專利名稱：抑制凋亡過程及改善細(xì)胞性能的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及防止或延遲重組細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡。更具體而言，本發(fā)明涉及通過在細(xì)胞中表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽來抑制重組細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽來提高重組細(xì)胞的細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物、例如重組蛋白質(zhì)如抗體的產(chǎn)量。此外，本發(fā)明提供了表達(dá)抗凋亡多肽的重組細(xì)胞。這種細(xì)胞可用于細(xì)胞性治療或用于產(chǎn)生細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物，特別是在大規(guī)模生物反應(yīng)器中的商品化生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
在制藥或商品化生產(chǎn)環(huán)境中，利用真核細(xì)胞生產(chǎn)高價(jià)值的治療性或診斷性蛋白質(zhì)，受到有關(guān)可利用的發(fā)酵罐體積及發(fā)酵進(jìn)行時(shí)間的嚴(yán)格限制。從經(jīng)過一段時(shí)間制備成批發(fā)酵物來看，生產(chǎn)效率來自于使運(yùn)行中每單位時(shí)間內(nèi)的蛋白質(zhì)生成速率最高，使運(yùn)行停止時(shí)間最短，并使生產(chǎn)效率較低時(shí)的運(yùn)行時(shí)間部分最少。
提高容器中的細(xì)胞密度是在生產(chǎn)中提高蛋白質(zhì)產(chǎn)率的一個(gè)主要方法。通過營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)料方法、并利用保留細(xì)胞的系統(tǒng)灌注培養(yǎng)基，形成適當(dāng)平衡的培養(yǎng)基組成，可以顯著提高細(xì)胞密度。這些方法除了提高細(xì)胞密度之外，還能有效提高分批培養(yǎng)物的整體壽命。
提高制備產(chǎn)率的另一基本方法是提高細(xì)胞自身生成蛋白質(zhì)的速率，即提高比細(xì)胞產(chǎn)率(產(chǎn)生蛋白質(zhì)的量/細(xì)胞/天)。傳統(tǒng)上，獲得具有高生產(chǎn)速率細(xì)胞的方法來自一個(gè)多步驟的過程，其中第一步利用目的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)染大的細(xì)胞群體，第二步長(zhǎng)出較大群體的單細(xì)胞克隆，鑒定并選擇較高的生產(chǎn)細(xì)胞系，進(jìn)一步建立細(xì)胞系。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞群體中顯現(xiàn)蛋白質(zhì)生產(chǎn)速率的不均一性，其原因一般在于，首先是新的遺傳物質(zhì)在宿主細(xì)胞基因組中的整合位置的差異，其次是所整合的DNA序列總數(shù)(拷貝數(shù))的差異。因此，還已開發(fā)了在宿主基因組中定位異源DNA整合位點(diǎn)的方法，以便將DNA序列整合到與高水平轉(zhuǎn)錄為RNA有關(guān)的位點(diǎn)。這些方法的例子中，關(guān)于NEOSPLA載體由美國(guó)專利5,648,267、5,733,779、6,017,733和6,159,730提供，關(guān)于同源重組則由美國(guó)專利5,830,698和5,998,144提供。
通過共轉(zhuǎn)染目的蛋白質(zhì)的基因與可賦予毒劑抗性的另一蛋白質(zhì)基因，也提供了選擇高生產(chǎn)細(xì)胞的方法。通過將生長(zhǎng)中的細(xì)胞暴露給濃度增加的這樣一種毒劑，可以選擇具有較高抗性基因拷貝數(shù)的細(xì)胞。常常發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞經(jīng)歷抗性基因的基因組擴(kuò)增過程。編碼目的蛋白質(zhì)的相鄰基因共同擴(kuò)增，常引起目的蛋白質(zhì)的細(xì)胞比產(chǎn)率水平提高(Ringold，J.Mol.Appl.Genetic 1(3)165-75(1981)；Kaufman，J.Mol.Biol.159(4)601-21 1982)。
在起源完全不同于生物化學(xué)工程細(xì)胞培養(yǎng)制備過程的生物學(xué)研究領(lǐng)域，過去十年來對(duì)程序性細(xì)胞死亡過程-凋亡已經(jīng)頗為了解。與這些發(fā)展隨之而來的概念性突破是，存在導(dǎo)致細(xì)胞死亡的天然生理學(xué)過程。當(dāng)然，細(xì)胞死亡也可以是破壞細(xì)胞完整性的創(chuàng)傷所致直接和立即的結(jié)果，從而使細(xì)胞或其遺留物發(fā)生壞死。作為疾病病程的一部分，或者對(duì)生理壓力的響應(yīng)，凋亡可由自然的或自然發(fā)育的多種環(huán)境或刺激物啟動(dòng)。例如，器官成熟或重組的發(fā)育過程涉及特定類型細(xì)胞的死亡，以便為其它新型細(xì)胞的出現(xiàn)讓路。在遺傳及生物化學(xué)水平上理解凋亡，并探索其干預(yù)方法，使之或促進(jìn)、或終止，已成為醫(yī)學(xué)科學(xué)中相當(dāng)令人關(guān)注的領(lǐng)域。
然而，已經(jīng)開始將凋亡理解為哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中勢(shì)必發(fā)生的細(xì)胞死亡的主要途徑。在實(shí)驗(yàn)室和大規(guī)模制備環(huán)境中進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)的基本形式稱為分批培養(yǎng)。分批培養(yǎng)開始于健康的、活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞接種物；培養(yǎng)物生長(zhǎng)到峰值細(xì)胞密度，進(jìn)入衰退期，然后經(jīng)歷直至細(xì)胞群體相繼死去的過程。在后來的細(xì)胞培養(yǎng)衰退期，營(yíng)養(yǎng)物開始耗盡，毒性代謝物濃度上升，環(huán)境變得對(duì)細(xì)胞形成壓力。另外，發(fā)酵環(huán)境本身可以產(chǎn)生其它壓力因素，例如硬件產(chǎn)生的剪切力、與攪拌有關(guān)的流體和氣體渦流，以及培養(yǎng)物通過管線的流動(dòng)。已經(jīng)證明，所有這些因素(營(yíng)養(yǎng)限制、培養(yǎng)基中毒物及物理壓力)均可啟動(dòng)培養(yǎng)中細(xì)胞的凋亡，從而整體上在限制培養(yǎng)物預(yù)期壽命中起作用。
最近發(fā)現(xiàn)了幾種在凋亡過程中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，并分離和克隆了它們的基因。腺病毒蛋白質(zhì)E1B-19K是Bcl-2蛋白質(zhì)家族的抗凋亡成員。細(xì)胞對(duì)感染的響應(yīng)是啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)。該防御機(jī)制用于從組織中去除被感染的細(xì)胞。然而，某些病毒通過編碼表達(dá)于感染過程早期的、可抑制凋亡的蛋白質(zhì)，從而發(fā)展了對(duì)抗凋亡響應(yīng)的方法。在腺病毒感染過程中，由腺病毒基因組的E1區(qū)調(diào)節(jié)病毒基因在細(xì)胞中表達(dá)。E1區(qū)由E1A和E1B兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位組成。E1B單位編碼腺病毒的兩個(gè)不同腫瘤抗原，19kDa和55kDa蛋白質(zhì)。凋亡抑制劑E1B-19K的作用可理解為類似于抗凋亡蛋白質(zhì)Bcl-2，可在細(xì)胞死亡途徑的多個(gè)階段抑制凋亡。據(jù)認(rèn)為凋亡抑制的一個(gè)機(jī)理是通過穩(wěn)定線粒體膜，從而防止將細(xì)胞色素C和其它前凋亡因子釋放到胞質(zhì)溶膠中。(VanderHeiden Cell 91(5)627-37(1997))。細(xì)胞色素C參與結(jié)合到涉及啟動(dòng)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)級(jí)聯(lián)的復(fù)合物中的Apaf-1。Zou J.Biol.Chem.274(17)11549-56(1999)。Bcl-2家族成員(Bcl-XL)也通過直接結(jié)合Apaf-1來阻斷Apaf-1的活化。(Hu等人，J.Biol.Chem 273(10)5481-5(1998)；PNAS 95(8)4386-91(1998))。
普遍存在的膜蛋白質(zhì)Aven是另一種抗凋亡蛋白質(zhì)。Aven的抗凋亡活性是由于其能夠干擾天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活化子Apaf-1的自我締合，從而抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9活化(Chau Mol.Cell.631-40(2000))。已經(jīng)表明，Aven還增強(qiáng)Bcl-XL在BHK(baby hamster kidney)細(xì)胞中的抗凋亡活性，提示Aven和Bcl-XL之間存在相互作用(Chau(2000))。
上述提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的各種方法均成功進(jìn)行了不同程度的實(shí)踐。盡管如此，仍然需要發(fā)展提高細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物、例如重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量的方法，特別是在大規(guī)模商品化生產(chǎn)中。此外還需要發(fā)展防止或延遲程序性細(xì)胞死亡的方法。
發(fā)明概述及目的本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供防止或延遲重組細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的方法，其中該細(xì)胞不是小鼠骨髓瘤細(xì)胞。該方法包括在細(xì)胞中表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽，例如細(xì)胞性Bcl-xL、Bcl-2、Aven、或病毒性蛋白質(zhì)E1B-19K和p35，以便防止或延遲細(xì)胞程序性死亡，其中如果在細(xì)胞中表達(dá)一種抗凋亡多肽，則該抗凋亡多肽不是Bcl-xL相互作用因子，例如Aven。
更具體而言，本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供防止或延遲包含編碼一種或多種目的多肽的一種或多種異源多核苷酸的重組細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的方法，該目的多肽為例如，抗體如抗CD154(IDEC-131)、抗CD20抗體(例如RITUXAN，F(xiàn)DA批準(zhǔn)用于治療非霍奇金(non-Hodgkin’s)淋巴瘤的嵌合抗CD20，由ATCC登錄號(hào)69119生成，ZevalinTM)、抗CD80(IDEC 114)抗體、抗CD23抗體(IDEC 152)、抗CD4抗體(IDEC 151)、以及抗腫瘤抗原抗體、酶、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面因子、細(xì)胞代謝物、細(xì)胞分泌因子、病毒性因子以及膜結(jié)合因子。
本發(fā)明另一目的在于提供提高重組細(xì)胞的細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物產(chǎn)量的方法。該方法包括在細(xì)胞中表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽，以便提高該細(xì)胞的細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)量，其中如果在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一種抗凋亡多肽，則該抗凋亡多肽不是Bcl-xL相互作用因子，例如Aven。
本發(fā)明另一目的在于提供提高重組細(xì)胞產(chǎn)量的方法。該方法包括在細(xì)胞中表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽，以便提高該重組細(xì)胞的產(chǎn)量，其中如果在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一種抗凋亡多肽，則該抗凋亡多肽不是Bcl-xL相互作用因子，例如Aven。
本發(fā)明另一目的在于提供用于產(chǎn)生細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物的重組細(xì)胞。該重組細(xì)胞表達(dá)或可誘導(dǎo)表達(dá)至少兩種抗凋亡多肽。
本發(fā)明另一目的在于提供用于產(chǎn)生細(xì)胞的一種或多種生物功能的細(xì)胞群體。該細(xì)胞群體表達(dá)或可誘導(dǎo)表達(dá)至少兩種抗凋亡多肽。
本發(fā)明另一目的在于提供用于細(xì)胞性治療的細(xì)胞群體。該細(xì)胞群體表達(dá)或可誘導(dǎo)表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描述用于表達(dá)抗體IDEC 131的NEOSPLA表達(dá)載體。
圖2描述可誘導(dǎo)型表達(dá)載體，質(zhì)粒PX+E1B-19K。
圖3描述可誘導(dǎo)型表達(dá)載體，質(zhì)粒PX+Aven+E1B-19K。
圖4描述Aven cDNA多核苷酸和Aven多肽氨基酸序列。
圖5描述E1B-19K cDNA多核苷酸和E1B-19K多肽氨基酸序列。
圖6描述細(xì)胞存活力數(shù)據(jù)比較了(1)單獨(dú)轉(zhuǎn)染GFP、(2)轉(zhuǎn)染GFP+Aven、(3)轉(zhuǎn)染GFP+E1B-19K、(4)轉(zhuǎn)染GFP+Aven+E1B19K的細(xì)胞以及(5)未轉(zhuǎn)染的親本細(xì)胞在去除葡萄糖培養(yǎng)3天的存活率。
圖7描述細(xì)胞存活力數(shù)據(jù)比較了(1)單獨(dú)轉(zhuǎn)染GFP、(2)轉(zhuǎn)染GFP+Aven、(3)轉(zhuǎn)染GFP+E1B-19K、(4)轉(zhuǎn)染GFP+Aven+E1B19K的細(xì)胞在有和無類固醇誘導(dǎo)下，去除葡萄糖培養(yǎng)3天的存活率。
圖8描述抗凋亡多肽的誘導(dǎo)表達(dá)數(shù)據(jù)比較表達(dá)E1B-19K和Aven的類固醇誘導(dǎo)的細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系有關(guān)存活率和抗體產(chǎn)生水平的分批培養(yǎng)性能。
圖9描述抗凋亡多肽的誘導(dǎo)表達(dá)數(shù)據(jù)比較轉(zhuǎn)染E1B-19K和Aven的細(xì)胞在有和無類固醇誘導(dǎo)這些轉(zhuǎn)染基因表達(dá)的情況下，有關(guān)存活率和抗體產(chǎn)生水平的分批培養(yǎng)性能。
圖10包含表明CHO細(xì)胞系(CHO-K1)在去除血清及耗盡培養(yǎng)基后經(jīng)歷凋亡的結(jié)果。
圖11a和11b包含在10％FBS中培養(yǎng)的表達(dá)Aven、Bcl-xL以及Bcl-xL+Aven的細(xì)胞，隨后暴露于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的存活力數(shù)據(jù)。
圖12a、b和c也包含存活率數(shù)據(jù)，其中將表達(dá)Aven、Bcl-xL和Bcl-xL+Aven的CHO細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)之后測(cè)定細(xì)胞存活率。
圖13a、b和c描述了實(shí)施例所用誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)。
圖14顯示抗凋亡基因α-Aven和α-E1B-19K在CHO細(xì)胞中的誘導(dǎo)型表達(dá)。
圖15包含使用6孔培養(yǎng)物的葡萄糖去除實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖16-21包含在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中進(jìn)行的葡萄糖去除實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖22圖解描述了表達(dá)IDEC-131的CHO細(xì)胞系的產(chǎn)生以及所用的包含抗凋亡基因的誘導(dǎo)型表達(dá)載體。
圖23-26包含其它的轉(zhuǎn)瓶結(jié)果。
圖27比較了在誘導(dǎo)或非誘導(dǎo)條件下，IDEC 131在不同細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)。
圖28-31包含生物反應(yīng)器研究#1的結(jié)果。
圖32-34包含生物反應(yīng)器研究#2的結(jié)果。
圖35-37包含生物反應(yīng)器研究#3的結(jié)果。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明涉及防止或延遲重組細(xì)胞、特別是重組細(xì)胞、優(yōu)選產(chǎn)生細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，抑制細(xì)胞中凋亡可以提高細(xì)胞存活率及細(xì)胞性能。因此，本發(fā)明提供了通過在細(xì)胞中表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽來防止或延遲重組細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的方法。本發(fā)明還通過在細(xì)胞中表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽來提高重組細(xì)胞中細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)量。此外，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物或細(xì)胞性治療的重組細(xì)胞。
該方法抑制培養(yǎng)中的哺乳動(dòng)物及其它真核細(xì)胞細(xì)胞死亡的能力，可用于提高由目的細(xì)胞產(chǎn)生的任何天然或異源蛋白質(zhì)、或病毒的產(chǎn)量。目的天然和異源產(chǎn)物目標(biāo)應(yīng)包括但不限于由哺乳動(dòng)物或其它真核細(xì)胞天然產(chǎn)生或經(jīng)遺傳操作后產(chǎn)生的抗體、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素、血清蛋白質(zhì)、受體、酶、配體、細(xì)胞分泌因子、細(xì)胞代謝物、以及病毒載體。遺傳操作技術(shù)應(yīng)包括標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)，其中將目的靶基因整合到哺乳動(dòng)物基因組或染色體外元件，以使整合的基因表達(dá)異源蛋白質(zhì)。本申請(qǐng)所述技術(shù)適用于在細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生凋亡的所有哺乳動(dòng)物及其它真核細(xì)胞系。合適的細(xì)胞系包括但不限于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)、人胚腎(HEK)293、NSO骨髓瘤、COS、NFO哺乳動(dòng)物細(xì)胞及其它真核細(xì)胞，例如Sf-9、Sf-21和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)昆蟲細(xì)胞。這些細(xì)胞系可以從諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)等來源獲得。該技術(shù)適用于經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡、并可以經(jīng)遺傳操作產(chǎn)生如上所述異源目的蛋白質(zhì)的任何真核細(xì)胞。
靶蛋白質(zhì)和病毒應(yīng)包括可以在哺乳動(dòng)物或其它真核細(xì)胞中產(chǎn)生的、用于生物技術(shù)或制藥應(yīng)用的蛋白質(zhì)和病毒。用于該技術(shù)的幾種可能的目的蛋白質(zhì)包括但不限于生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，例如人生長(zhǎng)激素、粒細(xì)胞集落刺激因子(生長(zhǎng)因子)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、紅細(xì)胞生成素、白細(xì)胞介素1α和β、2、3、4、6、8、10、11、13、15、17和18、干擾素α和γ、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素、瘦素(leptin)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子-α、血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(bonemorphogenic protein)以及干細(xì)胞因子；酶，例如核酸酶、胰蛋白酶、抑酶肽和激酶；細(xì)胞培養(yǎng)試劑，例如層粘連蛋白、膠原和纖連蛋白；血漿和血清蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白組織纖溶酶原激活劑、纖溶酶原、纖溶酶和凝血酶以及因子VIII、IX、和X；細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、生長(zhǎng)因子及其它受體、配體和細(xì)胞結(jié)合因子的單克隆抗體；受體，例如腫瘤壞死因子受體1和2；紅細(xì)胞生成素受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、白細(xì)胞介素受體、瘦素受體、P和L選擇蛋白、ICAM、VCAM；配體，例如FAS配體和CD配體；代謝物，例如脂質(zhì)、脂肪、核苷酸以及碳水化合物；病毒性載體，例如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒以及腺伴隨病毒。雖然該清單包括許多當(dāng)前產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)及其它產(chǎn)物，但該技術(shù)同樣適用于其培養(yǎng)中的真核生產(chǎn)細(xì)胞在生產(chǎn)過程中經(jīng)歷凋亡的其它當(dāng)前及未來的蛋白質(zhì)和產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)方法，在細(xì)胞中表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽。例如，可以引入編碼一種或多種抗凋亡多肽的一種或多種多核苷酸構(gòu)建體。該構(gòu)建體可以是表達(dá)構(gòu)建體，并可包括與編碼一種或多種抗凋亡多肽的多核苷酸有效連接的至少一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用蛻皮激素誘導(dǎo)型系統(tǒng)，通過類固醇以劑量依賴方式控制一種或多種抗凋亡多肽的表達(dá)。美國(guó)專利5,534,418詳述了這種系統(tǒng)，在此全文引入以供參考。
也可應(yīng)用其它啟動(dòng)子。在真核細(xì)胞中使用的合適病毒性轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的例子有猿猴病毒40、腺病毒、Rous肉瘤病毒和巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子。可以利用刺激異源基因轉(zhuǎn)錄的反式作用轉(zhuǎn)錄活化子活化啟動(dòng)子。例如，SV 40 T抗原、腺病毒E1A和E1B蛋白質(zhì)可以作用于異源基因的某些病毒性啟動(dòng)子，包括CMV主要即早起(MIE)啟動(dòng)子。具有反式作用活性的其它分子包括皰疹病毒即早期蛋白質(zhì)、C-myc、以及人和猿猴AIDS病毒的基因。
在另一實(shí)施方案中，該表達(dá)構(gòu)建體包括可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和可篩選的或可選擇的標(biāo)志，以便選擇或檢測(cè)表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽的細(xì)胞。本發(fā)明可以使用任何合適的選擇或篩選標(biāo)志，例如綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)或增強(qiáng)的綠色熒光蛋白質(zhì)(EGF)。
根據(jù)本發(fā)明，可以表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽?？沟蛲龆嚯陌ň哂幸种苹蚪档图?xì)胞凋亡活性的任何多肽。例如，抗凋亡多肽可以由異源多核苷酸、例如真核細(xì)胞或病毒的基因編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗凋亡多肽是Bcl-2家族、Aven家族、腺病毒或桿狀病毒抗死亡蛋白質(zhì)家族成員或其片段。在另一實(shí)施方案中，抗凋亡多肽是Bcl-2、Bcl-xL、Aven、E1B-19K或p35。在另一實(shí)施方案中，如果表達(dá)一種抗凋亡多肽，則其不是Aven、Bcl-xL相互作用因子、保護(hù)細(xì)胞防止天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1所誘導(dǎo)凋亡的因子、抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶由細(xì)胞色素c和dATP活化的因子、結(jié)合抗凋亡Bcl-2成員的因子、或結(jié)合Apaf-1的因子。
在重組細(xì)胞中，抗凋亡多肽可以單獨(dú)表達(dá)、或與其它分子聯(lián)合表達(dá)。例如，可以只表達(dá)Aven、或共表達(dá)Aven和E1B-19K?？梢允褂靡环N或多種表達(dá)構(gòu)建體表達(dá)兩種或多種抗凋亡多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組細(xì)胞將Aven與一種或多種其它抗凋亡多肽聯(lián)合表達(dá)。
本發(fā)明的重組細(xì)胞包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知、并可以得到的任何合適細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該重組細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人、小鼠或嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，該重組細(xì)胞是BHK細(xì)胞或CHO細(xì)胞，例如CHO 5C11。此外，本發(fā)明方法可應(yīng)用于大規(guī)模生物反應(yīng)器或商品化生產(chǎn)培養(yǎng)裝置中的重組細(xì)胞。其它合適的細(xì)胞包括COS、CV-1、SP2/0和雜交瘤。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的重組細(xì)胞包含編碼一種或多種目的多肽的一種或多種異源多核苷酸。該多肽可以是任何多肽，包括而非限制于抗體、酶、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面因子、細(xì)胞代謝物、細(xì)胞分泌因子、病毒性因子以及膜結(jié)合因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽是抗體，包括而非限制于抗CD154(gp 39)抗體(IDEC-131)、抗CD20(Rituxan、ZevalinTM)抗體、抗CD80(B7.1)抗體(IDEC 114)、抗CD23抗體(IDEC 152)、抗CD4抗體(IDEC151)以及抗腫瘤抗原抗體。
根據(jù)本發(fā)明的另一特征，表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽可提高重組細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)量。細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物可以是因細(xì)胞性能而產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。例如，細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物可以是重組表達(dá)的或內(nèi)源性的蛋白質(zhì)、抗體、酶、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面因子、膜結(jié)合因子或多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物是病毒性因子、細(xì)胞代謝物、或任何細(xì)胞成分。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物可以是細(xì)胞本身。
本發(fā)明也提供用于產(chǎn)生細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物的重組細(xì)胞。這些細(xì)胞表達(dá)或可誘導(dǎo)表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些細(xì)胞表達(dá)至少兩種抗凋亡多肽。這些細(xì)胞因其提高的存活力和細(xì)胞性能，例如提高的細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)量，也可用于細(xì)胞性治療。
為進(jìn)一步闡明本發(fā)明而提供以下實(shí)施例。這些實(shí)施例并非意圖、亦不應(yīng)被解釋為進(jìn)一步限制本發(fā)明。
實(shí)施例1載體和轉(zhuǎn)染稱為NEOSPLA(圖1)的IDEC專利表達(dá)載體包含分為外顯子1和2的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、編碼抗體IDEC 131的人免疫球蛋白輕鏈、小鼠二氫葉酸還原酶基因、編碼抗體IDEC 131的人免疫球蛋白重鏈基因。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案建立細(xì)胞系的過程中，第一輪轉(zhuǎn)染使用該NEOSPLA載體。NEOSPLA表達(dá)載體充分描述于美國(guó)專利5,648,267、5,733,779、6,017,733、6,159,730，在此全文引入以供參考。
此處所述本發(fā)明實(shí)施方案產(chǎn)生的所需高價(jià)值蛋白質(zhì)是人源化的抗CD154抗體(IDEC 131)。CD154是不成熟及成熟的B淋巴細(xì)胞表面分子CD40的配體，在與抗體交聯(lián)時(shí)可誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖?？笴D154抗體充分描述于美國(guó)專利6,001,358，在此全文引入以供參考。
考慮到組成型表達(dá)抗凋亡基因可能長(zhǎng)期干擾需要連續(xù)生長(zhǎng)的生產(chǎn)細(xì)胞系的細(xì)胞分裂，優(yōu)選實(shí)施方案利用可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)，而非組成型啟動(dòng)子。然而在本發(fā)明某些特定實(shí)施方案中，組成型表達(dá)抗凋亡基因完全可能適當(dāng)并合乎需要。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案利用的載體pVgRXR(來自Invitrogen，Carlsbad，CA)，具有蛻皮激素可誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的特征。來自果蠅(Drosophila)的功能性雜合蛻皮激素類固醇激素受體的兩個(gè)亞基都組成型表達(dá)于調(diào)節(jié)子載體pVgRXR，而最后驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)的雜合蛻皮激素反應(yīng)性啟動(dòng)子(p-A-HSP)位于第二個(gè)類固醇激素誘導(dǎo)型表達(dá)載體中。首先利用pVgRXR轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，然后通過暴露于Zeocin來選擇據(jù)推測(cè)可表達(dá)功能性雜合蛻皮激素類固醇激素受體的穩(wěn)定細(xì)胞系。在誘導(dǎo)劑類固醇松甾酮A(ponasterone A)的存在下，該功能性雜合蛻皮激素類固醇激素受體結(jié)合于雜合蛻皮激素反應(yīng)性啟動(dòng)子的上游，從而活化目的基因的表達(dá)。通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染帶有便于測(cè)量的基因產(chǎn)物例如β半乳糖苷酶的誘導(dǎo)型表達(dá)載體，在給這些細(xì)胞系提供類固醇激素時(shí)，可以測(cè)定該類固醇激素可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子刺激轉(zhuǎn)錄的能力。其中多數(shù)穩(wěn)定的Zeocin抗性細(xì)胞系將不誘導(dǎo)類固醇反應(yīng)性基因。
建立了在足以支持類固醇誘導(dǎo)的水平上穩(wěn)定表達(dá)雜合類固醇激素受體的改造的細(xì)胞系以后，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系，該質(zhì)粒包含處于類固醇反應(yīng)性啟動(dòng)子控制之下的目的基因以及嘌呤霉素顯性可選擇標(biāo)志基因。然后通過嘌呤霉素選擇得到穩(wěn)定表達(dá)該啟動(dòng)子的細(xì)胞系。給予這些細(xì)胞系類固醇激素后，再分析其誘導(dǎo)目的基因的能力。其中多數(shù)細(xì)胞系不受類固醇誘導(dǎo)。如上所述，Evans在美國(guó)專利5,534,418中充分描述了類固醇誘導(dǎo)系統(tǒng)，特此全文引入以供參考。
在本發(fā)明建立細(xì)胞系的實(shí)施方案的抗體IDEC 131后階段，第二輪和第三輪分別使用該蛻皮激素可誘導(dǎo)型系統(tǒng)。第二個(gè)轉(zhuǎn)染步驟是將pVgRXR引入IDEC 131細(xì)胞系。第三個(gè)轉(zhuǎn)染步驟是引入蛻皮激素可誘導(dǎo)基因，含有或不含綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)基因。
修飾Invitrogen表達(dá)載體pIND，以便能夠接納另外多達(dá)三個(gè)目的基因，再經(jīng)修飾去除顯性可選擇性標(biāo)志基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，替換為可選擇性嘌呤霉素抗性基因。在隨后的各輪轉(zhuǎn)染中，修飾表達(dá)載體包括攜帶Aven基因、E1B-19K基因以及同時(shí)攜帶這兩種基因的實(shí)施方案，在每種情況下均含有以及不含GFP。所述載體的例子如圖2和3所述。圖2描述了修飾的Invitrogen表達(dá)載體PX+E1B-19K；圖3則描述修飾的Invitrogen表達(dá)載體PX+Aven+E1B-19K。在第三輪轉(zhuǎn)染中使用這種載體產(chǎn)生各自或聯(lián)合表達(dá)這兩種抗凋亡蛋白質(zhì)的細(xì)胞系。當(dāng)GFP響應(yīng)類固醇的誘導(dǎo)而在這些CHO細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，便提供了蛋白質(zhì)表達(dá)的陽(yáng)性標(biāo)志，可用于通過流式細(xì)胞術(shù)分類并選擇高表達(dá)的類固醇可誘導(dǎo)型細(xì)胞。
Aven cDNA多核苷酸和Aven多肽氨基酸序列的詳細(xì)序列表如圖4所示；E1B-19K cDNA多核苷酸和E1B-19K多肽氨基酸的序列表如圖5所示。
實(shí)施例2細(xì)胞群體的起源治療性蛋白質(zhì)商品化生產(chǎn)所用哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，是永生化細(xì)胞系，可以一代一代無限地持續(xù)經(jīng)歷連續(xù)不斷的分裂循環(huán)。這與正常二倍體動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)物明顯相反，后者壽命有限，約50代顯現(xiàn)衰老及停止分裂。
一般而言，通過從單細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞群體，可以獲得標(biāo)準(zhǔn)均一性水平的細(xì)胞系。雖不認(rèn)為絕對(duì)可以證明某一群體具有單細(xì)胞祖先來源，但是已經(jīng)建立了公認(rèn)可得到很高這種概率的嚴(yán)格方法。該方法名為單細(xì)胞克隆，通過在培養(yǎng)基中稀釋懸浮細(xì)胞而完成，使分到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔的單位體積中的細(xì)胞在統(tǒng)計(jì)上少于1個(gè)。利用目視及自動(dòng)化方法支持該統(tǒng)計(jì)方法，確保每個(gè)培養(yǎng)孔中的細(xì)胞不多于1個(gè)。當(dāng)這些孔中出現(xiàn)小的群體時(shí)，可以認(rèn)為其極有可能是單細(xì)胞來源。該方法即為下述實(shí)施例7和8所用的產(chǎn)生細(xì)胞群體的方法。
獲得均一性細(xì)胞群體的另一方法是根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，選擇表型均一的一群細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)方法依次測(cè)定各個(gè)細(xì)胞的熒光或光散射特征，并依據(jù)該測(cè)量值決定每個(gè)細(xì)胞收集與否。該方法非常有效，可以產(chǎn)生高均一性細(xì)胞群，然后進(jìn)行擴(kuò)增，并入特定群體中。然而，盡管該群體可能具有均一性，并且利用任何測(cè)定方法均可能難以與上述單細(xì)胞來源的群體相區(qū)分，但根據(jù)單細(xì)胞來源的標(biāo)準(zhǔn)來判定，它并非是克隆性的。流式細(xì)胞術(shù)方法的優(yōu)點(diǎn)在于，與單細(xì)胞來源的群體相比，可以更快速地獲得具有目的特征的較大的均一性群體。該流式細(xì)胞術(shù)選擇方法即為以下實(shí)施例5和6所用的產(chǎn)生群體的方法。如下所述，該流式細(xì)胞術(shù)可選擇性特征為表達(dá)綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)。
實(shí)施例3細(xì)胞系歷史本發(fā)明所述細(xì)胞系的直接親本CHO 5C11細(xì)胞系具有支持抗凋亡基因表達(dá)的兩個(gè)顯著特征，并證明此處所述本發(fā)明方法及優(yōu)選實(shí)施方案。該親本細(xì)胞系分泌目的蛋白質(zhì)，抗體IDEC 131，并表達(dá)胞質(zhì)溶膠雜合蛻皮激素類固醇激素受體，這是可誘導(dǎo)抗凋亡基因表達(dá)的系統(tǒng)的組分。
CHO 5C11細(xì)胞系來源于Columbia University建立的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO DG44(Urlaub，PNAS 83(17)6519-23(1986))。CHODG44細(xì)胞系的二氫葉酸還原酶(DHFR)表達(dá)缺陷，因而依賴所轉(zhuǎn)染的DHFR的表達(dá)，以便獲得對(duì)用于選擇基因組擴(kuò)增的毒劑氨甲蝶呤的抗性。在CHO 5C11細(xì)胞系建立過程中，從DG44階段開始，經(jīng)歷了兩次主要轉(zhuǎn)染事件。
利用包含抗體IDEC 131編碼序列的NEOSPLA載體進(jìn)行CHO DG44細(xì)胞系的第一次轉(zhuǎn)染。在細(xì)胞群體可能來源于單細(xì)胞的條件下進(jìn)行新霉素選擇，并擴(kuò)增抗體生產(chǎn)細(xì)胞系。選擇所產(chǎn)生的一株高產(chǎn)量新霉素抗性細(xì)胞系G418，進(jìn)一步建系。
通過5nM、50nM、最后500nM逐步提高氨甲蝶呤濃度，每一步均在細(xì)胞群體可能來源于單細(xì)胞的選擇條件下進(jìn)行，使抗體生產(chǎn)細(xì)胞系G418經(jīng)受進(jìn)一步的選擇壓力及抗體表達(dá)擴(kuò)增，產(chǎn)生的細(xì)胞系鑒定為500E9。
在第二次轉(zhuǎn)染步驟中，將500nM氨甲蝶呤抗性細(xì)胞系通過電穿孔轉(zhuǎn)染載體pVgRXR，于Zeocin(來自Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)中選擇，從而使宿主細(xì)胞具有類固醇可誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)。在該細(xì)胞系可能來源于單細(xì)胞的條件下，選擇轉(zhuǎn)染后得到的Zeocin抗性細(xì)胞系。然后通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染類固醇可誘導(dǎo)型β-半乳糖苷酶基因，測(cè)試各個(gè)細(xì)胞系的可誘導(dǎo)性，得到類固醇受體可誘導(dǎo)型細(xì)胞系CHO 5C11。細(xì)胞系CHO 5C11具有質(zhì)粒pVgRXR的單個(gè)整合位點(diǎn)，進(jìn)一步說明其可能來源于單細(xì)胞。
在第三次轉(zhuǎn)染步驟中，使用CHO 5C11細(xì)胞系作為本發(fā)明此處公開的實(shí)施例所用的系列轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的親本。修飾Invitrogen載體系統(tǒng)，使其進(jìn)一步表達(dá)多達(dá)3種另外的單個(gè)基因，并引入嘌呤霉素抗性的顯性選擇性標(biāo)志。故而構(gòu)建了6個(gè)載體系統(tǒng)，其中分別包含(1)綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)，(2)GFP+Aven，(3)GFP+E1B-19K，以及(4)GFP+Aven+E1B-19K(5)E1B-19K，和(6)Aven+EIB-19K。GFP是發(fā)熒光的標(biāo)志蛋白質(zhì)，其表達(dá)使得可以利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行選擇。Aven和E1B-19K是兩種上述抗凋亡蛋白質(zhì)的基因。
對(duì)于包含GFP的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞群體首先在嘌呤霉素選擇性壓力下生長(zhǎng)，產(chǎn)生各個(gè)轉(zhuǎn)染群體穩(wěn)定表達(dá)蛋白質(zhì)的混合體。通過流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)類固醇誘導(dǎo)的GFP表達(dá)，跟蹤其中每個(gè)群體響應(yīng)類固醇誘導(dǎo)而表達(dá)轉(zhuǎn)染基因的能力，利用流式細(xì)胞術(shù)正選擇高熒光細(xì)胞并混合。利用細(xì)胞裂解物的Western印跡研究來證實(shí)其它新轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。該方法產(chǎn)生蛋白質(zhì)表達(dá)速率均一的細(xì)胞群體，但該群體并非來源于單細(xì)胞。
在另一方法中，利用包含E1B-19K的載體(上列第5種)以及包含E1B-19K和Aven的載體(上列第6種)轉(zhuǎn)染并經(jīng)嘌呤霉素選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，將其分離為可能的單細(xì)胞培養(yǎng)物，并擴(kuò)增至可以由此鑒別高度可誘導(dǎo)型群體。然后通過系列培養(yǎng)擴(kuò)增這種可能是單細(xì)胞來源的群體，最后用于下述實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例3和4。
實(shí)施例4細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)及培養(yǎng)基CHO 5C11細(xì)胞系在Gibco產(chǎn)品(Grand Island，NY)無血清培養(yǎng)基CHO SSFM II中生長(zhǎng)。不斷利用新鮮培養(yǎng)基將一部分較高細(xì)胞密度的培養(yǎng)物傳到新的培養(yǎng)物中，從而使細(xì)胞培養(yǎng)物連續(xù)生長(zhǎng)。下述實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例7和8使用無血清CHO SSFM II培養(yǎng)基的無葡萄糖品種。已經(jīng)在小規(guī)模系統(tǒng)、例如包含1-2ml培養(yǎng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)皿以及包含50-200ml體積培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)瓶中，使用分批或終末(terminal)培養(yǎng)物進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性研究。
本發(fā)明的實(shí)施可以應(yīng)用于大量細(xì)胞類型、培養(yǎng)系統(tǒng)及培養(yǎng)基。商業(yè)化培養(yǎng)系統(tǒng)一般包括體積為1-50,000升的生物反應(yīng)器。細(xì)胞通常在游離懸浮生長(zhǎng)，但附著依賴型以及聚集型細(xì)胞的例子也很常見。許多參考文獻(xiàn)發(fā)表了大規(guī)模培養(yǎng)方法及相關(guān)要點(diǎn)，示例性文獻(xiàn)有R.J.Freshney，Animal Cell Culture″A Practical Approach，2ndEd.，Oxford University Press，New York，1992以及M.Butler，Mammalian Cell BiotechnologyA Practical Approach，OxfordUniversity Press，New York，1991。詳述細(xì)胞培養(yǎng)基要點(diǎn)的典型參考文獻(xiàn)為ATCC Media Handbook，Cote等人，American Type CultureCollection出版，Rockville，MD，1984。
實(shí)施例5本研究如圖6所述，比較了(1)單獨(dú)轉(zhuǎn)染GFP、(2)轉(zhuǎn)染GFP和Aven、(3)轉(zhuǎn)染GFP和E1B-19K、(4)轉(zhuǎn)染GFP及聯(lián)合轉(zhuǎn)染Aven和E1B19K的細(xì)胞、以及(5)未轉(zhuǎn)染的親本細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3天的細(xì)胞存活率。細(xì)胞在正常培養(yǎng)基、即CHO SSFM II中生長(zhǎng)，直至開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性培養(yǎng)，為此更換培養(yǎng)基為無葡萄糖培養(yǎng)基，通過添加5μM松甾酮A誘導(dǎo)所轉(zhuǎn)染基因。無葡萄糖環(huán)境使細(xì)胞遭受嚴(yán)重的營(yíng)養(yǎng)危機(jī)，因而形成強(qiáng)烈的凋亡刺激。
所有培養(yǎng)物最初的存活率為95％，在無葡萄糖環(huán)境中第1天結(jié)束后，存活率下降，Aven+E1B-19K培養(yǎng)物的存活率降到80％，所有其它培養(yǎng)物均降到約70％。在其后的兩天中，Aven+E1B-19K培養(yǎng)物的存活率一直明顯高于其它培養(yǎng)物。第2天結(jié)束后，E1B-19K轉(zhuǎn)染以及Aven轉(zhuǎn)染的兩種培養(yǎng)物與兩種對(duì)照培養(yǎng)物、即GFP(單獨(dú))以及未轉(zhuǎn)染的親本細(xì)胞系相比，其存活率差異顯著。因而第2天，Aven+E1B-19K培養(yǎng)物的存活率為80％，Aven和E1B-19K培養(yǎng)物的存活率均約60％，而對(duì)照培養(yǎng)物為30％-40％。第3天，Aven+E1B-19K培養(yǎng)物為75％存活率，E1B-19K培養(yǎng)物為45％存活率，Aven培養(yǎng)物以及兩種對(duì)照培養(yǎng)物均顯示零存活率。
這些數(shù)據(jù)表明，E1B-19K與Aven每個(gè)基因的單獨(dú)表達(dá)，在經(jīng)受營(yíng)養(yǎng)匱乏壓力的CHO細(xì)胞中具有抗凋亡作用，E1B-19K單獨(dú)表達(dá)的作用顯著強(qiáng)于單獨(dú)的Aven。E1B-19K和Aven兩個(gè)基因的共同作用相對(duì)于其單個(gè)作用具有協(xié)同性，即聯(lián)合表達(dá)的作用強(qiáng)于其單個(gè)作用的簡(jiǎn)單相加。觀察到單獨(dú)Aven在第3天似乎對(duì)存活限度沒有益處，與E1B-19K聯(lián)合表達(dá)比單獨(dú)表達(dá)EIB-19K的細(xì)胞存活限度高20％，更支持了這一結(jié)論。
實(shí)施例6本研究如圖7所述，比較了(1)單獨(dú)轉(zhuǎn)染GFP、(2)轉(zhuǎn)染GFP和Aven、(3)轉(zhuǎn)染GFP和E1B-19K、(4)轉(zhuǎn)染GFP并聯(lián)合轉(zhuǎn)染Aven和E1B19K的細(xì)胞、以及(5)未轉(zhuǎn)染的親本細(xì)胞的細(xì)胞性能。這5種細(xì)胞類型均在有和無松甾酮A存在下培養(yǎng)，從而得到總共10個(gè)實(shí)驗(yàn)組。
開始測(cè)試轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)前2天，在實(shí)驗(yàn)期間將包含類固醇的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入5μM松甾酮A，以便充分誘導(dǎo)抗凋亡基因。在轉(zhuǎn)瓶中將250K細(xì)胞/ml接種在含葡萄糖的正常培養(yǎng)基中，開始每次實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)。第2天將培養(yǎng)基更換為無葡萄糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
為方便觀察數(shù)據(jù)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果分成5張圖，顯示以培養(yǎng)天數(shù)為函數(shù)的存活率。
●圖7a顯示有和無松甾酮A的對(duì)照的單獨(dú)GFP培養(yǎng)物，在第2天存活率急劇下降。
●圖7b顯示有和無松甾酮A的Aven培養(yǎng)物，松甾酮的存在(誘導(dǎo)Aven表達(dá))可有效提高小部分細(xì)胞在培養(yǎng)第3天的存活。
●圖7c顯示有和無松甾酮A的E1B-19K細(xì)胞，其兩種培養(yǎng)物的存活率均顯著高于對(duì)照(圖6a)和單獨(dú)Aven(圖6b)，類固醇的存在導(dǎo)致存活顯著提高。
●圖7d顯示有和無松甾酮A的E1B-19K+Aven細(xì)胞。這些細(xì)胞在松甾酮存在下第3天的存活率為80％，而此時(shí)其它所有培養(yǎng)物已經(jīng)完全死亡，直到培養(yǎng)第5天存活率降到零。
●圖7e關(guān)注兩個(gè)完全不同的組的直接比較(head-to-headcomparison)，GFP對(duì)照組顯示較低的存活率，而E1B-19K組顯示極高存活率；這兩種細(xì)胞類型均處于松甾酮存在下。
這些數(shù)據(jù)證實(shí)了實(shí)施例1的結(jié)果，即單獨(dú)E1B-19K和單獨(dú)Aven的表達(dá)具有抗凋亡提高存活率的作用，單獨(dú)E1B-19K的作用顯著并高于單獨(dú)Aven，聯(lián)合表達(dá)這兩種基因產(chǎn)生協(xié)同作用，即超過各個(gè)基因作用相加所預(yù)期的結(jié)果?？沟蛲鲎饔门c這些轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)特別有關(guān)，觀察到該作用完全依賴于類固醇誘導(dǎo)，進(jìn)一步支持了這一點(diǎn)。
實(shí)施例7圖8所述研究包括，比較轉(zhuǎn)染E1B-19K和Aven兩者的穩(wěn)定細(xì)胞系與作為對(duì)照的親本5C11細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)及抗體產(chǎn)生的性能。通過轉(zhuǎn)染后的單細(xì)胞克隆得到本實(shí)施例以及實(shí)施例4中的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系(E1B-19K和Aven)。
以3×105細(xì)胞/ml接種轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)物，按分批培養(yǎng)生長(zhǎng)9天。在兩種培養(yǎng)物中加入5μM的類固醇松甾酮，該濃度可有效誘導(dǎo)所轉(zhuǎn)染的類固醇可誘導(dǎo)型基因。每日提取培養(yǎng)樣品，獲得細(xì)胞計(jì)數(shù)，并通過ELISA測(cè)定抗體濃度。
數(shù)據(jù)表明，培養(yǎng)物直至第6天均具有相似的性能。第6天出現(xiàn)微小差別，對(duì)照培養(yǎng)物的存活率略微下降至低于E1B-19K+Aven培養(yǎng)物，E1B-19K+Aven的抗體滴度略微高于對(duì)照培養(yǎng)物。隨后3天內(nèi)，這些差別日益增大。第9天對(duì)照培養(yǎng)物的存活率降到28％，而E1B-19K+Aven培養(yǎng)物的存活率為78％。對(duì)照培養(yǎng)物的最終滴度為247mg/L，而E1B-19K+Aven培養(yǎng)物達(dá)到309mg/L，提高了約20％。
實(shí)施例8圖9所述研究測(cè)試了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染E1B-19K+Aven的細(xì)胞系中的類固醇誘導(dǎo)作用。因此以300K細(xì)胞/ml接種E1B-19K+Aven細(xì)胞的兩個(gè)培養(yǎng)物；第2天，其中一個(gè)(實(shí)驗(yàn))培養(yǎng)物加入5μM松甾酮A，另一個(gè)(對(duì)照)不加類固醇。在培養(yǎng)的前6天，這兩個(gè)培養(yǎng)物顯示相似的性能，利用類固醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)物顯示存活率稍高。到第8天，對(duì)照培養(yǎng)物的存活率降到60％，而類固醇誘導(dǎo)的細(xì)胞系保持90％存活。第9天，對(duì)照培養(yǎng)物的存活率為35％，而類固醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)物為70％。最后，在第10天，對(duì)照培養(yǎng)物為30％存活，而誘導(dǎo)細(xì)胞系為40％存活。對(duì)照培養(yǎng)物的最終滴度為240mgs/升，而類固醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的最終滴度為290mgs/升，提高了約20％。
實(shí)施例7和8的凋亡壓力是在持續(xù)9-10天的分批培養(yǎng)過程中形成的營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性。凋亡表現(xiàn)為細(xì)胞突然死亡，對(duì)于對(duì)照細(xì)胞而言，開始于分批培養(yǎng)的第6或7天。結(jié)合前兩個(gè)實(shí)施例的結(jié)論是，表達(dá)轉(zhuǎn)染的抗凋亡基因E1B-19K和Aven的聯(lián)合作用在于延遲培養(yǎng)物的壽命，提高培養(yǎng)物的抗體滴度約20％，并且這兩種基因的活性的確依賴于類固醇的誘導(dǎo)。
實(shí)施例9其它蛋白質(zhì)治療性產(chǎn)物的實(shí)例上述代表本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)施例是關(guān)于人源化抗CD154抗體(IDEC 131)的生產(chǎn)。CD154是不成熟及成熟的B淋巴細(xì)胞表面分子CD40的配體，在與抗體交聯(lián)時(shí)可誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將本發(fā)明方法應(yīng)用于治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)物、特別是抗體及其通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵方法制備，其優(yōu)選實(shí)例如下人RSV融合蛋白質(zhì)的抗體，如美國(guó)專利5,811,524、5,840,298、5,866,125、5,939,068、5,955,364和5,958,765所述。
人CD20的抗體，為治療B細(xì)胞淋巴瘤而設(shè)計(jì)，如美國(guó)專利5,736,137和5,776,456所述。
用于人類治療的包括舊世界猴(old world monkey)部分以及人源部分的嵌合重組抗體，如美國(guó)專利5,658,570、5,681,722、5,693,780、5,750,105和5,756,096所述。
包含人γ1恒定結(jié)構(gòu)域的人CD23的單克隆抗體，可抑制B細(xì)胞由IL-4誘導(dǎo)的IgE生成，如美國(guó)專利6,011,138所述。
針對(duì)人B7.1(CD80)和B7.2(CD86)的靈長(zhǎng)類源化抗體在治療自身免疫性疾病以及防止移植排斥中用作特異性免疫抑制劑，如美國(guó)專利6,113,898所述。
包含舊世界猴可變序列以及人恒定結(jié)構(gòu)域序列的針對(duì)人CD4 γ1恒定結(jié)構(gòu)域的嵌合抗體，如美國(guó)專利6,136,310所述。
實(shí)施例10Aven在血清去除后增強(qiáng)Bcl-xL的功能許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)中需要血清進(jìn)行增殖，除非其已經(jīng)適應(yīng)在無血清環(huán)境中生長(zhǎng)。血清為細(xì)胞提供生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)、代謝物、激素以及細(xì)胞因子，并已經(jīng)表明在生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中提供抗凋亡作用。我們已經(jīng)表明，CHO-K1在血清去除后經(jīng)歷凋亡(圖10以及Mastrangelo等人，Bioreg.Bioeng.67(5)544-54(2000)，F(xiàn)igueroa等人，Bioreg.Bioeng.7(3)211-222(2001))。在生物產(chǎn)物的生產(chǎn)過程中可發(fā)生營(yíng)養(yǎng)物及生長(zhǎng)因子的耗盡，故而引入血清去除研究作為該環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)模型。
為確定是否可以改造細(xì)胞以克服這種傷害，將生長(zhǎng)于10％FBS并表達(dá)Aven、Bcl-xL和Bcl-xL+Aven的CHO細(xì)胞隨后暴露于無血清培養(yǎng)基。然后在去除后的數(shù)天監(jiān)測(cè)存活率，如圖11A所示。血清去除2天后，觀察到改造的細(xì)胞系優(yōu)于親本CHO K-1細(xì)胞。在血清去除后的前2天，表達(dá)Aven提供了保護(hù)作用，使此時(shí)培養(yǎng)物的存活率保持在高于90％。實(shí)際上，在去除2天時(shí)，CHO-aven細(xì)胞的存活率高于CHO-bcl-xL，并與CHO-bcl-xL+aven相當(dāng)。然而，血清去除2天以后，與Bcl-xL提供的保護(hù)相比，表達(dá)Aven所提供的保護(hù)作用極小?？偠灾?，CHO-bcl-xL+aven的性能超過CHO-bcl-xL、CHO-aven和親本CHO K-1。血清去除3天以后，Aven和Bcl-xL聯(lián)合提供的增強(qiáng)的保護(hù)作用明顯，并在暴露于無血清培養(yǎng)基以后維持5天。CHO-bcl-xL+aven保持大于85％的存活率；而CHO-K1的存活率剛過20％，CHO-bcl-xL同時(shí)顯示小于60％的存活率。去除9天以后也測(cè)定存活率，以觀察該保護(hù)作用是否可長(zhǎng)期維持(圖11B)。血清去除9天后，親本CHO-K1細(xì)胞的存活率為7％，而表達(dá)一種抗凋亡基因的細(xì)胞的存活率略高于10％。然而，CHO-bcl-xL+aven保持24％的存活率，兩倍于只表達(dá)一種基因的細(xì)胞，并比對(duì)照高三倍。
實(shí)施例11Aven在4和5天耗竭培養(yǎng)基(spent medium)中增強(qiáng)Bcl-xL的功能許多生物反應(yīng)器在運(yùn)行末期經(jīng)常碰到代謝廢物及細(xì)胞溶質(zhì)碎片的積累，連同營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)因子的耗盡，產(chǎn)生不利于細(xì)胞存活的環(huán)境。為了模擬這種環(huán)境，將CHO細(xì)胞暴露于4和5天培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中，評(píng)價(jià)表達(dá)Aven、Bcl-xL和Bcl-xL+Aven的作用。為得到耗竭培養(yǎng)基，將CHO K-1細(xì)胞在DMEM完全培養(yǎng)基中傳代并擴(kuò)增4或5天，然后收集培養(yǎng)基。收集時(shí)觀察到細(xì)胞在4和5天的耗竭培養(yǎng)基中的存活率差異顯著。CHO K-1擴(kuò)增4天以后，培養(yǎng)基(黃/橙色)因代謝廢物積累、血清耗盡(緩沖液特性)以及培養(yǎng)物自分泌信號(hào)而酸化，可是培養(yǎng)物仍存活(存活率大于75％)，但100％貼壁。培養(yǎng)5天后，CHO K-1存活率急劇降低到30％以下，細(xì)胞完全脫離培養(yǎng)瓶，并伴隨培養(yǎng)基進(jìn)一步酸化(深黃色)。培養(yǎng)基持續(xù)酸化可能主要?dú)w因于大部分細(xì)胞死亡并溶解，將細(xì)胞內(nèi)溶物釋放到培養(yǎng)基中。如圖10所示，將CHO細(xì)胞暴露于4和5天的耗竭培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，可誘導(dǎo)凋亡。
為檢測(cè)耗竭培養(yǎng)基中的細(xì)胞存活率，將細(xì)胞用PBS洗滌兩次，以確保去除血清，然后暴露于耗竭培養(yǎng)基中。暴露于4天耗竭培養(yǎng)基中以后，改造的CHO K-1細(xì)胞系在幾乎所有時(shí)間點(diǎn)的存活率均高于親本CHO K-1(圖12A和12B)。Aven單獨(dú)表達(dá)可增強(qiáng)暴露后3天的存活率，此時(shí)存活率已降到類似于親本CHO K-1的水平(圖12A)。為確定這是克隆特征還是所表達(dá)基因的特征，將兩個(gè)不同的CHO-aven克隆暴露于4天的耗竭培養(yǎng)基中。引人注目的是，兩個(gè)克隆均顯示相同的特征性保護(hù)模式，其中存活率在前3天增強(qiáng)，然后下降到等于或低于野生型CHO細(xì)胞的水平。相反，表達(dá)Bcl-xL的CHO細(xì)胞對(duì)4天耗竭培養(yǎng)基顯示不同的敏感性模式(圖12B)。在暴露后第1天，CHO-bcl-xL與其它細(xì)胞系包括CHO-K1相比，存活率下降最為顯著。在暴露后第2天，CHO-bcl-xL的存活率穩(wěn)定，與親本CHO-K1相比，Bcl-xL的表達(dá)在暴露于耗竭培養(yǎng)基期間提供了保護(hù)作用。在暴露于4天的耗竭培養(yǎng)基中的每一天，CHO-bcl-xL+aven的存活率均等于或好于CHO-aven、CHO-bcl-xL以及親本CHO K-1。在暴露于4天的耗竭培養(yǎng)基的4天中，攜帶兩種抗凋亡基因的細(xì)胞系的存活率保持高于85％，而同一時(shí)間親本CHO-K1和CHO-aven的存活率約為40％。
暴露于5天的耗竭培養(yǎng)基后，與暴露于4天的耗竭培養(yǎng)基相比，細(xì)胞死亡率顯著提高。如圖12C所示，暴露于5天的耗竭培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物，在暴露2天以后存活率急劇下降。CHO-Kl在4天耗竭培養(yǎng)基中的存活率為68％，但由于5天培養(yǎng)基的毒性增高，其存活率水平急劇下降到14％。然而，改造的CHO細(xì)胞系的性能再次超過親本CHOK-1。與親本CHO K-1相比，在兩個(gè)不同克隆中的Aven表達(dá)對(duì)暴露于5天的耗竭培養(yǎng)基所致程序性細(xì)胞死亡提供了某種保護(hù)作用。表達(dá)Bcl-xL提供了更強(qiáng)的毒性防護(hù)作用，其5天的耗竭培養(yǎng)基中的存活率超過40％。共表達(dá)Bcl-xL和Aven對(duì)暴露于5天的耗竭培養(yǎng)基以后的細(xì)胞死亡率改變最大，在該環(huán)境中2天后的存活率為48％。然而，在毒性更大的5天的耗竭培養(yǎng)基中，表達(dá)兩種基因相比單獨(dú)表達(dá)Bcl-xL所提供的增強(qiáng)的保護(hù)作用不如以前在4天培養(yǎng)基中所觀察到的那么大。CHO-bclxL+aven在4天的耗竭培養(yǎng)基中的存活率始終高于CHO-bclxL將近20個(gè)百分點(diǎn)，而在高度酸化和高毒性的5天的耗竭培養(yǎng)基中，該差別小于8個(gè)百分點(diǎn)。
實(shí)施例12使用蛻皮激素可誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)另外進(jìn)行的去除研究圖13a和13b圖解描述了本實(shí)施例所用的先前所述蛻皮激素可誘導(dǎo)型系統(tǒng)及載體系統(tǒng)。如圖13c進(jìn)一步所示，由pVgRXR表達(dá)RXR和VgEcR，加入配體(即松甾酮A)可誘導(dǎo)異二聚體RXR和VgEcR結(jié)合到雜合的蛻皮激素反應(yīng)元件(EGRE)，從修飾的蛻皮激素受體中的VP16反式激活結(jié)構(gòu)域活化轉(zhuǎn)錄。
如圖14所示，CHO細(xì)胞包含表達(dá)α-GFP、α-Aven或α-E1B-19K的可誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)，利用5μM松甾酮A進(jìn)行誘導(dǎo)。
如圖15所示，使用該可誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行葡萄糖去除實(shí)驗(yàn)(其中在實(shí)驗(yàn)開始之前，處于6孔培養(yǎng)物中的細(xì)胞群體經(jīng)5μM松甾酮誘導(dǎo)48小時(shí))，隨時(shí)間測(cè)定細(xì)胞存活率。圖16包含GFP對(duì)照組的轉(zhuǎn)瓶結(jié)果，圖17為表達(dá)E1B-19K的細(xì)胞，圖18包含在轉(zhuǎn)瓶中去除葡萄糖的條件下，表達(dá)E1B-19K的細(xì)胞與表達(dá)GFP的細(xì)胞比較的細(xì)胞存活率結(jié)果。
圖19、20和21分別包含經(jīng)松甾酮A誘導(dǎo)后，表達(dá)Aven、Aven+E1B19K以及Aven+E1 B19K與GFP比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
這些結(jié)果提供了進(jìn)一步的證據(jù)，證明Aven和E1B-19K經(jīng)松甾酮A誘導(dǎo)后穩(wěn)定表達(dá)，單獨(dú)Aven可對(duì)葡萄糖去除所誘導(dǎo)的凋亡提供微小的保護(hù)作用，但是共表達(dá)Aven可以顯著增強(qiáng)E1B-19K對(duì)葡萄糖去除所啟動(dòng)的凋亡的保護(hù)作用。
實(shí)施例13利用IDEC-131抗凋亡細(xì)胞系(14C6)的結(jié)果在本實(shí)施例中，表達(dá)IDEC-131的CHO細(xì)胞系(單細(xì)胞分離物)與500nM的氨甲蝶呤接觸，并轉(zhuǎn)染可組成性表達(dá)類固醇受體異二聚體的pVgRXR載體(Invitrogen載體)，產(chǎn)生5C11，在Zeocin抗性條件下培養(yǎng)。
這些細(xì)胞然后轉(zhuǎn)染經(jīng)修飾包含抗凋亡基因的相同可誘導(dǎo)型表達(dá)載體(包含Aven+E1B-19K基因的修飾的Invitrogen載體)，利用松甾酮A誘導(dǎo)這些細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)于Zeocin/嘌呤霉素抗性條件下(這些實(shí)驗(yàn)如圖22圖解所示)。
然后根據(jù)包括生長(zhǎng)率、比產(chǎn)率(pg/細(xì)胞/天)、可誘導(dǎo)型蛋白質(zhì)表達(dá)(通過western印跡)以及抗體滴度(ELISA/HPLC)的標(biāo)準(zhǔn)，將該細(xì)胞系與原始的500 E9細(xì)胞系作比較。
這些實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了表達(dá)E1B-19K以及表達(dá)Aven和E1 B19K的14個(gè)細(xì)胞系。在誘導(dǎo)及非誘導(dǎo)條件下，于100mL體積、1x雙份、2x三份進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。
圖22-26包含這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。此處所含結(jié)果表明，表達(dá)E1 B19K可延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間(w/wo誘導(dǎo))，但是可以證明其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，卻不增強(qiáng)抗體生成。
相反，共表達(dá)Aven+E1 B 19K的細(xì)胞誘導(dǎo)后可延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間多達(dá)3天，并顯著增強(qiáng)抗體滴度(相對(duì)于親本CHO細(xì)胞系500E9多達(dá)20-30％)。這些細(xì)胞系顯示這些抗凋亡基因低水平組成型表達(dá)。
實(shí)施例14生物反應(yīng)器反應(yīng)器研究#1在這些實(shí)驗(yàn)中，利用補(bǔ)料分批方法的5L生物反應(yīng)器評(píng)價(jià)3個(gè)細(xì)胞系(14C6、15C3和15E2)。這3個(gè)實(shí)驗(yàn)利用單反應(yīng)器、誘導(dǎo)及非誘導(dǎo)條件下的雙反應(yīng)器、3種不同方法以及高密度接種進(jìn)行。
圖28-31包含這些生物反應(yīng)器研究的結(jié)果。該研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)的15C3細(xì)胞系的細(xì)胞存活率、活細(xì)胞密度以及滴度均高于500E9。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，15C3的比產(chǎn)率高于14C6，但兩者均低于500 E9細(xì)胞系。還觀察到松甾酮誘導(dǎo)并未提高15C3細(xì)胞系的抗體滴度。
實(shí)施例15生物反應(yīng)器研究#2在這些實(shí)驗(yàn)中，再次以松甾酮A為誘導(dǎo)劑，在對(duì)數(shù)早期的誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)15C3抗體生產(chǎn)細(xì)胞系。圖32-37包含這些結(jié)果，表明未誘導(dǎo)培養(yǎng)物產(chǎn)生的存活率、細(xì)胞密度以及滴度均高于500E9細(xì)胞系。
具體而言，未誘導(dǎo)培養(yǎng)物的抗體滴度高出500E9 20-30％。還觀察到該誘導(dǎo)可提高培養(yǎng)物壽命，但未提高抗體滴度，比產(chǎn)率低于500E9細(xì)胞系。
實(shí)施例16生物反應(yīng)器研究#3在100％的新鮮培養(yǎng)基中高密度接種相同的500E9和15C3細(xì)胞系，于對(duì)數(shù)中期誘導(dǎo)，進(jìn)行第3個(gè)生物反應(yīng)器研究。圖35-37包含該研究的結(jié)果。這些結(jié)果表明，15C3培養(yǎng)物產(chǎn)生的細(xì)胞衍生物以及滴度均高于500E9，未誘導(dǎo)培養(yǎng)物的滴度高出500E9 20-30％。誘導(dǎo)也提高培養(yǎng)物壽命，但未提高抗體滴度。該結(jié)果還表明，15C3的比產(chǎn)率低于500E9。
因此，總而言之，上述實(shí)施例所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，CHO DG44細(xì)胞系遭受長(zhǎng)期培養(yǎng)及葡萄糖去除時(shí)經(jīng)歷凋亡性細(xì)胞死亡，單獨(dú)或聯(lián)合表達(dá)抗凋亡基因的細(xì)胞系顯示，在表達(dá)兩種測(cè)試的抗凋亡基因(Aven和E1B-19K基因)的CHO細(xì)胞系的轉(zhuǎn)瓶和生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中，細(xì)胞存活率及產(chǎn)率提高。
這些結(jié)果表明，表達(dá)一種或多種抗凋亡基因，優(yōu)選在可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、如蛻皮激素可誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下表達(dá)，提供了增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)物、例如產(chǎn)生目的重組蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的比產(chǎn)率的不同方法。
本申請(qǐng)引用的全部專利和非專利參考文獻(xiàn)在此全文引入以供參考。
盡管詳述發(fā)現(xiàn)的說明書已經(jīng)描述了本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方案，應(yīng)當(dāng)理解以上說明書只是說明、而非限制本公開發(fā)明。本發(fā)明僅受以下權(quán)利要求的限制。
權(quán)利要求
1.防止或延遲重組細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡的方法，其中該細(xì)胞不是小鼠骨髓瘤細(xì)胞，其包含在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽，以便防止或延遲細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡，其中如果在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一種抗凋亡多肽，則該抗凋亡多肽不是Aven。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞包含編碼一種或多種目的多肽的一種或多種異源多核苷酸。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述目的多肽選自抗體、酶、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面因子、細(xì)胞代謝物、細(xì)胞分泌因子、病毒性因子以及膜結(jié)合因子。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗體選自抗CD154抗體(IDEC-131)、抗CD20抗體(Rituxan、ZevalinTM、抗B7抗體(IDEC 114)、抗CD23抗體(IDEC 152)、抗CD4抗體(IDEC 151)以及抗腫瘤抗原抗體。
5.權(quán)利要求1的方法，其中一種或多種抗凋亡多肽的表達(dá)受與編碼所述一種或多種抗凋亡多肽的多核苷酸有效連接的至少一種可誘導(dǎo)型異源啟動(dòng)子控制。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述可誘導(dǎo)型異源啟動(dòng)子可由類固醇誘導(dǎo)。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述可誘導(dǎo)型異源啟動(dòng)子是蛻皮激素啟動(dòng)子。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述重組細(xì)胞進(jìn)一步包含與所述至少一種可誘導(dǎo)型異源啟動(dòng)子有效連接的可篩選或可選擇的標(biāo)志。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述可篩選或可選擇的標(biāo)志是綠色熒光蛋白(GFP)或增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGF)。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗凋亡多肽由真核細(xì)胞或病毒中的基因編碼。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗凋亡多肽選自Bcl-xL、Bcl-2、Aven、E1B-19K和p35。
12.權(quán)利要求1的方法，包含表達(dá)一種抗凋亡多肽。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗凋亡多肽是E1B-19K。
14.權(quán)利要求1的方法，包含表達(dá)至少兩種抗凋亡多肽。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少兩種抗凋亡多肽包括E1B-19K和Aven。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述重組細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述重組細(xì)胞選自人類細(xì)胞、小鼠細(xì)胞以及嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述重組細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述重組細(xì)胞是CHO 5C11。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述重組細(xì)胞是BHK細(xì)胞。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述重組細(xì)胞處于商品化生產(chǎn)的大規(guī)模生物反應(yīng)器或培養(yǎng)裝置中。
22.提高重組細(xì)胞的細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，其包含在細(xì)胞中表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽，以便提高該細(xì)胞的細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物產(chǎn)量，其中如果在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一種抗凋亡多肽，則該抗凋亡多肽不是Aven。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物選自重組蛋白質(zhì)、抗體、酶、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面因子、細(xì)胞代謝物、細(xì)胞分泌因子、病毒性因子、膜結(jié)合因子以及多核苷酸。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述抗體選自抗CD154抗體(IDEC-131)、抗CD20抗體(Rituxan、ZevalinTM、抗B7抗體(IDEC 114)、抗CD23抗體(IDEC 152)、抗CD4抗體(IDEC 151)以及抗腫瘤抗原抗體。
25.權(quán)利要求22的方法，其中一種或多種抗凋亡多肽的表達(dá)受與編碼所述一種或多種抗凋亡多肽的多核苷酸有效連接的至少一種可誘導(dǎo)型異源啟動(dòng)子控制。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述可誘導(dǎo)型異源啟動(dòng)子可由類固醇誘導(dǎo)。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述可誘導(dǎo)型異源啟動(dòng)子是蛻皮激素啟動(dòng)子。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述重組細(xì)胞進(jìn)一步包含與所述至少一種可誘導(dǎo)型異源啟動(dòng)子有效連接的可篩選或可選擇的標(biāo)志。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述可篩選或可選擇的標(biāo)志是綠色熒光蛋白(GFP)或增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGF)。
30.權(quán)利要求22的方法，其中所述抗凋亡多肽由真核細(xì)胞或病毒中的基因編碼。
31.權(quán)利要求22的方法，其中所述抗凋亡多肽選自Bcl-xL、Bcl-2、Aven、E1B-19K和p35。
32.權(quán)利要求22的方法，包含表達(dá)一種抗凋亡多肽。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述抗凋亡多肽是E1B-19K。
34.權(quán)利要求22的方法，包含表達(dá)至少兩種抗凋亡多肽。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述至少兩種抗凋亡多肽包括E1B-19K和Aven。
36.權(quán)利要求22的方法，其中所述重組細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述重組細(xì)胞選自人類細(xì)胞、小鼠細(xì)胞以及嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述重組細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述重組細(xì)胞是CHO 5C11。
40.權(quán)利要求36的方法，其中所述重組細(xì)胞是BHK細(xì)胞。
41.權(quán)利要求22的方法，其中所述重組細(xì)胞處于商品化生產(chǎn)的大規(guī)模生物反應(yīng)器或培養(yǎng)裝置中。
42.提高重組細(xì)胞產(chǎn)量的方法，其包含在細(xì)胞中表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽，以便提高該重組細(xì)胞的產(chǎn)量，其中如果在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一種抗凋亡多肽，則該抗凋亡多肽不是Aven。
43.用于產(chǎn)生細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物的重組細(xì)胞，其表達(dá)或能夠表達(dá)至少兩種抗凋亡多肽。
44.權(quán)利要求43的重組細(xì)胞，其中所述抗凋亡多肽由真核細(xì)胞或病毒的基因編碼。
45.權(quán)利要求43的重組細(xì)胞，其中所述抗凋亡多肽選自Bcl-xL、Bcl-2、Aven、E1B-19K和p35。
46.權(quán)利要求43的重組細(xì)胞，其中所述至少兩種抗凋亡多肽包括E1B-19K和Aven。
47.權(quán)利要求43的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物選自重組蛋白質(zhì)、抗體、酶、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面因子、細(xì)胞代謝物、細(xì)胞分泌因子、病毒性因子、膜結(jié)合因子以及多核苷酸。
48.權(quán)利要求43的重組細(xì)胞，其中所述抗體選自抗CD154抗體(IDEC-131)、抗CD20抗體(Rituxan、ZevalinTM、抗B7抗體(IDEC 114)、抗CD23抗體(IDEC 152)、抗CD4抗體(IDEC 151)以及抗腫瘤抗原抗體。
49.權(quán)利要求43的重組細(xì)胞，其中一種或多種抗凋亡多肽的表達(dá)受與編碼所述一種或多種抗凋亡多肽的多核苷酸有效連接的至少一種可誘導(dǎo)型異源啟動(dòng)子控制。
50.權(quán)利要求49的重組細(xì)胞，其中所述可誘導(dǎo)型異源啟動(dòng)子可由類固醇誘導(dǎo)。
51.權(quán)利要求49的重組細(xì)胞，其中所述可誘導(dǎo)型異源啟動(dòng)子是蛻皮激素啟動(dòng)子。
52.權(quán)利要求49的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞進(jìn)一步包含與所述至少一種可誘導(dǎo)型異源啟動(dòng)子有效連接的可篩選或可選擇的標(biāo)志。
53.權(quán)利要求52的重組細(xì)胞，其中所述可篩選或可選擇的標(biāo)志是綠色熒光蛋白(GFP)或增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGF)。
54.權(quán)利要求43的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
55.權(quán)利要求43的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞選自人類細(xì)胞、小鼠細(xì)胞以及嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞。
56.權(quán)利要求43的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
57.權(quán)利要求56的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞是CHO 5C11。
58.權(quán)利要求43的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞是BHK細(xì)胞。
59.權(quán)利要求43的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在商品化生產(chǎn)的大規(guī)模生物反應(yīng)器或培養(yǎng)裝置中產(chǎn)生細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物。
60.細(xì)胞群體，用于產(chǎn)生所述細(xì)胞的一種或多種生物功能，其表達(dá)或能夠表達(dá)至少兩種抗凋亡多肽。
61.用于細(xì)胞性治療的細(xì)胞群體，其表達(dá)或能夠表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽來防止或延遲程序性細(xì)胞死亡，從而防止或延遲細(xì)胞內(nèi)程序性細(xì)胞死亡。本發(fā)明還涉及通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一種或多種抗凋亡多肽來提高細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)量，從而提高該細(xì)胞的細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)量。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物或用于細(xì)胞性治療的重組細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/85GK1526011SQ02813851
公開日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2002年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月10日
發(fā)明者M·里夫, M·J·貝滕鮑格, B·小菲格羅亞, E·埃羅, M·哈德維克, M 里夫, 攣, 聘衤捫, 貝滕鮑格 申請(qǐng)人:Idec藥物公司