專利名稱：糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法以及糖鏈天冬酰胺衍生物。
背景技術(shù)：
以前，通過糖水解酶將糖鏈分解制備衍生物的技術(shù)一直用于糖鏈的結(jié)構(gòu)解析等數(shù)毫克級的分析研究。但是，由于不能大量得到各種糖鏈的衍生物，因此克等級的研究技術(shù)發(fā)展緩慢。因此，難以將糖鏈的衍生物應(yīng)用于藥品制造等合成研究。
另一方面，已知由卵黃能夠得到大量糖肽(BiochimicaetBiophysica Acta 1335(1997)p23～32)。但是，并沒有大量得到關(guān)于圖1所示化合物1以及該化合物1中缺失分支糖鏈的一個非還原末端的唾液酸或半乳糖等幾個糖殘基的一系列化合物的芴基甲氧基羰基(Fmoc)化的糖鏈衍生物。另外，也有從人體血液中的蛋白質(zhì)等少量分離出幾種糖鏈的實例，但是如果將該糖鏈用于藥品的制造，則存在對人體有害的艾滋病病毒或肝炎病毒等混入該藥品中的危險性，因此將該糖鏈應(yīng)用于藥品的技術(shù)成了問題。
可是，也有很多用分支型糖鏈制備其分支部分具有相同結(jié)構(gòu)的糖鏈的實例。作為這種現(xiàn)有技術(shù)，存在三種方法。第一種是由天然存在的糖蛋白分離純化結(jié)合了天冬酰胺的復(fù)合型糖鏈的方法。作為其代表例，有T.Tamura等，Anal.Biochem.，1994，216，p335-344；V.H.Thomas等，Carbohydr.Res.，1998，306，p387-400；K.G.Rice等，Biochemistry，1993，32，p7264-7270等記載的方法。這些方法的優(yōu)點在于沒有必要合成糖鏈。但是，也存在一些缺點。例如，來源于上述糖蛋白的糖鏈作為在非還原末端部分隨機缺失幾個糖殘基的糖鏈的混合物得到，該混合物中含有的糖鏈由于其物理和化學(xué)性質(zhì)類似，分離成各種糖鏈非常困難，因此大量得到單一的糖鏈實際上是不可能的。另外，為了比較大量地得到糖鏈，也有由人血中的蛋白質(zhì)(由血纖維蛋白原(fibrinogen)分離C.H.Hokke等，Carbohydr.Res.，305(1997)，p463-468；由人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(Human SerumTransferrin)分離M.Mizuno等，J.Am.Chem.Soc.，1999，121，p284-290)分離糖鏈的實例。如上所述，在人血中的蛋白質(zhì)中有可能混入了艾滋病病毒和肝炎病毒，必需慎重操作。因此，難以將得到的糖鏈、其衍生物用于開發(fā)醫(yī)藥品。另外，即使得到大量糖鏈，其結(jié)構(gòu)也是有限的，實際上并沒有得到多種結(jié)構(gòu)的糖鏈或其衍生物的實例。
在K.G.Rice等，Biochemistry，1993，32，p7264-7270或Rice等，Neoglycoconjugate，Academic Press，1994，ISBN 0-12-440585-1 p286-321中，使用糖水解酶由糖鏈的非還原末端除去了糖殘基，但是由于不能大量得到作為原料的單一結(jié)構(gòu)的糖鏈，因此只能在分析等級實施。E.Meinjohanns(J.Chem.Soc.Perkin Transl，1998，p549-560)等由牛胎球蛋白(Bovine Fetuin)(來源于牛的糖蛋白)得到圖5所示的化合物56后，經(jīng)由圖3所示的化合物33，合成了圖1所示的化合物10。為了得到最初的原料化合物56，利用了肼分解反應(yīng)。該肼毒性高，將得到的糖鏈衍生物應(yīng)用于醫(yī)藥品時，有可能混入微量的肼，因此在安全性方面存在問題。另外，只能少量得到未結(jié)合唾液酸的化合物56、33和10的糖鏈衍生物。
第二種方法是化學(xué)合成糖鏈的方法。如J.Seifert等，Angew ChemInt.Ed.2000，39，p531-534的報告例所述，現(xiàn)在已經(jīng)能夠利用化學(xué)合成法將單糖組合構(gòu)建約10個糖。這種方法的優(yōu)點是理論上能夠得到所有糖鏈衍生物。但是，由于其步驟數(shù)量龐大，因此存在難以大量合成的缺點。另外，即使合成數(shù)毫克約10個糖殘基結(jié)合而成的糖鏈，也需要近1年的時間。迄今為止雖然有一些化學(xué)合成糖鏈的實例，但現(xiàn)狀是大多數(shù)僅能合成數(shù)毫克作為目的物的糖鏈。
第三種方法是將酶反應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)組合合成糖鏈的方法。作為其代表例，有例如Carlo Unverzagt，Angew Chem Int.Ed.1996，35，p2350-2353的報道。這種方法是利用化學(xué)合成構(gòu)建某種程度的糖鏈后，利用酶反應(yīng)在糖鏈上加成糖殘基，使糖鏈延長的方法。但是，由于延長糖時使用的酶具有基質(zhì)特異性，因此能夠?qū)胩擎湹奶堑姆N類受到限制。另外，由于化學(xué)合成的步驟數(shù)量龐大，因此難以大量合成，最終只能得到少量目的物。另外，C.H.Lin(Bioorganic & MedicinalChemistry，1995，p1625-1630)等采用M.Koketsu等報道的方法(J.Carbohydrate Chemistry，1995，14(6)，p833-841)，由卵黃得到唾液酸寡糖肽，然后使用糖水解酶、糖轉(zhuǎn)移酶，改變了糖鏈的非還原末端部分的結(jié)構(gòu)。在該論文的圖中，記載了非還原末端部分僅結(jié)合了1個天冬酰胺(Asn)殘基的糖鏈，但是按照J(rèn).CarbohydrateChemistry，1995，14(6)，p833-841報道的方法，得到糖鏈的非還原末端除天冬酰胺以外還結(jié)合了平均2.5個賴氨酸等幾種氨基酸的物質(zhì)的混合物。因此，不能作為單一化合物得到糖鏈的衍生物，另外，也沒有暗示得到大量有關(guān)分支型糖鏈的分支糖鏈的糖殘基任意缺失的化合物的各種衍生物。在C.H.Lin等的論文中，也沒有給出作為單一產(chǎn)物得到糖鏈肽的根據(jù)。Y.Ichikawa在Glycopeptide and RelatedCompounds(Marcel Dekker，Inc.，1997，ISBN 0-8247-9531-8，p79-205)中指出，對3支鏈型的復(fù)合型糖鏈從末端依次用糖水解酶處理，能夠從糖鏈的非還原末端依次除去糖鏈，得到各種糖鏈的衍生物。但是，并沒有敘述酶處理后如何分離各種糖鏈，另外，僅合成了支鏈均一的物質(zhì)。因此，認(rèn)為采用該方法，也不能大量得到有關(guān)分支型糖鏈的分支糖鏈的糖殘基任意缺失的化合物的各種衍生物。
發(fā)明公開本發(fā)明的目的在于提供一種糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法，與以前相比能夠非常容易且大量地得到醫(yī)藥品開發(fā)等領(lǐng)域中有用的各種分離的糖鏈天冬酰胺衍生物。另外，本發(fā)明的目的還在于提供一種糖鏈天冬酰胺的制備方法和糖鏈的制備方法，其中包括制備糖鏈天冬酰胺衍生物的步驟，與以前相比能夠非常容易且大量地分別得到與糖鏈天冬酰胺衍生物同樣有用的各種分離的糖鏈天冬酰胺和糖鏈。而且，本發(fā)明的目的還在于提供一種新型的糖鏈天冬酰胺衍生物、糖鏈天冬酰胺和糖鏈。
也就是說，本發(fā)明涉及(1)一種來源于糖鏈天冬酰胺的糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法，其中，包括下述步驟(a)在含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入脂溶性的保護基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物，以及(b)將該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物或該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，將得到的混合物供于色譜法，分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物。
(2)如上述(1)所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法，進一步包括步驟(b’)，即，使用糖水解酶將步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物水解。
(3)如上述(1)或(2)所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法，含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有下述化合物和/或該化合物中缺失1個以上糖殘基得到的化合物。

(4)如上述(1)～(3)中任意一項所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法，脂溶性的保護基是芴基甲氧基羰基(Fmoc)。
(5)如上述(1)～(3)中任意一項所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法，步驟(a)是在含有1種或2種以上在非還原末端具有唾液酸殘基的糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入Fmoc基，并在唾液酸殘基上導(dǎo)入苯甲基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的步驟。
(6)一種糖鏈天冬酰胺的制備方法，其中，包括下述步驟(a)在含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入脂溶性的保護基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物，(b)將該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物或該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，將得到的混合物供于色譜法，分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物，以及(c)除去步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物的保護基，得到糖鏈天冬酰胺。
(7)如上述(6)所述的糖鏈天冬酰胺的制備方法，進一步包括下述步驟(b’)使用糖水解酶將步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物水解的步驟，和/或(c’)使用糖水解酶將步驟(c)得到的糖鏈天冬酰胺水解的步驟。
(8)如上述(6)或(7)所述的糖鏈天冬酰胺的制備方法，含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有下述化合物和/或該化合物中缺失1個以上糖殘基得到的化合物。

(9)如上述(6)～(8)中任意一項所述的糖鏈天冬酰胺的制備方法，脂溶性的保護基是Fmoc基。
(10)如上述(6)～(8)中任意一項所述的糖鏈天冬酰胺的制備方法，步驟(a)是在含有1種或2種以上在非還原末端具有唾液酸殘基的糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入Fmoc基，并在唾液酸殘基上導(dǎo)入苯甲基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的步驟。
(11)一種糖鏈的制備方法，其中，包括下述步驟(a)在含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入脂溶性的保護基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物，(b)將該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物或該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，將得到的混合物供于色譜法，分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物，(c)除去步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物的保護基，得到糖鏈天冬酰胺，以及(d)除去步驟(c)得到的糖鏈天冬酰胺的天冬酰胺殘基，得到糖鏈。
(12)如上述(11)所述的糖鏈的制備方法，進一步包括下述步驟(b’)使用糖水解酶將步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物水解的步驟，和/或(c’)使用糖水解酶將步驟(c)得到的糖鏈天冬酰胺水解的步驟，和/或(d’)使用糖水解酶將步驟(d)得到的糖鏈水解的步驟。
(13)如上述(11)或(12)所述的糖鏈的制備方法，含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有下述化合物和/或該化合物中缺失1個以上糖殘基得到的化合物。

(14)如上述(11)～(13)中任意一項所述的糖鏈的制備方法，脂溶性的保護基是Fmoc基。
(15)如上述(11)～(13)中任意一項所述的糖鏈的制備方法，步驟(a)是在含有1種或2種以上在非還原末端具有唾液酸殘基的糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入Fmoc基，并在唾液酸殘基上導(dǎo)入苯甲基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的步驟。
(16)具有下述通式的糖鏈天冬酰胺衍生物。
(式中，R1和R2是H或下式表示的基團，可以相同也可以不同。
或
其中，R1和R2均為下式所示基團的場合除外。
(17)具有下述通式的糖鏈天冬酰胺衍生物。
(式中，RX和RY中一方為下式表示的基團， 另一方為H或下式表示的基團。
或 (18)具有下述通式的糖鏈天冬酰胺。
(式中，R3和R4是H或下式表示的基團，可以相同也可以不同。
或 其中，R3和R4均為下式所示基團的場合除外。
或 (19)具有下述通式的糖鏈。
(式中，R5和R6是H或下式表示的基團，可以相同也可以不同。
或 其中，R5和R6均為下式所示基團的場合，
或 或者R5或R6中一方為H，且另一方為下式所示基團的場合除外。


圖1是表示本發(fā)明能夠得到的一組糖鏈天冬酰胺衍生物的結(jié)構(gòu)的圖。
圖2是表示本發(fā)明能夠得到的一組糖鏈天冬酰胺衍生物的結(jié)構(gòu)的圖。
圖3是表示本發(fā)明能夠得到的一組糖鏈天冬酰胺的結(jié)構(gòu)的圖。
圖4是表示本發(fā)明能夠得到的一組糖鏈天冬酰胺的結(jié)構(gòu)的圖。
圖5是表示本發(fā)明能夠得到的一組糖鏈的結(jié)構(gòu)的圖。
圖6是表示本發(fā)明能夠得到的一組糖鏈的結(jié)構(gòu)的圖。
圖7是表示本發(fā)明糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法的步驟的一個實例的圖。
圖8是表示使用各種糖水解酶改變糖鏈天冬酰胺衍生物的步驟的一個實例的圖。
圖9是表示使用各種糖水解酶改變糖鏈天冬酰胺衍生物的步驟的一個實例的圖。
圖10是表示使用各種糖水解酶改變糖鏈天冬酰胺衍生物的步驟的一個實例的圖。
圖11是表示使用各種糖水解酶改變糖鏈天冬酰胺衍生物的步驟的一個實例的圖。
圖12是表示由糖鏈天冬酰胺衍生物除去保護基(Fmoc基)的步驟以及由糖鏈天冬酰胺除去天冬酰胺殘基的步驟的一個實例的圖。
發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法的一大特征在于，在例如來源于天然糖蛋白的糖鏈天冬酰胺，優(yōu)選由天冬酰胺結(jié)合型糖鏈得到的糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入(結(jié)合)脂溶性保護基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物后，將該混合物分離成各種糖鏈天冬酰胺衍生物。另外，在本說明書中，“糖鏈天冬酰胺”是指結(jié)合了天冬酰胺的狀態(tài)的糖鏈。另外，“天冬酰胺結(jié)合型糖鏈”是指在蛋白質(zhì)的多肽中天冬酰胺(Asn)的酰氨基上，通過N-糖苷鍵結(jié)合了還原末端存在的N-乙?；咸前?，且以Man(β1-4)GlcNac(β1-4)GlcNac為母核的糖鏈群?！疤擎溙於０费苌铩笔侵柑於０窔埢辖Y(jié)合了脂溶性保護基的狀態(tài)的糖鏈天冬酰胺。另外，化合物的結(jié)構(gòu)式中，“AcHN”表示乙酰氨基。
如上所述，來源于天然糖蛋白的糖鏈?zhǔn)欠沁€原末端的糖殘基隨機缺失的糖鏈混合物。本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)通過在來源于天然糖蛋白的糖鏈，具體而言是糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺中導(dǎo)入脂溶性的保護基，能夠采用公知的色譜法容易地將導(dǎo)入了該保護基的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物分離成各種糖鏈天冬酰胺衍生物。據(jù)此，能夠分別大量地制備具有各種結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物。例如，能夠分離以前難以分離的圖1所示化合物2和6或者圖2所示化合物3和7這種結(jié)構(gòu)類似的糖鏈天冬酰胺衍生物，從而能夠分別容易且大量地制備這些化合物。另外，以得到的糖鏈天冬酰胺衍生物為基礎(chǔ)，例如使糖水解酶依次作用，除去糖殘基，也能夠進一步合成各種糖鏈天冬酰胺衍生物。
如上所述，通過在糖鏈天冬酰胺中引入脂溶性保護基得到衍生物，能夠分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物，認(rèn)為這是由于通過引入脂溶性的保護基，糖鏈天冬酰胺衍生物整體的脂溶性增高，例如與適合使用的反相柱的相互作用大幅度提高，結(jié)果能夠更靈敏地反映糖鏈結(jié)構(gòu)的差異，分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物。例如，本發(fā)明中優(yōu)選使用的脂溶性保護基Fmoc基的脂溶性非常高。也就是說，F(xiàn)moc基的芴基骨架采取中心的五元環(huán)上結(jié)合2個苯環(huán)的脂溶性非常高的結(jié)構(gòu)，與反相柱之一的ODS柱的十八烷基產(chǎn)生非常強的相互作用，能夠分離結(jié)構(gòu)類似的糖鏈天冬酰胺衍生物。
而且，按照本發(fā)明，如下所述，通過除去得到的糖鏈天冬酰胺衍生物的保護基，能夠容易且大量地獲得各種糖鏈天冬酰胺，此外，通過除去得到的糖鏈天冬酰胺的天冬酰胺殘基，能夠容易且大量地獲得各種糖鏈。
本發(fā)明的糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法，具體包括下述步驟(a)在含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入脂溶性的保護基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物，以及(b)將該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物或該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，將得到的混合物供于色譜法，分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物。
作為步驟(a)中使用的含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物，只要是含有1種或2種以上結(jié)合有天冬酰胺的糖鏈的混合物即可，并沒有特別的限定。例如，可以是含有1種或2種以上結(jié)合了1個或多個天冬酰胺的糖鏈的混合物。其中，從容易獲得的觀點來看，優(yōu)選含有1種或2種以上還原末端結(jié)合了天冬酰胺的糖鏈的混合物。另外，在本說明書中，“糖鏈”是指2個以上任意的單糖結(jié)合得到的物質(zhì)。
所述糖鏈天冬酰胺的混合物，可以按照公知的方法得到，優(yōu)選由天然的原料，例如乳汁、來源于牛的胎球蛋白或者蛋得到糖蛋白和/或糖肽的混合物，在該混合物中添加例如蛋白分解酶，如鏈霉蛋白酶(和光純藥社制)、肌動蛋白酶-E(Actinase-E，科研制藥社制)或一般的羧基肽酶、氨基肽酶等酶，在公知的反應(yīng)條件下進行反應(yīng)，切斷肽部分，作為該反應(yīng)后的反應(yīng)液得到，或者按照公知的方法，例如利用使用凝膠過濾柱、離子交換柱等的各種色譜法或者高效液相色譜法(HPLC)的純化法，由反應(yīng)液除去糖鏈天冬酰胺以外的成分后得到。從容易制得的觀點來看，優(yōu)選使用公知的來源于蛋的糖肽〔Biochimicaet Biophysica Acta 1335(1997)p23～32；粗純化SGP(含有蛋黃中的蛋白質(zhì)、無機鹽等，且含有糖肽10～80重量％的混合物)〕制備上述混合物。
另外，從有效得到具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物的觀點來看，優(yōu)選進一步將該混合物中含有的糖鏈天冬酰胺水解，預(yù)先將一部分糖殘基切斷。另外，該切斷的程度只要在至少保持本說明書所說的作為“糖鏈”的結(jié)構(gòu)的范圍內(nèi)即可，并沒有特別的限定。作為這樣得到的混合物，可以例舉含有圖3所示化合物24和/或該化合物中缺失1個以上糖殘基得到的化合物的混合物。另外，在這種情況下，對于該缺失了糖殘基的化合物，從保持本說明書所說的“糖鏈”結(jié)構(gòu)的觀點來看，糖殘基的缺失上限為9。
例如圖3所示化合物25和29可以通過如下所述將含有化合物24的糖鏈天冬酰胺混合物(以下稱為化合物24混合物)酸水解，在該混合物中有效獲得，進而可以有效獲得對應(yīng)的糖鏈天冬酰胺衍生物，即圖1所示化合物2和6。
例如，在化合物24混合物中適量加入0.1N左右的酸水溶液，在4～100℃下進行反應(yīng)。這時，利用薄層色譜法(例如，使用硅膠60F254(Merck公司制)，并使用乙酸乙酯∶甲醇∶水＝4∶4∶3作為展開溶劑)追蹤水解反應(yīng)的進行，在得到化合物25和29最多的時刻停止反應(yīng)。例如，在25℃的條件下可以經(jīng)5～10小時停止反應(yīng)，在100℃的條件下可以經(jīng)數(shù)分鐘停止反應(yīng)。優(yōu)選在70℃下進行反應(yīng)，反應(yīng)開始后，經(jīng)35分鐘停止反應(yīng)，迅速用冰冷卻。另外，可以通過中和反應(yīng)液停止反應(yīng)。另外，作為上述酸，并沒有特別限定，例如可以使用鹽酸、硫酸、硝酸、三氟乙酸等無機酸和有機酸、陽離子交換樹脂、不溶性的固體試劑等。
同樣，由化合物24也可以在上述混合物中有效得到化合物33。例如，在化合物24混合物中適量加入上述酸水溶液，優(yōu)選在80℃下進行反應(yīng)，反應(yīng)開始后優(yōu)選經(jīng)60分鐘停止反應(yīng)。
另外，水解也可以利用酶進行。作為這時可以使用的酶，優(yōu)選糖水解酶，內(nèi)切型、外切型任何一種反應(yīng)方式的酶均可使用。例如，與上述同樣，由化合物24得到化合物25和29的場合，可以使用具有由末端切斷唾液酸的活性的唾液酸水解酶。作為這種酶，并沒有特別的限定，只要具有上述活性，市售的酶、新分離出來的酶、通過基因工程創(chuàng)造出的酶均可。酶反應(yīng)可以采用公知的條件，這時可以與上述同樣利用薄層色譜法追蹤反應(yīng)的進行，在獲得化合物25和29最多的時刻適當(dāng)停止反應(yīng)。
使用這樣得到的含有糖鏈天冬酰胺的混合物，在其中含有的糖鏈天冬酰胺中導(dǎo)入脂溶性的保護基。作為該保護基，沒有特別的限定，例如可以使用Fmoc基、叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲基、烯丙基、烯丙氧基碳酸酯基、乙酰基等碳酸酯類或酰胺類的保護基等。從可以將得到的糖鏈天冬酰胺衍生物直接用于合成所需的糖肽的觀點來看，作為該保護基，優(yōu)選Fmoc基或Boc基等，更優(yōu)選Fmoc基。在唾液酸等比較酸性的條件下糖鏈上存在不穩(wěn)定的糖時，F(xiàn)moc基特別有效。另外，保護基的導(dǎo)入可以按照公知的方法(參照例如Protecting groups inOrganic chemistry，John Wiley & Sons INC.，New York 1991，ISBN0-471-62301-6)進行。
例如，使用Fmoc基的場合，在含有糖鏈天冬酰胺的混合物中適量加入丙酮后，再加入9-芴基甲基-N-琥珀酰亞胺基(succinimidyl)碳酸酯和碳酸氫鈉，溶解，在25℃下進行Fmoc基結(jié)合到天冬酰胺殘基上的反應(yīng)，可以在該糖鏈天冬酰胺的天冬酰胺殘基上導(dǎo)入Fmoc基。
通過以上操作，可以得到導(dǎo)入了脂溶性保護基的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物。
接著，在步驟(b)中，將糖鏈天冬酰胺衍生物混合物供于公知的色譜法，特別是分離型的色譜法，分離成各種糖鏈天冬酰胺衍生物。另外，在所述步驟中，可以直接使用上述步驟(a)中得到的糖鏈天冬酰胺衍生物混合物，從有效得到具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物的觀點來看，也可以使用進一步將該混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，預(yù)先切斷一部分糖殘基得到的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物。另外，糖殘基的切斷程度與上述同樣。另外，水解與上述同樣進行。
例如，得到化合物3和7的場合，與從和化合物2和6的混合物將其分離相比，使用半乳糖水解酶對該混合物進行水解處理，用HPLC能夠更容易地從得到的混合物分離化合物3和7，而且能夠作為單一化合物大量獲得各種化合物。
利用色譜法分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物，可以適當(dāng)采用單獨的公知色譜法進行，或者組合使用多種公知色譜法進行。
例如，用凝膠過濾柱色譜法將得到的糖鏈天冬酰胺衍生物混合物純化后，用HPLC純化。作為HPLC中可以使用的柱，優(yōu)選反相系的柱，例如可以利用ODS、Phenyl系、腈系或陰離子交換系的柱，具體而言，例如Pharmacia公司制MonoQ柱Iatron公司制Iatrobeads柱等。分離條件等可以適當(dāng)參照公知的條件進行調(diào)整。通過以上操作，可以由糖鏈天冬酰胺衍生物混合物得到所需的各種糖鏈天冬酰胺衍生物。圖7示意性地表示本發(fā)明糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法的步驟的一個實例。
而且，通過將步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，可以有效得到具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物〔步驟(b’)〕。例如，在分離糖鏈天冬酰胺衍生物的階段，限制混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物的種類，將糖鏈天冬酰胺衍生物大致分離，接著水解，例如使用糖水解酶進行水解，從而能夠有效得到具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物。另外，水解可以與上述同樣進行。從更有效地得到具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物的觀點來看，特別優(yōu)選使用糖殘基的切斷方式明確的糖水解酶進行水解。
例如，化合物2和6通過除去半乳糖殘基轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?和7(圖8)，可以通過將化合物2和6溶解于緩沖液(例如磷酸緩沖溶液、醋酸緩沖溶液、Good’s緩沖溶液等)中，按照公知的條件，使用半乳糖水解酶，進行半乳糖殘基的切斷反應(yīng)實現(xiàn)。另外，化合物2和6可以是其混合物，也可以是各種分離后的物質(zhì)。在該反應(yīng)中使用的半乳糖水解酶優(yōu)選利用市售的公知外切型酶。另外，只要具有同樣的活性，也可以是新分離出的酶、利用基因工程創(chuàng)造出的酶。接著，可以與上述同樣，將反應(yīng)后得到的反應(yīng)液(糖殘基切斷后的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)供于色譜法，得到各種糖鏈天冬酰胺衍生物。例如，分離優(yōu)選采用HPLC(ODS柱，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶15)進行。
化合物3和7通過除去N-乙?；咸前窔埢D(zhuǎn)變?yōu)榛衔?和8(圖8)，可以通過將化合物3和7溶解于緩沖液(例如磷酸緩沖溶液、醋酸緩沖溶液、Good’s緩沖溶液等)中，按照公知的條件，使用N-乙?；咸前匪饷?，進行N-乙?；咸前窔埢那袛喾磻?yīng)實現(xiàn)。另外，也可以使用N-乙?；被禾擒彰杆饷?。另外，化合物3和7可以是其混合物，也可以是各種分離后的物質(zhì)。在該反應(yīng)中使用的各種酶優(yōu)選利用市售的外切型酶。另外，只要具有同樣的活性，也可以是新分離出的酶、利用基因工程創(chuàng)造出的酶。接著，可以與上述同樣，將反應(yīng)后得到的反應(yīng)液(糖殘基切斷后的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)供于色譜法，得到各種糖鏈天冬酰胺衍生物。例如，分離優(yōu)選采用HPLC(ODS柱，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶甲醇＝65∶35或50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶15)進行。
化合物4和8通過除去甘露糖殘基轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?和9(圖8)，可以通過將化合物4和8溶解于緩沖液(例如磷酸緩沖溶液、醋酸緩沖溶液、Good’s緩沖溶液等)中，按照公知的條件，使用甘露糖水解酶，進行甘露糖殘基的切斷反應(yīng)實現(xiàn)。另外，化合物4和8可以是其混合物，也可以是各種分離后的物質(zhì)。在該反應(yīng)中使用的甘露糖水解酶優(yōu)選利用市售的外切型酶。另外，只要具有同樣的活性，也可以是新分離出的酶、利用基因工程創(chuàng)造出的酶。接著，可以與上述同樣，將反應(yīng)后得到的反應(yīng)液(糖殘基切斷后的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)供于色譜法，得到各種糖鏈天冬酰胺衍生物。例如，分離優(yōu)選采用HPLC(ODS柱，展開溶劑可以將10-200mM的醋酸銨等緩沖溶液與乙腈、或者乙醇、或者甲醇、或者丁醇或或者丙醇等具有脂溶性的水溶性有機溶劑適當(dāng)混合后使用。其中在舉例的情況下，作為展開溶劑，優(yōu)選50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶18)進行。
化合物10通過除去半乳糖殘基轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?1(圖9)，可以通過將化合物10溶解于緩沖液(例如磷酸緩沖溶液、醋酸緩沖溶液、Good’s緩沖溶液等)中，與上述同樣，按照公知的條件，使用半乳糖水解酶，進行半乳糖殘基的切斷反應(yīng)實現(xiàn)。由反應(yīng)后的反應(yīng)液(糖殘基切斷后的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)分離糖鏈天冬酰胺衍生物，例如優(yōu)選采用HPLC(ODS柱，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝85∶15)進行。
另外，進一步使用任意的糖水解酶將化合物11水解，可以轉(zhuǎn)變成各種糖鏈天冬酰胺衍生物(例如化合物11、12和13等)。
化合物11通過除去N-乙?；咸前窔埢D(zhuǎn)變?yōu)榛衔?2(圖9)，可以通過將化合物11溶解于緩沖液(例如磷酸緩沖溶液、醋酸緩沖溶液、Good’s緩沖溶液等)中，與上述同樣，按照公知的條件，使用N-乙酰基葡糖胺水解酶，進行N-乙酰基葡糖胺殘基的切斷反應(yīng)實現(xiàn)。由反應(yīng)后的反應(yīng)液(糖殘基切斷后的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)分離糖鏈天冬酰胺衍生物，例如優(yōu)選采用HPLC(ODS柱，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝85∶18)進行。
化合物12通過除去甘露糖殘基轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?3(圖9)，可以通過將化合物12溶解于緩沖液(例如磷酸緩沖溶液、醋酸緩沖溶液、Good’s緩沖溶液等)中，與上述同樣，按照公知的條件，使用甘露糖水解酶，進行甘露糖殘基的切斷反應(yīng)實現(xiàn)。由反應(yīng)后的反應(yīng)液(糖殘基切斷后的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物，例如優(yōu)選采用高效液相柱色譜法(ODS柱，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶18)進行。
化合物3和7轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?4和19(圖10)，可以通過將化合物3和7溶解于緩沖液(例如磷酸緩沖溶液、醋酸緩沖溶液、Good’s緩沖溶液等)中，按照公知的條件，使用唾液酸水解酶，進行唾液酸殘基的切斷反應(yīng)實現(xiàn)。另外，化合物3和7可以是其混合物，也可以是各種分離后的物質(zhì)。在該反應(yīng)中使用的唾液酸水解酶優(yōu)選利用市售的外切型酶。另外，只要具有同樣的活性，也可以是新分離出的酶、利用基因工程創(chuàng)造出的酶。接著，可以與上述同樣，將反應(yīng)后得到的反應(yīng)液(糖殘基切斷后的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)供于色譜法，得到各種糖鏈天冬酰胺衍生物。例如，分離優(yōu)選采用高效液相柱色譜法(ODS柱，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝85∶15)進行。
化合物14和19通過除去N-乙?；咸前窔埢D(zhuǎn)變?yōu)榛衔?5和20(圖10)，可以通過將化合物14和19溶解于緩沖液(例如磷酸緩沖溶液、醋酸緩沖溶液、Good’s緩沖溶液等)中，與上述同樣，按照公知的條件，使用N-乙?；咸前匪饷?，進行N-乙酰基葡糖胺殘基的切斷反應(yīng)實現(xiàn)。由反應(yīng)后的反應(yīng)液(糖殘基切斷后的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物，例如優(yōu)選采用高效液相柱色譜法(ODS柱，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶18)進行。
化合物15和20通過除去甘露糖殘基轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?6和21(圖10)，可以通過將化合物15和20溶解于緩沖液(例如磷酸緩沖溶液、醋酸緩沖溶液、Good’s緩沖溶液等)中，與上述同樣，按照公知的條件，使用甘露糖水解酶，進行甘露糖殘基的切斷反應(yīng)實現(xiàn)。由反應(yīng)后的反應(yīng)液(糖殘基切斷后的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物，例如優(yōu)選采用高效液相柱色譜法(ODS柱，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶18)進行。
化合物16和21通過除去半乳糖殘基轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?7和22(圖11)，可以通過將化合物16和21溶解于緩沖液(例如磷酸緩沖溶液、醋酸緩沖溶液、Good’s緩沖溶液等)中，與上述同樣，按照公知的條件，使用半乳糖水解酶，進行半乳糖殘基的切斷反應(yīng)實現(xiàn)。由反應(yīng)后的反應(yīng)液(糖殘基切斷后的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物，例如優(yōu)選采用高效液相柱色譜法(ODS柱，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝85∶15)進行。
化合物17和22通過除去N-乙?；咸前窔埢D(zhuǎn)變?yōu)榛衔?8和23(圖11)，可以通過將化合物17和22溶解于緩沖液(例如磷酸緩沖溶液、醋酸緩沖溶液、Good’s緩沖溶液等)中，與上述同樣，按照公知的條件，使用N-乙酰基葡糖胺水解酶，進行N-乙酰基葡糖胺殘基的切斷反應(yīng)實現(xiàn)。由反應(yīng)后的反應(yīng)液(糖殘基切斷后的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物，例如優(yōu)選采用高效液相柱色譜法(ODS柱，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶18)進行。
如上所述得到各種糖鏈天冬酰胺衍生物后，通過進一步使用各種糖水解酶等將該衍生物水解，除去糖鏈的非還原末端的糖殘基，能夠分別作為單一化合物得到糖鏈末端的分支結(jié)構(gòu)不均一的各種糖鏈天冬酰胺衍生物。另外，通過改變使用各種糖水解酶進行水解的順序及其種類，可以制備更多種類的糖鏈天冬酰胺衍生物。
按照以前的方法，即便想以分析等級得到具有有限的糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物，都需要非常長的時間和非常多的成本，但是按照本發(fā)明，不需要特別的裝置和試劑，使用常用的凝膠過濾柱、HPLC柱以及至少3種糖水解酶(例如半乳糖水解酶、甘露糖水解酶、N-乙酰基葡糖胺水解酶)等，2周左右就能夠以1g的程度制備具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物。
通過以上操作，例如保護基為Fmoc基的場合，可以有效得到具有下述通式的糖鏈天冬酰胺衍生物。
(式中，R1和R2是H或下式表示的基團，可以相同也可以不同。
或 其中，R1和R2均為下式所示基團的場合除外。
作為上述糖鏈天冬酰胺衍生物，具體可以例舉圖1和圖2所示的各種化合物。其中，化合物1、化合物2～9、11～23、70和71是本發(fā)明首次制備的化合物。本發(fā)明包括該化合物。
另外，作為本發(fā)明糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法的優(yōu)選方式，提供一種糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法，其中，步驟(a)是使用含有1種或2種以上非還原末端具有唾液酸殘基的糖鏈天冬酰胺的混合物，在該混合物中含有的糖鏈天冬酰胺上導(dǎo)入Fmoc基，并在唾液酸殘基上導(dǎo)入苯甲基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的步驟。采用上述制備方法，能夠更有效地大量得到各種類型的糖鏈天冬酰胺衍生物。例如，能夠提高圖1所示化合物2和6的分離效率，有效進行兩種化合物的制備。也就是說，從化合物2和6的混合物直接有效地明確分離兩種化合物是不利的，但按照本方式，在兩種化合物的唾液酸殘基中導(dǎo)入苯甲基，一旦作為以下的化合物76和77的混合物供于上述步驟(b)，則化合物76和77的分離能夠比較容易地進行，因此能夠分離兩種化合物，然后按照后述的方法使苯甲基脫離，即可有效地從化合物2和6的混合物分離兩種化合物。


認(rèn)為化合物2和6的分離有些困難，而在這些化合物的唾液酸殘基上導(dǎo)入苯甲基得到的化合物76和77的分離能夠容易地進行，是由于在唾液酸殘基的羧基上導(dǎo)入脂溶性高的苯甲基，進一步提高了與HPLC(高效液相色譜法)的反相柱的疏水性相互作用。因此，推測與分離步驟(b)中適合使用的反相柱的相互作用大幅度提高，結(jié)果能夠更敏銳地反映糖鏈結(jié)構(gòu)的差異，從而分離兩種化合物。
作為含有1種或2種以上在非還原末端具有唾液酸殘基的糖鏈天冬酰胺的混合物，只要是含有1種或2種以上具有所述結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺的混合物即可，并沒有特別的限定。從容易獲得的觀點來看，優(yōu)選含有1種或2種以上在非還原末端具有唾液酸殘基且在還原末端結(jié)合了天冬酰胺的糖鏈的混合物。作為該混合物，優(yōu)選含有上述圖3所示化合物24和/或該化合物中缺失1個以上糖殘基得到的化合物的混合物。
另外，從更有效得到具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物的觀點來看，優(yōu)選實施上述步驟(b’)。
另外，在本方式中，分別得到導(dǎo)入了苯甲基和Fmoc基的糖鏈天冬酰胺衍生物，以及僅導(dǎo)入了Fmoc基的糖鏈天冬酰胺衍生物。
在糖鏈天冬酰胺的唾液酸殘基上導(dǎo)入苯甲基可以按照公知方法(例如參照Protecting groups in Organic chemistry，John Wiley& Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)進行。
通過以上操作，例如可以有效得到具有下述通式的導(dǎo)入了苯甲基和Fmoc基的糖鏈天冬酰胺衍生物。
(式中，RX和RY中一方為下式表示的基團，
另一方為H或下式表示的基團。
或 作為所述糖鏈天冬酰胺衍生物，具體可以例舉上述化合物76和77及以下的化合物78。

按照本方式得到的糖鏈天冬酰胺衍生物可以直接用于糖肽的固相合成。由于該糖鏈天冬酰胺衍生物的唾液酸殘基上存在的羧基被苯甲基保護，因此具有下述優(yōu)點，即，與未導(dǎo)入苯甲基的糖鏈天冬酰胺衍生物相比，在糖肽的固相合成中，不會發(fā)生與該羧基有關(guān)的副反應(yīng)，能夠有效得到所需的糖肽。
另外，本發(fā)明還提供能夠大量得到各種分離的糖鏈天冬酰胺的糖鏈天冬酰胺制備方法。該方法在按照上述糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法的糖鏈天冬酰胺衍生物的制備步驟之后，還包括由得到的糖鏈天冬酰胺衍生物除去保護基的步驟。
也就是說，本發(fā)明的糖鏈天冬酰胺的制備方法包括下述步驟(a)在含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入脂溶性的保護基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物，(b)將該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物或該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，將得到的混合物供于色譜法，分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物，以及(c)除去步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物的保護基，得到糖鏈天冬酰胺。
步驟(a)和(b)與上述糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法的場合同樣，使用的含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物以及脂溶性的保護基也與上述同樣。
步驟(c)中由糖鏈天冬酰胺衍生物除去保護基，可以按照公知的方法進行(例如，參照Protecting groups in Organic chemistry，John Wiley & Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)。例如，保護基為Fmoc基的場合，如圖12示意性所示，通過在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，向糖鏈天冬酰胺衍生物中加入嗎啉進行反應(yīng)，可以除去Fmoc基。另外，Boc基可以通過使弱酸反應(yīng)除去。除去保護基后，可以根據(jù)需要，適當(dāng)采用公知的方法，例如通過使用凝膠過濾柱、離子交換柱等的各種色譜法或HPLC進行分離的方法，進行純化，得到糖鏈天冬酰胺。
另外，與上述糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法同樣，作為本發(fā)明糖鏈天冬酰胺的制備方法的優(yōu)選方式，提供一種糖鏈天冬酰胺的制備方法，其中，步驟(a)是使用含有1種或2種以上非還原末端具有唾液酸殘基的糖鏈天冬酰胺的混合物，在該混合物中含有的糖鏈天冬酰胺上導(dǎo)入Fmoc基，并在唾液酸殘基上導(dǎo)入苯甲基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的步驟。在所述方式中，步驟(c)中，除了除去Fmoc基以外，還要除去苯甲基。苯甲基的除去可以按照公知的方法進行(例如，參照Protecting groups in Organic chemistry，John Wiley& Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)。
而且，與上述同樣，從有效得到具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺的觀點來看，優(yōu)選將步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物水解和/或?qū)⒉襟E(c)得到的糖鏈天冬酰胺水解。另外，水解可以與上述同樣進行。從更有效地得到具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺的觀點來看，更優(yōu)選使用糖水解酶進行水解〔步驟(b’)和/或步驟(c’)〕。
通過以上操作，例如可以有效得到具有下述通式的糖鏈天冬酰胺。
(式中，R3和R4是H或下式表示的基團，可以相同也可以不同。
或 其中，R3和R4均為下式所示基團的場合除外。
或 作為所述糖鏈天冬酰胺，具體可以例舉圖3和圖4所示的各種化合物。其中，化合物25～32、34～46、72和73是本發(fā)明首次制備的化合物。本發(fā)明包括該化合物。
而且，本發(fā)明還提供能夠大量得到各種分離的糖鏈的糖鏈制備方法。該方法在按照上述糖鏈天冬酰胺的制備方法的糖鏈天冬酰胺的制備步驟之后，還包括由得到的糖鏈天冬酰胺除去天冬酰胺殘基的步驟。
也就是說，本發(fā)明的糖鏈的制備方法包括下述步驟(a)在含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入脂溶性的保護基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物，(b)將該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物或該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，將得到的混合物供于色譜法，分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物，(c)除去步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物的保護基，得到糖鏈天冬酰胺，以及(d)除去步驟(c)得到的糖鏈天冬酰胺的天冬酰胺殘基，得到糖鏈。
步驟(a)～(c)與上述糖鏈天冬酰胺的制備方法的場合同樣，使用的含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物以及脂溶性的保護基也與上述同樣。
另外，在本發(fā)明的糖鏈的制備方法中，作為其優(yōu)選方式，提供一種糖鏈天冬酰胺的制備方法，其中，步驟(a)是使用含有1種或2種以上非還原末端具有唾液酸殘基的糖鏈天冬酰胺的混合物，在該混合物中含有的糖鏈天冬酰胺上導(dǎo)入Fmoc基，并在唾液酸殘基上導(dǎo)入苯甲基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的步驟。在所述方式中，步驟(c)中，除了除去Fmoc基以外，還要除去苯甲基。苯甲基的除去可以按照上述方法進行。
步驟(d)中由糖鏈天冬酰胺除去天冬酰胺殘基，可以按照公知的方法進行。例如，如圖12示意性所示，通過使糖鏈天冬酰胺與無水肼反應(yīng)后，進行乙?；梢猿ヌ於０窔埢?，得到糖鏈。另外，通過用堿性水溶液將糖鏈天冬酰胺加熱回流后，進行乙?；?，也可以除去天冬酰胺殘基，得到糖鏈。除去天冬酰胺殘基后，可以根據(jù)需要，適當(dāng)采用公知的方法，例如通過使用凝膠過濾柱、離子交換柱等的各種色譜法或HPLC進行分離的方法，進行純化。
而且，與上述同樣，從有效得到具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈的觀點來看，優(yōu)選將步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物水解和/或?qū)⒉襟E(c)得到的糖鏈天冬酰胺水解和/或?qū)⒉襟E(d)得到的糖鏈水解。另外，水解可以與上述同樣進行。從更有效地得到具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈的觀點來看，更優(yōu)選使用糖水解酶進行水解〔步驟(b’)和/或步驟(c’)和/或步驟(d’)〕。
通過以上操作，例如可以有效得到具有下述通式的糖鏈。
(式中，R5和R6是H或下式表示的基團，可以相同也可以不同。
或 其中，R5和R6均為下式所示基團的場合，
或者R5或R6中一方為H，且另一方為下式所示基團的場合除外。
作為所述糖鏈，具體可以例舉圖5和圖6所示的各種化合物。其中，化合物48～55、57～69、74和75是本發(fā)明首次制備的化合物。本發(fā)明包括該化合物。
如上所述，按照本發(fā)明，可以廉價且有效地大量制備具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物、糖鏈天冬酰胺和糖鏈(以下，有時將這3種總稱為糖鏈類)。
所述糖鏈類在醫(yī)藥品開發(fā)等領(lǐng)域非常有用。例如，作為醫(yī)藥品開發(fā)中的應(yīng)用例，可以例舉癌癥疫苗的合成。已知如果細(xì)胞發(fā)生癌變，則會出現(xiàn)體內(nèi)所沒有的糖鏈。另外，還已知如果化學(xué)合成該糖鏈，作為疫苗向個體給藥，則可以抑制癌的增殖。因此，如果按照本發(fā)明能夠制備所需的糖鏈類，則能夠合成對于癌癥的治療有效的疫苗。另外，將化學(xué)反應(yīng)和利用糖轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)等組合，進一步使本發(fā)明得到的糖鏈類結(jié)合新的糖殘基，制備衍生物，能夠合成新型的疫苗。
另外，例如作為糖蛋白的紅細(xì)胞生成素(EPO)由于其紅細(xì)胞增殖能力一直作為貧血的治療藥使用，但是判斷出該EPO如果不與糖鏈結(jié)合，則沒有活性。如上所述，有時蛋白質(zhì)通過結(jié)合糖鏈才能表達(dá)生理活性，因此例如通過不能結(jié)合糖鏈的大腸桿菌表達(dá)體系僅制備大量蛋白質(zhì)，接著導(dǎo)入具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的按照本發(fā)明制備的糖鏈，使之能夠表達(dá)生理活性，或者在任意的蛋白質(zhì)上導(dǎo)入具有各種糖鏈結(jié)構(gòu)的按照本發(fā)明制備的糖鏈，也能夠合成具有新的生理活性的新型糖蛋白。
另外，通過使天然糖蛋白中存在的糖鏈與本發(fā)明制備的糖鏈進行置換，也能夠賦予其新的生理活性。作為使糖蛋白具有的糖鏈與本發(fā)明得到的糖鏈進行置換的技術(shù)，可以例舉P.Seas and C.H.Wong，Science，2001，vol 291，p2344～2350記載的方法。亦即，可以例舉用β-N-乙?；被咸擒彰?Endo-H)處理糖蛋白，成為蛋白質(zhì)表面的天冬酰胺殘基上僅結(jié)合1個N-乙?；咸前窔埢臓顟B(tài)。接著，使用β-N-乙?；被咸擒彰?Endo-M)，使本發(fā)明得到的糖鏈天冬酰胺(例如，圖3和圖4的各種化合物)中的所需糖鏈結(jié)合在上述N-乙?；咸前窔埢系姆椒?。另外，也可以在tRNA上結(jié)合N-乙?；咸前泛螅么竽c桿菌等的表達(dá)體系，合成具有N-乙酰基葡糖胺殘基的糖蛋白后，使用Endo-M導(dǎo)入本發(fā)明得到的糖鏈天冬酰胺中所需的糖鏈。
另外，關(guān)于目前利用糖蛋白作為治療藥時存在的問題，可以例舉給藥后糖蛋白的代謝速度快。這是由于糖蛋白的糖鏈末端存在的唾液酸在生物體內(nèi)被除去后，該糖蛋白立即由肝臟代謝。因此，必需給予某種程度的量的糖蛋白。因而，如果按照本發(fā)明制備糖鏈末端新連接了難以除去的唾液酸的糖鏈，利用Endo-M將該糖鏈導(dǎo)入對象蛋白質(zhì)中，則能夠控制糖蛋白在生物體內(nèi)的代謝速度，也能夠降低給予的糖蛋白的量。
以下，結(jié)合實施例更具體地說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不受這些實施例的限定。各化合物的結(jié)構(gòu)式和序號如圖1～圖6所示。另外，關(guān)于1H-NMR數(shù)據(jù)，實施例1～7是在30℃下以HOD為4.8ppm進行測定得到的值，實施例8～45是在30℃下以作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的丙酮的甲基的信號為2.225ppm，以HOD為4.718ppm進行測定得到的值。另外，對于除去了Fmoc基的化合物，使測定溶劑中共存50mM碳酸氫銨進行測定。
實施例1 化合物24的合成將來源于蛋的粗純化SGP(唾液酸糖肽)2.6g溶解于Tris-鹽酸·氯化鈣緩沖液(TRIZMA BASE 0.05mol/l、氯化鈣0.01mol/l、pH7.5)100ml中。向其中加入疊氮化鈉58mg(772μmol)和肌動蛋白酶-E(科研制藥社制)526mg，37℃下靜置。65小時后，再加入肌動蛋白酶-E 263mg，再在37℃下靜置24小時。將該溶液冷凍干燥后，用凝膠過濾柱色譜法(Sephadex G-25，2.5φ×1m，展開溶劑為水，流速為1.0ml/min)將殘留物精制2次，得到所需的圖3所示化合物24 1.3g(555μmol)。SGP中含有的糖鏈的結(jié)構(gòu)如下所示。
另外，得到的化合物24的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-HMR(D2O、30℃)5.15(1H，s，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，dd，Asn-βCH)，3.00(1H，dd，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.15(18H，s×6，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)實施例2 化合物1、2、6和10的合成將實施例1得到的化合物24(609mg，261μmol)溶解于水20.7ml中，再加入0.1N鹽酸13.8ml。在70℃下將該溶液加熱35分鐘后，迅速用冰冷卻，加入飽和碳酸氫鈉水溶液，達(dá)到pH7。將其冷凍干燥后，用凝膠過濾柱色譜法(Sephadex G-25，2.5φ×1m，展開溶劑為水，流速為1.0ml/min)精制殘留物，得到圖3所示的化合物24、化合物25和29、化合物33的混合物534mg。這4種成分無需一一分離，進入以下步驟。
另外，得到的糖鏈混合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)5.13(s，Man4-H1)，5.12(s，Man4-H1)，5.01(d，GlcNAc1-H1)，4.94(s，Man4’-H1)，4.93(s，Man4’-H1)，4.82(s，Man3-H1)，4.60(d，GlcNAc2-H1)，4.58(d，GlcNAc5，5’-H1)，4.47(dd，Gal6，6’-H1)，4.44(d，Gal6，6’-H1)，4.24(d，Man3-H2)，4.19(d，Man4’-H2)，4.11(d，Man4-H2)，2.97(bdd，Asn-βCH)，2.72(dd，NeuAc7-H3eq，NeuAc7-H3eq)，2.64(bdd，Asn-βCH)，2.15(s×5，-Ac)，1.79(dd，NeuAc7-H3ax，NeuAc7’-H3ax)將得到的糖鏈混合物429mg溶解于丙酮16.3ml和水11.2ml中。向其中加入9-芴基甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯(155.7mg，461.7μmol)和碳酸氫鈉(80.4mg，957μmol)，在室溫下攪拌2小時。將該溶液供于蒸發(fā)器，除去丙酮，用凝膠過濾柱色譜法(SephadexG-25，2.5φ×1m，展開溶劑為水，流速為1.0ml/min)精制殘留的溶液，得到圖1所示化合物1、化合物2和6、化合物10的混合物309mg。使用HPLC(ODS柱，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶甲醇＝65∶35，2.0φ×25cm，流速為3ml/min)精制該混合物，51分鐘后洗脫出化合物1，67分鐘后洗脫出化合物2和6的混合物，93分鐘后洗脫出化合物10。分別收集這些化合物，冷凍干燥后，用凝膠過濾柱色譜法(SephadexG-25，2.5φ×30cm，展開溶劑為水，流速為1.0ml/min)脫鹽，得到目的化合物2和6的混合物150mg。
另外，得到的化合物1的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)7.99(2H，d，F(xiàn)moc)，7.79(2H，d，F(xiàn)moc)，7.55(4H，m，F(xiàn)moc)，5.15(1H，s，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，bdd，Asn-βCH)，3.00(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.15(18H，s×6，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)；HRMS按C103H154N8NaO66[M+Na+]計算2581.8838，測定2581.8821.
另外，得到的化合物2和6的混合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)7.99(d，F(xiàn)moc)，7.79(d，F(xiàn)moc)，7.55(m，F(xiàn)moc)，5.14(s，Man4-H1)，5.12(s，Man4-H)，5.00(d，GlcNAc1-H1)，4.94(s，Man4’-H1)，4.93(s，Man4’-H1)，4.82(s，Man3-H1)，4.60(d，GlcNAc2-H1)，4.58(d，GlcNAc5，5’-H1)，4.46(dd，Gal6，6’-H1)，4.44(d，Gal6，6’-H1)，4.24(d，Man3-H2)，4.19(d，Man4’-H2)，4.11(d，Man4-H2)，2.97(bdd，Asn-βCH)，2.72(dd，NeuAc7-H3eq，NeuAc7-H3eq)，2.64(bdd，Asn-βCH)，2.15(s×5，-Ac)，1.79(dd，NeuAc7-H3ax.NeuAc7’-H3ax)另外，得到的化合物10的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)7.99(2H，d，F(xiàn)moc)，7.79(2H，d，F(xiàn)moc)，7.55(4H，m，F(xiàn)moc)，5.12(1H，s，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.93(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，bdd，Asn-βCH)，3.00(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)；HRMS按C81H120N6NaO50[M+Na+]計算1999.6930.測定1999.6939.
實施例3 化合物3和7的合成將實施例2得到的化合物2和6的混合物(224mg，97μmol)和牛血清白蛋白24mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH6.0)22ml中，再加入來源于肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae)的β-半乳糖苷酶(1.35U)。在37℃下將該溶液靜置15小時后，進行冷凍干燥。用HPLC(ODS柱，2.0φ×25cm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝85∶15，流速為3ml/min)精制殘留物，129分鐘后洗脫出圖2所示的化合物3，134分鐘后洗脫出化合物7。分別收集這些化合物，進行冷凍干燥。接著，使用HPLC(ODS柱，2.0φ×25cm，展開溶劑采取梯度方式，在最初的15分鐘為水，16分鐘后至30分鐘后為水∶乙腈(體積比)＝10∶0至85∶15，31分鐘后至45分鐘后為水∶乙腈＝85∶15至80∶20，流速為3.0ml/min)進行脫鹽處理，得到目的化合物381mg，化合物775mg。
另外，得到的化合物3的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)7.99(2H，d，F(xiàn)moc)，7.79(2H，d，F(xiàn)moc)，7.55(4H，m，F(xiàn)moc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(1H，d，Gal6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7’-H3eq)，2.61(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(15H，s×5，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS按C86H127N7NaO53[M+Na+]計算2128.7356，測定2128.7363.
另外，得到的化合物7的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)7.99(2H，d，F(xiàn)moc)，7.79(2H，d，F(xiàn)moc)，7.55(4H，m，F(xiàn)moc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5.5’-H1)，4.53(1H，d，Gal6-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7-H3eq)，2.60(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(15H，s×5，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7-H3ax)；HRMS按C86H125N7Na3O53[M+Na+]計算2172.6995，測定2172.7084.
實施例4 化合物4和8的合成不對實施例3得到的化合物3和7的混合物(90mg，47.3μmol)一一進行分離，與牛血清白蛋白8mg一起溶解于HEPES緩沖溶液50mM，pH6.0)8.1ml中，再加入來源于牛腎(Bovine kidney)的β-氨基葡糖苷酶(Sigma-Aldrich公司制，來源于牛腎)2.88U。在37℃下將該溶液靜置18小時后，進行冷凍干燥，用HPLC(ODS柱，2.0φ×25cm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶甲醇＝65∶35，流速為3ml/min)精制殘留物，117分鐘后洗脫出圖2所示的化合物4，127分鐘后洗脫出化合物8。分別收集這些化合物，進行冷凍干燥。接著，使用HPLC(ODS柱，2.0φ×25cm，展開溶劑采取梯度方式，在最初的15分鐘為水，16分鐘后至30分鐘后為水∶乙腈＝10∶0至85∶15，31分鐘后至45分鐘后為水∶乙腈＝85∶15至80∶20，流速為3.0ml/min)進行脫鹽處理，得到目的化合物4 40mg，化合物8 37mg。
另外，得到的化合物4的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)8.01(2H，d，F(xiàn)moc)，7.80(2H，d，F(xiàn)moc)，7.56(4H，m，F(xiàn)moc)，5.22(1H，s，Man4-H1)，5.08(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.94(1H，s，Man4’-H1)，4.84(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(1H，d，GlcNAc5-H1)，4.55(1H，d，Gal6-H1)，4.33(1H，dd，Man3-H2)，4.20(1H，dd，Man4-H2)，4.15(1H，dd，Man4’-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.62(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)；HRMS按C78H114N6NaO48[M+Na+]計算1925.6562，測定1925.6539.
另外，得到的化合物8的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)7.99(2H，d，F(xiàn)moc)，7.79(2H，d，F(xiàn)moc)，7.55(4H，m，F(xiàn)moc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH2)，2.76(1H，dd，NeuAc7’-H3eq)，2.61(1H，bdd，Asn-βCH2)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS按C78H114N6NaO48[M+Na+]計算1925.6562，測定1925.6533.
實施例5 化合物5的合成將實施例4得到的化合物4(30mg，473μmol)和牛血清白蛋白3mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH6.0)6ml中，再加入來源于刀豆(JackBeans)的α-甘露糖苷酶10U。在37℃下將該溶液靜置21小時后，進行冷凍干燥，接著用HPLC(ODS柱，2.0φ×25cm，展開溶劑采取梯度方式，在最初的15分鐘為水，16分鐘后至30分鐘后為水∶乙腈＝10∶0至85∶15，31分鐘后至45分鐘后為水∶乙腈＝85∶15至80∶20，流速為3.0ml/min)進行精制，得到所需的圖1所示化合物5 20mg。
另外，得到的化合物5的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)8.01(2H，d，F(xiàn)moc)，7.80(2H，d，F(xiàn)moc)，7.56(4H，m，F(xiàn)moc)，5.00(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.84(1H，s，Man3-H1)，4.67(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.56(1H，d，GlcNAc5-H1)，4.44(1H，d，Gal6-H1)，4.11(1H，dd，Man4’-H2)，4.07(1H，dd，Man3-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7’-H3eq)，2.62(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS按C72H104N6NaO43[M+Na+]計算1763.6034，測定1763.6074.
實施例6 化合物9的合成將實施例4得到的化合物8(40mg，630μmol)和牛血清白蛋白5mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH6.0)7.8ml中，加入來源于刀豆(JackBeans)的α-甘露糖苷酶38U。在37℃下將該溶液靜置63小時后，進行冷凍干燥，接著用HPLC(ODS柱，2.0φ×25cm，展開溶劑采取梯度方式，在最初的15分鐘為水，16分鐘后至30分鐘后為水∶乙腈＝10∶0至85∶15，31分鐘后至45分鐘后為85∶15至80∶20，流速為3.0ml/min)進行精制，得到目的化合物9 30mg。
另外，得到的化合物9的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)8.01(2H，d，F(xiàn)moc)，7.80(2H，d，F(xiàn)moc)，7.56(4H，m，F(xiàn)moc)，5.23(1H，s，Man4-H1)，5.08(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.53(1H，d，Gal6-H1)，4.32(1H，dd，Man3-H2)，4.28(1H，dd，Man4-H2)，2.81(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7-H3eq)，2.59(1H，bdd，Asn-βCH)，2.13(12H，s×4，-Ac)，1.80(1H，dd，NeuAc7H3ax)；HRMS按C72H104N6NaO43[M+Na+]計算1763.6034，測定1763.6041.
實施例7 Fmoc基的脫保護(化合物33的合成)將實施例2得到的化合物10(10.5mg，5.27μmol)溶解于50％嗎啉/N，N-二甲基甲酰胺溶液1.4ml中，在室溫、氬氣環(huán)境下，使之反應(yīng)2小時。向該溶液中加入甲苯3ml，在35℃下供于蒸發(fā)器。重復(fù)該操作3次，除去反應(yīng)溶劑。用凝膠過濾柱色譜法(Sephadex G-25，2.5φ×30cm，展開溶劑為水，流速為1.0ml/min)精制殘留物，得到所需的圖3所示化合物33 7mg(收率為76％)。另外，由于1H-NMR波譜與由實施例2得到的化合物33一致，從而確認(rèn)了所得化合物的結(jié)構(gòu)。
化合物33的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.12(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.62(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.58(d，2H，J＝7.8Hz，GlcNAc5，5’-H-1)，4.47(d，2H，J＝7.9Hz，Gal6，6’-H-1)，4.24(bd，1H，Man3-H-2)，4.19(bdd，1H，J＝3.2Hz，1.4Hz，Man4’-H-2)，4.12(bdd，1H，J＝3.2Hz，1.4Hz，Man4-H-2)，2.93(dd，1H，J＝4.5Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.93(dd，1H，J＝6.8Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.08(s，3H，Ac)，2.05(s，6H，Ac×2)，2.01(s，3H，Ac)
實施例8 化合物14的合成將化合物3(28mg，21.3μmol)和牛血清白蛋白1.0mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，454μl)中，加入神經(jīng)氨酸苷酶(Sigma-Aldrich公司制，來源于霍亂弧菌(Viblio Cholerae)，198mU)。在37℃下將該溶液靜置20小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)精制反應(yīng)溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物14(17mg，收率為70％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.4Hz，GlcNAc5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，1H，F(xiàn)moc)，4.24(bd，1H，J＝1.9Hz Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，4.11(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.5Hz，Man4’-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝3.0Hz，15.7Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.7Hz，15.7Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，2.04，1.89(each s，each 3H，Ac)；HRMS按C75H110N6NaO45[M+Na+]計算1837.6402，測定1837.6471實施例9 化合物19的合成將化合物7(20mg，9.4μmol)和牛血清白蛋白1.6mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，323μl)中，加入神經(jīng)氨酸苷酶(Sigma-Aldrich公司制，來源于霍亂弧菌(Viblio Cholerae)，141mU)。在37℃下將該溶液靜置18小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。接著，用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)精制。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物19(13mg，收率為76％)。由于1H-NMR與標(biāo)準(zhǔn)品一致，從而確認(rèn)了所得化合物的結(jié)構(gòu)。
實施例10 化合物15的合成將化合物4(45mg，24μmol)和牛血清白蛋白1.7mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，820μL)中，加入神經(jīng)氨酸苷酶(Sigma-Aldrich公司制，來源于霍亂弧菌(Viblio Cholerae，134mU)。在37℃下將該溶液靜置14小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。接著，用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)精制反應(yīng)溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物15(28mg，收率為74％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.44(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.10(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)4.58(d，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6’-H-1)，4.35(t，1H，F(xiàn)moc)，4.24(bd，1H，J＝1.9Hz，Man3-H-2)，4.11(bs，1H，Man4’-H-2)，4.07(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.7Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06，2.04，1.89(each s，each 3H，Ac)；HRMS按C67H97N5NaO40[M+Na+]計算1634.5608，測定1634.5564實施例11 化合物70的合成將化合物15(11mg，6.8μmol)和牛血清白蛋白1.5mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，269μL)中，加入β-半乳糖苷酶(生化學(xué)工業(yè)社制，來源于刀豆(Jack Beans)，11μL，275mU)。在37℃下將該溶液靜置14小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。用HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)精制反應(yīng)溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物70(6.3mg，收率為64％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.10(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.32(t，1H，F(xiàn)moc)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.10(bs，1H，Man4-H-2)，4.06(bs，1H，J＝1.3Hz，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝14.0Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.5Hz，14.8Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C61H88N5O35[M+H+]計算1450.5，測定1450.4實施例12 化合物20的合成將化合物8(47mg，25μmol)和牛血清白蛋白1.9mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，840μl)中，加入神經(jīng)氨酸苷酶(Sigma-Aldrich公司制，來源于霍亂弧菌(Viblio Cholerae，369mU)。在37℃下將該溶液靜置37小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。將反應(yīng)溶液冷凍干燥，接著用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120AODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)精制。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物20(26mg，收率為65％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.57(bd，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.5Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，3H，F(xiàn)moc)，4.24(bs，1H，Man4’-H-2)，4.19(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.2Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；HRMS按C67H97N5NaO40[M+Na+]計算1634.5608，測定1634.5644實施例13 化合物71的合成將化合物20(12mg，7.4μmol)和牛血清白蛋白1.0mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，330μL)中，加入β-半乳糖苷酶(生化學(xué)工業(yè)社制，來源于刀豆(Jack Beans)，12μL，297mU)。在37℃下將該溶液靜置46小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。用HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)精制反應(yīng)溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物71(6.6mg，收率為61％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.90(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.49(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.42(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.11(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，GlcNAc2，5-H-1)，4.31(b，1H，F(xiàn)moc)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4-H-2)，3.97(dd，1H，J＝1.8Hz，3.3Hz，Man4’-H-2)，2.72(bd.1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.0Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，1.88(each s，each3H，Ac)；MS(Fab)按C61H88N5O35[M+H+]計算1450.5，測定1450.3實施例14 化合物16的合成將化合物5(32mg，18.4μmol)和牛血清白蛋白2.5mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，713μL)中，加入神經(jīng)氨酸苷酶(Sigma-Aldrich公司制，來源于霍亂弧菌(Viblio Cholerae，134mU)。在37℃下將該溶液靜置17小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。接著，用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)精制反應(yīng)溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物16(13mg，收率為52％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.44(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.00(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.75(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，2H，J＝7.5Hz，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，1H，F(xiàn)moc)，4.10(bd，1H，Man3-H-2)，4.07(bs，1H，Man4’-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.2Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.07，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C61H88N5O35[M+H+]計算1450.5，測定1450.3.
實施例15 化合物17的合成將化合物16(9mg，6.2μmol)和牛血清白蛋白1.6mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，613μL)中，加入β-半乳糖苷酶(生化學(xué)工業(yè)社制，來源于刀豆(Jack Beans)，186mU)。在37℃下將該溶液靜置32小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。用HPLC(YMC PackedColumn D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)精制反應(yīng)溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物17(5.4mg，收率為68％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.89(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.68(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.49(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.42(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.1Hz，GlcNAc2，5’-H-1)，4.09，4.07(s，1H，Man4’-H-2，Man3-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz Asn-βCH)，2.56(bdd，1H，J＝8.1Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.07，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C55H77N5NaO30[M+Na+]計算1310.5，測定1310.2實施例16 化合物18的合成將化合物17(3.4mg，2.6μmol)和牛血清白蛋白1.1mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，257μL)中，加入N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷酶(Sigma-Aldrich，來源于刀豆(Jack Beans)，144mU)。在37℃下將該溶液靜置24小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)精制反應(yīng)溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物18(2.1mg，收率為75％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.00(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(d，1H，J＝1.6Hz，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，1H，J＝7.8Hz，GlcNAc2-H-1)，4.34(t，1H，F(xiàn)moc)，4.07(d，1H，J＝2.7Hz，Man4’-H-2)，3.97(dd，1H.J＝1.6Hz，3.7Hz，Man3-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝3.2Hz，15.1Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.9Hz，15.1Hz，Asn-βCH)，2.07，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C47H65N4O25[M+Na+]計算1085.4，測定1085.3實施例17 化合物21的合成將化合物9(28mg，16μmol)和牛血清白蛋白1.7mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，624μL)中，加入神經(jīng)氨酸苷酶(Sigma-Aldrich公司制，來源于霍亂弧菌(Viblio Cholerae，117mU)。在37℃下將該溶液靜置17小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。接著，用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)精制反應(yīng)溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物21(14.6mg，收率為68％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.57(d，2H，J＝7.2Hz，GlcNAc2-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6-H-1)，4.34(t，1H Fmoc)，4.22(bd，1H，J＝2.7Hz，Man3-H-2)，4.19(b，1H，Man4-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.8Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05(s，6H，Ac×2)，1.89(s，3H，Ac)；MS(Fab)按C61H88N5O35[M+H+]計算1450.5，測定1450.3實施例18 化合物22的合成將化合物21(10mg，6.9μmol)和牛血清白蛋白1.6mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，672μL)中，加入β-半乳糖苷酶(生化學(xué)工業(yè)社制，來源于刀豆(Jack Beans)，205mU)。在37℃下將該溶液靜置20小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。用HPLC(YMC PackedColumn D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)精制反應(yīng)溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物22(5.6mg，收率為64％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.87(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.67(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.48(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.41(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，J＝8.6Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.26(t，1H，F(xiàn)moc)，4.22(d，1H，J＝2.2Hz，Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，J＝1.3Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.54(bdd，1H，J＝9.5Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05(s，6H，Ac×2)，1.88(s，3H，Ac)；MS(Fab)按C55H78N5O30[M+H+]計算1288.5，測定1288.3實施例19 化合物23的合成將化合物22(3.6mg，2.8μmol)和牛血清白蛋白1.2mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，227μL)中，加入N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷酶(Sigma-Aldrich，來源于刀豆(Jack Beans)，195mU)。在37℃下將該溶液靜置24小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)精制反應(yīng)溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物23(2.3mg，收率為77％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.11(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.57(d，1H，J＝6.5Hz，GlcNAc-H-1)，4.33(t，1H，F(xiàn)moc)，4.22(d，1H，J＝3.0Hz，Man3-H-2)，4.07(bdd，1H，J＝2.1Hz，Man4-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.9Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C47H65N4O25[M+H+]計算1085.4.測定1085.3
實施例20 化合物11的合成將化合物10(123mg，62μmol)和牛血清白蛋白(1.1mg)溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，2.5mL)中，加入β-半乳糖苷酶(生化學(xué)工業(yè)社制，來源于刀豆(Jack Beans)，24μL，612mU)。在37℃下將該溶液靜置61小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。冷凍干燥反應(yīng)溶液，接著，用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120AODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為3.5mL/min)精制。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物11(71mg，收率為70％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.11(s，1H，Man4-H-1)，4.99(1H，d，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，J＝8.6Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.34(t，1H，F(xiàn)moc)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.18(s，1H，Man4-H-2)，4.10(s，1H，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.51(bdd，1H，J＝9.0Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06(s，3H，Ac)，2.05(s，6H，Ac×2)，1.88(s，3H，Ac)；HRMS按C69H100N6NaO40[M+Na+]計算1675.5873，測定1675.5841實施例21 化合物12的合成將化合物11(50mg，30μmol)和牛血清白蛋白2.0mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，920μL)中，加入N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷酶(Sigma-Aldrich公司制，來源于刀豆(Jack Beans)，2.1U)。在37℃下將該溶液靜置48小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)精制反應(yīng)溶液，冷凍干燥。用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)對該殘留物進行脫鹽，得到目的化合物12(25mg，收率為66％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.10(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(bd，1H，J＝1.6Hz，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.58～4.52(b，1H，GlcNAc2-H-1)，4.33(t，1H，F(xiàn)moc)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.06(dd，1H，J＝1.6Hz，3.2Hz，Man4-H-2)，3.97(dd，1H，J＝1.6Hz，3.5Hz，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.53(bdd，1H，J＝9.0Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05，1.88(each s，each 3H，Ac)實施例22 化合物13的合成將化合物12(10mg，11μmol)和牛血清白蛋白0.9mg溶解于HEPES緩沖溶液(50mM，pH5.0，440μL)中，加入α-甘露糖苷酶(Sigma-Aldrich公司制，來源于刀豆(Jack Beans)，30μL，3.2U)。在37℃下將該溶液靜置21小時后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。接著，用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為4mL/min)進行精制。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物13(3mg，收率為43％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.57(1H，GlcNAc2-H-1)，4.06(d，1H，J＝3.2Hz，Man3-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.3Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05，1.89(each s，each3H，Ac)(糖鏈天冬酰胺衍生物的Fmoc基的脫保護)
以下，對所有糖鏈天冬酰胺衍生物，按照下述順序進行Fmoc基的脫保護。首先，向每1μmol糖鏈天冬酰胺Fmoc體中加入240μL的N，N-二甲基甲酰胺、160μL的嗎啉，在室溫、氬氣環(huán)境下使之反應(yīng)。通過TLC(使用1M醋酸銨∶異丙醇＝8∶5作為展開溶劑)確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，用冰水冷卻。向其中加入反應(yīng)溶液的10倍量的乙醚，攪拌15分鐘后，過濾析出的沉淀物。將得到的殘渣溶解于水中，在35℃下進行蒸發(fā)。再加入甲苯3mL，進行蒸發(fā)，這種操作重復(fù)3次。用反相柱色譜法(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，展開溶劑為水)對殘留物進行精制。
實施例23 化合物33的合成按照上述操作使化合物10(10.5mg，5.3μmol)反應(yīng)7小時后，得到目的化合物33(7mg，收率76％)。由于1H-NMR與標(biāo)準(zhǔn)品一致，從而確認(rèn)了得到的化合物。
實施例24 化合物26的合成按照上述操作使化合物3(8.0mg，3.8μmol)反應(yīng)21小時后，得到目的化合物26(6.3mg，收率88％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.13(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.95(s，1H，Man4’-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.62(2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.56(d，1H，J＝8.1Hz，GlcNAc5-H-1)，4.52(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.25(bs，1H，Man3-H-2)，4.19(bs，1H，Man4’-H-2)，4.12(bs，1H，Man4-H-2)，2.94(dd，1H，J＝4.5Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝6.8Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.68(dd，1H，J＝4.6Hz，12.4Hz，NeuAc7’-H-3eq)，2.08，2.07，2.06，2.04，2.02(each s，each 3H，Ac)，1.72(dd，1H，J＝12.1Hz，12.1Hz，NeuAc7’-H-3ax)；MS(Fab)按C71H118N7O51[M+H+]計算1884.7，測定1884.5實施例25 化合物27的合成按照上述操作使化合物4(11.0mg，5.8μmol)反應(yīng)23小時后，得到目的化合物27(8.5mg，收率88％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.08(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.95(s，1H，Man4’-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.62(d，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.45(d，1H，J＝7.6Hz，Gal6’-H-1)，4.26(bd，1H，Man3-H-2)，4.12(bd，1H，Man4’-H-2)，4.08(bdd，1H，J＝1.6Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，2.94(dd，1H，J＝4.0Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝7.2Hz，17.2Hz，Asn-CH)，2.68(dd，1H，J＝4.1Hz，12.1Hz，NeuAc7’-H-3eq)，2.09，2.07，2.04，2.02(each s，each 3H，Ac)，1.72(dd，1H，J＝12.1Hz，12.1Hz，NeuAc7’-H-3ax)；MS(Fab)按C63H104N6NaO46[M+Na+]計算1703.6，測定1703.1實施例26 化合物28的合成按照上述操作使化合物5(7.0mg，4.0μmol)反應(yīng)21小時后，得到目的化合物28(5.3mg，收率87％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.07(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.94(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.59(each d，each 1H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.44(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.10，4.07(each 1H，Man4’，3-H-2)，2.93(dd，1H，J＝4.6Hz，17.5Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝7.0Hz，17.5Hz，Asn-βCH)，2.67(dd，1H，J＝4.6Hz，12.2Hz，NeuAc7’-H-3eq)，2.08，2.06，2.02，2.01(each s，each 3H，Ac)，1.71(2H，dd，J＝12.2Hz，12.2Hz，NeuAc7’-H-3ax)；MS(Fab)按C57H94N6NaO41[M+Na+]計算1541.5，測定1541.3實施例27 化合物30的合成按照上述操作使化合物7(13.9mg，6.6μmol)反應(yīng)7小時后，得到目的化合物30(8.0mg，收率64％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.13(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.60(each d，each 1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.4Hz，GlcNAc5’-H-1)，4.44(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6-H-1)，4.24(bd，1H，Man3-H-2)，4.19(bdd，1H，J＝1.3Hz，3.2Hz，Man4’-H-2)，4.10(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.2Hz，Man4-H-2)，2.90(dd，1H，J＝4.5Hz，16.7Hz，Asn-βCH)，2.80(dd，1H，J＝7.5Hz，16.7Hz，Asn-βCH)，2.66(dd，1H，J＝4.6Hz，12.4Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.07，2.06，2.05，2.02，2.01(each s，each 3H，Ac)，1.71(dd， 1H，J＝12.4Hz，12.4Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)按C71H117N7NaO51[M+Na+]計算1906.7，測定1906.1實施例28 化合物31的合成按照上述操作使化合物8(8.0mg，4.2μmol)反應(yīng)12小時后，得到目的化合物31(6.0mg，收率86％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.12(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.59(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.43(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6-H-1)，4.24(bd，1H，Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，Man4’-H-2)，2.91(bd，1H，J＝17.0Hz，Asn-βCH)，2.81(dd，1H，J＝6.5Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.66(dd，1H，J＝4.6Hz，12.6Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.06，2.06，2.02，2.00(each s，each 3H，Ac)，1.70(dd，1H，J＝12.6Hz，12.6Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)按C63H104N6NaO46[M+Na+]計算1703.6，測定1703.0實施例29 化合物32的合成按照上述操作使化合物9(7.7mg，4.4μmol)反應(yīng)23小時后，得到目的化合物32(5.2mg，收率78％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.14(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4,60(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.44(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6-H-1)，4.23(d，1H，J＝3.0Hz，Man3-H-2)，4.19(bdd，1H，J＝1.3Hz，2.9Hz，Man4-H-2)，2.92(dd，1H，J＝4.1Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.83(dd，1H，J＝7.5Hz，12.7Hz，Asn-βCH)，2.67(dd，1H，J＝4.6Hz，12.7Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.06(s，6H，Ac×2)，2.03，2.01(each s，each3H，Ac)1.71(dd，1H，J＝12.7Hz，12.7Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)按C57H94N6NaO41[M+Na+]計算1541.5，測定1541.2實施例30 化合物37的合成按照上述操作使化合物14(9.1mg，5.0μmol)反應(yīng)13小時后，得到目的化合物37(6.5mg，收率77％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.75(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57，4.55(each d，each1H，J＝7.5Hz，GlcNAc2，5，5’-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.3Hz，Gal6’-H-1)，4.23(bs，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4’-H-2)，4.10(bs，1H，Man4-H-2)，2.87(dd，1H，J＝4.8Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.76(dd，1H，J＝7.2Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07(s，3H，Ac)，2.04(s，6H，Ac×2)，2.00(s，3H，Ac)；MS(Fab)按C60H100N6NaO43[M+Na+]計算1615.6，測定1615.0實施例31 化合物42的合成按照上述操作使化合物19(9.8mg，5.4μmol)反應(yīng)13小時后，得到目的化合物42(8.0mg，收率88％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.60，4.57，4.55(each d，each 1H，GlcNAc2，5，5’-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.8 z，Gal6-H-1)，4.28(s，1H，Man3-H-2)，4.18(s，1H，Man4’-H-2)，4.10(s，1H，Man4-H-2)，2.88(dd，1H，J＝4.0Hz，16.6Hz，Asn-βCH)，2.77(dd，1H，J＝7.5Hz，16.6Hz，Asn-βCH)，2.07(s，3H，Ac)，2.04(s，6H，Ac×2)，2.00(s，3H，Ac)；MS(Fab)按C60H101N6O43[M+H+]計算1593.6，測定1593.8實施例32 化合物38的合成按照上述操作使化合物15(5.1mg，3.2μmol)反應(yīng)11小時后，得到目的化合物38(4.0mg，收率91％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.10(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57(each d，each 1H，J＝7.8Hz，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’·H-1)，4.24(d，1H，J＝2.3Hz，Man3-H-2)；4.10，4.06(each bd，each 1H，Man4’，4-H-2)，2.90(dd，1H，J＝4.2Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.81(dd，1H，J＝7.3Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C52H88N5O38[M+H+]計算1390.5，測定1390.1實施例33 化合物72的合成按照上述操作使化合物70(4.0mg，2.8μmol)反應(yīng)13小時后，得到目的化合物72(2.9mg，收率85％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.09(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.8Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.54(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.10，4.06(each bs，each 1H，Man4，4’-H-2)，2.87(dd，1H，J＝17.2Hz，Asn-βCH)，2.76(dd，1H，J＝6.5Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.00(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C46H78N5O33[M+H+]計算1228.5，測定1228.3實施例34 化合物43的合成按照上述操作使化合物20(5.4mg，3.3μmol)反應(yīng)11小時后，得到目的化合物43(4.1mg，收率87％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.46(d，1H，Gal6-H-1)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4-H-2)2.90(dd，1H，J＝4.0Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.80(dd，1H，J＝7.3Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C52H88N5O38[M+H+]計算1390.5，測定1390.2實施例35 化合物73的合成按照上述操作使化合物71(4.0mg，2.8μmol)反應(yīng)13小時后，得到目的化合物73(2.9mg，收率85％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.60，4.54(each d，each 1H，J＝7.9Hz，GlcNAc2.5-H-1)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.18(dd，1H，J＝1.6Hz，1.6Hz，Man4-H-2)，3.96(1H，dd，J＝1.6Hz，1.6Hz，Man4-H-2)，2.88(dd，1H，J＝4.3Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.77(dd，1H，J＝7.2Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.06，2.04，2.00(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C46H78N5O33[M+H+]計算1228.5，測定1228.3實施例36 化合物39的合成按照上述操作使化合物16(2.2mg，1.5μmol)反應(yīng)7小時后，得到目的化合物39(1.6mg，收率84％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.75(s，1H，Man3-H-1)，4.62，4.58(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.09，4.08(each s，each 1H，Man3，4’-H-2)，2.91(dd，1H，J＝4.1Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.81(dd，1H，J＝6.8Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.08，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C46H77N5NaO33[M+Na+]計算1250.4，測定1250.3實施例37 化合物40的合成按照上述操作使化合物17(1.5mg，1.2μmol)反應(yīng)14小時后，得到目的化合物40(1.1mg，收率89％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.07(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.62，4.55(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.10，4.07(each s，each 1H，Man4’，3-H-2)，2.89(dd，1H，J＝3.7Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.79(dd，1H，J＝7.0Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.05，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C40H67N5NaO28[M+Na+]計算1088.4，測定1088.2
實施例38 化合物41的合成按照上述操作使化合物18(1.3mg，1.2μmol)反應(yīng)14小時后，得到目的化合物41(0.8mg，收率80％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.07(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.62(d，1H，J＝7.8Hz，GlcNAc2-H-1)，4.08(d，1H，J＝2.9Hz，Man3-H-2)，2.92(dd，1H，J＝3.9Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.83(dd，1H，J＝7.0Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.07，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C32H55N4O27[M+H+]計算863.3，測定863.2實施例39 化合物44的合成按照上述操作使化合物21(2.3mg，1.6μmol)反應(yīng)7小時后，得到目的化合物44(1.6mg，收率84％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.8Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.8Hz，Gal-H-1)，4.22，4.18(each bs，each 1H，Man3，4-H-2)，2.91(dd，1H，J＝4.1Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.82(dd，1H，J＝7.0Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.05，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C46H78N5O33[M+H+]計算1228.5，測定1228.3實施例40 化合物45的合成按照上述操作使化合物22(1.6mg，1.3μmol)反應(yīng)14小時后，得到目的化合物45(1.1mg，收率85％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.12(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.54(each d，each 1H， GlcNAc2，5-H-1)，4.22(d，1H，J＝2.5Hz，Man3-H-2)，4.18(dd，1H，J＝1.4Hz，3.0Hz，Man4’-H-2)，2.89(dd，1H，J＝4.3Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.78(dd，1H，J＝7.5Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C40H67N5NaO28[M+Na+]計算1088.4，測定1088.3.
實施例41 化合物46的合成按照上述操作使化合物23(1.6mg，1.5μmol)反應(yīng)14小時后，得到目的化合物46(1.1mg，6.4μmol，收率85％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.10(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61(d，1H，J＝7.3Hz，GlcNAc2-H-1)，4.22(d，1H，J＝2.4Hz，Man3-H-2)，4.07(dd，1H，J＝1.6Hz，3.0Hz，Man4’-H-2)2.90(dd，1H，J＝4.3Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.80(dd，1H，J＝7.0Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.05，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C32H55N4O23[M+H+]計算863.3，測定863.3實施例42 化合物34的合成按照上述操作使化合物11(12.4mg，7.5μmol)反應(yīng)11小時后，得到目的化合物34(9.2mg，收率86％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝10.0Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61(d，1H，J＝6.8Hz，GlcNAc2-H-1)，4.55(d，2H，GlcNAc5，5’-H-1)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4’-H-2)，4.10(bs，1H，Man4-H-2)，2.80(dd，1H，J＝3.8Hz，15.6Hz，Asn-βCH)，2.63(dd，1H，J＝8.2Hz，15.6Hz，Asn-βCH)，2.07(s，3H，Ac)，2.05(s，6H，Ac×2)，2.01(s，3H，Ac)；MS(Fab)按C54H90N6NaO38[M+Na+]計算1453.5，測定1453.2實施例43 化合物35的合成按照上述操作使化合物12(12.0mg，8.4μmol)反應(yīng)11小時后，得到目的化合物35(7.0mg，收率81％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)δ5.10(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.61(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.25(bs，1H，Man3-H-2)，4.06(bs，1H，Man4’-H-2)，3.97(bs，1H，Man4-H-2)，2.79(dd，1H，J＝5.0Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.61(dd，1H，J＝7.3Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C38H65N4O28[M+H+]計算1025.4，測定1025.2實施例44 化合物76、77的合成與分離將化合物2、6(5.0mg，2.2μmol)溶解于220μL的水中，加入22mM的碳酸銫水溶液100μL，達(dá)到pH7.0。將該溶液冷凍干燥。向干燥后的固體物質(zhì)中加入N，N-二甲基甲酰胺430μL，再加入6.6μmol的苯甲基溴/N，N-二甲基甲酰胺溶液20μL。在氬氣環(huán)境下攪拌該溶液。48小時后，通過TLC(展開溶劑使用1M NH4OAc∶異丙醇＝2∶1)確認(rèn)原料消失后，加入4.4mL的乙醚，使化合物沉淀。過濾沉淀的糖鏈，使殘留的糖鏈溶解于水，冷凍干燥。用分離HPLC(YMC PackedColumn D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展開溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝78∶22，流速為4.0mL/min)精制冷凍干燥后的殘留物，88分鐘后洗脫出化合物77，91分鐘后洗脫出化合物76。分別收集這些化合物，再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流過H2O 50mL，接著流過25％乙腈進行洗脫)脫鹽，得到目的化合物76 1.6mg，化合物77 1.8mg。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下所述。
化合物76的數(shù)據(jù)1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.53-7.40(m，9H，F(xiàn)moc，-CH2-Ph)，5.38(d，1H，J＝12.1Hz，-CH2-Ph)，5.31(d，1H，J＝12.1Hz，-CH2-Ph)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(m，3H，GlcNAc2，5，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.9Hz，Gal6’-H-1)，4.33(d，1H，J＝7.9Hz，Gal6-H-1)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.19(bs，1H，Man4’-H-2)，4.11(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，Asn-βCH)，2.68(dd，1H，J＝4.6Hz，12.7Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.52(dd，1H，J＝8.7Hz，15.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.03，2.02，1.89(each s，each 3H，Ac)1.84(dd，1H，J＝12.7Hz，12.7Hz，NeuAc7-H3ax)；MS(Fab)按C99H143N17NaO58[M+H+]計算2380.8，測定2380.0.
化合物77的數(shù)據(jù)
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.53-7.41(m，9H，F(xiàn)moc，-CH2-Ph)，5.37(d，1H，J＝12.1Hz，-CH2-Ph)，5.31(d，1H，J＝12.1Hz，-CH2-Ph)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.8Hz，GlcNAc1-H-1)，4.93(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(m，3H，GlcNAc2，5，5’-H-1)，4.46(1H，d，J＝7.8Hz，Gal6-H-1)，4.33(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.19(bs，1H，Man4’-H-2)，4.11(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，Asn-βCH)，2.68(dd，1H，J＝4.8Hz，13.0Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.52(bdd，1H，J＝9.7Hz，14.1Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，2.04，2.02，1.89(each s，each 3H，Ac)，1.84(dd，1H，J＝13.0Hz，13.0Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)按C99H143N7NaO58[M+H+]計算2380.8，測定2380.5實施例45 化合物78的合成使化合物1(20mg)的冷水溶液流入冷卻至4℃的Dowex-50W×8(H+)的柱(φ0.5cm×5cm)，將洗脫出的水溶液冷凍干燥。將得到的冷凍干燥物溶解于4℃的冷水中，向其中加入Cs2CO3水溶液(2.5mg/1ml)，調(diào)節(jié)水溶液的pH為5～6，然后將該水溶液冷凍干燥。將冷凍干燥后的Fmoc-二唾液酸糖鏈樣品溶解于DryDMF(1.3ml)中，加入苯甲基溴(5.1μL)，在氬氣流下，室溫下攪拌45小時。通過TLC確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溶液冷卻至0℃，加入乙醚10ml，使目的物析出。用濾紙將其過濾。在殘留的目的物中加入蒸餾水，作為濾液進行洗脫，接著將其減壓濃縮。用ODS柱(φ1.6cm×14cm，洗脫液水溶液)精制得到的殘渣，得到化合物78(18.2mg，收率85％)。得到的化合物78的物理數(shù)據(jù)如下所述。
1H-NMR(30℃)7.90(d，2H，F(xiàn)moc)，7.70(d，2H，F(xiàn)moc)，7.53-7.40(m，9H，Bn，F(xiàn)moc)，5.36(d，2H，J＝11.6Hz，CH2)，5.30(d，2H，J＝11.6Hz，CH2)，5.12(s，1H，Man4-H1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H1)，4.93(s，1H，Man4’-H1)，4.75(s，1H，Man3-H1)，4.57(m，3H，GlcNAc2-H1，GlcNAc5，5’-H1)，4.32(d，2H，Gal6，6’-H1)，4.24(d，1H，Man3-H2)，4.18(d，1H，Man4’-H2)4.10(1H，d，Man4-H2)，2.72(bd，1H，Asn-βCH)，2.67(dd，2H，NeuAc7，7’-H3eq)，2.51(bdd，1H，Asn-βCH)，2.06(s，3H，Ac)，2.03，2.01(each s，each 6H，Ac×2)，1.89(s，3H，Ac)，1.83(2H，dd，J＝12.2，12.2Hz，NeuAc7，7’-H3ax)；HRMS按C117H165N8Na2O66[M+Na+]計算2783.9597，測定2783.9501工業(yè)實用性按照本發(fā)明，可以非常容易且大量地得到具有所需糖鏈結(jié)構(gòu)的各種糖鏈類。因此，期待用于癌、炎癥、流感等的治療藥。特別是按照本發(fā)明可以得到的糖鏈天冬酰胺衍生物、糖鏈天冬酰胺，在制備過程中不存在混入毒性成分等的危險性，安全性優(yōu)良。
權(quán)利要求
1.一種來源于糖鏈天冬酰胺的糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法，其中，包括下述步驟(a)在含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入脂溶性的保護基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物，以及(b)將該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物或該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，將得到的混合物供于色譜法，分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法，進一步包括步驟(b’)，即，使用糖水解酶將步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物水解。
3.如權(quán)利要求1或2所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法，含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有下述化合物和/或該化合物中缺失1個以上糖殘基得到的化合物。
4.如權(quán)利要求1～3中任意一項所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法，脂溶性的保護基是芴基甲氧基羰基(Fmoc)。
5.如權(quán)利要求1～3中任意一項所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法，步驟(a)是在含有1種或2種以上在非還原末端具有唾液酸殘基的糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入Fmoc基，并在唾液酸殘基上導(dǎo)入苯甲基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的步驟。
6.一種糖鏈天冬酰胺的制備方法，其中，包括下述步驟(a)在含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入脂溶性的保護基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物，(b)將該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物或該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，將得到的混合物供于色譜法，分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物，以及(c)除去步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物的保護基，得到糖鏈天冬酰胺。
7.如權(quán)利要求6所述的糖鏈天冬酰胺的制備方法，進一步包括下述步驟(b’)使用糖水解酶將步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物水解的步驟，和/或(c’)使用糖水解酶將步驟(c)得到的糖鏈天冬酰胺水解的步驟。
8.如權(quán)利要求6或7所述的糖鏈天冬酰胺的制備方法，含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有下述化合物和/或該化合物中缺失1個以上糖殘基得到的化合物。
9.如權(quán)利要求6～8中任意一項所述的糖鏈天冬酰胺的制備方法，脂溶性的保護基是Fmoc基。
10.如權(quán)利要求6～8中任意一項所述的糖鏈天冬酰胺的制備方法，步驟(a)是在含有1種或2種以上在非還原末端具有唾液酸殘基的糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入Fmoc基，并在唾液酸殘基上導(dǎo)入苯甲基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的步驟。
11.一種糖鏈的制備方法，其中，包括下述步驟(a)在含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入脂溶性的保護基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物，(b)將該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物或該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，將得到的混合物供于色譜法，分離各種糖鏈天冬酰胺衍生物，(c)除去步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物的保護基，得到糖鏈天冬酰胺，以及(d)除去步驟(c)得到的糖鏈天冬酰胺的天冬酰胺殘基，得到糖鏈。
12.如權(quán)利要求11所述的糖鏈的制備方法，進一步包括下述步驟(b’)使用糖水解酶將步驟(b)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物水解的步驟，和/或(c’)使用糖水解酶將步驟(c)得到的糖鏈天冬酰胺水解的步驟，和7或(d’)使用糖水解酶將步驟(d)得到的糖鏈水解的步驟。
13.如權(quán)利要求11或12所述的糖鏈的制備方法，含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中含有下述化合物和/或該化合物中缺失1個以上糖殘基得到的化合物。
14.如權(quán)利要求11～13中任意一項所述的糖鏈的制備方法，脂溶性的保護基是Fmoc基。
15.如權(quán)利要求11～13中任意一項所述的糖鏈的制備方法，步驟(a)是在含有1種或2種以上在非還原末端具有唾液酸殘基的糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺上，導(dǎo)入Fmoc基，并在唾液酸殘基上導(dǎo)入苯甲基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的步驟。
16.具有下述通式的糖鏈天冬酰胺衍生物， 式中，R1和R2是H或下式表示的基團，可以相同也可以不同， 或 其中，R1和R2均為下式所示基團的場合除外。
17.具有下述通式的糖鏈天冬酰胺衍生物， 式中，RX和RY中一方為下式表示的基團， 另一方為H或下式表示的基團。 或
18.具有下述通式的糖鏈天冬酰胺， 式中，R3和R4是H或下式表示的基團，可以相同也可以不同， 或 其中，R3和R4均為下式所示基團的場合除外。 或
19.具有下述通式的糖鏈， 式中，R5和R6是H或下式表示的基團，可以相同也可以不同， 或 其中，R6和R6均為下式所示基團的場合， 或 或者R5或R6中一方為H，且另一方為下式所示基團的場合除外。
全文摘要
本發(fā)明提供糖鏈天冬酰胺衍生物的制備方法。按照該制備方法，與以前相比能夠非常容易且大量地得到醫(yī)藥品開發(fā)等領(lǐng)域中有用的各種分離的糖鏈天冬酰胺衍生物。另外，本發(fā)明還提供通過上述糖鏈天冬酰胺衍生物的制備工序制備糖鏈天冬酰胺的方法以及制備糖鏈的方法。而且，本發(fā)明還提供新型的糖鏈天冬酰胺衍生物、糖鏈天冬酰胺和糖鏈。
文檔編號C12P19/00GK1543471SQ0281621
公開日2004年11月3日 申請日期2002年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月19日
發(fā)明者梶原康宏, 佐佐木賢, 原康宏, 賢 申請人:大塚化學(xué)株式會社, 梶原康宏, 大 化學(xué)株式會社