專(zhuān)利名稱(chēng)：擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法，控制這些反應(yīng)的方法以及試劑盒和試劑，特別是用以進(jìn)行反應(yīng)的酶。
擴(kuò)增反應(yīng)，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)已是眾所周知，并被廣泛地應(yīng)用在生物技術(shù)研究、診斷和檢測(cè)領(lǐng)域中。
PCR是根據(jù)DNA的堿基配對(duì)特性和互補(bǔ)DNA鏈的準(zhǔn)確復(fù)制，產(chǎn)生大量特定核酸序列，特別是DNA序列的步驟。典型PCR包括三個(gè)基本步驟的循環(huán)過(guò)程。
變性將含有PCR試劑的混合物(包括待復(fù)制核酸，可以是DNA或RNA(模板)；各個(gè)核苷酸堿基(A、T、G、C)；合適的引物和聚合酶)加熱至預(yù)定溫度，以使靶DNA的雙鏈分離。
退火然后將混合物冷卻至另一個(gè)預(yù)定溫度，引物定位于它們?cè)贒NA鏈上的互補(bǔ)序列，并與其結(jié)合。
延伸再次將混合物加熱至另一個(gè)預(yù)定溫度。聚合酶(作為催化劑)將各個(gè)核苷酸堿基加入到引物的末端，以形成與靶DNA的序列互補(bǔ)的DNA新鏈，雙鏈彼此結(jié)合。
這些反應(yīng)依賴(lài)于以非常精確的次序發(fā)生的步驟的順序，以及操作這些步驟所需的精確溫度。當(dāng)在不同溫度下將試劑混合即使很短時(shí)間，例如在反應(yīng)開(kāi)始前，也會(huì)產(chǎn)生一個(gè)問(wèn)題。引物可能與核酸模板相互作用，引起模板引物延伸。這樣會(huì)導(dǎo)致預(yù)期產(chǎn)物的總產(chǎn)量下降及非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。
克服該難題的多種不同方法以前已經(jīng)被提出過(guò)。例如，最初嘗試采用蠟屏障使試管中多種不同的PCR試劑彼此分離，以克服該難題(見(jiàn)例如USP5,565,339)。當(dāng)反應(yīng)混合物加熱至初始變性溫度時(shí)，蠟融化，使得試劑盡可能晚地混合，而使副反應(yīng)的可能性減到最小。這種反應(yīng)被認(rèn)為是“熱啟動(dòng)”反應(yīng)。
其它實(shí)現(xiàn)抑制副反應(yīng)的化學(xué)方法已經(jīng)被嘗試過(guò)。例如，美國(guó)專(zhuān)利No.5,677,152描述的方法中，DNA聚合酶被化學(xué)修飾，以確保其僅在高溫時(shí)具有活性。然而，為實(shí)現(xiàn)這一方法，需要在高溫溫育反應(yīng)混合物一段時(shí)間，以產(chǎn)生活性酶。這種遲滯，在一些情況中有時(shí)不顯著，但在快速要求PCR結(jié)果的情況下可能是不利的。對(duì)PCR技術(shù)的許多應(yīng)用而言，在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成循環(huán)順序是理想的。例如，特別是當(dāng)人類(lèi)消耗的空氣、液體或食物和動(dòng)物貯存物被懷疑污染的時(shí)候，快速診斷方法即使不能挽救健康也可以節(jié)省可觀(guān)的金錢(qián)，甚至可以挽救生命。
其它方法中，水生嗜熱桿菌(Taq)DNA聚合酶的單克隆抗體，如Sigma提供的抗Taq DNA聚合酶抗體，被引入反應(yīng)混合物中?？贵w結(jié)合到酶上，以使其在室溫失活。然而，在擴(kuò)增循環(huán)期間采用的高溫使抗體變性，并從酶上解離，酶從而具有活性。不過(guò)在一些情況中，該方法似乎不能除去非特異副產(chǎn)物。
在PCR反應(yīng)期間，模板的引物延伸可以被表示為
dNTP是脫氧核糖核酸三磷酸，dNMP是相應(yīng)的脫氧核糖核酸單磷酸，PPi是無(wú)機(jī)焦磷酸鹽。該反應(yīng)也可表示為
已知PPi水平的增加可使上述反應(yīng)逆向進(jìn)行，例如在DNA測(cè)序反應(yīng)中。這被認(rèn)為是焦磷酸解作用，并且在70℃采用耐熱DNA聚合酶進(jìn)行的DNA測(cè)序中，該作用是公認(rèn)的難題。通過(guò)將耐熱PPase添加到用于DNA測(cè)序中的DNA聚合酶配方中，可克服這一難題。
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)可形成優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增反應(yīng)的基礎(chǔ)，在該優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增反應(yīng)中，非特異產(chǎn)物的產(chǎn)量可被減到最小。
本發(fā)明提供了一種進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法，該方法包括在足量焦磷酸鹽存在下，形成擴(kuò)增反應(yīng)混合物，以避免引物延伸的發(fā)生；酶消化該焦磷酸鹽；并使該反應(yīng)混合物處于可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的條件下。
采用本發(fā)明的方法，可進(jìn)行精確擴(kuò)增反應(yīng)，該反應(yīng)可快速進(jìn)行，并且具有良好的特異。因此這是現(xiàn)有“熱啟動(dòng)”擴(kuò)增技術(shù)的一個(gè)好的可選方案。
用于發(fā)明方法中的初始擴(kuò)增反應(yīng)混合物總的來(lái)說(shuō)是常規(guī)混合物，如用于PCR反應(yīng)中，添加了焦磷酸鹽的混合物。因此該混合物通常包括i)含有或懷疑含有靶核酸序列的樣品；ii)至少一個(gè)雜交于該靶序列末端區(qū)域的引物；iii)鎂離子源；iv)構(gòu)成靶序列的核苷酸或核苷堿基(即DNA擴(kuò)增情況中的A，T，C，G和/或U，或RNA擴(kuò)增情況中的A，U，C和G)，及v)在實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)的溫度下耐熱的DNA聚合酶。根據(jù)實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的需要，如本領(lǐng)域所知，該混合物也可包括緩沖液。
特別的，對(duì)DNA擴(kuò)增而言，(iv)可包括核苷酸A，T，G和C；對(duì)RNA擴(kuò)增而言，可包括核苷A，U，C和G。
然而，在進(jìn)行其它基于引物的擴(kuò)增反應(yīng)，如逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)時(shí)，可以利用其它組合。
另外，試劑可以包括標(biāo)記的探針或引物，和/或其它標(biāo)記方式，諸如Sybr Green、Sybr Gold、溴化乙錠等嵌入染料，或這些染料的組合，使得應(yīng)用可被監(jiān)測(cè)，無(wú)須隨后檢測(cè)凝膠上的產(chǎn)物。這些標(biāo)記方式的性質(zhì)取決于進(jìn)行的鑒定類(lèi)型。一般的嵌入劑方法采用嵌入染料監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中雙鏈DNA中的增加情況。這些僅是準(zhǔn)鏈特異性，所以在要求檢測(cè)鏈特異性時(shí)需要其它標(biāo)記。
鏈特異性方法利用另外的核酸反應(yīng)組分監(jiān)測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)展。這些方法經(jīng)常以熒光能轉(zhuǎn)移(FET)作為檢測(cè)的基礎(chǔ)。一個(gè)或多個(gè)核酸探針由熒光分子標(biāo)記，其中一個(gè)熒光分子可作為能量供體，另一個(gè)熒光分子則是能量受體分子。有時(shí)這些分子被認(rèn)為分別是報(bào)道分子和淬滅分子。供體分子由位于其激發(fā)光譜內(nèi)的特定波長(zhǎng)的光激發(fā)，并隨后在其熒光發(fā)射波長(zhǎng)內(nèi)發(fā)光。通過(guò)多種距離依賴(lài)性能量轉(zhuǎn)移機(jī)制，受體分子接受來(lái)自供體分子的能量，從而也在該波長(zhǎng)被激發(fā)?？砂l(fā)生的熒光能量轉(zhuǎn)移的特定實(shí)例是熒光共振能量轉(zhuǎn)移或“FRET”。通常，當(dāng)受體分子與供體分子極為接近(如，位于同一分子，或鄰近分子)時(shí)，受體分子接受供體分子的發(fā)射能。熒光能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)的基礎(chǔ)是監(jiān)測(cè)供體和受體發(fā)射波長(zhǎng)的改變。
有兩種常用的FET或FRET探針類(lèi)型，一類(lèi)利用核酸探針的水解作用使供體與受體分離，另一類(lèi)利用雜交作用改變供體與受體分子的空間關(guān)系。
水解探針是商業(yè)上可獲得的，如TaqManTM探針。這類(lèi)探針由供體和受體分子標(biāo)記的DNA寡聚核苷酸組成。探針被設(shè)計(jì)為結(jié)合到PCR產(chǎn)物的一條鏈上的特定區(qū)域。
在PCR引物退火到該鏈上后，Taq酶通過(guò)5’到3’的聚合酶活性延伸DNA。Taq酶也抑制5’到3’的核酸外切酶活性。在3’末端，磷酸化作用保護(hù)TaqManTM探針，使其不能引發(fā)Taq延伸。如果TaqManTM探針被雜交到產(chǎn)物鏈，延伸的Taq分子也可水解探針，從受體釋放出供體作為檢測(cè)的基礎(chǔ)。該情況中的信號(hào)是累積的，游離供體和受體分子的濃度隨著擴(kuò)增反應(yīng)的每一個(gè)循環(huán)而增加。
美國(guó)專(zhuān)利No.5,491,063描述了一種熒光標(biāo)記探針的溶液內(nèi)猝滅的方法，該方法依賴(lài)于通過(guò)DNA結(jié)合劑對(duì)來(lái)自標(biāo)記的單鏈寡核苷酸的信號(hào)進(jìn)行的修飾。聚合酶鏈反應(yīng)期間，探針裂解(水解作用)后，由于探針的鏈長(zhǎng)度減少引起的該信號(hào)的差異被認(rèn)為提供了一種檢測(cè)靶核酸是否存在的方法。
雜交探針有許多形式可利用。分子信標(biāo)是具有互補(bǔ)的5’和3’序列，并因此形成發(fā)夾環(huán)的寡聚核苷酸。當(dāng)發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)形成時(shí)，末端熒光標(biāo)記是處于極為接近便于發(fā)生FRET的位置。分子信標(biāo)雜交到互補(bǔ)序列后，熒光標(biāo)記便被分離了，所以FRET不會(huì)發(fā)生，并且這形成了檢測(cè)基礎(chǔ)。
也可采用成對(duì)的標(biāo)記寡聚核苷酸。它們?cè)赑CR產(chǎn)物鏈上極為接近的位置上雜交，使供體和受體分子結(jié)合，以使FRET可以發(fā)生。增強(qiáng)的FRET是檢測(cè)的基礎(chǔ)。這種類(lèi)型的變體包括采用具有單一鄰近探針的標(biāo)記擴(kuò)增引物。
美國(guó)專(zhuān)利No.4,868,103概括地描述了檢測(cè)分析物是否存在的FRET體系，該體系利用嵌入染料作為供體分子。該方法不包括擴(kuò)增期。
利用FET或FRET檢測(cè)的分析的其它實(shí)例有，WO 99/28500描述了利用嵌入染料和單一標(biāo)記探針的組合作為信號(hào)傳遞體系，WO 99/28501描述了利用標(biāo)記引物和酶的組合以產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)，WO99/42611描述了利用嵌入染料與熒光標(biāo)記的核苷酸的組合作為信號(hào)基礎(chǔ)。然而作為補(bǔ)充，例如在WO 99/66071中描述的進(jìn)一步分析是利用包括標(biāo)記和化學(xué)阻滯劑的復(fù)合引物。
用于本發(fā)明方法中的反應(yīng)混合物可以包括任何進(jìn)行上述分析進(jìn)行所必需的標(biāo)記試劑。這種反應(yīng)混合物尤其可以有利地被應(yīng)用在基因型分析中，并且更為特別的是應(yīng)用在SNP評(píng)估中。這些情況中，本發(fā)明的方法與雙TaqManTM探針聯(lián)合使用，一個(gè)探針特異于基礎(chǔ)序列，另一個(gè)探針則特異于突變體。每一個(gè)探針優(yōu)選地含有不同的熒光團(tuán)，因此依賴(lài)于存在基因的不同形式的數(shù)量便產(chǎn)生了不同的信號(hào)。單一信號(hào)產(chǎn)生自純合體，混合的信號(hào)產(chǎn)生自雜合體。
本發(fā)明范圍內(nèi)可用的合適DNA聚合酶的實(shí)例是耐熱聚合酶，如水生棲熱菌聚合酶(Taq)、嗜熱棲熱菌聚合酶(Tth)、棲熱菌NH聚合酶(TspNH)、Thermus brockianus聚合酶(Tbr)(以上均可獲得自例如GeneSys Limited，F(xiàn)arnborough，U.K.)、激烈火球菌聚合酶(Pfu)(可獲得自Stratagene)、9°N7外DNA聚合酶、Thermococcuslitoralis DNA聚合酶(可獲得自New England Biolabs，為VENTTMDNA聚合酶)。
用于本發(fā)明方法中的焦磷酸鹽可以是任何可溶性焦磷酸鹽，包括可溶性金屬和非金屬(如銨鹽)。這種化合物通常被認(rèn)為是“無(wú)機(jī)焦磷酸鹽”或PPi，本申請(qǐng)采用該術(shù)語(yǔ)。特別地，焦磷酸鹽可為堿金屬焦磷酸鹽，如焦磷酸鈉或焦磷酸鉀，包括焦磷酸二鈉(Na2H2P2O7)、無(wú)水焦磷酸四鈉(Na4P2O7)、十水合焦磷酸四鈉(Na4P2O7·10H2O)和焦磷酸四鉀(無(wú)水)。其它可應(yīng)用的可溶性焦磷酸鹽包括焦磷酸鐵，如焦磷酸鐵(Fe4(P2O7)3)，可溶性銨鹽如無(wú)水焦磷酸三丁銨。其它可溶性焦磷酸鹽可通過(guò)商業(yè)渠道獲得。
優(yōu)選的無(wú)機(jī)焦磷酸鹽是焦磷酸四鈉，分子式為Na4P2O7。
反應(yīng)混合物應(yīng)用的焦磷酸鹽的濃度應(yīng)該足以阻止引物延伸的發(fā)生。這在很大程度上取決于擴(kuò)增序列的特性和濃度，采用的引物和聚合酶及其濃度，并其在任何特定情況下都可通過(guò)常規(guī)方法測(cè)定。
最初形成的反應(yīng)混合物合適地含有至少0.5mM濃度的焦磷酸鹽，合適的是至少1mM，例如1-10mM，優(yōu)選的是1-5mM。
無(wú)機(jī)焦磷酸鹽的酶消化作用是在擴(kuò)增反應(yīng)的第一個(gè)階段期間或之前立即合適地進(jìn)行。該作用可通過(guò)在擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始之前立即添加焦磷酸酶(Ppase)(可被認(rèn)為是無(wú)機(jī)焦磷酸酶-PPiase)實(shí)現(xiàn)。
然而，酶消化作用優(yōu)選的是采用在高溫下，如超過(guò)50℃仍具有活性的耐熱焦磷酸酶實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)選的酶僅在這些高溫下具有有效活性。這意味著在形成反應(yīng)混合物時(shí)，焦磷酸酶可以被包括其中，但是它在常溫則不能或不能有效地消化抑制性焦磷酸鹽。僅當(dāng)反應(yīng)混合物在必要時(shí)被加熱時(shí)，如在PCR反應(yīng)的起始變性階段，焦磷酸酶才具有適當(dāng)?shù)幕钚?。不過(guò)可以在高溫下進(jìn)行短暫的初步溫育，如50-100℃，及優(yōu)選的是80-95℃。
耐熱焦磷酸酶的實(shí)例包括可獲得自GeneSys Limited，F(xiàn)arnborough UK.的嗜酸熱硫化葉菌焦磷酸酶(Sac PPase-Meyer etal.，Achieves of Biochem.and Biophys.(1995)319，1，149-156)，或可獲得自New England Biolabs(目錄號(hào)#M0296S和#M0296L)的Thermococcus litoralis焦磷酸酶。優(yōu)選的耐熱焦磷酸酶是可獲得自Genesys Limited，F(xiàn)arnborough UK的Aeropyrum pernix無(wú)機(jī)焦磷酸酶。
第一種嚴(yán)格需氧的高度嗜熱的古生菌，Aeropyrum pernix K1，是1993年在Kodaka ra-Jima Island，Japan，從海岸硫化熱噴泉中分離而來(lái)(Sako et al.，Int.J.Syst.Bacteriol.46(1996)1070-1077)。保藏于日本微生物保藏中心，JCM 9820。
申請(qǐng)人首次從Aeropyrum pernix中分離出耐熱焦磷酸酶，并且這構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。包括該焦磷酸酶的基因組序列，如SEQ ID NO.1所示，相應(yīng)的氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示(下文

圖11)。發(fā)明的酶特別具有如SEQ ID NO 25所示的氨基酸序列，該序列被圖11中黑體顯示的SEQ ID NO 1區(qū)域編碼，也如SEQ ID NO 26所示。
因此，本發(fā)明包括含有SEQ ID NO 26的多核苷酸和其變體或片段。例如，發(fā)明提供了SEQ ID NO 1的多核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步包括含有SEQ ID NO 25的氨基酸序列和其變體或片段。例如，該氨基酸序列可包含SEQ ID NO 2。
此處所用與多核苷酸序列相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“其片段”指具有與完整多核苷酸序列相同活性的已知多核苷酸序列的任何部分。片段合適地包含至少300個(gè)，優(yōu)選地包含至少450個(gè)來(lái)自基礎(chǔ)序列的連續(xù)堿基。
與多核苷酸序列相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“其變體”指任何在多核苷酸上發(fā)生的一個(gè)或多個(gè)核酸的取代、變異、修飾、置換、缺失、或添加，提供了多核苷酸編碼的相應(yīng)蛋白質(zhì)序列，該序列顯示了與基礎(chǔ)序列編碼的蛋白質(zhì)相同的特性。因此該術(shù)語(yǔ)包括等位變體，也包括與本發(fā)明多核苷酸序列基本雜交的多核苷酸。優(yōu)選的這種雜交作用發(fā)生在低和高嚴(yán)格性條件下或之間。概括地，低嚴(yán)格性條件可定義為3×SSC在約室溫到約55℃，高嚴(yán)格性條件為0.1×SSC在約65℃。SSC是0.15M NaCl，0.015M檸檬酸三鈉緩沖液的名稱(chēng)。3×SSC是SSC的三倍強(qiáng)度等等。
典型的變體具有62％或更多的核苷酸與本發(fā)明的多核苷酸序列相同，更典型的是65％，優(yōu)選的是70％，甚至更為優(yōu)選的是80％或85％，特別優(yōu)選的是90％，95％，98％或99％或更高的同一性。
為測(cè)定同一性程度，比較核酸序列時(shí)，可采用諸如BESTFIT和GAP程序(均來(lái)自Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)軟件包)。例如BESTFIT比較兩種序列，并生成最相似區(qū)段的最佳比對(duì)。GAP可使序列沿其全長(zhǎng)比對(duì)，并通過(guò)在任一適當(dāng)序列中插入間隔，從而找到最佳比對(duì)。合適地，在本發(fā)明范圍內(nèi)，當(dāng)討論核酸序列同一性時(shí)，是通過(guò)沿其全長(zhǎng)排列序列進(jìn)行比較的。
此處所用與氨基酸序列相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“其片段”指具有與完整氨基酸序列相同活性的已知氨基酸序列的任意部分。片段合適地包含至少100個(gè)，優(yōu)選地包含至少150個(gè)來(lái)自基礎(chǔ)序列的連續(xù)氨基酸。
此處所用與氨基酸序列相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“其變體”指與其來(lái)源的基礎(chǔ)序列不同，即基礎(chǔ)序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸被其它氨基酸所取代而得到的氨基酸序列。氨基酸取代作用可被認(rèn)為是“保守的”，即氨基酸被具有廣泛相似特性的不同氨基酸所置換。非保守取代作用是指氨基酸被不同類(lèi)型氨基酸所置換。一般地說(shuō)，不改變多肽的生物學(xué)活性的更少非保守取代是可能的。合適的變體與基礎(chǔ)序列有至少60％，優(yōu)選至少75％，更為優(yōu)選至少90％的同一性。
在該情況中的同源性是可以被判定的，例如運(yùn)用Lipman-Pearson算法，設(shè)置Ktuple2，空位罰分4，空位長(zhǎng)度罰分12，標(biāo)準(zhǔn)PAM評(píng)分矩陣(Lipman，D.J.and Pearson，W.R.，Rapid and Sensitive ProteinSimilarity Searchs，Science，1985，vol.227，1435-1441)。
優(yōu)選的本發(fā)明的多核苷酸包含SEQ ID NO 26和與其相比具有超過(guò)6 2％同一性的序列。
這些酶可從天然來(lái)源獲得，或可采用常規(guī)方法于重組宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)。
除去焦磷酸鹽，如于＞50℃，通過(guò)耐熱焦磷酸酶(PPase)作用，然后如常規(guī)進(jìn)行引物延伸(并因此擴(kuò)增)。該過(guò)程中，1摩爾的焦磷酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)?摩爾不干擾擴(kuò)增反應(yīng)的無(wú)機(jī)磷酸鹽(Pi)。
所包含焦磷酸酶的量應(yīng)當(dāng)足以消化反應(yīng)混合物中存在的過(guò)量焦磷酸鹽。一般而言，這個(gè)量應(yīng)大于常規(guī)用于相同循環(huán)反應(yīng)中那些酶的量，以阻止焦磷酸解作用的發(fā)生，例如大約5倍多。準(zhǔn)確的量取決于多種不同因素，包括采用的特定酶，焦磷酸鹽的濃度等。擴(kuò)增反應(yīng)混合物中包括的PPase和特定耐熱PPase的典型濃度為至少0.04個(gè)單位/50μL PCR反應(yīng)混合物，優(yōu)選至少含有0.08個(gè)單位/50μL PCR反應(yīng)混合物，更為優(yōu)選的是含有0.2-10個(gè)單位/50μL PCR反應(yīng)混合物。該情況中，一個(gè)單位被定義為1分鐘內(nèi)，75℃和下列反應(yīng)條件下1mMK4P2O7，2mM MgCl2，50mM Tris-HCl，pH9.0(25℃)，催化1μmol焦磷酸鹽轉(zhuǎn)化為2μmol正磷酸鹽所需要的酶的量。
本發(fā)明方法中的酶可迅速除去無(wú)機(jī)焦磷酸鹽，這取決于采用的溫度。通?？稍谏儆?分鐘的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全除去，更為通常的是在少于2分鐘的時(shí)間內(nèi)，如果需要可少至15秒。
一旦從反應(yīng)混合物中酶促除去了無(wú)機(jī)焦磷酸鹽，便可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，例如采用常規(guī)熱循環(huán)程序。
本發(fā)明方法借以達(dá)到預(yù)期結(jié)果的機(jī)制尚不清楚?？赡苁沁^(guò)量焦磷酸鹽的存在抑制了引物延伸反應(yīng)。不過(guò)，似乎沒(méi)有顯著降低PCR靈敏度或產(chǎn)量。
本發(fā)明方法可在任何常規(guī)設(shè)備中進(jìn)行以進(jìn)行應(yīng)用反應(yīng)。這些設(shè)備包括Perkin-Elmer Corporation提供的常規(guī)封閉加熱設(shè)備如EP-A-0810030，或Idaho Technologies Inc.提供的快速熱空氣熱循環(huán)儀如RapidCyclerTM和LightCyclerTM，或如WO98/24548中描述的其它類(lèi)型的熱循環(huán)儀。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒。該試劑盒包含無(wú)機(jī)焦磷酸鹽、無(wú)機(jī)焦磷酸酶，及擴(kuò)增反應(yīng)所需任選的一種或多種試劑。如上所述，無(wú)機(jī)焦磷酸鹽合適地足量存在，以抑制擴(kuò)增反應(yīng)。試劑盒中存在的無(wú)機(jī)焦磷酸酶優(yōu)選的量足以消化所有該無(wú)機(jī)焦磷酸鹽。
一種或多種試劑包括上文所列(ii)-(v)試劑中的任意一種，并且也可包括緩沖液。無(wú)機(jī)焦磷酸酶的特定實(shí)例是上述的耐熱無(wú)機(jī)焦磷酸酶。
特別的，試劑盒可以合適地包含一種任選的附加試劑，一種或多種進(jìn)行擴(kuò)增特定靶DNA序列所需的引物，例如一種診斷特定疾病條件或樣品中特定病原體是否存在的序列。該方法也可被用于檢測(cè)遺傳分析中的多態(tài)性或等位變異。
此外，試劑盒可以包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記試劑，如嵌入染料，或熒光標(biāo)記的探針、引物或核苷酸，這些試劑將有助于原位檢測(cè)或監(jiān)測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)。
另一方面中，本發(fā)明提供了上述無(wú)機(jī)焦磷酸鹽在進(jìn)行上述擴(kuò)增反應(yīng)的方法中的用途。優(yōu)選的無(wú)機(jī)焦磷酸酶是來(lái)自Aeropyrum pernix。
最后，在另一方面中，本發(fā)明提供了上述無(wú)機(jī)焦磷酸酶在進(jìn)行上述擴(kuò)增反應(yīng)的方法中的用途。
現(xiàn)在，將通過(guò)附有簡(jiǎn)圖的實(shí)施例特別詳細(xì)地描述本發(fā)明。
圖1顯示的是在不同量的PP i存在下進(jìn)行PCR的結(jié)果，其中PPi為焦磷酸三鈉；圖2顯示的是在3mM PPi缺乏或存在情況下增加MgCl2的效果；圖3顯示的是采用本發(fā)明方法和常規(guī)PCR反應(yīng)獲得的結(jié)果；圖4顯示的是在分析中采用本發(fā)明方法，并與常規(guī)PCR比較所獲得的結(jié)果；圖5顯示的是測(cè)試本發(fā)明方法所用PCR反應(yīng)混合物的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并與常規(guī)混合物的結(jié)果進(jìn)行比較；圖6顯示的是在本發(fā)明方法中采用不同PPase所獲得的結(jié)果；圖7a和7b及圖8a和8b顯示的是采用本發(fā)明方法和多種不同DNA聚合酶進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)果；圖9顯示的是比較本發(fā)明方法與常規(guī)“熱啟動(dòng)”P(pán)CR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖10顯示的是進(jìn)行類(lèi)似試驗(yàn)，但采用可選的常規(guī)PCR所獲得的結(jié)果；圖11顯示的是如SEQ ID NO.1所示的Aeropyrum pernix的基因組序列(參考GenBank BA000002中的NC 000854)、相應(yīng)的氨基酸序列SEQ ID NO.2和酶的序列(SEQ ID NO 25)；圖12顯示的是不同PPase序列(SEQ ID NOS 2-9)的比對(duì)，包括如SEQ ID NO.2所示的Aeropyrum pernix的蛋白質(zhì)序列；圖13顯示的是從Aeropyrum pernix分離焦磷酸酶期間產(chǎn)生的686個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物(SEQ ID NO 10)；圖14顯示的是從Aeropyrum pernix分離焦磷酸酶所用的多接頭序列(SEQ ID NO 11)；圖15顯示的是從Aeropyrum pernix分離焦磷酸酶所用的pTTQ18NHK載體的序列(SEQ ID NO 12)；圖16顯示的是pTTQ18NHK載體的序列(Z＝終止)，包括從Aeropyrum pernix分離焦磷酸酶所用的PPase序列(SEQ ID NO 13)；及圖17顯示的是本發(fā)明方法采用來(lái)自Aeropyrum pernix的無(wú)機(jī)焦磷酸酶所獲得的結(jié)果。
實(shí)施例1PPi對(duì)PCR的影響在不同量的無(wú)機(jī)焦磷酸鹽，十水合焦磷酸四鈉(PPi)存在下采用Taq DNA聚合酶及下列試劑，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)500bpλ模板PCR。
λ500bp引物序列5’引物 GAT GAG TTC GTG TCC GTA CAA CTG G(SEQ ID NO 14)3’引物 GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CGC C(SEQ ID NO 15)1×反應(yīng)緩沖液10mM Tris.pH8.0，50mM KCl。
用于試驗(yàn)的PCR條件如下i)94℃ 3.00分鐘ii)20個(gè)循環(huán)的94℃ 10秒50℃ 10秒72℃ 30秒iii)72℃ 7分鐘
iv)25℃保持添加PPi使其在反應(yīng)混合物中的最終濃度為0、1、2、3、4和5mM。結(jié)果如圖1所示。該圖中，泳道與PPi的下列濃度對(duì)應(yīng)。
泳道1+2 0 PPi3+4 1mM PPi5+6 2mM PPi7+8 3mM PPi9+10 4mM PPi11 5mM PPi在所有測(cè)試的PPi水平上，均沒(méi)有產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例2增加鎂離子濃度的影響Mg結(jié)合PPi，因此實(shí)施例1的觀(guān)測(cè)結(jié)果有可能是由于Mg被過(guò)量的PPi螯合而產(chǎn)生。這導(dǎo)致存在的Mg不足以使引物延伸得以進(jìn)行。為消除這種可能性，在不同濃度鎂離子存在下重復(fù)進(jìn)行采用3mM PPi的實(shí)施例1的步驟。
結(jié)果如圖2所示。該圖中，泳道代表下列反應(yīng)泳道1+21.5mM MgCl23+45mM MgCl25+67.5mM MgCl27+810mM MgCl29+10 1.5mM MgCl2+3mM PPi11+12 5mM MgCl2+3mM PPi13+14 7.5mM MgCl2+3mM PPi15 10mM MgCl2+3mM PPi結(jié)果顯示添加Mg++高達(dá)10mM最終濃度(1.5mM是PCR中的標(biāo)準(zhǔn))，也不能使PCR發(fā)生，這表明是PPi阻滯了引物延伸。
實(shí)施例3在PPi和PPase存在下的PCR反應(yīng)重復(fù)實(shí)施例1的500bpλPCR，不過(guò)這次在含焦磷酸鹽(PPi)的反應(yīng)中包括了0.2u的嗜酸熱硫化葉菌PPase(Sac PPase)。在0.2u的Sac PPase存在下，于95℃溫育反應(yīng)5分鐘，足以破壞焦磷酸鹽，使PCR反應(yīng)得以進(jìn)行。
結(jié)果如圖3所示，其中泳道代表下列反應(yīng)泳道上排1+2 1mM PPi+0.2u PPase3+4 2mM PPi+0.2u PPase5+6 3mM PPi+0.2u PPase7+8 4mM PPi+0.2u PPase9+10 5mM PPi+0.2u PPase下排1+2 1mM PPi3+4 2mM PPi5+6 3mM PPi7+8 4mM PPi9+10 5mM PPi11+120mM PPi當(dāng)與沒(méi)有PPi和PPase二者參與的反應(yīng)相比時(shí)，產(chǎn)生了PCR產(chǎn)物的可比較水平。
采用小于1mM的PPi濃度重復(fù)該實(shí)施例。結(jié)果(未示出)表明0.4mM的PPi不能完全抑制PCR，但在PPi濃度為0.6mM時(shí)，PCR不能發(fā)生。
實(shí)施例4PCR試驗(yàn)將本發(fā)明方法應(yīng)用到需要“熱啟動(dòng)”反應(yīng)的試驗(yàn)體系，以產(chǎn)生正確大小的PCR產(chǎn)物。
試驗(yàn)基于人類(lèi)血管緊張素基因的321bp片段的擴(kuò)增。該試驗(yàn)被認(rèn)為僅在甜菜堿存在情況下可產(chǎn)生正確擴(kuò)增產(chǎn)物(EP-A-0962526-具體見(jiàn)實(shí)施例8)。
無(wú)甜菜堿存在時(shí)，熱啟動(dòng)DNA聚合酶產(chǎn)生很少或根本不產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，反之，非熱啟動(dòng)DNA聚合酶PCR可產(chǎn)生大量非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
血管緊張素試驗(yàn)所用的PCR條件可概括如下試劑 體積 最終濃度10×反應(yīng)緩沖液5μl1×25mM MaCl23μl1.5Mm5mM dNTPs 2μl200μM5’引物(100μm) 0.250.5/μM3’引物(100μm) 0.250.5/μM模板100ng/μl 50ng人類(lèi)xsomal DNA5M甜菜堿 10.01MDNA聚合酶(5u/μl) 0.251.25u加水至總體積 50.0μl血管緊張素引物序列5’引物GCA ACG CCC CTC ACT ATA AA (SEQ ID NO 16)3’引物GCA CCC CGC CCT TGA AGT CC (SEQ ID NO 17)1×反應(yīng)緩沖液10mM Tris.pH8.0，50mM KCl。
用于試驗(yàn)的PCR條件如下i)95℃2分鐘或少于2分鐘ii)35個(gè)循環(huán)的95℃ 15秒50℃ 30秒72℃ 30秒iii)72℃ 7分鐘iv)25℃保持采用PE9700儀器，在實(shí)施例3所述3mM PPi和0.2u PPase的存在情況下進(jìn)行反應(yīng)。
結(jié)果如圖4所示，其中泳道代表下列反應(yīng)。
泳道1標(biāo)準(zhǔn)Taq聚合酶PCR—無(wú)甜菜堿—許多錯(cuò)誤引發(fā)2標(biāo)準(zhǔn)Taq聚合酶PCR—有甜菜堿—亮條帶是正確產(chǎn)物—有一些錯(cuò)誤引發(fā)
3標(biāo)準(zhǔn)Taq聚合酶PCR—無(wú)甜菜堿，但有3mM PPi和0.2u SacPPase—無(wú)錯(cuò)誤引發(fā)--95℃下5分鐘變性4標(biāo)準(zhǔn)Taq聚合酶PCR—有甜菜堿，還有3mM PPi和0.2u SacPPase—僅有正確產(chǎn)物--95℃下5分鐘變性5+6按照3的反應(yīng)，但在95℃下僅2分鐘變性7+8按照4的反應(yīng)，但在95℃下僅2分鐘變性很明顯，采用本發(fā)明方法可實(shí)現(xiàn)有效的“熱啟動(dòng)”反應(yīng)。在甜菜堿存在情況下，采用PPi和Sac PPase可獲得純的單一產(chǎn)物。另外，未發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤引發(fā)，甚至在甜菜堿不存在的情況下，也未發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤引發(fā)。
實(shí)施例5室溫儲(chǔ)存的影響研究在進(jìn)行血管緊張素試驗(yàn)前，將含0.2u Sac PPase和3mM PPi的PCR混合物置于室溫20℃，持續(xù)不同時(shí)間段的影響。盡管Sac PPase是耐熱酶，但仍然可能在室溫下具有低水平的酶活性。這可能導(dǎo)致反應(yīng)中抑制/終止DNA聚合酶的PPi的量不足，從而引起引物延伸，并缺乏“熱啟動(dòng)”功能性。
重復(fù)實(shí)施例4的方法，但是在進(jìn)行試驗(yàn)前將反應(yīng)混合物儲(chǔ)存于室溫，持續(xù)不同時(shí)間段最長(zhǎng)達(dá)2小時(shí)。
結(jié)果如圖5所示，其中上排—顯示的是室溫下溫育試劑所示的時(shí)間后，進(jìn)行血管緊張素的常規(guī)Taq聚合酶PCR的結(jié)果(有或無(wú)甜菜堿存在)；及下排—顯示的是根據(jù)本發(fā)明方法的相似的一組試驗(yàn)，在所有情況下，每50μl PCR試驗(yàn)混合物中含有3mM PPi和0.2u PPase。
泳道甜菜堿的存在22℃持續(xù)時(shí)間段(室溫)1+2-03+4+05+6-30mins7+8+30mins9+10 -60mins11+12 +60mins13+14 -120mins15+16 +120mins
甚至在2小時(shí)以后，根據(jù)本發(fā)明的試驗(yàn)仍然如預(yù)想進(jìn)行，表明室溫下，Sac PPase對(duì)PPi的消化是不充分的。
圖5顯示的結(jié)果表明如果采用PPi和Sac PPase，在PCR前將PCR混合物室溫溫育2小時(shí)對(duì)特異性沒(méi)有影響。
實(shí)施例6其它耐熱PPase在本發(fā)明方法中的用途重復(fù)實(shí)施例4的試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行相似反應(yīng)，采用不同的商業(yè)可獲得耐熱PPase(具有不同單位定義的活性)取代Sac PPase。結(jié)果如圖6所示，其中泳道代表下列反應(yīng)泳道1+2標(biāo)準(zhǔn)Taq聚合酶PCR-無(wú)甜菜堿3+4標(biāo)準(zhǔn)Taq聚合酶PCR-有甜菜堿5+6標(biāo)準(zhǔn)Taq聚合酶PCR-無(wú)甜菜堿，但有3mM PPi和0.2u SacPPase7+8標(biāo)準(zhǔn)Taq聚合酶PCR-有甜菜堿，及3mM PPi和0.2u Sac PPase9+10標(biāo)準(zhǔn)Taq聚合酶PCR-無(wú)甜菜堿，但有3mM PPi和10u*Thermococcus litoralis PPase11+12標(biāo)準(zhǔn)Taq聚合酶PCR-有甜菜堿，及3mM PPi和10u*Thermococcus litoralis PPase*該情況采用的單位由生產(chǎn)商提供，定義為于標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下(50mM Tricine[pH8.5]、1mM MgCl2、0.32mM PPi、0.5ml反應(yīng)體積中，75℃反應(yīng)10分鐘)，每分鐘可產(chǎn)生40nmol磷酸鹽的酶的量。
該試驗(yàn)中Thermococcus litoralis PPase(獲得自New EnglandBiolabs)似乎具有與Sac PPase相同的效果。
實(shí)施例7不同耐熱DNA聚合酶在發(fā)明方法中的用途在本發(fā)明方法和一些比較試驗(yàn)中，應(yīng)用了多種耐熱DNA聚合酶。這些酶包括一些未校正的棲熱菌DNA聚合酶、校正的超耐高度嗜熱的古生菌DNA聚合酶，及未校正和校正的DNA聚合酶的混合物。
采用如實(shí)施例1所述的500bpλPCR測(cè)試所有酶(圖7a和7b)，個(gè)別采用實(shí)施例4所述血管緊張素試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試(圖8a和8b)。
具體試驗(yàn)條件概括如下圖7a—棲熱DNA聚合酶泳道上排1+2 Taq聚合酶0mM PPi，無(wú)PPase3+4 Taq聚合酶3mM PPi，無(wú)PPase5+6 Taq聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase7+8 Tbr聚合酶0mM PPi，無(wú)PPase9+10 Tbr聚合酶3mM PPi，無(wú)PPase11+12 Tbr聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase下排1+2 Tth聚合酶0mM PPi，無(wú)PPase3+4 Tth聚合酶3mM PPi，無(wú)PPase5+6 Tth聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase7+8 TspNH聚合酶0mM PPi，無(wú)PPase9+10 TspNH聚合酶3mM PPi，無(wú)PPase11+12 TspNH聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase圖7b—古生菌校正DNA聚合酶泳道上排1+2 Pfu聚合酶0mM PPi，無(wú)PPase3+4 Pfu聚合酶3mM PPi，無(wú)PPase5+6 Pfu聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase7+8 9°N外聚合酶0mM PPi，無(wú)PPase9+10 9°N外聚合酶3mM PPi，無(wú)PPase11+12 9°N外聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase下排1+2 VENT聚合酶0mM PPi，無(wú)PPase3+4 VENT聚合酶3mM PPi，無(wú)PPase5+6 VENT聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase圖8a血管緊張素試驗(yàn)，無(wú)PPi，無(wú)Sac PPase(有和無(wú)甜菜堿)
泳道1+2Taq聚合酶無(wú)甜菜堿3+4Taq聚合酶有甜菜堿5+6Accurase聚合酶無(wú)甜菜堿7+8Accurase聚合酶有甜菜堿9+10 Tbr聚合酶無(wú)甜菜堿11+12 Tbr聚合酶有甜菜堿13+14 Tth聚合酶無(wú)甜菜堿15+16 Tth聚合酶有甜菜堿圖8b血管緊張素試驗(yàn)，有PPi，有Sac PPase(有和無(wú)甜菜堿)對(duì)照泳道為1-4(上排)和12-16(下排)泳道上排1+2 Taq聚合酶，無(wú)甜菜堿，有3mM PPi，無(wú)Sac PPase3+4 Taq聚合酶，有甜菜堿，有3mM PPi，無(wú)Sac PPase以下全部有3mM PPi和0.2u Sac PPase5+6 Taq聚合酶，無(wú)甜菜堿7+8 Taq聚合酶，有甜菜堿9+10 Accurase聚合酶，無(wú)甜菜堿11+12 Accurase聚合酶，有甜菜堿13+14 Tbr聚合酶，無(wú)甜菜堿15+16 Tbr聚合酶，有甜菜堿下排以下全部有3mM PPi和0.2u Sac PPase1+2Tth聚合酶無(wú)甜菜堿3+4Tth聚合酶有甜菜堿5+6TspNH聚合酶無(wú)甜菜堿7+8TspNH聚合酶有甜菜堿9+10 Pfu聚合酶無(wú)甜菜堿11+12 Pfu聚合酶有甜菜堿13+14 Taq聚合酶對(duì)照無(wú)甜菜堿，無(wú)PPi或PPase
15+16 Taq聚合酶對(duì)照有甜菜堿，無(wú)PPi或PPase測(cè)試的所有DNA聚合酶均受PPi抑制，采用Sac PPase可克服該抑制作用。
比較實(shí)施例8本發(fā)明方法與常規(guī)“熱啟動(dòng)”方法學(xué)的比較我們有一些原始結(jié)果(圖9和10)顯示化學(xué)修飾的Taq聚合酶(如美國(guó)專(zhuān)利No 5,677,152所述方法進(jìn)行修飾)在缺乏甜菜堿時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些錯(cuò)誤PCR產(chǎn)物，但在甜菜堿存在情況下可得到正確產(chǎn)物。
圖9血管緊張素試驗(yàn)泳道1+2 Taq聚合酶，無(wú)甜菜堿3+4 Taq聚合酶，有甜菜堿5+6 化學(xué)修飾的Taq，無(wú)甜菜堿7+8 化學(xué)修飾的Taq，有甜菜堿9+10 本發(fā)明的方法(3mM PPi和2u Sac PPase)，無(wú)甜菜堿11+12 本發(fā)明的方法(3mM PPi和2u Sac PPase)，有甜菜堿看來(lái)在這些環(huán)境下，化學(xué)修飾的酶是無(wú)活性的，直到在95℃下激活10分鐘才具有活性。沒(méi)有經(jīng)過(guò)初步溫育時(shí)，產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物少到可以忽略。因?yàn)榛瘜W(xué)修飾的Taq在室溫是無(wú)活性的，所以難以解釋在缺乏甜菜堿時(shí)產(chǎn)生錯(cuò)誤PCR產(chǎn)物和明顯錯(cuò)誤引發(fā)的原因。
圖10血管緊張素試驗(yàn)，有Taq和抗Taq抗體泳道1+2 抗-Taq抗體加Taq聚合酶，無(wú)甜菜堿3+4 抗-Taq抗體加Taq聚合酶，有甜菜堿在抗Taq DNA聚合酶抗體介導(dǎo)的熱啟動(dòng)中，在缺乏甜菜堿的情況下產(chǎn)生大量的錯(cuò)誤產(chǎn)物(與無(wú)甜菜堿的標(biāo)準(zhǔn)Taq聚合酶PCR類(lèi)似)，并且在甜菜堿存在的情況下，伴隨正確產(chǎn)物也產(chǎn)生了極少的錯(cuò)誤產(chǎn)物。
發(fā)明方法似乎給出比這些商業(yè)HotStart方法學(xué)更為特異的快速PCR反應(yīng)。
實(shí)施例9從Aeropyrum pernix分離無(wú)機(jī)焦磷酸酶從J.C.M.保藏中心獲得Aeropyrum pernix?？寺?、表達(dá)并純化無(wú)機(jī)焦磷酸酶。
從A.pernix克隆并表達(dá)無(wú)機(jī)焦磷酸酶包含Aeropyrum pernix的焦磷酸酶基因的基因組序列如圖11所示。所用的引物是從Aeropyrum pernix的基因組序列設(shè)計(jì)而來(lái)。這些引物以5’-3’的順序如下所示，并具有黑體顯示的限制酶切位點(diǎn)。
來(lái)自具有其它焦磷酸鹽基因的基因組的推斷序列的比對(duì)表明后一個(gè)ATG應(yīng)該是起始蛋氨酸，并非數(shù)據(jù)庫(kù)所顯示的那樣(圖11SEQ ID NO.1中的斜體顯示)，并且酶的氨基酸序列實(shí)際上如SEQ ID NO 25所示。因此根據(jù)后一個(gè)蛋氨酸設(shè)計(jì)引物(圖11SEQ ID NO.1中的黑體顯示)。
采用100ng的Aeropyrum pernix DNA和50pM的上述引物，在100μl反應(yīng)體積中進(jìn)行PCR。進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，55℃退火，45秒延伸時(shí)間。
最初在94℃保持3分鐘。
20個(gè)循環(huán)的94℃，10秒，55℃，10秒，68℃，45秒。
最終在72℃保持7分鐘。
PCR條件50pM上引物(5’......TGCATGCATATGACAGGCTGTCTGAAAATTG..3′-SEQID NO 18)50pM下引物(5’......TAAGTGTAAGCTTGACTGTGGGGGCGGTGAAAG..3′-SEQ ID NO 19)1.5mM MgCl21.25u Accurase DNA聚合酶(Cat.No.AC001，GeneSys Ltd.)
75mM Tris，pH8.820mM硫酸銨0.1％(w/v)Tween20100ng Aeropyrum pernix基因組DNAPCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為686個(gè)堿基對(duì)，如圖13所示。按照生產(chǎn)商推薦條件采用PrepanolTM(Cat.No.P001，GeneSys Ltd.)沉淀PCR產(chǎn)物，并最終重懸浮于10mM Tris，0.1mM EDTA中。
采用限制酶Nde I和Hind III消化PCR產(chǎn)物，苯酚提取，乙醇沉淀，并重懸浮于10mM Tris，0.1mM EDTA中。
pTTQ18NHK載體(如圖15所示)也由Nde I和Hind III消化，苯酚提取，乙醇沉淀，并重懸浮于10mM Tris，0.1mM EDTA中。
在1×NEB連接緩沖液中，采用200u的New England Biolabs T4 DNA連接酶使100ng切割的PCR序列與1μg切割的pTTQ18NHK載體連接，總體積為10μl，16℃下過(guò)夜(見(jiàn)圖16)。質(zhì)粒載體是pTTQ18NHK，即載體pTTQ18的修飾形式(StarkMJ，Gene，1987；51(2-3)255-67)，該修飾載體含有插入在獨(dú)特的Eco0109 I限制酶位點(diǎn)的卡那霉素抗生素基因，和插入在原始載體的EcoR I位點(diǎn)和Hind III位點(diǎn)之間的替代多接頭(見(jiàn)圖14)。
添加20μl水，并把反應(yīng)加熱到70℃持續(xù)20分鐘。添加1/10體積pH5.2的3M乙酸鈉和2體積乙醇?；靹蚝笤?20℃存放1小時(shí)。在10,000g微離心10分鐘后，從沉淀的DNA中移去上清液，并在5μl水中重懸浮DNA。
通過(guò)電穿孔將0.5μl導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’細(xì)胞中，并在37℃恢復(fù)1小時(shí)后，將細(xì)胞的等分試樣平鋪在卡那霉素Luria Broth瓊脂平板上。在37℃溫育過(guò)夜。
將菌落在新鮮卡那霉素Luria培養(yǎng)液瓊脂平板上，和添加有1μl20mg/ml XGAL及1μl0.5M IPTG/毫升瓊脂凝膠的卡那霉素Luria培養(yǎng)液瓊脂平板(KIX平板)上以雙份鋪格。
在37℃溫育過(guò)夜后，通過(guò)PCR以M13正向和反向引物篩選在KIX平板上的白色菌落，以檢測(cè)相應(yīng)于A(yíng)eropyrum pernix PCR產(chǎn)物的插入是否存在。
當(dāng)含有701bp產(chǎn)物的9個(gè)菌落在加有100μg/ml卡那霉素的20mlLB中生長(zhǎng)至OD600＝1.0時(shí)，通過(guò)添加IPTG至0.5mM的最終濃度，以誘導(dǎo)表達(dá)。細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)4小時(shí)，然后收獲細(xì)胞，并于-20℃冷凍存放。
通過(guò)添加0.5ml含50mM pH7.9的Tris-HCl、50mM葡萄糖、1mMEDTA的溶液和0.5ml含10mM pH7.9的Tris-HCl、50mM KCl、1mMEDTA、0.5％(v/v)Tween20、0.5％(v/v)Nonidet-P40的溶液，并于80℃溫育15分鐘以裂解細(xì)胞。
室溫下10,000g離心10分鐘后，通過(guò)凝膠濃度為12％的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析取自每一裂解細(xì)胞的等分試樣。電泳完成后，采用考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色。所有樣品均顯示大約23kDa的條帶與推定的PPase大小符合。
然后采用Jukka K.Heinonen，Reijo J.Lahti.(1981)Analytical Biochemistry，Vol.113，pp313-317描述的比色分析法檢驗(yàn)同一樣品在75℃的PPase活性。
所有樣品均顯示陽(yáng)性，證實(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)具有嗜熱無(wú)機(jī)焦磷酸酶活性。
隨后利用第一個(gè)克隆大規(guī)模制備蛋白質(zhì)。
焦磷酸酶的純化將該克隆培養(yǎng)在24升的LB中。一旦OD600達(dá)到大約1.5的時(shí)候，采用0.5mM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物，并繼續(xù)生長(zhǎng)4小時(shí)。然后收獲細(xì)胞，并裂解細(xì)胞沉淀。通過(guò)在苯基-瓊脂糖凝膠CL4B(Amersham PharmaciaBiotech)、羥磷灰石(Bio-rad Laboratories)及Hi-PerformanceQ瓊脂糖凝膠(Amersham Pharmacia Biotech)上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)柱層析以純化表達(dá)的酶，最后將純化的酶-20℃存放在含有下列物質(zhì)的溶液中20mM Tris-HCl，pH8.0、100mM NaCl、0.5％(v/v)Tween 20、0.5％(v/v)Nonidet P40、0.1mM EDTA、1mM二硫蘇糖醇、50％甘油。
實(shí)施例10采用A.pernix無(wú)機(jī)焦磷酸酶的PCR試驗(yàn)采用A.pernix無(wú)機(jī)焦磷酸酶進(jìn)行本發(fā)明的方法。試驗(yàn)基于人類(lèi)B-肌動(dòng)蛋白基因的擴(kuò)增。
該試驗(yàn)中，采用獲得自Eurogentec S.A.，ParcScientifique duSart-Tilman，rue Bois Saint-Jean 14，4102 SERAING，Belgium(Cat.No.RT-QP73-05)的試劑盒。標(biāo)準(zhǔn)Taq聚合酶被試劑盒提供的HotStartTaq聚合酶替代。
PCR反應(yīng)混合物1×反應(yīng)緩沖液200μM，dATP，dCTP，dGTP和400μM dUTP0.025u/μl未修飾Taq聚合酶0.025u/μl Aeropyrum pernix無(wú)機(jī)焦磷酸酶0.3μM 5’引物(5′GAC TCG TCA TAC TCC TGC TTG CT 3′-SEQ IDNO 22)0.3μM 3’引物(5′CAT TGC CGA CAG GAT GCA GAA 3′-SEQ ID NO 23)0.15μM Taqman探針(FAM-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGACAGT-TAMRA-SEQ ID NO 24)5mM MgCl22mM NaPPi被動(dòng)參考從7.5ng(2500拷貝)起始對(duì)人類(lèi)基因組DNA進(jìn)行1∶4稀釋。
循環(huán)條件94℃最初變性3分鐘40個(gè)循環(huán)的94℃，15秒和60℃，60秒結(jié)果如圖19所示。
總之，我們相信采用本發(fā)明方法，利用焦磷酸鹽抑制PCR，并隨后消除抑制作用，例如80℃-95℃通過(guò)利用耐熱PPase，表現(xiàn)方式與HotStart PCR相同，但快速并兼具增加特異性的益處。
在以上說(shuō)明書(shū)中提到的文獻(xiàn)在此引入，作為參考。本發(fā)明的其它修改沒(méi)有背離發(fā)明范圍和精神，并且對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。盡管本發(fā)明是連同特定優(yōu)選實(shí)施方案一起被描述的，仍然應(yīng)當(dāng)理解權(quán)利要求的發(fā)明不應(yīng)當(dāng)過(guò)度局限于這些特定實(shí)施方案。實(shí)際上，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，對(duì)描述的實(shí)施發(fā)明的方式所進(jìn)行的多種修改應(yīng)該被包括在下文權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表<110>英國(guó)國(guó)防部英國(guó)威爾特郡<120>擴(kuò)增方法<130>CG/P/133/WOD<140>
<141>
<150>GB 0110501.4<151>2001-04-30<160>26<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>960<212>DNA<213>Aeropyrum pernix<400>1taatcctaat tcgctttatg tggacgatcc ttcccagcaa aaccgggttt gttaacagcc 60ttagctttat aactcgacta gccaaactat cggttagacg ggtgcatgca atgacaggct 120gtctgaaaat tggtcctgga gatgaggctc cagatgttgt gaatgtcgtt atagagatac 180ctatgaacag ttctgttaag tacgagttcg acaaggaggc gtgtattgtt aaggttgata 240ggttccttta caccagcatg gtctacccct tcaactacgg gttcatacca ggcactctag 300aggaggacgg agatcctgtt gacgttctag ttattagccg ggagcccgtt gctcccggct 360cgcttataga ggctgtgccc gtggccgtgt tagacatgga ggacgaggag ggtccggaca 420gcaaggttgt tgccgtaccc aaggccaagc tggaccccct attcgccagc tataaggacg 480ttggcgacat acctgatgcc ctgaaatcca agataaagca cttcttcgag cactataagg 540agctggagcc tggaaagtgg gttagagtga ctggatggag gcctgctgcc gatgcgaagg 600agattataag gagggctata gagaggtata agggggcgtg atgagggctt aacggctcac 660gttttctggg agagtgtcgc acctttgagg gcgatcaccc tcgccagcgt gcgtgtgctt 720ttgtctatga ttatggctac agttcttcta gccgctttca ccgcccccac agtcaataca 780cttacaccta gaggttctgc gctgtatgct gtggatgtag ttgtagtaga cgccagcaca 840ggatctgccc tggggttctc ccggtttgtc gtatccgcct acagaggggg ggtcggggat 900gtgggtgtta tctactcttc gggggtctca gtatcagggt ctagtctgga aaggctgctg 960<210>2<211>207<212>PRT<213>Aeropyrum pernix
<400>2Met Trp Thr Ile Leu Pro Ser Lys Thr Gly Phe Val Asn Ser Leu Ser1 5 10 15Phe Ile Thr Arg Leu Ala Lys Leu Ser Val Arg Arg Val His Ala Met20 25 30Thr Gly Cys Leu Lys Ile Gly Pro Gly Asp Glu Ala Pro Asp Val Val35 40 45Asn Val Val Ile Glu Ile Pro Met Asn Ser Ser Val Lys Tyr Glu Phe50 55 60Asp Lys Glu Ala Cys Ile Val Lys Val Asp Arg Phe Leu Tyr Thr Ser65 70 75 80Met Val Tyr Pro Phe Asn Tyr Gly Phe Ile Pro Gly Thr Leu Glu Glu85 90 95Asp Gly Asp Pro Val Asp Val Leu Val Ile Ser Arg Glu Pro Val Ala100 105 110Pro Gly Ser Leu Ile Glu Ala Val Pro Val Ala Val Leu Asp Met Glu115 120 125Asp Glu Glu Gly Pro Asp Ser Lys Val Val Ala Val Pro Lys Ala Lys130 135 140Leu Asp Pro Leu Phe Ala Ser Tyr Lys Asp Val Gly Asp Ile Pro Asp145 150 155 160Ala Leu Lys Ser Lys Ile Lys His Phe Phe Glu His Tyr Lys Glu Leu165 170 175Glu Pro Gly Lys Trp Val Arg Val Thr Gly Trp Arg Pro Ala Ala Asp180 185 190Ala Lys Glu Ile Ile Arg Arg Ala Ile Glu Arg Tyr Lys Gly Ala195 200 205<210>3<211>173<212>PRT<213>硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)<400>3Met Lys Leu Ser Pro Gly Lys Asn Ala Pro Asp Val Val Asn Val Leu
1 5 10 15Val Glu Ile Pro Gln Gly Ser Asn Ile Lys Tyr Glu Tyr Asp Asp Glu20 25 30Glu Gly Val Ile Lys Val Asp Arg Val Leu Tyr Thr Ser Met Asn Tyr35 40 45Pro Phe Asn Tyr Gly Phe Ile Pro Gly Thr Leu Glu Glu Asp Gly Asp50 55 60Pro Leu Asp Val Leu Val Ile Thr Asn Tyr Gln Leu Tyr Pro Gly Ser65 70 75 80Val Ile Glu Val Arg Pro Ile Gly Ile Leu Tyr Met Lys Asp Glu Glu85 90 95Gly Glu Asp Ala Lys Ile Val Ala Val Pro Lys Asp Lys Thr Asp Pro100 105 110Ser Phe Ser Asn Ile Lys Asp Ile Asn Asp Leu Pro Gln Ala Thr Lys115 120 125Asn Lys Ile Val His Phe Phe Glu His Tyr Lys Glu Leu Glu Pro Gly130 135 140Lys Tyr Val Lys Ile Ser Gly Trp Gly Ser Ala Thr Glu Ala Lys Asn145 150 155 160Arg Ile Gln Leu Ala Ile Lys Arg Val Ser Gly Gly Gln165 170<210>4<211>176<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>4Met Ser Leu Leu Asn Gly Pro Ala Gly Lys Asp Leu Pro Glu Asp Ile1 5 10 15Tyr Val Val Ile Glu Ile Pro Ala Asn Ala Asp Pro Ile Lys Tyr Glu20 25 30Ile Asp Lys Glu Ser Gly Ala Leu Phe Val Asp Arg Phe Met Ser Thr35 40 45
Ala Met Phe Tyr Pro Cys Asn Tyr Gly Tyr Ile Asn His Ile Leu Ser50 55 60Leu Asp Gly Asp Pro Val Asp Val Leu Val Pro Thr Pro Tyr Pro Leu65 70 75 80Gln Pro Gly Ser Val Ile Arg Cys Arg Pro Val Gly Val Leu Lys Met85 90 95Thr Asp Glu Ala Gly Glu Asp Ala Lys Leu Val Ala Val Pro His Ser100 105 110Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Asp His Ile Lys Asp Val Asn Asp Leu Pro115120 125Glu Leu Leu Lys Ala Gln Ile Ala His Phe Phe Glu His Tyr Lys Asp130 135 140Leu Glu Lys Gly Lys Trp Val Lys Val Glu Gly Trp Glu Asn Ala Glu145 150 155 160Ala Ala Lys Ala Glu Ile Val Ala Ser Phe Glu Arg Ala Lys Asn Lys165 170 175<210>5<211>178<212>PRT<213>Aquifex aeolicus<400>5Met Gly Tyr Asp Gln Leu Pro Pro Gly Lys Asn Pro Pro Glu Asp Ile1 5 10 15Tyr Val Val Ile Glu Ile Pro Gln Gly Ser Ala Val Lys Tyr Glu Leu20 25 30Asp Lys Asp Thr Gly Val Ile Phe Val Asp Arg Phe Leu Phe Thr Ala35 40 45Met Tyr Tyr Pro Phe Asn Tyr Gly Phe Val Pro Gln Thr Leu Ala Asp50 55 60Asp Gly Asp Pro Val Asp Val Leu Val Ile Ser Arg Glu Pro Val Val65 70 75 80
Pro Gly Ala Val Met Arg Cys Arg Pro Ile Gly Met Leu Glu Met Arg85 90 95Asp Glu Ala Gly Ile Asp Thr Lys Val Ile Ala Val Pro His Glu Lys100 105 110Leu Asp Pro Ser Tyr Ser Asn Ile Lys Thr Val Asp Asn Leu Pro Glu115 120 125Ile Val Arg Glu Lys Ile Lys His Phe Phe Glu His Tyr Lys Glu Leu130 135 140Glu Pro Gly Lys Trp Val Lys Val Glu Asn Trp Lys Gly Leu Gln Asp145 150 155 160Ala Ile Glu Glu Ile Lys Lys Gly Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Asn Lys165 170 175Glu Gly<210>6<211>178<212>PRT<213>Pyrococcus horikoshii<400>6Met Asn Pro Phe His Asp Leu Glu Pro Gly Pro Asn Val Pro Glu Val1 5 10 15Val Tyr Ala Leu Ile Glu Ile Pro Lys Gly Ser Arg Asn Lys Tyr Glu20 25 30Leu Asp Lys Glu Thr Gly Leu Leu Lys Leu Asp Arg Val Leu Tyr Thr35 40 45Pro Phe His Tyr Pro Val Asp Tyr Gly Ile Ile Pro Arg Thr Trp Tyr50 55 60Glu Asp Gly Asp Pro Phe Asp Ile Met Val Ile Met Arg Glu Pro Thr65 70 75 80Tyr Pro Leu Thr Ile Ile Glu Ala Arg Pro Ile Gly Leu Phe Lys Met85 90 95Ile Asp Ser Gly Asp Lys Asp Tyr Lys Val Leu Ala Val Pro Val Glu
100 105 110Asp Pro Tyr Phe Lys Asp Trp Lys Asp Ile Ser Asp Val Pro Lys Ala115 120 125Phe Leu Asp Glu Ile Ala His Phe Phe Lys Arg Tyr Lys Glu Leu Glu130 135 140Gly Lys Glu Ile Ile Val Glu Gly Trp Glu Gly Ala Glu Ala Ala Lys145 150 155 160Arg Glu Ile Leu Arg Ala Ile Glu Met Tyr Lys Glu Lys Phe Gly Lys165 170 175Lys Glu<210>7<211>178<212>PRT<213>Pyrococcus abyssi<400>7Met Asn Pro Phe His Asp Leu Glu Pro Gly Pro Asn Val Pro Glu Val1 5 10 15Val Tyr Ala Leu Ile Glu Ile Pro Lys Gly Ser Arg Asn Lys Tyr Glu20 25 30Leu Asp Lys Lys Thr Gly Leu Leu Lys Leu Asp Arg Val Leu Tyr Ser35 40 45Pro Phe Phe Tyr Pro Val Asp Tyr Gly Ile Ile Pro Arg Thr Trp Tyr50 55 60Asp Asp Asp Asp Pro Phe Asp Ile Met Val Ile Met Arg Glu Pro Thr65 70 75 80Tyr Pro Leu Thr Ile Ile Glu Ala Arg Pro Ile Gly Leu Phe Lys Met85 90 95Ile Asp Ser Gly Asp Lys Asp Tyr Lys Val Leu Ala Val Pro Val Glu100 105 110Asp Pro Tyr Phe Lys Asp Trp Lys Asp Ile Asp Asp Val Pro Lys Ala115 120 125
Phe Leu Asp Glu Ile Ala His Phe Phe Lys Arg Tyr Lys Glu Leu Gln130 135 140Gly Lys Glu Ile Ile Val Glu Gly Trp Glu Gly Ala Glu Ala Ala Lys145 150 155 160Arg Glu Ile Leu Arg Ala Ile Glu Leu Tyr Lys Glu Lys Phe Gly Ser165 170 175Lys Glu<210>8<211>176<212>PRT<213>Thermococcus litoralis<400>8Met Asn Pro Phe His Asp Leu Glu Pro Gly Pro Glu Val Pro Glu Val1 5 10 15Val Tyr Ala Leu Ile Glu Ile Pro Lys Gly Ser Arg Asn Lys Tyr Glu20 25 30Leu Asp Lys Lys Thr Gly Leu Ile Lys Leu Asp Arg Val Leu Tyr Ser35 40 45Pro Phe His Tyr Pro Val Asp Tyr Gly Ile Ile Pro Gln Thr Trp Tyr50 55 60Asp Asp Asp Asp Pro Phe Asp Ile Met Val Ile Met Arg Glu Pro Thr65 70 75 80Tyr Pro Gly Val Leu Ile Glu Ala Arg Pro Ile Gly Leu Phe Lys Met85 90 95Ile Asp Ser Gly Asp Lys Asp Tyr Lys Val Leu Ala Val Pro Val Glu100 105 110Asp Pro Tyr Phe Asn Asp Trp Lys Asp Ile Ser Asp Val Pro Lys Ala115 120 125Phe Leu Asp Glu Ile Ala His Phe Phe Gln Arg Tyr Lys Glu Leu Gln130 135 140Gly Lys Glu Ile Ile Val Glu Gly Trp Glu Asn Ala Glu Lys Ala Lys145 150 155 160
Gln Glu Ile Leu Arg Ala Ile Glu Leu Tyr Lys Glu Lys Phe Lys Lys165 170 175<210>9<211>179<212>PRT<213>嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)<400>9Met Glu Ser Phe Tyr His Ser Val Pro Val Gly Pro Lys Pro Pro Glu1 5 10 15Glu Val Tyr Val Ile Val Glu Ile Pro Arg Gly Ser Arg Val Lys Tyr20 25 30Glu Ile Ala Lys Asp Phe Pro Gly Met Leu Val Asp Arg Val Leu Tyr35 40 45Ser Ser Val Val Tyr Pro Val Asp Tyr Gly Leu Ile Pro Arg Thr Leu50 55 60Tyr Tyr Asp Gly Asp Pro Met Asp Val Met Val Leu Ile Ser Gln Pro65 70 75 80Thr Phe Pro Gly Ala Ile Met Lys Val Arg Pro Ile Gly Met Met Lys85 90 95Met Val Asp Gln Gly Glu Thr Asp Asn Lys Ile Leu Ala Val Phe Asp100 105 110Lys Asp Pro Asn Val Ser Tyr Ile Lys Asp Leu Lys Asp Val Asn Ala115 120 125His Leu Leu Asp Glu Ile Ala Asn Phe Phe Ser Thr Tyr Lys Ile Leu130 135 140Gln Lys Lys Glu Thr Lys Val Leu Gly Trp Glu Gly Lys Glu Ala Ala145 150 155 160Leu Lys Glu Ile Glu Val Ser Ile Lys Met Tyr Glu Glu Lys Tyr Gly165 170 175Lys Lys Asn
<210>10<211>686<212>DNA<213>Aeropyrum pernix<400>10tgcatgcata tgacaggctg tctgaaaatt ggtcctggag atgaggctcc agatgttgtg 60aatgtcgtta tagagatacc tatgaacagt tctgttaagt acgagttcga caaggaggcg 120tgtattgtta aggttgatag gttcctttac accagcatgg tctacccctt caactacggg 180ttcataccag gcactctaga ggaggacgga gatcctgttg acgttctagt tattagccgg 240gagcccgttg ctcccggctc gcttatagag gctgtgcccg tggccgtgtt agacatggag 300gacgaggagg gtccggacag caaggttgtt gccgtaccca aggccaagct ggacccccta 360ttcgccagct ataaggacgt tggcgacata cctgatgccc tgaaatccaa gataaagcac 420ttcttcgagc actataagga gctggagcct ggaaagtggg ttagagtgac tggatggagg 480cctgctgccg atgcgaagga gattataagg agggctatag agaggtataa gggggcgtga 540tgagggctta acggctcacg ttttctggga gagtgtcgca cctttgaggg cgatcaccct 600cgccagcgtg cgtgtgcttt tgtctatgat tatggctaca gttcttctag ccgctttcac 660cgcccccaca gtcaagctta cactta 686<210>11<211>89<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明pTTQ18NHK的修飾的多接頭序列<400>11atgcaccacc accaccacca tatgggcatg ctgaattcga gctcggtacc cggggatcct 60ctagagtcga cctgcaggca tgcaagctt 89<210>12<211>5503<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明pTTQ18NHK載體<220>
<221>misc_特征<222>(3279，3525)<223>n是a或g或c或t
<400>12gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 60atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg 120caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 180gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 240accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag 300ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg 360gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca 420acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 480atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 540ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 600gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 660gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 720tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt 780taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 840cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 900gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 960gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1020agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1080aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1140agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1200cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1260accgaactga gatacctaca gcgtgagcat tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1320aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1380ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 1440cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 1500gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 1560tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 1620agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc 1680aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gaattaattc tcatgtttga 1740cagcttatca tcgactgcac ggtgcaccaa tgcttctggc gtcaggcagc catcggaagc 1800tgtggtatgg ctgtgcaggt cgtaaatcac tgcataattc gtgtcgctca aggcgcactc 1860ccgttctgga taatgttttt tgcgccgaca tcataacggt tctggcaaat attctgaaat 1920gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat 1980ttcacacagg aaacacatat atgcaccacc accaccacca tatgggcatg ctgaattcga 2040gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg gcactggccg 2100tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag 2160cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc 2220aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 2280tgtgcggtat ttcacaccgc ataaattccc tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc 2340ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc 2400agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc 2460gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg 2520aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct 2580cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg 2640gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct 2700gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttcctgtc gtcatatcta caagccatcc 2760
ccccacagat acggtaaact agcctcgttt ttgcatcagg aaagcaggga atttatggtg 2820cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac 2880acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt 2940gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag 3000acgaaagggc ctgattagaa aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata 3060tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca 3120ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca 3180acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca 3240ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagnt tatgcatttc tttccagact 3300tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta 3360ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta 3420caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca 3480cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt tcccngggat cgcagtggtg 3540agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat 3600tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg 3660ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca 3720cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg 3780gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt 3840gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt attgttcatg atgatatatt tttatcttgt 3900gcaatgtaac atcagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata 3960atggtttctt agacgtgagg ttctgtaccc gacaccatcg aatggtgcaa aacctttcgc 4020ggtatggcat gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta 4080acgttatacg atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg 4140aaccaggcca gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag 4200ctgaattaca ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt 4260ggcgttgcca cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa 4320tctcgcgccg atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc 4380gaagcctgta aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt 4440aactatccgc tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg 4500gcgttatttc ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa 4560gacggtacgc gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg 4620ttagcgggcc cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat 4680ctcactcgca atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc 4740ggttttcaac aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt 4800gccaacgatc agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt 4860ggtgcggata tctcggtagt gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg 4920ccgttaacca ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg 4980ctgcaactct ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg 5040aaaagaaaaa ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat 5100tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc 5160aattaatgta agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccgac 5220ctgcaagaac ctcacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 5280tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 5340gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 5400tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 5460aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atc 5503
<210>13<211>6105<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明包含PPase序列的pTTQ18NHK載體<220>
<221>misc_特征<222>(3881，4127)<223>n是a或g或c或t<400>13gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 60atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg 120caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 180gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 240accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag 300ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg 360gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca 420acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 480atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 540ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 600gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 660gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 720tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt 780taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 840cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 900gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 960gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1020agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1080aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1140agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1200cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1260accgaactga gatacctaca gcgtgagcat tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1320aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1380ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 1440cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 1500gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 1560tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 1620agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc 1680aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gaattaattc tcatgtttga 1740cagcttatca tcgactgcac ggtgcaccaa tgcttctggc gtcaggcagc catcggaagc 1800tgtggtatgg ctgtgcaggt cgtaaatcac tgcataattc gtgtcgctca aggcgcactc 1860ccgttctgga taatgttttt tgcgccgaca tcataacggt tctggcaaat attctgaaat 1920gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat 1980ttcacacagg aaacacatat atgcaccacc accaccacca tatgacaggc tgtctgaaaa 2040
ttggtcctgg agatgaggct ccagatgttg tgaatgtcgt tatagagata cctatgaaca 2100gttctgttaa gtacgagttc gacaaggagg cgtgtattgt taaggttgat aggttccttt 2160acaccagcat ggtctacccc ttcaactacg ggttcatacc aggcactcta gaggaggacg 2220gagatcctgt tgacgttcta gttattagcc gggagcccgt tgctcccggc tcgcttatag 2280aggctgtgcc cgtggccgtg ttagacatgg aggacgagga gggtccggac agcaaggttg 2340ttgccgtacc caaggccaag ctggaccccc tattcgccag ctataaggac gttggcgaca 2400tacctgatgc cctgaaatcc aagataaagc acttcttcga gcactataag gagctggagc 2460ctggaaagtg ggttagagtg actggatgga ggcctgctgc cgatgcgaag gagattataa 2520ggagggctat agagaggtat aagggggcgt gatgagggct taacggctca cgttttctgg 2580gagagtgtcg cacctttgag ggcgatcacc ctcgccagcg tgcgtgtgct tttgtctatg 2640attatggcta cagttcttct agccgctttc accgccccca cagtcaagct tggcactggc 2700cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc 2760agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc 2820ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 2880tctgtgcggt atttcacacc gcataaattc cctgttttgg cggatgagag aagattttca 2940gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat ttgcctggcg 3000gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc agaagtgaaa cgccgtagcg 3060ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa 3120cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct 3180ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga 3240gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc 3300ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa actcttcctg tcgtcatatc tacaagccat 3360ccccccacag atacggtaaa ctagcctcgt ttttgcatca ggaaagcagg gaatttatgg 3420tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca 3480acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 3540gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 3600agacgaaagg gcctgattag aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca 3660tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact 3720caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc 3780caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat 3840caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag nttatgcatt tctttccaga 3900cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca accaaaccgt 3960tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcg atcgctgtta aaaggacaat 4020tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca ggaacactgc cagcgcatca acaatatttt 4080cacctgaatc aggatattct tctaatacct ggaatgctgt tttcccnggg atcgcagtgg 4140tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt gatggtcgga agaggcataa 4200attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac atcattggca acgctacctt 4260tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc atacaatcga tagattgtcg 4320cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc atttataccc atataaatca gcatccatgt 4380tggaatttaa tcgcggcctc gagcaagacg tttcccgttg aatatggctc ataacacccc 4440ttgtattact gtttatgtaa gcagacagtt ttattgttca tgatgatata tttttatctt 4500gtgcaatgta acatcagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa 4560taatggtttc ttagacgtga ggttctgtac ccgacaccat cgaatggtgc aaaacctttc 4620gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag 4680taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg 4740tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg 4800agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga 4860ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta 4920
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<223>人工序列說(shuō)明引物<400>14gatgagttcg tgtccgtaca actgg 25<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明引物<400>15ggttatcgaa atcagccaca gcgcc 25<210>16<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明引物<400>16gcaacgcccc tcactataaa20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明引物<400>17gcaccccgcc cttgaagtcc20<210>18<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明引物<400>18tgcatgcata tgacaggctg tctgaaaatt g 31<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明引物<400>19taagtgtaag cttgactgtg ggggcggtga aag 33<210>20
<400>20000<210>21<400>21000<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明引物<400>22gactcgtcat actcctgctt gct 23<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明引物<400>23cattgccgac aggatgcaga a21<210>24<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明探針<400>24atccacatct gctggaaggt ggacagt 27<210>25<211>176
<212>PRT<213>Aeropyrum pernix<400>25Met Thr Gly Cys Leu Lys Ile Gly Pro Gly Asp Glu Ala Pro Asp Val1 5 10 15Val Asn Val Val Ile Glu Ile Pro Met Asn Ser Ser Val Lys Tyr Glu20 25 30Phe Asp Lys Glu Ala Cys Ile Val Lys Val Asp Arg Phe Leu Tyr Thr35 40 45Ser Met Val Tyr Pro Phe Asn Tyr Gly Phe Ile Pro Gly Thr Leu Glu50 55 60Glu Asp Gly Asp Pro Val Asp Val Leu Val Ile Ser Arg Glu Pro Val65 70 75 80Ala Pro Gly Ser Leu Ile Glu Ala Val Pro Val Ala Val Leu Asp Met85 90 95Glu Asp Glu Glu Gly Pro Asp Ser Lys Val Val Ala Val Pro Lys Ala100 105 110Lys Leu Asp Pro Leu Phe Ala Ser Tyr Lys Asp Val Gly Asp Ile Pro115120 125Asp Ala Leu Lys Ser Lys Ile Lys His Phe Phe Glu His Tyr Lys Glu130 135 140Leu Glu Pro Gly Lys Trp Val Arg Val Thr Gly Trp Arg Pro Ala Ala145 150 155 160Asp Ala Lys Glu Ile Ile Arg Arg Ala Ile Glu Arg Tyr Lys Gly Ala165 170 175<210>26<211>531<212>DNA<213>Aeropyrum pernix<400>26atgacaggct gtctgaaaat tggtcctgga gatgaggctc cagatgttgt gaatgtcgtt 60atagagatac ctatgaacag ttctgttaag tacgagttcg acaaggaggc gtgtattgtt 120
aaggttgata ggttccttta caccagcatg gtctacccct tcaactacgg gttcatacca 180ggcactctag aggaggacgg agatcctgtt gacgttctag ttattagccg ggagcccgtt 240gctcccggct cgcttataga ggctgtgccc gtggccgtgt tagacatgga ggacgaggag 300ggtccggaca gcaaggttgt tgccgtaccc aaggccaagc tggaccccct attcgccagc 360tataaggacg ttggcgacat acctgatgcc ctgaaatcca agataaagca cttcttcgag 420cactataagg agctggagcc tggaaagtgg gttagagtga ctggatggag gcctgctgcc 480gatgcgaagg agattataag gagggctata gagaggtata agggggcgtg a 53權(quán)利要求
1.一種進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法，該方法包括在足量焦磷酸鹽存在下形成擴(kuò)增反應(yīng)混合物，以阻止引物延伸的發(fā)生；采用焦磷酸酶(PPase)消化該焦磷酸鹽；使該反應(yīng)混合物處于可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的條件下。
2.權(quán)利要求1的方法，其中擴(kuò)增反應(yīng)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，并且反應(yīng)混合物含有適于進(jìn)行該反應(yīng)的試劑。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中反應(yīng)混合物含有選自下組的DNA聚合酶水生棲熱菌聚合酶(Taq)、嗜熱棲熱菌聚合酶(Tth)、棲熱菌NH聚合酶(TspNH)、Thermus brockianus聚合酶(Tbr)、激烈火球菌聚合酶(Pfu)、9°N7外DNA聚合酶、Thermococcus literalisDNA聚合酶。
4.以上權(quán)利要求中的任何一項(xiàng)的方法，其中無(wú)機(jī)焦磷酸鹽是堿土金屬焦磷酸鹽。
5.權(quán)利要求4的方法，其中無(wú)機(jī)焦磷酸鹽是焦磷酸四鈉，分子式為Na4P2O7。
6.以上權(quán)利要求中的任何一項(xiàng)的方法，其中存在于反應(yīng)混合物中的焦磷酸鹽的濃度為至少0.5mM。
7.權(quán)利要求6的方法，其中焦磷酸鹽以1-10mM的濃度存在。
8.以上權(quán)利要求中的任何一項(xiàng)的方法，其中該消化是采用耐熱焦磷酸酶實(shí)現(xiàn)的。
9.權(quán)利要求8的方法，其中耐熱焦磷酸酶是嗜酸熱硫化葉菌無(wú)機(jī)焦磷酸酶(Sac PPase)，Thermococcus litoralis無(wú)機(jī)焦磷酸酶或Aeropyrum pernix無(wú)機(jī)焦磷酸酶。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中耐熱焦磷酸酶是在其形成時(shí)添加到反應(yīng)混合物中。
11.權(quán)利要求10的方法，包括擴(kuò)增反應(yīng)前在高溫下的溫育步驟，以使焦磷酸酶消化存在的無(wú)機(jī)焦磷酸鹽。
12.以上權(quán)利要求中的任何一項(xiàng)的方法，其中添加到反應(yīng)混合物中的焦磷酸酶的濃度為至少0.04u/50μl PCR反應(yīng)混合物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中添加到反應(yīng)混合物中的焦磷酸酶的濃度為0.08u/50μl PCR反應(yīng)混合物。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中添加到反應(yīng)混合物中的焦磷酸酶的濃度為0.2-10u/50μl PCR反應(yīng)混合物。
15.一種進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒，該試劑盒包含焦磷酸鹽、焦磷酸酶、以及擴(kuò)增反應(yīng)所需的任選一種或多種試劑。
16.權(quán)利要求15的試劑盒，進(jìn)一步包含進(jìn)行特定目標(biāo)核酸擴(kuò)增所必需的一種或多種引物。
17.權(quán)利要求15或16的試劑盒，進(jìn)一步包含一種或多種熒光標(biāo)記的試劑。
18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中熒光標(biāo)記的試劑選自下組的一或多個(gè)嵌入染料、熒光標(biāo)記的探針、熒光標(biāo)記的引物或熒光標(biāo)記的核苷酸。
19.焦磷酸鹽在權(quán)利要求1-14中的任何一項(xiàng)的進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的方法中的用途。
20.焦磷酸酶在權(quán)利要求1-14中的任何一項(xiàng)的進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的方法中的用途。
21.分離自Aeropyrum pernix的焦磷酸酶。
22.由SEQ ID NO.26所示的多核苷酸序列或其變體或片段編碼的焦磷酸酶。
23.包含如SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列或其變體或片段的焦磷酸酶。
24.分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼權(quán)利要求22或23的酶。
25.權(quán)利要求21-23中的任何一項(xiàng)的焦磷酸酶在權(quán)利要求1-14中的任何一項(xiàng)的進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的方法中的用途。
26.一種進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的方法，基本如前所述并參考實(shí)施例。
全文摘要
一種進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法。該方法包括在足量的焦磷酸鹽存在下，形成擴(kuò)增反應(yīng)混合物，以避免引物延伸的發(fā)生；采用焦磷酸酶(PPase)消化該焦磷酸鹽；并使該反應(yīng)混合物處于可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的條件下。該方法可作為“熱啟動(dòng)”擴(kuò)增應(yīng)用。也描述并要求保護(hù)用于該方法中特定的新的焦磷酸酶。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1522305SQ02813272
公開(kāi)日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2002年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月30日
發(fā)明者D·R·克拉克, S·P·文森特, D R 克拉克, 文森特 申請(qǐng)人:英國(guó)國(guó)防部