專利名稱：新型大酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大酶(maxizyme)及其應(yīng)用，更具體地說(shuō)，涉及對(duì)目標(biāo)RNA具有優(yōu)異RNA切割活性的大酶及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
二十世紀(jì)八十年代初，根據(jù)美國(guó)科羅拉多大學(xué)Cech等人發(fā)現(xiàn)的四膜蟲的rRNA自剪接現(xiàn)象(K.Kruger，Cell，31，147-157(1982))、美國(guó)耶魯大學(xué)Altman進(jìn)行的對(duì)RNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合體酶—RNA酶P的分析結(jié)果(C.Guerrier-Takada，Cell，35，849-857(1983))，發(fā)現(xiàn)了具有催化劑機(jī)能的RNA—核酶(ribozyme核苷酸+酶)。
從那以后，發(fā)現(xiàn)了各種各樣的核酶，其中錘頭狀核酶是被研究最多的核酶之一。錘頭狀核酶是在天然自切割反應(yīng)(順式)中發(fā)揮機(jī)能的核酶，Uhlenbeck等人和Hasehoff等人的研究小組將其分開成(轉(zhuǎn)換成反式)兩條RNA鏈(底物區(qū)和酶活性保持區(qū))(O.C.Uhlenbeck，Nature，328，596(1987)；J.Hasehoff，W.L. Gerlach，Nature，334，585(1988))，從而顯示出將核酶應(yīng)用于基因治療的可能性。
于是大量報(bào)道了以癌癥、艾滋病為目標(biāo)的各種應(yīng)用研究(M，Cotton，M.L.Bimstlel，EMBOJ8，861(1989))，本發(fā)明人也開發(fā)了具有極高底物特異性，對(duì)正常mRNA完全沒有影響，僅切割具有異常連接序列的mRNA的大酶(國(guó)際公開WO99/46388號(hào)公報(bào))。
但是，由于目標(biāo)mRNA具有二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，當(dāng)大酶的底物結(jié)合區(qū)被莖結(jié)構(gòu)隱藏時(shí)，就會(huì)有大酶向目標(biāo)位點(diǎn)的接近受阻，無(wú)法獲得充分效果的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供無(wú)論目標(biāo)mRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)如何都可與其結(jié)合，進(jìn)行有效切割的大酶。
本發(fā)明人為實(shí)現(xiàn)上述目的，進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)使大酶與具有解旋酶活性的分子一起作用，可以獲得優(yōu)異的RNA切割活性，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及下述(1)-(19)。
(1)大酶，其特征在于與具有解旋酶活性的分子結(jié)合。
(2)大酶，所述大酶含有與具解旋酶活性的分子結(jié)合的區(qū)。
(3)大酶，所述大酶由含有下列核苷酸序列(a)的RNA分子和含有下列核苷酸序列(b)的RNA分子形成的二聚體結(jié)構(gòu)構(gòu)成。
5’X11…X1hY11…Y1iZ11…Z1jB11…B1p3’(a)5’Z21…Z2nY21…Y2mX21…X2kB21…B2q3’(b)(序列中，X11…X1h、X21…X2k、Y11…Y1i、Y21…Y2m、Z11…Z1j、Z21…Z2n、B11…B1p和B21…B2q各自獨(dú)立為A、U、T、C或G，h和k為1以上的整數(shù)(例如1-100的整數(shù)))，i和m為1以上的整數(shù)(例如1-100的整數(shù))，j和n為1以上的整數(shù)(例如l-100的整數(shù))，p和q為1以上的整數(shù)(例如1-100的整數(shù))，X11…X1h和X21…X2k是與目標(biāo)RNA中的特異性序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或者是含有與目標(biāo)RNA的切割位點(diǎn)周圍的序列互補(bǔ)的區(qū)和只在目標(biāo)RNA存在下可形成捕捉Mg2+(鎂離子)的孔穴的區(qū)的核苷酸序列；Y11…Y1I和Y21…Y2m是形成莖的核苷酸序列；Z1I…Z1j和Z21…Z2n是含有與目標(biāo)RNA的切割位點(diǎn)周圍的序列互補(bǔ)的區(qū)和只在目標(biāo)RNA存在下可形成捕捉Mg2+的孔穴的區(qū)的核苷酸序列；B11…B1p和B21…B2q其中之一或者兩者是含有與具有解旋酶活性的分子結(jié)合的區(qū)的核苷酸序列。
(4)(3)中記載的大酶，其中作為只在目標(biāo)RNA存在下可形成捕捉Mg2+(鎂離子)的孔穴的核苷酸序列，Z11…Z1j含有序列GAA，Z21…Z2n含有序列CUGAYZGA，YZ表示A、G、U、C任一種單核苷酸。
(5)(3)或(4)中記載的大酶，其中作為只在目標(biāo)RNA存在下可形成捕捉Mg2+的孔穴的核苷酸序列，包含X21…X2k的序列GAA、X11…X1h的序列CUGAYXGA，YX表示A、G、U、C任一種單核苷酸。
(6)(1)-(5)任一項(xiàng)中記載的大酶，其中具有解旋酶活性的分子為RNA解旋酶。
(7)(6)中記載的大酶，其中與具解旋酶活性的分子結(jié)合的區(qū)為SEQ ID NO.1(CTE)表示的核苷酸。
(8)(6)中記載的大酶，其中與具解旋酶活性的分子結(jié)合的區(qū)為SEQ ID NO.2(TAR)表示的核苷酸。
(9)(3)-(8)任一項(xiàng)中記載的大酶，其中在核苷酸序列(a)和(b)各自的上游添加了接頭序列和tRANval啟動(dòng)序列。
(10)(9)中記載的大酶，其中添加到核苷酸序列(a)上游的接頭序列含有下述核苷酸序列(e)，添加到核苷酸序列(b)上游的接頭序列含有下述核苷酸序列(f)。
5’AAA 3’(e)5’UUU 3’(f)(11)(9)中記載的大酶，其中添加到核苷酸序列(a)和(b)各自上游的tRANval啟動(dòng)序列為SEQ ID NO.3。
(12)(9)中記載的大酶，其中在核苷酸序列(a)和(b)各自下游添加了附加序列和終止序列。
(13)(12)中記載的大酶，其中添加到核苷酸序列(a)下游的附加序列含有下述核苷酸序列(g)，添加到核苷酸序列(b)下游的附加序列含有下述核苷酸序列(h)，添加到核苷酸序列(a)和(b)各自下游的終止序列含有下述核苷酸序列(i)。
5’AAA 3’ (g)5’AACCGUA 3’ (h)5’UUUUU 3’(i)
(14)表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有編碼(1)-(13)中任一項(xiàng)記載的大酶的DNA。
(15)復(fù)合體，該復(fù)合體為(1)-(13)中任一項(xiàng)記載的大酶與具有解旋酶活性的分子的復(fù)合體。
(16)藥物組合物，該組合物含有(1)-(13)中任一項(xiàng)記載的大酶、(14)中記載的表達(dá)載體或(15)中記載的復(fù)合體作為有效成分。
(17)切割目標(biāo)核酸的方法，該方法使用(1)-(13)中任一項(xiàng)記載的大酶、(14)中記載的表達(dá)載體、(15)中記載的復(fù)合體進(jìn)行。
(18)特異性阻礙或抑制目標(biāo)核酸的生物學(xué)機(jī)能的方法，該方法使用(1)-(13)中任一項(xiàng)記載的大酶、(14)中記載的表達(dá)載體或(15)中記載的復(fù)合體進(jìn)行。
(19)目標(biāo)核酸的生物學(xué)機(jī)能的分析方法，該方法包括用(1)-(13)中任一項(xiàng)記載的大酶、(14)中記載的表達(dá)載體或(15)中記載的復(fù)合體特異性切割目標(biāo)核酸或者特異性阻礙目標(biāo)核酸的生物學(xué)機(jī)能，研究該切割或該阻礙對(duì)生物學(xué)活性的影響。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示CTE(組成型轉(zhuǎn)運(yùn)元件，constitutiVe transport element)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
圖2表示CTE-Mz的簡(jiǎn)圖。
圖3表示LTR-螢光素酶mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
圖4表示Luc同型Mz與2個(gè)mRNA的Luc切割位點(diǎn)結(jié)合時(shí)的圖。
圖5表示Luc同型Mz與2個(gè)mRNA的TAR切割位點(diǎn)結(jié)合時(shí)的圖。
圖6表示Luc同型Mz與1個(gè)mRNA的Luc切割位點(diǎn)和TAR切割位點(diǎn)結(jié)合時(shí)的圖。
圖7表示大酶和CTE-大酶與1個(gè)LTR-螢光素酶mRNA結(jié)合的圖(順式大酶)。
圖8表示大酶和CTE-大酶與2個(gè)LTR-螢光素酶mRNA結(jié)合的圖(反式大酶)。
圖9表示螢光素酶活性的結(jié)果(同二聚體型大酶)。
圖10表示螢光素酶活性的結(jié)果(異二聚體型大酶)。
實(shí)施發(fā)明的最佳方案本發(fā)明的大酶的特征在于與具有解旋酶活性的分子結(jié)合。
本發(fā)明人當(dāng)初推測(cè)大酶與具有解旋酶活性的分子結(jié)合時(shí)，由于空間位阻而不可能形成二聚體。特別是將pol III系統(tǒng)作為表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，由于5’末端上添加了tRNAval，大酶的空間位阻變大更大。但是，令人吃驚的是大酶形成了二聚體，并證實(shí)其具有比現(xiàn)有大酶更優(yōu)異的RNA切割活性。
下面詳述本發(fā)明。
(大酶)本發(fā)明中大酶是指作為二聚體發(fā)揮作用的小型化錘頭狀核酶。該小型化通常通過(guò)以短鏈的接頭置換由反義區(qū)(莖I和莖II)、活性中心區(qū)、莖-環(huán)II區(qū)構(gòu)成的錘頭狀核酶的莖-環(huán)II區(qū)而得以構(gòu)建。大酶的活性表達(dá)需要Mg2+(鎂離子)，莖II部分的G-C堿基對(duì)對(duì)于形成二聚體很重要。錘頭狀核酶和大酶的序列設(shè)計(jì)在生物物理2000年第4卷第2期第99-104頁(yè)上有記載，將該文獻(xiàn)的內(nèi)容全部引用結(jié)合進(jìn)本文作為本說(shuō)明書內(nèi)容的一部分。
可形成捕捉鎂離子的孔穴的位點(diǎn)即活性中心區(qū)相應(yīng)于每1個(gè)大酶可以有1個(gè)，也可以有2個(gè)。有2個(gè)活性中心區(qū)的大酶如果是能夠與1個(gè)底物同時(shí)在兩個(gè)部位結(jié)合，并在該兩個(gè)部位的NUX三聯(lián)體(N為A、G、C或U，X為A、C或U)之后切割底物，則底物的切割效率將升高。
大酶因其二聚結(jié)構(gòu)(二聚體)，與目標(biāo)mRNA在兩個(gè)部位結(jié)合。在形成二聚體時(shí)，可以設(shè)計(jì)為2個(gè)同一種類的單體結(jié)合形成的同二聚體型大酶(homodimer type maxizyme)(圖4、圖5)、兩種不同種類的單體結(jié)合形成的異二聚體型大酶(hetero dimeric maxizyme)(圖6)。同二聚體型大酶與具有設(shè)定的結(jié)合位點(diǎn)的mRNA在兩個(gè)部位結(jié)合。此時(shí)2個(gè)mRNA與1個(gè)大酶在分子內(nèi)結(jié)合(反式大酶，圖7)。另一方面，異二聚體型大酶可以與2個(gè)不同的序列部分結(jié)合，有與1個(gè)mRNA內(nèi)的不同部位同時(shí)結(jié)合的情況(順式大酶，圖8)和不同的序列部分個(gè)別地與1個(gè)大酶在分子間(2個(gè)mRNA)結(jié)合的情況(反式大酶)。
(具有解旋酶活性的分子)本發(fā)明中，具有解旋酶活性的分子是指通過(guò)作用于mRNA，使RNA的螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，從而具有打開包含雙鏈RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)的作用的分子，其具體例子有RNA解旋酶、核糖體、限制酶(EcoRI、EcoRV等)等。這類具有解旋酶活性的分子可以與大酶直接結(jié)合，也可以經(jīng)由銜接分子結(jié)合。只要不損害大酶的切割活性，對(duì)具有解旋酶活性的分子與大酶的結(jié)合位點(diǎn)沒有特別限制，優(yōu)選在大酶的3’末端附近。
為了使具有解旋酶活性的分子與大酶結(jié)合，需要添加新結(jié)合區(qū)，以使具有解旋酶活性的分子或上述銜接分子與大酶穩(wěn)定結(jié)合。與具有解旋酶活性的分子等結(jié)合的區(qū)隨作為目標(biāo)的具有解旋酶活性的分子或銜接分子不同而不同，但可以從具有解旋酶活性的分子與RNA兩條鏈結(jié)合的結(jié)合區(qū)設(shè)計(jì)得到。例如，優(yōu)選添加組成型轉(zhuǎn)運(yùn)元件(CTE、SEQ IDNO.1，圖1)、HIV TAR RNA、POLY A RNA等作為具有解旋酶活性的分子的結(jié)合區(qū)。
CTE是指為了病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)和包裝，而將未剪接的基因組RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)的順式作用性病毒RNA。CTE是Mason-Pfizer猴病毒(MPLV)等猴D型反轉(zhuǎn)錄病毒本來(lái)具有的RNA，因?yàn)楹送廪D(zhuǎn)運(yùn)未剪接的RNA，所以認(rèn)為這些病毒具有所述CTE這樣的RNA基序(H.Tang等，(1997)Science 2761412-1415；J.Li等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96709-714；H.Tang等，(1999)Mol.Cell Biol.193540-3550)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以使用上述CTE、實(shí)質(zhì)上與該CTE具有相同機(jī)能的RNA或者實(shí)質(zhì)上與該CTE具有相同機(jī)能的CTE序列的突變體。這里“實(shí)質(zhì)上與該CTE具有相同機(jī)能的RNA”是指除CTE以外與RNA解旋酶具有結(jié)合親和性的分子，例如指經(jīng)SELEX法人工制備的與解旋酶結(jié)合的銜接適體(aptamer)等分子?！巴蛔凅w”是指一個(gè)或多個(gè)核苷酸的改變(置換、缺失、添加或插入)。這樣的改變可通過(guò)J.Sambrook等人的Molecular Cloning A Laboratory Mannual，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)等一般文獻(xiàn)中記載的方法進(jìn)行。
polyA RNA通過(guò)聚腺苷酸結(jié)合蛋白(PABP)和與PABP相互作用的蛋白質(zhì)-1的相互作用而與RNA解旋酶相互作用。
與具有解旋酶活性的分子結(jié)合的區(qū)可以僅存在于大酶(同二聚體、異二聚體)的一個(gè)單體中，也可以存在于兩個(gè)單體中(圖7)。當(dāng)存在于大酶的兩個(gè)單體中時(shí)，雖然可以預(yù)見有極大的空間位阻，但即使是在這種情況下，也可確認(rèn)有優(yōu)異的mRNA切割活性。
(與具有解旋酶活性的分子結(jié)合的大酶)本發(fā)明的以與具解旋酶活性的分子結(jié)合為特征的大酶或者含有與具解旋酶活性的分子結(jié)合的區(qū)的大酶的具體例子有與解旋酶或與解旋酶形成復(fù)合體的分子具有結(jié)合親和性的大酶，優(yōu)選與RNA解旋酶或與RNA解旋酶形成復(fù)合體的分子(銜接分子)具有結(jié)合親和性的大酶，例如含有與RNA解旋酶A結(jié)合的所謂CTE(組成型轉(zhuǎn)運(yùn)元件)的RNA序列、HIV TAR RNA或POLY ARNA序列的大酶，但并不僅限于此。
本發(fā)明的與具解旋酶活性的分子結(jié)合的大酶通常由與解旋酶或與解旋酶形成復(fù)合體的分子具有結(jié)合親和性的核酸序列和大酶的核酸序列直接或間接結(jié)合而構(gòu)成，例如可通過(guò)使用DNA/RNA合成儀(例如Applied Biosystems公司制造的394型等)進(jìn)行化學(xué)合成。作為兩個(gè)核酸序列的結(jié)合方式，與解旋酶或與解旋酶形成復(fù)合體的分子具有結(jié)合親和性的核酸序列可以在大酶核酸序列的上游側(cè)，也可以在大酶核酸序列的下游側(cè)，優(yōu)選與解旋酶或與解旋酶形成復(fù)合體的分子具有結(jié)合親和性的核酸序列結(jié)合到大酶核酸序列的下游側(cè)。由此可進(jìn)一步提高大酶的活性效率。
(大酶的表達(dá)系統(tǒng))為了使本發(fā)明的與具解旋酶活性的分子結(jié)合的大酶在細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)，需要在大酶序列的上游有啟動(dòng)序列。當(dāng)使用pol III表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，可在該表達(dá)系統(tǒng)中添加tRNAval序列作為過(guò)度序列(excessive sequence)(大酶部分以外的啟動(dòng)序列)。實(shí)際上構(gòu)建了該大酶的表達(dá)載體，但由該載體表達(dá)的結(jié)構(gòu)是在tRNAval序列的下游通過(guò)短鏈接頭與大酶的序列相連。
如圖7和圖8所示，可以預(yù)見到與3’末端結(jié)合的解旋酶和5’末端的tRNAval對(duì)于大酶來(lái)說(shuō)是非常大的空間位阻。但是，添加了tRNAval序列的形式的大酶卻被證實(shí)有明確的切割活性，由此表明本發(fā)明的大酶能有效地形成二聚體。
(表達(dá)載體)編碼本發(fā)明的與具解旋酶活性的分子結(jié)合的大酶的表達(dá)載體例如可通過(guò)將啟動(dòng)序列、終止序列和編碼前述大酶的DNA序列連接之后，將其導(dǎo)入適當(dāng)?shù)妮d體中而構(gòu)建。
表達(dá)載體可以使用pUC19(寶酒造，京都)、pGREEN LANTERN(LifeTech Oriental，東京)、pHaMDR(HUMAN GENE THERAPY6905-915(1995年7月))等質(zhì)粒載體，以及作為基因治療用載體的腺病毒載體或反轉(zhuǎn)錄病毒載體等。
上述載體中，可以在編碼大酶的DNA的上游含有啟動(dòng)序列。啟動(dòng)序列是調(diào)控該DNA表達(dá)的元件，可以包含病毒啟動(dòng)子(SV40啟動(dòng)子等)、噬菌體啟動(dòng)子(λPL啟動(dòng)子等)、pol III啟動(dòng)子(人tRNA啟動(dòng)子(例如tRNAval啟動(dòng)子)、腺病毒VA1啟動(dòng)子等)等。本發(fā)明優(yōu)選使用pol III啟動(dòng)子，特別是tRNA啟動(dòng)子。
本發(fā)明的載體中，還可以在編碼與具解旋酶活性的分子結(jié)合的大酶的DNA的下游含有終止序列。只要是使轉(zhuǎn)錄終結(jié)的序列的終止子，可以使用任何序列。根據(jù)需要，載體中可以包含抗抗生素基因(例如Ampr，Neor)、營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因等選擇標(biāo)記基因或者報(bào)道基因。
編碼本發(fā)明的大酶的核酸可以通過(guò)DNA/RNA合成儀化學(xué)合成，或者可以將上述表達(dá)載體DNA作為模板，在依賴于DNA的RNA聚合酶存在下合成RNA，回收生成的RNA而獲得。將本發(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，可以通過(guò)同源重組整合到染色體上后，表達(dá)本發(fā)明的與具解旋酶活性的分子結(jié)合的大酶。為了引發(fā)同源重組，可以在與一部分宿主細(xì)胞基因組同源的序列內(nèi)部插入編碼本發(fā)明的能與具解旋酶活性的分子結(jié)合的大酶的DNA，再將其整合進(jìn)載體DNA中。對(duì)染色體的整合不僅可以通過(guò)基因治療法中所用的腺病毒載體或反轉(zhuǎn)錄病毒載體，還可以通過(guò)質(zhì)粒載體進(jìn)行。
(本發(fā)明的大酶與具有解旋酶活性的分子的復(fù)合體)本發(fā)明還包括以與具解旋酶活性的分子結(jié)合為特征的大酶與具解旋酶活性的分子的復(fù)合體。具有解旋酶活性的分子的具體例子有RNA解旋酶、核糖體、限制酶(EcoRI、EcoRV等)等，優(yōu)選RNA解旋酶。大酶與具有解旋酶活性的分子的結(jié)合只要不損害各成分機(jī)能，可以以共價(jià)鍵結(jié)合或者以非共價(jià)鍵結(jié)合。以非共價(jià)鍵結(jié)合時(shí)，可以通過(guò)與解旋酶特異性結(jié)合的連接物與CTE或聚腺苷酸序列結(jié)合。以共價(jià)鍵結(jié)合時(shí)，可以根據(jù)需要通過(guò)接頭結(jié)合。
(藥物組合物)本發(fā)明還包括以上述大酶、表達(dá)載體或復(fù)合體為有效成分的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)需要含有藥學(xué)上可接受的載體(例如生理鹽水、緩沖液等稀釋劑)。本發(fā)明的藥物組合物是否適用取決于大酶的機(jī)能種類。即，本發(fā)明的藥物組合物可以用于預(yù)防或治療由大酶的目標(biāo)RNA引起的疾病。
本發(fā)明的藥物組合物可用于預(yù)防或治療例如艾滋病毒(HIV)、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒等病毒引起的疾病、細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病(例如阿爾茨海默病、帕金森氏病等)、癌癥、自身免疫性疾病、炎癥、基因疾病等疾病。
本發(fā)明所用的大酶通過(guò)切割疾病的病因物質(zhì)核酸，或者與核酸互補(bǔ)結(jié)合從而產(chǎn)生機(jī)能阻礙，或者與病原蛋白質(zhì)特異性結(jié)合而產(chǎn)生機(jī)能阻礙，可以破壞病因物質(zhì)的正常機(jī)能。
將含有本發(fā)明大酶或編碼該大酶的DNA的載體導(dǎo)入細(xì)胞的方法有磷酸鈣法、電穿孔法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、顯微注射法、使用基因槍的方法、使用脂質(zhì)體的方法(例如中西守等，蛋白質(zhì)核酸酶44卷，No.11，1590-1596(1999))等。在使用載體的情況下，可以將載體通過(guò)上述方法導(dǎo)入細(xì)胞。例如，可以取出一部分疾病部位的細(xì)胞，在體外進(jìn)行基因?qū)牒?，再將該?xì)胞移回到組織中；或者可以向疾病部位的組織直接導(dǎo)入載體。用病毒載體感染時(shí)的病毒滴度通常為107pfu/ml以上。
(本發(fā)明的大酶、表達(dá)載體或復(fù)合體的應(yīng)用)本發(fā)明還提供用本發(fā)明的大酶、表達(dá)載體或復(fù)合體特異性切割目標(biāo)核酸或者阻礙或抑制目標(biāo)核酸的生物學(xué)機(jī)能的方法。該方法例如也可以用于闡明目標(biāo)核酸的生物學(xué)機(jī)能。如果將大酶的目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)(莖I和莖II)的序列隨機(jī)分布，則可以闡明某種生物學(xué)機(jī)能所需的基因。
具體地說(shuō)，就是向細(xì)胞導(dǎo)入上述具有隨機(jī)分布的目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)的大酶。例如，向正常細(xì)胞導(dǎo)入后可引起癌變，或者向異常癌細(xì)胞導(dǎo)入后可使其恢復(fù)成正常細(xì)胞時(shí)，由此可知與癌變相關(guān)的基因。根據(jù)需要，通過(guò)用Gene Bank等來(lái)研究其序列，可以闡明該基因的全序列和機(jī)能。當(dāng)基因?yàn)槲粗獣r(shí)，可以在目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行目標(biāo)基因的克隆而確定全序列。即使上述隨機(jī)序列與重要的基因互補(bǔ)，大多數(shù)也會(huì)由于對(duì)方的高級(jí)結(jié)構(gòu)而無(wú)法與目標(biāo)相互作用，結(jié)果不能對(duì)其進(jìn)行切割。本發(fā)明中，通過(guò)使用能與具解旋酶活性的分子相結(jié)合的大酶，可以避免上述問(wèn)題，使效率得到顯著提高。
作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的申請(qǐng)即特愿2001-134469號(hào)說(shuō)明書的全部?jī)?nèi)容引用進(jìn)本文，作為本說(shuō)明書的一部分。
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的具體說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例本實(shí)施例中，評(píng)價(jià)具有與具解旋酶活性的分子結(jié)合的核苷酸序列的大酶對(duì)目標(biāo)mRNA的細(xì)胞內(nèi)活性。本實(shí)施例中，選擇RNA解旋酶A作為具有解旋酶活性的分子，用使CTE RNA與大酶的下游連接的大酶(CTE-Mz)作為能與該分子結(jié)合的基序。
實(shí)施例1構(gòu)建具有與具解旋酶活性的蛋白質(zhì)結(jié)合的核苷酸序列的大酶表達(dá)載體(CTE-Mz表達(dá)載體)當(dāng)制備本發(fā)明的大酶時(shí)，確定大酶的序列，使來(lái)源于HIV-1的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)基因內(nèi)的TAR RAN區(qū)(證明具有牢固的二級(jí)結(jié)構(gòu))和螢光素酶mRNA(為了能進(jìn)行定量評(píng)價(jià))為目標(biāo)位點(diǎn)。
可根據(jù)文獻(xiàn)(J.Virol.73，1868-1877(1999)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA96，1886-1891(1999))記載的方法構(gòu)建CTE-Mz表達(dá)載體?；瘜W(xué)合成單鏈的寡核苷酸，該寡核苷酸在5’和3’末端分別具有限制位點(diǎn)Csp45I和SalI，從上游依次具有編碼大酶(SEQ ID NO.4、5、6、7)的DNA序列、限制位點(diǎn)KpnI和EcoRV，3’末端具有終止序列(TTTTT)，通過(guò)以其為模板的聚合酶鏈反應(yīng)，合成雙鏈寡核苷酸。將該雙鏈寡核苷酸用限制酶Csp45I和SalI處理后，插入到同樣用限制酶Csp45I和SalI處理過(guò)的質(zhì)粒pUC-dt的tRNAval的下游。將其用限制酶KpnI和EcoRV處理后，插入編碼來(lái)自猿猴D型反轉(zhuǎn)錄病毒(SRV)基因的組成型轉(zhuǎn)運(yùn)元件(CTE，圖1)的DNA序列，得到CTE-Mz表達(dá)載體(圖2)。
實(shí)施例2通過(guò)螢光素酶活性評(píng)價(jià)Mz活性本評(píng)價(jià)使用可使連接長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)基因與螢光素酶(Luc)基因的嵌合基因(SEQ ID NO.8)穩(wěn)定表達(dá)的HeLa細(xì)胞(LTR-Luc HeLa)。將1×105個(gè)LTR-Luc HeLa接種到12孔板上，于37℃、5％二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。將實(shí)施例1所得CTE-Mz表達(dá)載體MzL和MzR各2μg(同源大酶的情況下含有4μg單體大酶)、100ng來(lái)自HIV-1的Tat基因表達(dá)質(zhì)粒(LTR-Luc的表達(dá)需要Tat蛋白)、50ng pSVβ-半乳糖苷酶(Promega)加入到含有4μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(GIBCO/BRL，Rockville，MD)的Optimen I培養(yǎng)基(GIBCO/BRL)中，在室溫下溫育30分鐘以上，然后滴加到12孔板上的細(xì)胞中，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。于37℃、二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，回收細(xì)胞，用PicaGene試劑盒(東京油墨，日本東京)測(cè)定螢光素酶活性。將細(xì)胞用150μl細(xì)胞溶解液(100mM K2HPO4，100mMKH2PO4，0.2％Triton X-100，1mM DTT；pH7.8)溶解，在4℃以10,000xg離心1分鐘。將10μl該上清液添加到100μl螢光素酶活性測(cè)定試劑(20mM Tricine，1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2，2 67mM MgSO4，0.1mM EDTA，33.3mM DTT，270μM輔酶A，470μM螢光素，530μM ATP)中，3秒后開始用螢光光度計(jì)測(cè)定螢光強(qiáng)度10秒鐘(Lumant LB 9501，Borthold，Bad Wildbad，Germany)。轉(zhuǎn)染效率對(duì)螢光素酶活性的影響通過(guò)同時(shí)轉(zhuǎn)染的來(lái)自pSV β-半乳糖苷酶的β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行修正。
本實(shí)施例結(jié)果如圖9和圖10所示。將作為對(duì)照(pCD-SRα/tat)的螢光素酶活性作為100％，給出了與其的相對(duì)活性。
使CTE-Mz與LTR-螢光素酶mRNA作用時(shí)，與使通常的Mz作用的情況相比，顯示出顯著低的螢光素酶活性。即，可知CTE-Mz對(duì)通常Mz難以切割的TAR和Luc具有優(yōu)異的切割活性。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明可提供無(wú)論目標(biāo)mRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)如何都可與其結(jié)合進(jìn)行有效切割的大酶。本發(fā)明的大酶可用作藥物，還可用于特異性切割目標(biāo)核酸的方法和阻礙或抑制目標(biāo)核酸的生物學(xué)機(jī)能的方法，通過(guò)應(yīng)用該方法，可闡明目標(biāo)核酸的生物學(xué)機(jī)能。
序列表<110>獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIALSCIENCE AND TECHNOLOGY)<110>大正制藥株式會(huì)社(TAISHO PHARMACEUTICAL CO.，LTD.)<110>株式會(huì)社基因功能(GENOFUNCTION INC.)<120>新型大酶<130>A21216A<160>8<210>1<211>173<212>RNA<213>人(Homo Sapiens)<400>1agaccaccuc cccugcgagc uaagcuggac agccaaugac ggguaagaga gugacauugu 60ucacuaaccu aagacaggag ggccgucaga gcuacugccu aauccaaaga cggguaaaag 120ugauaaaaau guaucacucc aaccuaagac aggcgcagcu uccgagggat ttg 173<210>2<211>60<212>RNA<213>人(Homo Sapiens)<400>2gggucucucu gguuagacca gaucugagcc ugggagcucu cuggcuaacu agggaaccca 60<210>3<211>87<212>RNA
<213>人(Homo Sapiens)<400>3accguugguu uccguagugu agugguuauc acguucgccu aacacgcgaa agguccccgg 60uucgaaaccg ggcacuacaa aaaccaac<210>4<211>30<212>RNA<213>人工序列<400>4aucuggucuc ugaugagcga aaccagagag 30<210>5<211>30<212>RNA<213>人工序列<400>5uauuccgcgc ugaugagcga aaccagagag 30<210>6<211>30<212>RNA<213>人工序列<400>6aucuggucuc ugaugagcga aacuugaugu 30<210>7<211>30<212>RNA<213>人工序列<400>7uauuccgcgc ugaugagcga aacuugaugu 30
<210>8<211>30<212>RNA<213>人工序列<400>8gggucucucu gguuagacca gaucugagcc ugggagcucu cuggcuaacu agggaaccca 60cugcuuaagc cucaauaaag cuuggcauuc cgguacuguu gguaaaaugg aagacgccaa 120aaacauaaag aaaggcccgg cgccauucua uccucuagag gauggaaccg cuggagagca 180acugcauaag gcuaugaaga gauacgcccu gguuccugga acaauugcuu uuacagaugc 240acauaucgag gugaacauca cguacgcgga auacuucgaa auguccguuc gguuggcaga 300
權(quán)利要求
1.大酶，其特征在于與具有解旋酶活性的分子結(jié)合。
2.大酶，所述大酶含有與具解旋酶活性的分子結(jié)合的區(qū)。
3.大酶，所述大酶由含有下列核苷酸序列(a)的RNA分子和含有下列核苷酸序列(b)的RNA分子形成的二聚體結(jié)構(gòu)構(gòu)成，5’X11…X1hY11…Y1iZ11…Z1jB11…B1p3’(a)5’Z21…Z2nY21…Y2mX21…X2kB21…B2q3’(b)序列中，X11…X1h、X21…X2k、Y11…Y1i、Y21…Y2m、Z11…Z1j、Z21…Z2n、B11…B1p和B21…B2q各自獨(dú)立為A、U、T、C或G，h和k為1以上的整數(shù)(例如1-100的整數(shù))，i和m為1以上的整數(shù)(例如1-100的整數(shù))，j和n為1以上的整數(shù)(例如1-100的整數(shù))，p和q為1以上的整數(shù)(例如1-100的整數(shù))；X11…X1h和X21…X2k是與目標(biāo)RNA中的特異性序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或者是含有與目標(biāo)RNA的切割位點(diǎn)周圍的序列互補(bǔ)的區(qū)和只在目標(biāo)RNA存在下可形成捕捉Mg2+(鎂離子)的孔穴的區(qū)的核苷酸序列；Y11…Y1I和Y21…Y2m是形成莖的核苷酸序列；Z11…Z1j和Z21…Z2n是含有與目標(biāo)RNA的切割位點(diǎn)周圍的序列互補(bǔ)的區(qū)和只在目標(biāo)RNA存在下可形成捕捉Mg2+的孔穴的區(qū)的核苷酸序列；B11…B1p和B21…B2q其中之一或者兩者是含有與具有解旋酶活性的分子結(jié)合的區(qū)的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求3的大酶，其中作為只在目標(biāo)RNA存在下可形成捕捉Mg2+(鎂離子)的孔穴的核苷酸序列，Z11…Z1j含有序列GAA，Z21…Z2n含有序列CUGAYZGA，YZ表示A、G、U、C任一種單核苷酸。
5.權(quán)利要求3或4的大酶，其中作為只在目標(biāo)RNA存在下可形成捕捉Mg2+的孔穴的核苷酸序列，是包含X21…X2k的序列GAA，包含X11…X1h的序列CUGA(YXGA，YX表示A、G、U、C任一種單核苷酸)的序列。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的大酶，其中具有解旋酶活性的分子為RNA解旋酶。
7.權(quán)利要求6的大酶，其中與具解旋酶活性的分子結(jié)合的區(qū)為SEQID NO.1(CTE)表示的核苷酸。
8.權(quán)利要求6的大酶，其中與具解旋酶活性的分子結(jié)合的區(qū)為SEQID NO.2(TAR)表示的核苷酸。
9.權(quán)利要求3-8中任一項(xiàng)的大酶，其中在核苷酸序列(a)和(b)各自上游添加了接頭序列和tRANval啟動(dòng)序列。
10.權(quán)利要求9的大酶，其中添加到核苷酸序列(a)上游的接頭序列含有下述核苷酸序列(e)，添加到核苷酸序列(b)上游的接頭序列含有下述核苷酸序列(f)，5’AAA 3’(e)5’UUU 3’(f)。
11.權(quán)利要求9的大酶，其中添加到核苷酸序列(a)和(b)各自上游的tRANval啟動(dòng)序列為SEQ ID NO.3。
12.權(quán)利要求9的大酶，其中在核苷酸序列(a)和(b)各自的下游添加了附加序列和終止序列。
13.權(quán)利要求12的大酶，其中添加到核苷酸序列(a)下游的附加序列含有下述核苷酸序列(g)，添加到核苷酸序列(b)下游的附加序列含有下述核苷酸序列(h)，添加到核苷酸序列(a)和(b)各自下游的終止序列含有下述核苷酸序列(i)，5’AAA 3’(g)5’AACCGUA 3’(h)5’UUUUU 3’ (i)。
14.表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有編碼權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的大酶的DNA。
15.復(fù)合體，該復(fù)合體為權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的大酶與具有解旋酶活性的分子的復(fù)合體。
16.藥物組合物，該組合物含有權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的大酶、權(quán)利要求14的表達(dá)載體或權(quán)利要求15的復(fù)合體作為有效成分。
17.切割目標(biāo)核酸的方法，該方法使用權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的大酶、權(quán)利要求14的表達(dá)載體、權(quán)利要求15的復(fù)合體進(jìn)行。
18.特異性阻礙或抑制目標(biāo)核酸的生物學(xué)機(jī)能的方法，該方法使用權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的大酶、權(quán)利要求14的表達(dá)載體或權(quán)利要求15的復(fù)合體進(jìn)行。
19.目標(biāo)核酸的生物學(xué)機(jī)能的分析方法，該方法包括用權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的大酶、權(quán)利要求14的表達(dá)載體或權(quán)利要求15的復(fù)合體特異性切割目標(biāo)核酸或者特異性阻礙目標(biāo)核酸的生物學(xué)機(jī)能，研究該切割或該阻礙對(duì)生物學(xué)活性的影響。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供無(wú)論目標(biāo)mRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)如何都可與其結(jié)合進(jìn)行有效切割的大酶。本發(fā)明可提供以與具解旋酶活性的分子結(jié)合為特征的大酶。
文檔編號(hào)C12N15/55GK1522300SQ02813198
公開日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2002年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月1日
發(fā)明者多比良和誠(chéng), 藳科知子, 藳科雅岐, 川崎廣明, 原壽史, 野澤嚴(yán), 子, 岐, 明 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所, 大正制藥株式會(huì)社, 株式會(huì)社基因功能