，4H)，3.08(m，2H)；2.83(dd，2H，J＝13和5Hz)，2.70(t，2H，J＝13Hz)；2.13(t，4H，J＝7Hz)；1.89(quintuplet，4H，J＝7Hz)；1.55-1.70(m，12H)；1.37(m，4H)。2-醛66將溶解到35ml甲醇中的乙縮醛65(413mg；0.376mmol)用2NHCl(0.5ml)處理。蒸發(fā)后用乙醚洗滌，得到醛66(0.37g，90％)。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝10.11(s，1H)；8.82(t，2H，J＝6Hz)；8.62(s，1H)，8.47(s，2H)；7.73(t，2H，J＝5Hz)；4.30(m，2H)；4.11(m，2H)，3.30-3.60(m，24H)；3.06(m，6H)；2.80(dd，2H，J＝12和5Hz)，2.56(t，2H，J＝12Hz)；2.03(t，4H，J＝7Hz)；1.78(quintuplet，4H，J＝7Hz)；1.35-1.60(m，12H)；1.28(m，4H)。2-PDAM67用制備疊氮甲烷(實(shí)施例1)的方法將醛66轉(zhuǎn)化成疊氮甲烷67。該試劑的穩(wěn)定性在-20℃大于1月。實(shí)施例26.2間-Bio7-EG3-PMDAM的合成合成流程間-Bio7-EG3-PMDAM80EG3-苯乙酮化合物76將3，6，9-三氧-1，11-十一烷二酸(EG3，12.64ml，74mmol)在氬氣下溶解到80ml無水DMF中，在冰浴中冷卻。將二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC，11.45g，55.5mmol)溶解到無水20mlDMF中，然后緩慢加到上述溶液中。30min后加入3-氨基苯乙酮(5.0g，37mmol)，反應(yīng)在室溫下通氬氣進(jìn)行1h。然后在真空中將DMF蒸發(fā)，加入70mlCH2Cl2。溶液過濾后用3×25ml1％乙酸抽提。將水相混和后用25mlCH2Cl2洗滌。有機(jī)相混和后用無水硫酸鈉干燥并蒸發(fā)干。產(chǎn)物從MeOH:HaOpair重結(jié)晶。因此得到8.74g(70％)產(chǎn)物76。1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝2.55(s，3H)；3.5-3.7(m，8H)；4.0(s，2H)；4.1(s，2H)；7.45(t，1H)；7.65(d，1H)；7.90(d，2H)；8.2(s，1H)；9.8(s，1H)。(NH2)7-EG3-苯乙酮化合物77將產(chǎn)物76(120mg，0.35mmol)在氬氣下溶解到15ml無水DMF中，在冰上冷卻，然后加入DCC(110mg，0.53mmol)。30min后將此溶液緩慢加到一種市售的dendrimer(一種樹枝狀物)″StarburstPAMAMDendrimer，Generation1″(Aldrich，StQuentinFallavier)(1g，0.71mmol，溶于5ml甲醇中)溶液表面，劇烈攪拌。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1h，將混合物蒸發(fā)。殘留物收集到10mlCH2Cl2中，用30ml1％的乙酸抽提兩次。Biot7-EG3-苯乙酮化合物78將D-生物素(1.73g，7.08mmol)在氬氣下溶解到80ml無水DMF中，溶液在冰上冷卻。相繼加入N-甲基嗎啉(NMM，856μl，7.7mmol)和異丁基氯甲酸酯(1022μl，7.7mmol)。30min后加入產(chǎn)物77(1.13g，0.7mmol，溶于5ml甲醇中)，反應(yīng)在冰上置于氬氣中進(jìn)行3h?；旌衔镌谡婵罩袧饪s到50ml，然后加入100mlCH2Cl2。過濾后得到的沉淀物用乙醚洗滌，在真空中干燥，得到1.3g白色粉末形式的產(chǎn)物78。Biot7-EG3-腙化合物79在回流中將化合物78(300mg，0.09mmol)溶解到10ml無水乙醇中。加入一水合肼e(20ml，0.40mmol)，反應(yīng)在回流中進(jìn)行3小時(shí)。冷卻后沉淀形成，將沉淀過濾，用乙醚洗滌并在真空中干燥。因而得到109mg(36％)白色粉末狀的產(chǎn)物79。Biot7-EG3-PMDAM化合物80將腙79(100mg，0.03mmol)溶于5ml70℃的無水DMF中。等混合物降到室溫后加入MnO2(31mg，0.36mmol)。反應(yīng)進(jìn)行10min，用含有硅藻土(0.5cm)和粉末狀分子篩(0.5cm)的燒結(jié)玻璃過濾去除氧化鎂。過濾物蒸發(fā)干燥，用乙醚洗滌并在真空中干燥。因此得到78mg(78％)產(chǎn)物80。Dendrimers是一種樹枝狀分子，在其末端含有幾種活波基團(tuán)如氨基，羧基，羥基等(綜述參見Newcome等，(1996)DendriticMolecules；Concept，Syntheses，Perspectives.VCHEd.，Weinheim，Germany)。這些分子的合成在現(xiàn)在很容易控制，有許多dendrimers已被化學(xué)制造企業(yè)推上了市場。選擇PAMAM是基于其穩(wěn)定性、可溶性和柔韌性的考慮，因?yàn)樵谑袌錾嫌泻脦追N具有不同末端數(shù)目和類型的這類分子。通過″PAMAMGeneration1″可以在一個(gè)疊氮甲基基團(tuán)上添加上7種標(biāo)記物分子(只需一個(gè)合成步驟)。實(shí)施例27用間-BioPMDAM通過兩步標(biāo)記和片段化DNA擴(kuò)增子DNA擴(kuò)增子是按照實(shí)施例5描述的方法制備的。兩種標(biāo)記反應(yīng)方法如下。a.標(biāo)記和片段化分兩步進(jìn)行將10μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和77μl無DNA酶和RNA酶的水加入到10μlPCR產(chǎn)物中。溶液在95℃培養(yǎng)10min，然后加入3μl0.1MHCl再于95℃培養(yǎng)10min。b.標(biāo)記和片段化在一步中完成將10μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)、5μl0.1M的HCl和75μl無DNA酶和RNA酶的水加入到10μlPCR產(chǎn)物中。溶液在60℃培養(yǎng)30min。試驗(yàn)方法的其他步驟與實(shí)施例9相同。結(jié)果表13在兩個(gè)不同的步驟和一個(gè)步驟中進(jìn)行標(biāo)記和片段化的比較研究如表13所顯示的，用一個(gè)步驟的方案所得到的結(jié)果是令人滿意的，而分兩步進(jìn)行標(biāo)記和片段化效果更好。這個(gè)實(shí)施例說明標(biāo)記和裂解步驟可以分開進(jìn)行以便根據(jù)不同的靶位提高標(biāo)記效率。實(shí)施例28在不同的反應(yīng)體系中進(jìn)行DNA擴(kuò)增子的標(biāo)記和片段化DNA擴(kuò)增子是按照實(shí)施例5描述的方法制備的。三種標(biāo)記反應(yīng)方法如下。a.在250μl反應(yīng)體系中標(biāo)記和片段化將75μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和102.5μl無DNA酶和RNA酶的水加入到50μlPCR產(chǎn)物中。溶液在95℃培養(yǎng)25min，然后加入22.5μl0.1MHCl再于95℃培養(yǎng)5min。b.在200μl反應(yīng)體系中標(biāo)記和片段化將75μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和52.5μl無DNA酶和RNA酶的水加入到50μlPCR產(chǎn)物中。溶液在95℃培養(yǎng)25min，然后加入22.5μl0.1MHCl再于95℃培養(yǎng)5min。c.在150μl反應(yīng)體系中標(biāo)記和片段化將75μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和2.5μl無DNA酶和RNA酶的水加入到50μlPCR產(chǎn)物中。溶液在95℃培養(yǎng)25min，然后加入22.5μl0.1MHCl再于95℃培養(yǎng)5min。試驗(yàn)方法的其他步驟與實(shí)施例9相同。結(jié)果表14按照不同的反應(yīng)體系標(biāo)記和片段化從信號(hào)強(qiáng)度和同源性百分率來看所有試驗(yàn)方案得到的結(jié)果都是令人滿意的。而且盡管反應(yīng)體系從150μl變化到250μl，所得到的結(jié)果是一樣的。本實(shí)施例說明標(biāo)記試驗(yàn)的反應(yīng)體系具有較好的靈活性，可以用不同體積的體系，尤其是不同體積的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例29片段化前進(jìn)行純化的試驗(yàn)方案和片段化后進(jìn)行純化的試驗(yàn)方案比較DNA擴(kuò)增子是按照實(shí)施例5描述的方法制備的。兩種標(biāo)記反應(yīng)方法如下。a.標(biāo)記、純化，然后片段化DNA擴(kuò)增子將10μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和80μl無DNA酶和RNA酶的水加入到10μlPCR產(chǎn)物中。溶液在95℃培養(yǎng)10min。純化按照實(shí)施例9描述的方法進(jìn)行。在純化后的標(biāo)記的DNA擴(kuò)增子溶液中加入6μl0.1MHCl，再于95℃培養(yǎng)10min。加入400μl在95℃預(yù)熱10min的雜交緩沖液。雜交緩沖液的組成和其余的試驗(yàn)步驟與實(shí)施例9相同。b.標(biāo)記、片段化，然后純化DNA擴(kuò)增子將10μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和77μl無DNA酶和RNA酶的水加入到10μlPCR產(chǎn)物中。溶液在95℃培養(yǎng)10min。然后加入3μl0.1MHCl，再于95℃培養(yǎng)10min。其余的試驗(yàn)步驟與實(shí)施例9相同。結(jié)果表15片段化前進(jìn)行純化的試驗(yàn)方案和片段化后進(jìn)行純化的試驗(yàn)方案比較表15中所顯示的結(jié)果說明純化步驟可以在標(biāo)記和片段化步驟之間進(jìn)行。而且在標(biāo)記和片段化步驟之間進(jìn)行純化可以使在裂解期間進(jìn)行變性以及將所有的標(biāo)記擴(kuò)增子片段雜交到芯片上成為可能。實(shí)施例302-硝基-對(duì)-BioPDAM的合成合成流程醛基的保護(hù)將5g(25.5mmol)2，4-二氮苯甲醛溶解到250ml甲苯仲，加入20ml乙烯甘油和150mg副甲苯磺酸?；旌衔镌诨亓髦屑訜?h，水在Dean-Stark系統(tǒng)回收。混合物用150mlEtOAc和100ml水處理，溶液用乙酸乙酯抽提兩次，有機(jī)相用MgSO4干燥，然后蒸發(fā)。得到產(chǎn)物100相應(yīng)的油性物質(zhì)，用于下一步的反應(yīng)。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.70(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；8.44(dd，1Haro，J＝2Hz，J＝6Hz，H5)；8.02(d，1Haro，J＝8Hz，H6)；6.49(s，1H，CH)；4.12-4.06(m，4H，CH2-CH2)。二氮衍生物100的分解被保護(hù)的2，4-二氮苯甲醛(6.4g；25.5mmol)溶解到乙醇-水混合物(6/1)中，然后加入二倍當(dāng)量的無水Na2S(12.3g；51.1mmol)。反應(yīng)混合物加熱30min。蒸發(fā)后用二氯甲烷抽提。干燥并過濾后將反應(yīng)介質(zhì)蒸發(fā)以收獲油性物質(zhì)，產(chǎn)物在硅色譜柱上直接純化(環(huán)己烷/乙酸乙酯60/40)。得到化合物101，產(chǎn)率為45％化合物101熔點(diǎn)58-60℃.1HNMR(200MHz，CDCl3)7.49(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.09(d，1Haro，J＝2Hz，H6)；6.80(dd，1Haro，J＝2Hz，J＝6Hz，H5)；6.27(s，1H，CH)；3.99-3.97(m，4H，CH2-CH2)。與生物素偶合將D-生物素(1.0g；4.1mmol)溶解到20ml無水DMF和600μlN-甲基嗎啉中。在氬氣下加入異丁基氯甲酸酯(700μl；5.5mmol)，同時(shí)在冰浴上冷卻。混合物持續(xù)攪拌5min，然后加入1g(4.75mmol)化合物101和500μlN-甲基嗎啉。溶液在室溫中持續(xù)攪拌4h，然后蒸發(fā)干燥。得到的油性物質(zhì)直接通過硅色譜柱，洗脫溶劑為MeOH-DCM7％，然后是MeOH-DCM10％。得到產(chǎn)物102(1.1g；2.52mmol)，產(chǎn)率為62％。1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.40(s，1H，NH-CO)；8.31(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.77(dd，1Haro，J＝2Hz，J＝6Hz，H5)；7.68(d，1Haro，J＝2Hz，H6)；6.43(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.36(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.23(s，1H，CH)；4.28(m，1H，CH2-CH-NH)；4.14(m，1H，CH-CH-NH)；3.92(s，4H，CH2-CH2)；3.12(m，1H，CH-S)；2.85和2.76(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.29(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.61-1.39(m，6H，(CH2)3)。乙縮醛的去保護(hù)將產(chǎn)物102(768mg；1.76nnnol)懸于25mlTHF中。加入4ml2N的H2SO4后全部溶解?；旌衔锍掷m(xù)攪拌2h。蒸發(fā)后在燒結(jié)玻璃漂洗和洗滌。得到黃色粉末狀的產(chǎn)物103(694mg)，產(chǎn)率為90％。熔點(diǎn)165℃.1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.69(s，1H，NH-CO)；10.09(s，H，CHO)；8.43(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.91(s，2Haro，H5和H6)；6.42(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；δ＝6.23(s，1H，CH)；4.29(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.84和2.78(ABX系統(tǒng).2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.29(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.61-1.39(m，6H，(CH2)3)。腙104的制備將醛103懸于乙醇中，懸液加熱到80℃。加入肼后全部溶解，溶液立刻變成橙色。5min后沉淀形成?；旌衔镞厰嚢柽吋訜?h。在燒結(jié)玻璃上過濾后將沉淀物干燥。得到產(chǎn)物104(700mg；690mmol)，產(chǎn)率為98％。熔點(diǎn)169℃.1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.31(s，1H，NH-CO)；8.31(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.96(s，H，CHO)；7.87(d，1Haro，J＝2Hz，H6)；7.68(dd，1Haro，J＝2Hz，J＝6Hz，H5)；7.31(s，2H，NH2)；6.42(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.34(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.29(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.84和2.78(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.29(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.61-1.39(m，6H，(CH2)3)。疊氮105的制備將化合物104(200mg；0.492mmol)溶于8mlDMF中。加入400mgMnO2?；旌衔飫×覕嚢?0min。在含有硅藻土(厚度2cm)和粉末狀分子篩3(0.5cm)的微孔上過濾。蒸發(fā)干燥后用乙醚洗滌。混和物再于微孔上過濾。得到橙色粉末狀化合物105(180mg；0.445mmol)，產(chǎn)率為98％。熔點(diǎn)155℃.1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.21(s，1H，NH-CO)；8.60(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.77(d，1Harro，J＝6Hz，H5)；7.22(d，1Haro，J＝6Hz，H6)；6.60(s，H，CH-N)；6.41(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.33(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.29(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.84和2.78(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.29(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.61-1.39(m，6H，(CH2)3)?；衔?05的反應(yīng)性用尿嘧啶3’-單磷酸鑒定，用毛細(xì)管電泳監(jiān)測。分析條件與實(shí)施例6.1相同。結(jié)果顯示化合物的半衰期是45分鐘。試劑在-20℃條件下的穩(wěn)定性大于1個(gè)月。實(shí)施例31用標(biāo)記試劑2-硝基-對(duì)-BioPDAM標(biāo)記和片段化DNA擴(kuò)增子按照實(shí)施例30所描述的方法制備2-硝基-對(duì)-BioPDAM衍生物。按照實(shí)施例5描述的方法用PCR制備DNA擴(kuò)增子。兩種標(biāo)記反應(yīng)如下a.用2-硝基-對(duì)-BioPDAM試劑標(biāo)記將2μl2-硝基-對(duì)-BioPDAM(100mM，溶于DMSO中)、5μl0.1MHCl和83μl無DNA酶和RNA酶的水加入到10μlPCR產(chǎn)物中。溶液在60℃培養(yǎng)30min。b.用間-bioPMDAM試劑標(biāo)記將2μl間-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)、5μl0.1MHCl和83μl無DNA酶和RNA酶的水加入到10μlPCR產(chǎn)物中。溶液在60℃培養(yǎng)30min。試驗(yàn)方案的其他步驟與實(shí)施例9相同。結(jié)果<tablesid="table15"num="015"><tablewidth="745">所用的試驗(yàn)方案同源性(％)I(rfu)B(rfu)I/Ba.用2-硝基-對(duì)-BioPDAM試劑標(biāo)記100.02439289927.1b.用間-bioPMDAM試劑標(biāo)記98.92188377428.3</table></tables>表16用2-硝基-對(duì)-BioPDAM衍生物和間-bioPMDAM衍生物進(jìn)行標(biāo)記的比較研究從標(biāo)記強(qiáng)度和同源性百分率來看用2-硝基-對(duì)-BioPDAM試劑標(biāo)記DNA具有優(yōu)勢。實(shí)施例32在疊氮甲基功能基團(tuán)和苯核之間插入雙鍵，使DAM遠(yuǎn)離，以及特別適用于這種遠(yuǎn)離的分子的合成本實(shí)施例的目的在于使芳香族結(jié)構(gòu)的疊氮(DAM)功能基團(tuán)遠(yuǎn)離以便在磷酸基團(tuán)烷基化時(shí)以及標(biāo)記核酸與其互補(bǔ)序列雜交時(shí)盡量減少位阻效應(yīng)。合成流程為了羥基丁醛反應(yīng)以形成(對(duì)-甲氧羰基)苯乙烯基甲基酮89，用乙酰醋酸乙酯提高亞甲基質(zhì)子的酸性，從而促進(jìn)對(duì)亞?；墓?，進(jìn)而消除H2O(通過雙鍵與芳香環(huán)的結(jié)合而促進(jìn))，以及由于堿性介質(zhì)而水解去羧基化。本合成流程的其他步驟與其他實(shí)施例相同。終產(chǎn)物對(duì)-Bio-EG3-SMDAM90在疊氮甲基核芳香環(huán)之間多了兩個(gè)碳原子，這就限制了出現(xiàn)位阻效應(yīng)，通過與芳香系統(tǒng)連接從而保證了疊氮甲基的穩(wěn)定性。實(shí)施例33攜帶疊氮基團(tuán)的固體支持物上核酸的捕獲與檢測研究攜帶疊氮甲基基團(tuán)的樹脂的反應(yīng)性來確定其與核酸結(jié)合的能力。4-(重氮甲基)苯氧基甲基聚苯乙烯(參見17338，F(xiàn)luka)是一種樹脂，已有文獻(xiàn)描述了它和羧基，尤其是蛋白質(zhì)上的羧基結(jié)合的能力(G.Bhalay，A.R.Dunstan.TetrahedronLett.39，7803-1998)，但是沒有描述其與DNA分子結(jié)合的能力。我們檢測了用這種試劑捕獲核酸的能力，通過比色試驗(yàn)來觀察。本實(shí)驗(yàn)是用HLA-DR寡-檢測試劑盒(oligo-detectionkit)(參見33202，bioMerieux，F(xiàn)rance，基本原理見專利EP549776-B1)的一部分試劑來做的，該試劑盒可以檢測在微孔板上通過PCR擴(kuò)增的核酸，用比色方法來讀取數(shù)據(jù)。根據(jù)所描述的試驗(yàn)方法，通過PCR擴(kuò)增的核酸同時(shí)與檢測的樹脂和對(duì)-Bio-EG3-PDAM分子反應(yīng)，對(duì)-Bio-EG3-PDAM的合成在實(shí)施例20中已經(jīng)有描述。如果DNA與兩個(gè)化合物上的疊氮甲基功能基團(tuán)反應(yīng)，經(jīng)過洗滌和去除未共價(jià)結(jié)合的分子以后，用包括與鏈親和素結(jié)合的酶的比色反應(yīng)就可以觀察到結(jié)果。鏈親和素與辣根過氧化物酶結(jié)合，后者可以將鄰苯二胺分子(試劑盒的Color1試劑)降解成可在492nm處被檢測到的化合物。實(shí)施例33.1DNA的捕獲與檢測將50μl按照實(shí)施例5描述的方法擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物加到400μl純水(Sigma)和5μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM混合物中，然后加入10mg樹脂在60℃培養(yǎng)30min。然后用500μlPBSTween緩沖液(試劑盒的Color0HIA試劑，PBSpH7.0；1％Tween，0.2g/lBND；0.01g/lCiproflaxacin)洗滌，然后將樹脂懸于100μlPBSTween和250μl添加以1/10000稀釋的鏈親和素HRP(S-911，MOLECULARPROBES，EUGENE，OR，USA)的鏈親和素雜交緩沖液(PBSpH7.00.5％TWEEN)中。反應(yīng)混合物在室溫下培養(yǎng)30min。然后用500μlPBSTween緩沖液洗滌樹脂三次，在發(fā)色試劑(1Color1Tablet，鄰-苯二胺鹽酸，稀釋在5mlColor2緩沖液中，100mM磷酸鈉，50mM枸櫞酸，0.03％H2O2)存在的條件下于室溫下培養(yǎng)。在暗處培養(yǎng)20min后，培養(yǎng)液用50μlH2SO4(1.8NColor3試劑)終止反應(yīng)。上清液用移液管吸出放到微孔板中，讀取反應(yīng)介質(zhì)在492nm處的吸光度值。實(shí)施例33.2無核酸對(duì)照將10mg樹脂加入到添加5μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM的425μl純水(Sigma)中，60℃培養(yǎng)30min。然后用500μlPBS緩沖液洗滌樹脂。樣品的其余處理方式與實(shí)施例33.1相同。實(shí)施例33.3無模板的PCR產(chǎn)物對(duì)照將10mg樹脂加入到添加5μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM和50μlPCR產(chǎn)物的400μl純水中，60℃培養(yǎng)30min，其中的PCR產(chǎn)物是用25μl純水代替相同體積的DNA模板所擴(kuò)增出來的。然后用500μlPBS緩沖液洗滌樹脂。樣品的其余處理方式與實(shí)施例33.1相同。實(shí)施例33.4無顯色分子的PCR對(duì)照將10mg樹脂加入到添加5μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM的400μl純水中，60℃培養(yǎng)30min。然后用500μlPBSTween緩沖液洗滌樹脂。樣品的其余處理方式與實(shí)施例33.1相同。實(shí)施例33.5非捕獲核酸對(duì)照將10mg樹脂加入到添加5μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM的400μl純水中，60℃培養(yǎng)30min。然后用500μlPBSTween緩沖液(試劑盒的Color0HIA試劑，PBSpH7.0；1％Tween，0.2g/lBND；0.01g/lCiproflaxacin)洗滌樹脂。然后將樹脂懸于l00μlPBSTween和250μl添加以1/10000稀釋的鏈親和素HRP的鏈親和素雜交緩沖液中。加入50μl按如下方法制備的DNA樣品。將5μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM和70μl純水加入到25μl按照實(shí)施例5描述的方法通過PCR制備的DNA中?；旌衔镌?0℃培養(yǎng)30min，然后用QIAquick柱(NucleotideRemovalKit，Qiagen，Hilden，Germany)按照廠商提供的說明書去除多余的標(biāo)記物，最后洗脫出50μl體積的液體。反應(yīng)混合物在室溫下培養(yǎng)30min，然后按照實(shí)施例33.1描述的方法處理。結(jié)果條件在492nm處的吸光度值Ex.33.1捕獲在樹脂上的DNA527Ex.33.2無核酸249Ex.33.3無模板的PCR產(chǎn)物261Ex.33.4無標(biāo)記物對(duì)照264Ex.33.5非捕獲核酸249表17攜帶疊氮甲基基團(tuán)的樹脂的反應(yīng)性研究在表17中，高比色值說明了在反應(yīng)介質(zhì)中有高濃度的酶，相應(yīng)的就會(huì)有大量攜帶生物素衍生物的核酸存在。對(duì)照組的數(shù)據(jù)說明信號(hào)不是由于DNA非特異吸附到小珠上，不是對(duì)-Bio-EG3-PDAM與樹脂反應(yīng)，也不是鏈親和素HRP吸附到樹脂上，而是由于有被共價(jià)捕獲并被對(duì)-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記的核酸的存在。實(shí)施例34標(biāo)記PCR產(chǎn)物以便其被捕獲和在微孔板上檢測本實(shí)施例所要證實(shí)的是僅用一種類型的攜帶疊氮甲基功能基團(tuán)的分子就可能標(biāo)記DNA分子，從而在一步中就可以完成這種核酸分子的捕獲和檢測。本試驗(yàn)用HLA-DR寡-檢測試劑盒(參見33202，bioMérieux)的一部分試劑進(jìn)行，用比色方法檢測微孔板上通過PCR擴(kuò)增的核酸。根據(jù)所描述的試驗(yàn)方法，對(duì)-Bio-EG3-PDAM與通過PCR擴(kuò)增的核酸反應(yīng)，對(duì)-Bio-EG3-PDAM的合成在實(shí)施例20中已經(jīng)有描述。DNA與分子的疊氮甲基反應(yīng)，因此在其磷酸基團(tuán)上被連接上生物素。因而有可能通過在微孔板上培養(yǎng)來捕獲核酸，其中微孔板上吸附有鏈親和素，然后通過比色反應(yīng)就可以觀察。所用的檢測試劑也是鏈親和素分子，它可以與辣根過氧化物酶(HRP)反應(yīng)。在適當(dāng)條件下，過氧化物酶可以將鄰苯二胺分子(試劑盒的Color1試劑)降解成可在492nm處被檢測到的化合物。實(shí)施例34.1在微孔板上捕獲和檢測來源于PCR反應(yīng)的DNA將10μl用PCR擴(kuò)增得到的DNA加入到添加10μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM的80μl純水(Sigma)中，60℃培養(yǎng)30min。標(biāo)記后DNA用QIAquick柱(NucleotideRemovalKit，Qiagen，Hilden，Germany)按照廠商推薦的方法純化，將最終洗脫下來的物質(zhì)溶解到50μlEB緩沖液(10mMTrisEDTA，pH8.5)中。將20μl這種洗脫液稀釋到180μl添加以1/10000稀釋的鏈親和素HRP(S-911，MolecularProbes，Eugene，OR，USA)的PEG緩沖液(0.1MNaPO3；0.5MNaCl；0.65％Tween20；0.14mg/ml鮭精DMA(Gibco)；2％PEG4000)中。在鏈親和素包被的Combiplate8(參見95029263，Labsystem，Helsinki，F(xiàn)inland)的孔中或Maxisorb條帶(Maxisorbstrip)(Nunc，Denmark)的對(duì)照孔中加入100μl上述液體。實(shí)施例34.2對(duì)照組對(duì)照樣品同時(shí)按照下列方式制備A.無DNA的標(biāo)記對(duì)照將添加10μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM的90μl純水(Sigma)在60℃培養(yǎng)30min。然后B.無標(biāo)記物的標(biāo)記對(duì)照將10μl按照實(shí)施例5描述的方法通過PCR制備的DNA加入到90μl純水中，60℃培養(yǎng)30min。然后將混合物按照實(shí)施例34.1描述的方法處理。然后將所有的條帶用含有鏈親和素HRP的100μlPBSTween緩沖液(試劑盒的Color0HLA試劑，PBSpH7.0；1％Tween，0.2g/lBND；0.01g/lCiproflaxacin)洗滌三次，加入100μl比色試劑(1Color1片，鄰苯二胺鹽酸，稀釋到5mlColor2緩沖液中，100mM磷酸鈉，50mM檸檬酸，0.03％H2O2)，在暗處培養(yǎng)20min，然后用50μlH2SO2(1.8NColor3試劑)終止反應(yīng)。然后測量反應(yīng)介質(zhì)在492nm處的吸光度值。結(jié)果表18用對(duì)-Bio-EGB-PDAM標(biāo)記被捕獲的DNA的檢測表18中的試驗(yàn)結(jié)果表明用對(duì)-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記的DNA在微孔板上僅通過一步就可以被捕獲和檢測。如對(duì)照組所提示的，對(duì)照組的信號(hào)只是由于DNA而產(chǎn)生的，不是來自于核酸對(duì)微孔板壁的非特異吸附，也不是來自于核酸與鏈親和素的非特異結(jié)合，或者鏈親和素HRP與非標(biāo)記DNA或微孔板塑料的非特異反應(yīng)。實(shí)施例35雙標(biāo)記PCR產(chǎn)物以利于其在微孔板類的固體支持物上被捕獲和檢測本實(shí)施例所描述的是用兩種攜帶疊氮甲基功能基團(tuán)的分子在一個(gè)步驟中標(biāo)記DNA分子，以便于其在微孔板上被捕獲和檢測。試驗(yàn)所用的一部分試劑來自于HLA-DR寡-檢測試劑盒，通過簡單的比色方法來檢測在微孔板上的PCR擴(kuò)增核酸。上文中所描述的1-嵌二萘基重氮甲烷(PDAM)和對(duì)-Bio-EG3-PDAM同時(shí)于PCR擴(kuò)增的核酸反應(yīng)。如果DNA與兩個(gè)化合物的疊氮甲基基團(tuán)反應(yīng)，DNA就可以結(jié)合到攜帶抗-芘抗體的支持物上，因此就有可能通過一種與辣根過氧化物酶結(jié)合的鏈親和素分子來檢測它。該酶作為一種顯色劑可以將鄰-苯二胺分子降解成可在492nm波長下被檢測的化合物。實(shí)施例35.1雙標(biāo)記DNA并在微孔板上檢測將抗芘抗體吸附到8-孔Maxisorp條帶，室溫下培養(yǎng)過夜。每孔加入100μl溶液，該溶液是將1.1μl抗芘抗體稀釋到100μl碳酸氫鹽緩沖液(0.05MpH9.6)中。這種所謂的兔坑芘抗體(參見YSRT-AHP236)可以從AccurateChemical&amp;Scientific(Westbury，NewYork，UnitedStatesofAmerica)購買到。當(dāng)然也可以用其他公司的抗體來完成本試驗(yàn)，并且用其他公司的抗體所得到的結(jié)果與本實(shí)施例所得到的結(jié)果沒有明顯差異。將10μl按照實(shí)施例5描述的方法通過PCR制備的DNA加入到40μl純水(Sigma)、10μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM、2μlPDAM(P-1405，1-嵌二萘基重氮甲烷，MolecularProbes，Eugene，OR，USA)和38μlDMSO中標(biāo)記，60℃培養(yǎng)30min。標(biāo)記完成后，DNA用QIAquick試劑盒(QIAGEN)純化，最后的洗脫物溶解到50μlEB緩沖液(10mMTrisEDTA，pH8.5)中。將20μl此種洗脫物稀釋到添加以1/10000稀釋的鏈親和素HRP(S-911，MOLECULARPROBES，EUGENE，OR，USA)的180μlPEG緩沖液(0.1MNaPO3；0.5MNaCl；0.65％Tween20；0.14mg/ml鮭精DNA(Gibco)；2％PEG4000)中。然后將100μl此種制備液加入到吸附的Maxisorp條帶孔或非吸附對(duì)照孔中，37℃培養(yǎng)1h。實(shí)施例35.2準(zhǔn)備對(duì)照組對(duì)照樣品同時(shí)按照下列方式制備A.單獨(dú)用對(duì)-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記的對(duì)照將10μl按照實(shí)施例5描述的方法通過PCR制備的DNA加入到添加10μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM的90μl純水中標(biāo)記，60℃培養(yǎng)30min。標(biāo)記完成后，DNA用QIAquick試劑盒純化，最后的洗脫物溶解到50μlEB緩沖液中。將20μl此種洗脫物稀釋到添加以1/10000稀釋的鏈親和素HRP的180μlPEG緩沖液中。然后將100μl此種制備液加入到吸附的Maxisorp條帶孔或非吸附對(duì)照孔中，37℃培養(yǎng)1h。B.單獨(dú)用PDAM標(biāo)記的對(duì)照將10μl按照實(shí)施例5描述的方法通過PCR制備的DNA加入到添加2μlPDAM和38μlDMSO的90μl純水中標(biāo)記，60℃培養(yǎng)30min。標(biāo)記完成后，DNA用QIAquick試劑盒純化，最后的洗脫物溶解到50μlEB緩沖液中。將20μl此種洗脫物稀釋到添加以1/10000稀釋的鏈親和素HRP的180μlPEG緩沖液中。然后將100μl此種制備液加入到吸附的Maxisorp條帶孔或非吸附對(duì)照孔中，37℃培養(yǎng)1h。C.無標(biāo)記對(duì)照將10μl按照實(shí)施例5描述的方法通過PCR制備的DNA加入到100μl純水中標(biāo)記，60℃培養(yǎng)30min。標(biāo)記完成后，DNA用QIAquick試劑盒純化，最后的洗脫物溶解到50μlEB緩沖液中。將20μl此種洗脫物稀釋到添加以1/10000稀釋的鏈親和素HRP的180μlPEG緩沖液中。然后將100μl此種制備液加入到吸附的Maxisorp條帶孔或非吸附對(duì)照孔中，37℃培養(yǎng)1h。所述條帶用100μlPBSTween緩沖液(Color0)洗滌三次，然后通過加入100μl顯色試劑(Color2)在暗處培養(yǎng)20min就可以觀察到鏈親和素HRP的存在，用50μlH2SO2(Color3)終止反應(yīng)。然后測量反應(yīng)介質(zhì)在492nm處的吸光度值。結(jié)果表19用PDAM和對(duì)-Bio-EG3-PDAM雙標(biāo)記DNA表19中的結(jié)果清楚地表面強(qiáng)信號(hào)是來自于被孔壁上抗芘抗體捕獲的同時(shí)也是被連接的鏈親和素HRP標(biāo)記的DNA。對(duì)照組的結(jié)果說明這種DNA檢測是特異的，高強(qiáng)度信號(hào)不是來自于DNA或鏈親和素HRP與塑料的非特異吸附，也不是來自于酶與捕獲DNA的非特異結(jié)合。因此本實(shí)施例說明在一個(gè)步驟中雙標(biāo)記DNA是可能的，這種雙標(biāo)記用于同時(shí)捕獲和檢測DNA也是可能的。實(shí)施例36標(biāo)記PCR產(chǎn)物的同時(shí)用互補(bǔ)核酸探針捕獲和標(biāo)記本實(shí)施例在于證明通過與DNA上的磷酸基團(tuán)反應(yīng)的疊氮甲基功能基團(tuán)特異性地檢測DNA是可能的，所述DNA是被捕獲在固體支持物的表面。本試驗(yàn)用HLA-DR寡-檢測試劑盒(參見33202，bioMérieux，F(xiàn)rance)的一部分試劑進(jìn)行，用比色方法檢測微孔板上通過PCR擴(kuò)增的核酸。根據(jù)所描述的試驗(yàn)方法，對(duì)-Bio-EG3-PDAM與通過PCR擴(kuò)增的核酸反應(yīng)。DNA與分子的疊氮甲基反應(yīng)，因此在其磷酸基團(tuán)上被連接上生物素。因而有可能通過在微孔板上培養(yǎng)來捕獲核酸，其中微孔板上吸附有鏈親和素，然后一個(gè)含有與捕獲序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針來檢測DNA，該探針上連接有辣根過氧化物酶，該酶可以將鄰苯二胺分子(試劑盒的Color1試劑)降解成可在492nm處被檢測到的化合物。實(shí)施例36.1在微孔板上捕獲和特異性檢測DNA將10μl用PCR擴(kuò)增得到的DNA與20μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM在60℃培養(yǎng)30min以標(biāo)記DNA，設(shè)雙復(fù)孔。標(biāo)記后DNA用QIAquick柱(NucleotideRemoval試劑盒，Qiagen，Hilden，Germany)按照廠商推薦的方法純化，將最終洗脫下來的物質(zhì)溶解到50μlEB緩沖液(10mMTrisEDTA，pH8.5)中。將85μl這種洗脫液用8.5μl試劑R4(2NNaOH)在室溫下培養(yǎng)5min使之變性，然后用8.5μl試劑R5(2N乙酸)中和?；旌衔镏屑尤?50μl雜交緩沖液(R6-10mMTris-HCl，pH7.0，0.2g/lBND，0.01g/lCiproflaxacin)和85μl檢測寡核苷酸(R7-4mM磷酸鈉，1mM磷酸鉀，pH7.0，0.1％牛血清白蛋白，0.5％酚)。將100μl上述制備液加入到試劑盒提供的StripR1的陽性對(duì)照孔(被擴(kuò)增基因的一致序列捕獲)中，或鏈親和素包被的Combiplate8平板(參見95029263，Labsystem，Helsinki，F(xiàn)inland)的孔中，或者對(duì)照Maxisorb平板(Nunc，Denmark)的對(duì)照孔中。平行的試驗(yàn)中，同樣的雜交緩反應(yīng)是將DNA用EB緩沖液10倍和100稀釋以檢測該技術(shù)的靈敏度。實(shí)施例36.2對(duì)照組對(duì)照樣品同時(shí)按照下列方式制備A.比較HLA-DR試劑盒將10μl按照實(shí)施例5描述的方法用PCR擴(kuò)增得到的DNA與20μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM在60℃培養(yǎng)30min。標(biāo)記后DNA用QIAquick柱純化，將最終洗脫下來的物質(zhì)溶解到50μlEB緩沖液中。將45μl這種洗脫液用4.5μl試劑R4在室溫下培養(yǎng)5min使之變性，然后用4.5μl試劑R5中和?；旌衔镏屑尤?50μl雜交緩沖液R6和45μl檢測寡核苷酸。將100μl上述制備液加入到試劑盒提供的StripR1的陽性對(duì)照孔(被擴(kuò)增基因的一致序列捕獲)中，或鏈親和素包被的Combiplate8平板中，或者對(duì)照Maxisorb平板中。B.雜交所用DNA不與特異性探針雜交將10μl按照實(shí)施例5描述的方法用PCR擴(kuò)增得到的DNA與20μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM在60℃培養(yǎng)30min。樣品的其他處理方法與上面實(shí)施例A描述的相同。C.無DNA對(duì)照將10μl試劑R6(雜交緩沖液)和100μl試劑R7(檢測寡核苷酸)加入到試劑盒提供的StripR1的陽性對(duì)照孔中，或鏈親和素包被的Combiplate8平板中，或者對(duì)照Maxisorb平板中。將上述所有試驗(yàn)中的Strips在37℃培養(yǎng)1h30min，然后用100μlPBSTween緩沖液(試劑盒的Color0HLA試劑)洗滌三次，加入100μl顯色試劑(Color2試劑，PBSpH7.0；1％Tween，0.2g/lBND；0.01g/lCiproflaxacin)在暗處培養(yǎng)20min可以看到特異性檢測探針的存在，然后用50μlH2SO2(1.8NColor3試劑)終止反應(yīng)。然后測量反應(yīng)介質(zhì)在492nm處的吸光度值。結(jié)果表20在微孔板上特異性檢測PCR擴(kuò)增的DNA表20的結(jié)果顯示模板的優(yōu)越的擴(kuò)增可使其用于診斷成為可能。本實(shí)施例說明在磷酸基團(tuán)上的標(biāo)記可以使DNA被捕獲而不會(huì)影響其特異性雜交。實(shí)施例37細(xì)菌裂解物來源的DNA的捕獲和擴(kuò)增以及用對(duì)-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記本實(shí)施例用于說明利用疊氮甲基功能基團(tuán)與核酸上磷酸基的反應(yīng)性捕獲和擴(kuò)增細(xì)菌DNA是可能的。在本實(shí)施例中，細(xì)菌裂解物中的核酸被對(duì)-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記，然后被捕獲到鏈親和素包被的磁珠上。利用磁珠可以通過磁性使核酸被固定，以便在接下來的連續(xù)洗滌過程中除去反應(yīng)介質(zhì)中的細(xì)胞殘留物，去除殘留物是必須的，因?yàn)樗鼈兛赡軙?huì)抑制下一步的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過與DNA芯片雜交而分析。細(xì)菌DNA的獲得是通過裂解結(jié)核桿菌培養(yǎng)物中的細(xì)胞。裂解的方式是用機(jī)械手段。準(zhǔn)確的說是用超聲破碎法，所處理的液體樣品中含有玻璃珠。這種方法中關(guān)于磁珠的部分已被專利申請(qǐng)WO-A-99/15621的申請(qǐng)人所描述，超聲破碎的方法在專利申請(qǐng)WO-A-00/60049中也有描述。超聲也可用液體水浴進(jìn)行。但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的其他方法也可使用，如專利US-A-5,902,746以及專利申請(qǐng)WO-A-98/54306和WO-A-00/05338所描述的方法。所有這些方法的工業(yè)產(chǎn)權(quán)都屬于專利申請(qǐng)人。細(xì)菌DNA的定量是用Picogreen(P-7589；MolecularProbes.Eugene，OR，USA)按照廠商提供的說明書進(jìn)行，濃度為107拷貝/1μl。將10μl細(xì)菌裂解物與20μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM混和后在60℃培養(yǎng)30min。作為平行對(duì)照，將10μl細(xì)菌裂解物加入到20μl純水(Sigma)中在相同條件下培養(yǎng)。然后用QIAquick柱(NucleotideRemovalKit，Qiagen，Hilden，Germany)純化反應(yīng)混和液。純化方法是廠商推薦的。最終的洗脫物體積為50μl。然后將標(biāo)記的DNA片段捕獲到Dynal磁珠(DynabeadsM-280鏈親和素；參見112.05；DynalBiotechASA，Oslo，Norway)上，其制備方法如下90μlDynal珠用200μl純水(Sigma)洗滌兩次，然后收集到200μlPEG緩沖液(0.1MNaPO4，pH7，0.5MNaCl；0.65％Tween20；0.14ml鯡精DNA(參見15634-017，GibcoBRL)；2％PEG4000)，在37℃培養(yǎng)30min。然后用200μl含0.5％Tween的1×PBS緩沖液洗滌兩次，最后的洗脫物收集到90μl相同緩沖液中。10μl標(biāo)記或未標(biāo)記的DNA洗脫物與40μlPEG緩沖液和2.5μl如上所述制備的磁珠在室溫下培養(yǎng)5min。然后用200μl含0.5％Tween的1×PBS緩沖液洗滌磁珠三次，然后收集到200μl水中，60℃培養(yǎng)20min，然后再用200μlPBSTween洗滌四次。最后將磁珠收集到25μl水中，按照實(shí)施例5描述的方法進(jìn)行PCR。設(shè)兩個(gè)對(duì)照，一個(gè)25μl純水，另一個(gè)是2.5μl制備的磁珠，用與生物樣品相同的條件制備和洗滌，收集到25μl水中。結(jié)果PCR產(chǎn)物用Picogreen(P-7589；MolecularProbes，Eugene，OR，USA)按照廠商所提供的說明書定量。該方法的原理是基于所用的分子(Picogreen)只有在定位到DNA分子內(nèi)部(嵌入到兩個(gè)堿基之間)時(shí)才能變成熒光物質(zhì)。由于這種嵌入具有很高的特異性，并且所產(chǎn)生的熒光信號(hào)與介質(zhì)中存在的DNA量成正比，因此可以用這種方式很精確地分析樣品中所含有的DNA濃度。所檢測到的信號(hào)用rfu(相對(duì)熒光單位)表示。凝膠分析PCR結(jié)果顯示從對(duì)-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記的基因組DNA制備的樣品在凝膠的預(yù)期位置上出現(xiàn)一條單一的特異性條帶。如果用非標(biāo)記基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增就檢測不到該條帶。以Picogreen進(jìn)行DNA定量使確定產(chǎn)生的DNA量成為可能，這些DNA是通過擴(kuò)增捕獲在磁珠上的DNA得到的。表21從細(xì)菌裂解物中通過PCR擴(kuò)增處的DNA的定量、定量以及通過對(duì)-Bio-EG3-PDAM的純化按照實(shí)施例8描述的方法在DNA芯片上進(jìn)行分析就有可能用于確定下面表34中所列舉的擴(kuò)增的特異性。表22用對(duì)-Bio-EG3-PDAM捕獲和純化的靶的特異性檢測本實(shí)施例說明制備生物學(xué)樣品以擴(kuò)增其所含有的核酸是可能的，所用的捕獲技術(shù)是基于疊氮甲基功能基團(tuán)與磷酸基團(tuán)的反應(yīng)性。實(shí)施例38連續(xù)擴(kuò)增兩個(gè)來源于被捕獲在固體支持物上的細(xì)菌DNA的基因本實(shí)施例用于說明利用疊氮甲基功能基團(tuán)與核酸上磷酸基的反應(yīng)性擴(kuò)增幾次不同的靶DNA是可能的。在本實(shí)施例中，細(xì)菌裂解物中的核酸被對(duì)-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記，然后被捕獲到鏈親和素包被的磁珠上。利用磁珠可以通過磁性使核酸被固定，以便在接下來的連續(xù)洗滌過程中除去反應(yīng)介質(zhì)中的細(xì)胞殘留物，去除殘留物是必須的，因?yàn)樗鼈兛赡軙?huì)抑制下一步的PCR擴(kuò)增。這些擴(kuò)增發(fā)生在基因組DNA不同的兩個(gè)基因上，分別命名為16S和rpoB。這兩個(gè)基因通過與DNA芯片雜交而被分析。細(xì)菌DNA的獲得是按照實(shí)施例37所描述的方法通過裂解結(jié)核桿菌培養(yǎng)物中的細(xì)胞。細(xì)菌DNA的定量是用Picogreen按照廠商提供的說明書進(jìn)行，濃度為107拷貝/1μl。將10μl細(xì)菌裂解物與20μl對(duì)-Bio-EG3-PDAM混和后在60℃培養(yǎng)30min。作為平行對(duì)照，將10μl細(xì)菌裂解物加入到20μl純水(Sigma)中在相同條件下培養(yǎng)。然后用QIAquick柱(NucleotideRemovalKit，Qiagen，Hilden，Germany)純化反應(yīng)混和液。純化方法是廠商推薦的。最終的洗脫物體積為50μl。然后將標(biāo)記的DNA片段捕獲到Dynal磁珠(DynabeadsM-280鏈親和素；參見112.05；DynalBiotechASA，Oslo，Norway)上，其制備方法如下90μlDynal珠用200μl純水(Sigma)洗滌兩次，然后收集到200μlPEG緩沖液(0.1MNaPO4，pH7，0.5MNaCl；0.65％Tween20；0.14ml鯡精DNA(參見15634-017，GibcoBRL)；2％PEG4000)，在37℃培養(yǎng)30min。然后用200μl含0.5％Tween20的1×PBS緩沖液洗滌兩次，最后的洗脫物收集到90μl相同緩沖液中。10μl標(biāo)記或未標(biāo)記的DNA洗脫物與40μlPEG緩沖液和2.5μl如上所述制備的磁珠在室溫下培養(yǎng)5min。然后用200μl含0.5％Tween的1×PBS緩沖液洗滌磁珠三次，然后收集到200μl水中，60℃培養(yǎng)20min，然后再用200μlPBSTween洗滌四次。最后將磁珠收集到25μl水中，按照實(shí)施例5描述的方法進(jìn)行PCR。設(shè)兩個(gè)對(duì)照，一個(gè)25μl純水(Sigma)，另一個(gè)是2.5μl制備的磁珠，用與生物樣品相同的條件制備和洗滌，收集到25μl水中。擴(kuò)增以后，收集反應(yīng)液，將磁珠分離，用150μl含0.5Tween的1×PBS洗滌，然后懸于25μl純水(Sigma)中。另外一個(gè)擴(kuò)增是在磁珠上進(jìn)行，只是所用的引物是用于擴(kuò)增rpoB基因的。對(duì)照組的擴(kuò)增是用非捕獲基因組DNA，與上兩個(gè)擴(kuò)增系統(tǒng)(rpo和16S)同時(shí)進(jìn)行。結(jié)果所得到的產(chǎn)物用DNA芯片按照實(shí)施例8描述的方法分析。表23DNA芯片分析經(jīng)過連續(xù)PCR擴(kuò)增或不連續(xù)擴(kuò)增得到的DNA擴(kuò)增子凝膠分析PCR結(jié)果顯示從對(duì)-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記的基因組DNA制備的樣品在凝膠的預(yù)期位置上出現(xiàn)一條單一的特異性條帶。如果用非標(biāo)記基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增就檢測不到該條帶。如上面表23所顯示的用DNA芯片進(jìn)行分析可以確定兩次連續(xù)擴(kuò)增的特異性，因而就能夠從固定在固體支持物上的DNA中連續(xù)擴(kuò)增出幾個(gè)基因，從而就無需開發(fā)multiplexsystems，這樣的系統(tǒng)常常會(huì)降低核酸擴(kuò)增的敏感性和效率。實(shí)施例39在攜帶疊氮甲基基團(tuán)的尼龍膜上捕獲和擴(kuò)增DNA將尼龍膜活化以使其些但疊氮甲基基團(tuán)，用于捕獲細(xì)菌DNA，然后通過PCR擴(kuò)增這些DNA。實(shí)施例39.1BiodyneC濾膜的修飾合成流程化合物68將3’-氨基苯乙酮(14.5g，107mmol)溶解到50ml無水DMF中。加入琥珀酐(10.7g，107mmol)，混合物在室溫下通氬氣持續(xù)攪拌。6h后將溶液在真空中濃縮，然后加入50ml甲醇。過濾后得到的沉淀物用甲醇和乙醚洗滌。從而得到19.4g(81％)摻著少量灰黃顏色的白色粉末狀產(chǎn)物68。1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝2.5-2.6(m，7H)；7.45(t，1H)；7.64(d，1H)；7.83(d，1H)；8.19(s，1H)；10.16(s，1H)；12.12(s，1H)。化合物69將5.07g(22mmol)化合物68在氬氣下溶于10ml無水DMF中。溶液置于冰上，然后加入5.00g(32mmol)羰基二咪唑。20分鐘后緩慢加入20ml(94.6mmol)4，7，10-三氧三癸二胺(EG3)。在室溫下反應(yīng)3h后將DMF蒸發(fā)掉，殘留物收集到100mlCH2Cl2中。用飽和NaHCO3和H2O提取，然后用無水Na2SO4干燥有機(jī)相，將溶劑蒸發(fā)。從而得到4.34g(46％)產(chǎn)物69。1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝1.59(m，2H)；1.87(m，2H)；2.16(s，3H)；2.40(m，2H)；2.55(m，2H)；3.08(m，2H)；3.45(m，16H)；7.30(t，1H)；7.42(d，1H)；7.70(d，1H)；7.83(t，1H)；7.97(s，1H)；10.00(s，1H)?；衔?1在一張BiodyneC濾膜(參見60314；PallGelmanLaboratory；AnnArbor；Michigan；USA)上剪出一個(gè)4cm2的矩形，放入一個(gè)瓶子中，使之與3ml含有0.97g(6mmol)羰基二咪唑(CDI)的無水DMF接觸，瓶子置于冰上，通氬氣劇烈攪拌。20min后將溶液去掉，濾膜用DMF洗滌。然后加入3ml含0.53g產(chǎn)物68(1mmol)的無水DMF，在室溫下反應(yīng)過夜。然后去掉溶液，濾膜用乙醇研磨，在真空中干燥并保存在氬氣中?；衔?2將修飾的濾膜91放到97ml一水合肼(2mmol)和4ml無水乙醇的混合物中。溶液回流5h。溶液冷卻后用水、乙醇和乙醚洗滌濾膜，真空中干燥然后置于氬氣中。然后加入4ml無水DMF和86mgMnO2(1mmol)，混合物劇烈攪拌使之反應(yīng)。20min后將溶液棄掉，濾膜用DMF和乙醚研磨。得到的疊氮甲基修飾濾膜92存在在氬氣中，保存穩(wěn)定為-19到-31℃。實(shí)施例39.2生物學(xué)檢測將活化的膜剪成2mm2的小片，與25μl結(jié)核桿菌裂解物和375μl純水(Sigma)一起在室溫下培養(yǎng)30min，所用的細(xì)菌裂解物是通過機(jī)械方式制備的，其方法和最終的濃度與實(shí)施例37相同。然后將膜置于100ml洗滌緩沖液(5％甲酰胺(Sigma)，1×SSPE(Perbio)，0.01％TritonX-100)中在65℃培養(yǎng)60min以去除非特異性吸附到膜上的核酸，然后將膜儲(chǔ)存在1ml純水中以便進(jìn)行擴(kuò)增。按照實(shí)施例5.1所描述的進(jìn)行PCR，反應(yīng)混合物的體積用純水補(bǔ)足。平行對(duì)照的設(shè)置是按照與上面一樣的過程進(jìn)行，只是所用的膜無核酸共價(jià)結(jié)合?！し切揎桞iodyneC膜(膜A)，·按照上述方法化學(xué)修飾的Biodyne膜，但不用無水DMF和MnO2處理；此對(duì)照的目的在于說明在無疊氮甲基基團(tuán)的情況下的膜的情況(膜B)，以及·BiodyneC膜，不進(jìn)行修飾，但是用無水DMF和MnO2劇烈攪拌20min處理，此對(duì)照的目的在于說明這種處理步驟不會(huì)影響DNA對(duì)膜的吸附(膜C)。為了說明對(duì)膜的處理不會(huì)抑制PCR，同時(shí)用另外三個(gè)膜A，B和C的小片與25μl細(xì)菌裂解物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(管A’，B’和C’)。PCR產(chǎn)物用Picogreen按照廠商提供的說明書進(jìn)行定量。結(jié)果表24PCR擴(kuò)增捕獲在固體支持物上的細(xì)菌裂解物DNA所得到的DNA的量化表24中的這些結(jié)果說明將核酸通過疊氮化學(xué)方法共價(jià)捕獲在固體支持物上是可行的。所觀察到的擴(kuò)增不是由于DNA與膜的非特異吸附。另外，通過對(duì)照組試驗(yàn)可以看出膜不會(huì)抑制擴(kuò)增反應(yīng)。為了檢測膜上擴(kuò)增產(chǎn)物的性質(zhì)，擴(kuò)增產(chǎn)物按照上述的方法用DNA芯片分析。權(quán)利要求1.一種標(biāo)記和片段化單鏈或雙鏈脫氧核糖核酸(DNA)的方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟—通過在所述DNA上制造至少一個(gè)脫堿基位點(diǎn)而使DNA片段化，—通過標(biāo)記試劑的方式將標(biāo)記物連接到至少一個(gè)片段上，所述試劑主要是共價(jià)偶聯(lián)到所述片段的至少一個(gè)磷酸基上。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述片段化和標(biāo)記在兩步中完成。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述片段化和標(biāo)記在一步中完成。4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述脫堿基位點(diǎn)通過酸性含水介質(zhì)的作用而產(chǎn)生。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述酸性含水介質(zhì)的pH低于5，優(yōu)選的是低于4。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述酸性含水介質(zhì)是pH約為3的甲酸鈉緩沖液。7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述DNA至少含有一個(gè)能產(chǎn)生脫堿基位點(diǎn)的修飾堿基。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述能產(chǎn)生脫堿基位點(diǎn)的修飾堿基選自8-溴嘌呤衍生物。9.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述脫堿基位點(diǎn)通過烷基化試劑或氧化劑產(chǎn)生。10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述標(biāo)記試劑含有一個(gè)作為反應(yīng)官能團(tuán)的基序，該基序選自如下化合物疊氮甲基；烷基鹵化物；亞硝基脲；氮雜環(huán)丙烷；氮丙啶；環(huán)氧化物；三氟甲烷磺酸鹽。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述標(biāo)記試劑是5-(溴甲基)-熒光素。12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述標(biāo)記試劑選自具有結(jié)構(gòu)式(I)的化合物其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，以及·Z代表可檢測的標(biāo)記物，13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，Z是14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述標(biāo)記試劑選自具有結(jié)構(gòu)式(2)的化合物其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，·R2是一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1，以及·Z選自以下基團(tuán)或或或其中·R3和R4分別代表H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，R＝烷基或芳基，以及·-Y-X-代表-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述標(biāo)記試劑具有結(jié)構(gòu)式(3)其中·R1代表H或烷基，取代的烷基，芳基或取代的芳基，·R2是一個(gè)可檢測的標(biāo)記物，·L是一個(gè)連接臂，含有一個(gè)至少有兩個(gè)共價(jià)鍵的線形連接物，n等于0或1，·R3和R4分別代表H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，R＝烷基或芳基，以及·-Y-X-代表-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。16.如權(quán)利要求14和15所述的任何一種方法，其中，R2是熒光化合物或半抗原。17.如權(quán)利要求10-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述標(biāo)記試劑可溶于水溶性溶劑。18.一種檢測單鏈或雙鏈靶脫氧核糖核酸(DNA)的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟·按照權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的種方法片段化和標(biāo)記所述DNA，·使標(biāo)記片段與至少一種核酸探針雜交，該探針對(duì)于靶核酸來說具有足夠高的特異性，以及·用標(biāo)記物檢測形成的雜交物。19.檢測如權(quán)利要求18所述雙鏈靶脫氧核糖核酸(DNA)的方法，其特征在于，所述方法還包括片段化和標(biāo)記后的變性步驟。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述片段化，標(biāo)記和變性在一步中完成。21.一種檢測靶核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟·酶催化擴(kuò)增靶核酸以產(chǎn)生大量雙鏈DNA擴(kuò)增子，·按照權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的種方法片段化核苷標(biāo)記所述DNA擴(kuò)增子，·使標(biāo)記片段與至少一種核酸探針雜交，該探針對(duì)于靶核酸來說具有足夠高的特異性，以及·用標(biāo)記物檢測形成的雜交物。22.如權(quán)利要求21所述的方法，它還包括片段化和標(biāo)記后的變性步驟。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述片段化，標(biāo)記和變性在一步中完成。24.一種檢測靶核酸在預(yù)先確定或非預(yù)先確定的位置上多態(tài)性分布的方法，該方法是通過檢測所述靶核酸序列相對(duì)于所謂參考序列所具有的缺失和/或插入和/或突變，包括下列步驟·制備一種含有整個(gè)所要研究的多態(tài)性的靶DNA，所述DNA可隨意選擇一種酶催化擴(kuò)增技術(shù)制備?！び脵?quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的種方法片段化和標(biāo)記所述DNA，·將所述的片段與多種稱為捕獲探針的核酸探針雜交，這些捕獲探針附著在固體支持物上，并且至少完全涵蓋了所要研究的多態(tài)性，·用標(biāo)記物檢測標(biāo)記片段與至少一部分核酸探針形成的雜交物并由此推斷靶DNA的多態(tài)性。25.如權(quán)利要求24所述的方法，它還包括片段化和標(biāo)記后的變性步驟。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述片段化，標(biāo)記和變性在一步中完成。27.如權(quán)利要求24-26中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述固體支持物至少含有10個(gè)不同序列的核酸探針，較好的是至少400個(gè)，最好的是至少1000個(gè)。28.用權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述方法標(biāo)記的核酸片段在作為探針以檢測靶核酸中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及標(biāo)記和片段化單鏈或雙鏈脫氧核糖核酸的方法，包括如下步驟a.通過在所述DNA上制造至少一個(gè)脫堿基位點(diǎn)而化學(xué)片段化DNA，b.通過標(biāo)記試劑的方式將標(biāo)記物連接到至少一個(gè)片段上，所述的試劑共價(jià)而永久地偶聯(lián)到所述片段的至少一個(gè)磷酸基上。本發(fā)明優(yōu)選用于診斷領(lǐng)域。文檔編號(hào)C12N15/09GK1639356SQ02811492公開日2005年7月13日申請(qǐng)日期2002年5月3日優(yōu)先權(quán)日2001年5月4日發(fā)明者C·鮑格特,M·柯特拉,J·洛姆,E·特里維希奧,A·拉揚(yáng),C·托拉,I·索提爾申請(qǐng)人:比奧·麥利尤股份有限公司,約瑟夫福理埃大學(xué)(格勒諾布爾1),國家科學(xué)研究中心