專(zhuān)利名稱(chēng)：制備維生素b12的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterinm)制備維生素B12的方法。
早在本世紀(jì)三十年代，George Minot和William Murphy通過(guò)維生素B12在人體中的作用而間接發(fā)現(xiàn)了維生素B12(Stryer，L.，1988，生物化學(xué)(Biochemie)，第四版，528-531頁(yè)，Spektrum Akademischer VerlagGmbH，Heidelberg，柏林，紐約)。在1948年，維生素B12首次得到純化和分離，而直到八年后的1956年，Dorothy Hodgkin才闡明了維生素B12復(fù)雜的三維晶體結(jié)構(gòu)(Hodgkin，D.C.等人，1956，維生素B12的結(jié)構(gòu)(Structure of Vitamin B12)，自然(Nature)，176，325-328和自然，178，64-70)。維生素B12生物合成的天然最終產(chǎn)物是5’-脫氧腺苷鈷胺素(輔酶B12)和甲基鈷胺素(MeCb1)，然而維生素B12被定義為氰鈷胺素，這是工業(yè)上制備和處理的主要形式。在本發(fā)明中，除非專(zhuān)門(mén)指出，維生素B12總是指所有這三種類(lèi)似分子。
100多年前(1884)De Bary首次對(duì)巨大芽孢桿菌這一物種進(jìn)行了描述。盡管通常將巨大芽孢桿菌歸類(lèi)于土壤細(xì)菌，但在多種其它生境如海水、沉積物、水稻、干肉、牛奶或蜂蜜中也可檢測(cè)到巨大芽孢桿菌。巨大芽孢桿菌通常與假單胞菌屬(pseudomonads)和放線菌屬(actinomyces)相關(guān)聯(lián)。象它的近親枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)一樣，巨大芽孢桿菌是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，并且可以通過(guò)，特別是通過(guò)其相對(duì)明顯的個(gè)體大小2×5μm，據(jù)此而得名巨大芽孢桿菌，約38％的G+C含量和很強(qiáng)的芽孢形成能力辨別出來(lái)。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中即便是微量的錳也足以使巨大芽孢桿菌進(jìn)行完全的芽孢形成，這種能力只有一些嗜熱細(xì)菌(thermophilic bacilli)的芽孢形成效率能比得上。正是由于它的大小和非常有效的芽孢形成和發(fā)芽能力，針對(duì)巨大芽孢桿菌中這些過(guò)程的分子基礎(chǔ)開(kāi)展了不同的研究，以至于目前已有150多個(gè)涉及芽孢形成和發(fā)芽的巨大芽孢桿菌基因得以闡述。關(guān)于巨大芽孢桿菌的生理學(xué)方面的研究(Priest，F(xiàn).G.等人，1988，芽胞桿菌屬的一種數(shù)值分類(lèi)法(A Numerical Classification of the Genus Bacillus)，普通微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol.)，134，1847-1822)將這一物種歸類(lèi)于專(zhuān)性需氧的芽孢形成菌，該類(lèi)細(xì)菌為尿素酶陽(yáng)性和伏-波試驗(yàn)陰性，且不能夠還原硝酸鹽。巨大芽孢桿菌最顯著的特征之一是它利用大量碳源的能力。因此它可以利用大量的糖并且發(fā)現(xiàn)存在于如玉米糖漿、肉類(lèi)加工業(yè)的廢棄物甚至石油化學(xué)廢棄物中。鑒于其能夠代謝極廣泛碳源的能力，巨大芽孢桿菌可以不受限地等同于假單胞菌屬(Vary，P.S.，1994，微生物學(xué)(Microbiology)，40，1001-1013，研究巨大芽孢桿菌的全盛期(Prime timefor Bacillus megaterium))。
在各種各樣的酶、維生素等的工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用巨大芽孢桿菌的優(yōu)點(diǎn)是多樣的。這些優(yōu)點(diǎn)包括，其中首要且確定的優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化進(jìn)巨大芽孢桿菌的質(zhì)粒的環(huán)境證明是很穩(wěn)定的。這被認(rèn)為是與迄今已建立起來(lái)的例如用聚乙二醇處理來(lái)轉(zhuǎn)化這一物種的可行性有直接關(guān)系。直到幾年前，轉(zhuǎn)化的可行性仍然是利用巨大芽孢桿菌作為生產(chǎn)菌株的一個(gè)主要障礙。認(rèn)為相對(duì)充分研發(fā)的遺傳學(xué)的優(yōu)勢(shì)與轉(zhuǎn)化的可行性相關(guān)聯(lián)，在芽孢桿菌屬中這一點(diǎn)只有枯草芽孢桿菌超過(guò)了它。第二，巨大芽孢桿菌沒(méi)有堿性蛋白酶，所以在產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)時(shí)幾乎不發(fā)生降解作用。另外我們還知道巨大芽孢桿菌可高效分泌一些具有商業(yè)價(jià)值的產(chǎn)物，如利用它生產(chǎn)α-和β-淀粉酶。而且，巨大芽孢桿菌的大小使它能夠在達(dá)到致死的過(guò)密種群密度之前積累大量的生物量。在用巨大芽孢桿菌進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)中一個(gè)更有利且非常重要的情況是該物種能夠從廢棄物和低質(zhì)量物質(zhì)中制備高價(jià)值和非常高質(zhì)量的產(chǎn)品。巨大芽孢桿菌的這種能夠代謝極廣泛底物的能力也反映在它可以作為土壤解毒菌的用途上，它甚至可以分解各種氰化物、除草劑和殘留性農(nóng)藥。最后，巨大芽孢桿菌完全是非病原性的且不產(chǎn)生毒素，這是非常重要的，尤其是在生產(chǎn)食品和化妝品方面。正是由于以上這些優(yōu)點(diǎn)，巨大芽孢桿菌已經(jīng)廣泛應(yīng)用于大量工業(yè)生產(chǎn)，如生產(chǎn)α-和β-淀粉酶、青霉素酰胺酶、有毒廢棄物的處理或需氧維生素B12的生產(chǎn)(總結(jié)見(jiàn)Vary，P.S.，1994，微生物學(xué)，40，1001-1013，研究巨大芽孢桿菌的全盛期(Prime time forBacillus megaterium))。
由于在用生物技術(shù)生產(chǎn)各種具有工業(yè)利益的產(chǎn)品時(shí)，巨大芽孢桿菌具有大量?jī)?yōu)點(diǎn)，因此巨大芽孢桿菌的使用就具有了巨大的經(jīng)濟(jì)利益。然而，在需氧微生物的大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題，特別是對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行有效氧供給所引起的問(wèn)題，這與產(chǎn)量可觀的損失相關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是用巨大芽孢桿菌優(yōu)化維生素B12的制備。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用一種含有巨大芽孢桿菌的培養(yǎng)物制備維生素B12的方法可以達(dá)到這個(gè)目的，其中發(fā)酵作用在厭氧條件下進(jìn)行。
為了本發(fā)明的目的，原則上可使用所有適于作為維生素B12生產(chǎn)菌的普通巨大芽孢桿菌菌株。為了本發(fā)明的目的維生素B12的生產(chǎn)菌是指巨大芽孢桿菌菌株或同源微生物，它們已經(jīng)用經(jīng)典方法和/或分子遺傳學(xué)方法進(jìn)行了改造，使它們的代謝流向在生物合成維生素B12或其衍生物的方向上得以增加(代謝工程)。例如，在這些生產(chǎn)菌中將一個(gè)或多個(gè)位于代謝途徑關(guān)鍵位置上的基因和/或相應(yīng)的酶進(jìn)行調(diào)節(jié)上的修飾或甚至去調(diào)節(jié)，其中所述的基因和/或相應(yīng)的酶是至關(guān)重要的并受到相應(yīng)的復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用(瓶頸)。在這方面本發(fā)明包含了所有以前已知的維生素B12生產(chǎn)菌，優(yōu)選地為芽孢桿菌屬或同源生物。根據(jù)本發(fā)明這些具優(yōu)勢(shì)的菌株包括，特別是包括巨大芽孢桿菌的DSMZ 32菌株、DSMZ 509菌株和DSMZ 2894菌株。
根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)表明巨大芽孢桿菌在厭氧條件下生存是可能的，而且在這些條件下維生素B12的產(chǎn)量高于需氧條件下的產(chǎn)量。通過(guò)比較巨大芽孢桿菌在需氧和厭氧生長(zhǎng)條件下的維生素B12的產(chǎn)量，清楚地表明在所有被研究的菌株中厭氧條件下維生素B12的產(chǎn)量比需氧條件下的產(chǎn)量至少提高3-4倍。通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)條件、培養(yǎng)基成分和所使用的細(xì)菌菌株進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化實(shí)現(xiàn)維生素B12產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。
根據(jù)本發(fā)明，用巨大芽孢桿菌增加維生素B12的制備是可能的，如通過(guò)向培養(yǎng)基中至少加入鈷。應(yīng)用本發(fā)明的方法，加入如甜菜堿、甲硫氨酸、谷氨酸、二甲基苯并咪唑或膽堿或它們的組合對(duì)于維生素B12的生產(chǎn)有有利的作用。上述化合物單獨(dú)或組合后再與鈷配合使用可能也是有利的。
本發(fā)明相應(yīng)地也涉及到一種方法，這種方法的不同在于它在培養(yǎng)基中至少加入了鈷。也就是說(shuō)，例如鈷可以被單獨(dú)地加入或至少與甜菜堿、甲硫氨酸、谷氨酸、二甲基苯并咪唑或膽堿或與最后提到的化合物的組合配合加入。在本發(fā)明方法的一個(gè)改變形式中，通過(guò)在每升培養(yǎng)基中加入約200-750μM，優(yōu)選地加入250-500μM的鈷能夠提高維生素B-12的含量。
本發(fā)明的進(jìn)一步改變形式包括一種上述類(lèi)型的方法，其中巨大芽孢桿菌最初進(jìn)行需氧發(fā)酵然后再進(jìn)行厭氧發(fā)酵。在一個(gè)有利的改變形式中，從需氧發(fā)酵到厭氧發(fā)酵的轉(zhuǎn)變發(fā)生在需氧發(fā)酵細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)期。在這方面，從需氧到厭氧的轉(zhuǎn)變發(fā)生在需氧生長(zhǎng)細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)期的中期或末期，優(yōu)選地是在末期，是有利的。
在這方面本發(fā)明優(yōu)選的方法是一旦需氧培養(yǎng)物達(dá)到最大的光密度就將發(fā)酵作用從需氧轉(zhuǎn)變成厭氧，但光密度至少要達(dá)到約2-3。
為了本發(fā)明的目的，在本發(fā)明方法的單階段方法和兩階段方法中，厭氧條件都是指將需氧培養(yǎng)后的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到厭氧瓶并在其中發(fā)酵時(shí)的種種條件。轉(zhuǎn)移進(jìn)厭氧瓶?jī)?nèi)的時(shí)間，特別是在兩階段方法中，發(fā)生在需氧培養(yǎng)的細(xì)菌剛剛達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期。這表明，轉(zhuǎn)移到厭氧瓶后，細(xì)菌只消耗瓶中存在的氧而不再額外供氧。這些條件也可以說(shuō)成是半?yún)捬?。相?yīng)的步驟是常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室操作并且為技術(shù)人員所熟知。
起初將細(xì)菌在發(fā)酵罐里進(jìn)行需氧發(fā)酵然后將氧的供應(yīng)逐漸減少并最終建立起半?yún)捬鯒l件也是一種流行的相似方法。
在本發(fā)明的一個(gè)特殊改變形式中，例如通過(guò)向培養(yǎng)基中加入還原劑建立嚴(yán)格的厭氧條件也是可能的。
對(duì)于本發(fā)明在厭氧條件下(無(wú)論是半?yún)捬趸驀?yán)格的厭氧條件)的發(fā)酵，細(xì)菌一般不是絕對(duì)需要需氧培養(yǎng)(預(yù)培養(yǎng))。這意味著細(xì)菌也可在厭氧條件下培養(yǎng)，隨后進(jìn)一步在半?yún)捬趸驀?yán)格厭氧條件下發(fā)酵。也可以想象到保存的菌株可以直接用于接種并用來(lái)在厭氧條件下制備維生素B12。
在本發(fā)明的一個(gè)改變形式中，需氧條件下的發(fā)酵作用要加入大約250μM的鈷；而厭氧條件下的發(fā)酵作用加入大約500μM的鈷是有利的。
本發(fā)明還包括遺傳學(xué)修飾的細(xì)菌菌株，這種菌株可通過(guò)經(jīng)典的誘變或靶向分子生物學(xué)技術(shù)和恰當(dāng)?shù)倪x擇方法獲得。靶向遺傳學(xué)操作的令人感興趣的起始點(diǎn)特別是導(dǎo)致維生素B12分支的生物合成途徑的點(diǎn)，通過(guò)它可使代謝流向有意地引導(dǎo)到維生素B12最大產(chǎn)量一方。涉及代謝流向調(diào)節(jié)作用的基因的靶向修飾也包括對(duì)結(jié)構(gòu)基因上游和下游調(diào)節(jié)區(qū)的研發(fā)和改變，比如對(duì)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等的優(yōu)化和/或互換。本發(fā)明也包括提高DNA、mRNA或由它們編碼的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，例如通過(guò)降低或阻止核酸酶或蛋白酶的降解作用。
本發(fā)明涉及編碼參與維生素B12生物合成的酶的相應(yīng)的核苷酸序列。本發(fā)明也特別涉及到分離的編碼參與尿卟啉原III生物合成的酶的核苷酸序列或它的等位基因，其中所述核苷酸序列被組織到巨大芽孢桿菌hemAXCDBL操縱子中，這些核苷酸序列顯示于SEQ ID No.1中。根據(jù)本發(fā)明，也包括由巨大芽孢桿菌hemAXCDBL操縱子編碼的且其氨基酸序顯示于SEQ ID No.2-6的酶和它們的同工酶或修飾型。
同工型的酶是指一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，但具有相同或相當(dāng)?shù)牡孜锾禺愋院妥饔锰禺愋缘拿浮?br> 根據(jù)本發(fā)明，修飾型的酶是指這樣一些酶，即它們的序列有所改變，如在多肽的N末端和/或C末端或在氨基酸保守區(qū)域發(fā)生改變，但酶的功能沒(méi)有受到破壞。這些改變能夠通過(guò)氨基酸互換的形式實(shí)現(xiàn)，而氨基酸互換可通過(guò)本來(lái)就已知的方法產(chǎn)生。
本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中包含本發(fā)明多肽的變體，與相應(yīng)的原始蛋白質(zhì)相比這些多肽的活性已經(jīng)被減弱或增強(qiáng)，例如通過(guò)氨基酸互換的方法產(chǎn)生變體。該方法同樣應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)的本發(fā)明酶的穩(wěn)定性，例如這些酶對(duì)于蛋白酶降解的敏感性會(huì)有所增強(qiáng)或減弱。
根據(jù)本發(fā)明，分離的核酸或分離的核酸片段是指RNA或DNA的聚合物，它們可以是單鏈的或雙鏈的，且可任選地含有天然的、化學(xué)合成的、修飾的或人造的核苷酸。在這方面，術(shù)語(yǔ)DNA聚合物也包括DNA、cDNA或它們的混合物。
根據(jù)本發(fā)明，等位基因是指功能相當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄?，即本質(zhì)上具有相同作用的核苷酸序列。功能相當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄惺沁@樣一些序列，盡管它們的核苷酸序列不同，但卻具有如通過(guò)遺傳密碼的簡(jiǎn)并性仍具有所需的功能。因此，功能等同物包含此處所述序列的天然存在變體、和人工的核苷酸序列如通過(guò)化學(xué)合成得到的并且合適時(shí)適用于宿主生物密碼子使用的核苷酸序列。此外，功能相當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄羞€包含具有改變了的核苷酸序列的那些序列，其中所述改變了的核苷酸序列賦予酶諸如對(duì)抑制劑的不敏感性或抗性。
功能等同物也特別是指最初分離序列的天然或人工突變，這些突變?nèi)燥@示出所需的功能。突變包括一個(gè)以上核苷酸殘基的替換、添加、缺失、轉(zhuǎn)位或插入。它們包括所謂的有義突變，它導(dǎo)致在蛋白質(zhì)水平上出現(xiàn)諸如保守氨基酸的互換，但蛋白質(zhì)的活性基本不發(fā)生改變，因此在功能上是無(wú)作用的。突變還包括那些在蛋白質(zhì)水平影響其N(xiāo)末端或C末端但對(duì)其功能只產(chǎn)生微不足道影響的核苷酸序列的變化。這些變化事實(shí)上可對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用。
本發(fā)明還包含那些如通過(guò)核苷酸序列修飾得到的導(dǎo)致相應(yīng)衍生物產(chǎn)生的核苷酸序列。此類(lèi)修飾的目的可以是，如對(duì)其中存在的編碼序列的進(jìn)一步定位，或如其它限制性酶切位點(diǎn)的插入。功能等同物也是與原始的基因或基因片段相比功能已經(jīng)減弱或加強(qiáng)的變體。
此外，本發(fā)明還涉及到能夠賦予如上所述的預(yù)期特性的人工DNA序列。如通過(guò)蛋白質(zhì)的反翻譯可發(fā)現(xiàn)這樣的人工DNA序列，其中所述蛋白質(zhì)的反翻譯是通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助程序(分子模建)或體外選擇建立的。根據(jù)宿主生物特異的密碼子使用對(duì)多肽序列進(jìn)行反翻譯所得到的DNA編碼序列是特別合適的。掌握了分子遺傳學(xué)方法的技術(shù)人員通過(guò)對(duì)欲用于轉(zhuǎn)化的生物的其它以前已知的基因進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析可以容易地發(fā)現(xiàn)特異的密碼子使用。
根據(jù)本發(fā)明，同源序列是指那些與本發(fā)明核苷酸序列互補(bǔ)的序列和/或與后者雜交的序列。根據(jù)本發(fā)明，雜交序列這一術(shù)語(yǔ)包括能夠與先前提到的核苷酸序列在本身已知的嚴(yán)格條件下發(fā)生特異相互作用(結(jié)合)的基本相似的DNA或RNA核苷酸序列。這些還包括一些短的核苷酸序列，如長(zhǎng)度為10-30個(gè)核苷酸，優(yōu)選地是12-15個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，這還包括尤其是所謂的引物或探針。
本發(fā)明也包括編碼區(qū)(結(jié)構(gòu)基因)的前面序列區(qū)域(5-或上游)和/或后面序列區(qū)域(3’或下游)。這些序列區(qū)域特別包括那些具有調(diào)節(jié)功能的序列區(qū)域。它們可以影響轉(zhuǎn)錄、RNA的穩(wěn)定性或RNA加工和翻譯。調(diào)節(jié)序列的例子特別是啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱基因、終止子或翻譯增強(qiáng)子。
本發(fā)明進(jìn)一步包括這樣的基因結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含上述類(lèi)型的分離的核苷酸序列或其中部分序列和可操作地與其連接的具有調(diào)節(jié)功能的序列。
可操作的連接是指諸如啟動(dòng)子、編碼序列、終止子和適當(dāng)時(shí)進(jìn)一步的調(diào)節(jié)元件的按序排列，這種排列使得在編碼序列的表達(dá)過(guò)程中這些調(diào)節(jié)元件中的每一個(gè)都可以發(fā)揮其適當(dāng)?shù)墓δ堋＿@些調(diào)節(jié)性核苷酸序列可以是天然來(lái)源的，或是通過(guò)化學(xué)合成獲得的。合適的啟動(dòng)子原則上是指能在適宜的宿主生物中控制基因表達(dá)的任何啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明，啟動(dòng)子也可能是化學(xué)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠控制受其調(diào)控的基因在宿主細(xì)胞特定時(shí)期表達(dá)。β-半乳糖苷酶或阿拉伯糖系統(tǒng)在此作為實(shí)例被提到。
通過(guò)常規(guī)的重組和克隆技術(shù)將合適的啟動(dòng)子和至少一個(gè)本發(fā)明的核苷酸序列融合構(gòu)建了基因結(jié)構(gòu)，這些重組和克隆技術(shù)是由諸如Sambrook，J.等人在1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約一書(shū)中描述。
連接物或接頭可以附加到片段中用于將DNA片段連接起來(lái)。
本發(fā)明還包括載體，所述載體包含上述類(lèi)型的分離的核苷酸序列或其部分核苷酸序列或包含上述類(lèi)型的基因結(jié)構(gòu)，還包含一些額外的核苷酸序列，這些額外的核苷酸序列是用于選擇、用于在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和/或整合到宿主細(xì)胞基因組。關(guān)于這些額外核苷酸序列的很多例子在文獻(xiàn)中有所敘述，在此不再進(jìn)一步敘述。
所提及的基因在巨大芽孢桿菌中轉(zhuǎn)化和過(guò)表達(dá)的適宜體系為諸如pWH1510和pWH1520質(zhì)粒以及無(wú)質(zhì)粒的過(guò)表達(dá)巨大芽孢桿菌菌株WH320，這些是由Rygus T.等人描述的(1991，在巨大芽孢桿菌中異源基因的誘導(dǎo)型高效表達(dá)(Inducible High-Level Expression of heterologousgenes in Bacillus megaterium)，應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)(Appl.Microbiol.Biotechnol.)，35，55594-599)。質(zhì)粒也是商業(yè)可得的(Q biogens和MoBiTec)。然而，所提到的體系不用于限制本發(fā)明。
本發(fā)明還涉及到一種方法，該方法的不同在于它應(yīng)用hemAXCDBL操縱子或其部分呈現(xiàn)增強(qiáng)表達(dá)的巨大芽孢桿菌菌株進(jìn)行發(fā)酵。
本發(fā)明的一個(gè)改變形式中包含了這樣一種方法，在該方法中使用了與沒(méi)有進(jìn)行遺傳學(xué)改變的芽胞桿菌相比其hemAXCDBL操縱子或其部分在細(xì)胞中以增加的拷貝數(shù)存在的遺傳學(xué)改變的巨大芽孢桿菌菌株進(jìn)行發(fā)酵?？截悢?shù)可在2到幾百范圍內(nèi)變動(dòng)。
通過(guò)增加適宜基因的拷貝數(shù)可以提高基因的表達(dá)(過(guò)表達(dá))。以一種能夠使表達(dá)呈現(xiàn)速率增加的方式適當(dāng)?shù)馗淖兾挥诮Y(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)子區(qū)和/或調(diào)節(jié)區(qū)和/或核糖體結(jié)合位點(diǎn)也是進(jìn)一步可能的。整合到結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒也能夠以同樣的方式發(fā)揮作用。此外，在維生素B12的生產(chǎn)中，通過(guò)使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)增加表達(dá)也是可能的。
通過(guò)延長(zhǎng)mRNA壽命的方法同樣可以提高表達(dá)?；蚧蚧驑?gòu)建體以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒上和/或整合和/或擴(kuò)增至染色體上。
通過(guò)阻止酶蛋白質(zhì)的降解作用提高或增強(qiáng)酶自身的活性也是進(jìn)一步可能的。
通過(guò)改變培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)物的處理方法也是獲得相應(yīng)基因過(guò)表達(dá)的另一種可供選擇的可能方法。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及到用于上述類(lèi)型的維生素B12產(chǎn)生方法中的已經(jīng)轉(zhuǎn)化了的巨大芽孢桿菌菌株，這種菌株呈現(xiàn)hemAXCDBL操縱子或其部分的核苷酸序列表達(dá)增強(qiáng)和/或拷貝數(shù)得以增加。
根據(jù)本發(fā)明，還包括一種轉(zhuǎn)化了的巨大芽孢桿菌菌株，該菌株包含以復(fù)制型存在的上述類(lèi)型的基因結(jié)構(gòu)或載體。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及到分離的hemAXCDBL操縱子或其部分的核苷酸序列的用途，或進(jìn)一步涉及到上述類(lèi)型的基因結(jié)構(gòu)或載體的用途，用于產(chǎn)生上述類(lèi)型的經(jīng)轉(zhuǎn)化巨大芽孢桿菌菌株。本發(fā)明還包括上述類(lèi)型的轉(zhuǎn)化了的巨大芽孢桿菌菌株的用途，用于生產(chǎn)維生素B12。
以下的實(shí)施例用于闡明本發(fā)明。然而，它們對(duì)本發(fā)明沒(méi)有限制作用。
1.化學(xué)試劑和分子生物學(xué)試劑DNA分離試劑盒 QiagenFast-Link連接試劑盒 Biozym分子生物學(xué)酶類(lèi) Amersham-Pharmacia，NEN-LifeScience生長(zhǎng)培養(yǎng)基 Difco2.細(xì)菌菌株和質(zhì)粒本研究中使用的所有細(xì)菌菌株和質(zhì)粒都列于表1和表2中。
3.緩沖液和溶液3.1基本培養(yǎng)基大腸桿菌(E.coli)基本培養(yǎng)基K2HPO460.3mMKH2PO433.1mM(NH4)2SO47.6mM檸檬酸鈉 1.7mMMgSO41.0mMD-葡萄糖 10.1mM硫胺素 3.0μM酪蛋白氨基酸 0.025％(w/v)固體培養(yǎng)基中加入15g/l瓊脂。
Mopso基本培養(yǎng)基Mopso(pH7.0) 50.0mMN-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)(pH 7.0) 5.0mMMgCl2520.0μMK2SO4276.0μMFeSO450.0μMCaCl21.0mMMnCl2100.0μMNaCl 50.0mMKCl 10.0mMK2HPO41.3mM(NH4)6Mo7O2430.0pMH3BO34.0nMCoCl2300.0pMCuSO4100.0pMZnSO4100.0pMD-葡萄糖 20.2mMNH4Cl 37.4mM滴定試劑為KOH溶液。
鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌(S.typhimurium)基本培養(yǎng)基NaCl8.6mMNa2HPO433.7mMKH2PO422.0mMNH4Cl 18.7mMD-葡萄糖20.2mMMgSO42.0mM
CaCl20.1mM固體培養(yǎng)基中加入15g/l瓊脂。
3.2用于巨大芽孢桿菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的溶液SMMP緩沖液3號(hào)抗生素培養(yǎng)基(Difco)17.5g/l蔗糖 500.0mM馬來(lái)酸鈉(pH6.5) 20.0mMMgCl220.0mM滴定試劑為NaOH溶液。
PEG-P溶液PEG 6000 40.0％(w/V)蔗糖 500.0mM馬來(lái)酸鈉(pH6.5) 20.0mMMgCl220.0mM滴定試劑為NaOH溶液。
cR5上層瓊脂蔗糖 300.0mMMops(pH7.3) 31.1mMNaOH 15.0mML-脯氨酸 52.1mMD-葡萄糖 50.5mMK2SO41.3mMMgCl2×6H2O 45.3mMKH2PO4313.0μMCaCl213.8mM瓊脂 4.0g/l酪蛋白氨基酸 0.2g/l酵母提取物10.0g/l
滴定試劑為NaOH溶液。
4.培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加劑4.1培養(yǎng)基除非特別聲明，均使用Sambrook J.等人(1989，分子克??；實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)所述的Luria-Bertani肉湯(LB)完全培養(yǎng)基。
4.2添加劑添加劑，諸如碳源、氨基酸或抗生素，可以加入到培養(yǎng)基中一起高壓滅菌，或者用水配成濃縮貯液滅菌，適當(dāng)時(shí)通過(guò)過(guò)濾除菌。將這些物質(zhì)加入到已高壓滅菌并冷卻到50℃以下的培養(yǎng)基中。若含有對(duì)光敏感的物質(zhì)如四環(huán)素，要注意在暗處培養(yǎng)。通常使用的終濃度如下氨芐青霉素 296μM四環(huán)素 21μMALA 298μM血紅素 153μMX-Gal 98μM甲硫氨酸335μM半胱氨酸285μM硝酸鈉 10mM亞硝酸鈉10mM富馬酸二鈉 10mM葡萄糖 10mM氯化銨 37mM木糖33mM溶菌酶 10μg/ml酪蛋白氨基酸0.025％(w/v)5.微生物學(xué)技術(shù)5.1滅菌除非特別說(shuō)明，所有的培養(yǎng)基和緩沖液均在120℃，1巴壓力下，蒸汽滅菌20分鐘。對(duì)熱敏感物質(zhì)需通過(guò)過(guò)濾除菌，玻璃器具在180℃高熱滅菌至少3小時(shí)。
5.2一般生長(zhǎng)條件需氧細(xì)菌培養(yǎng)物在擋板搖瓶中37℃培養(yǎng)，最小轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘。培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)預(yù)期所要達(dá)到得細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度而有所不同。
5.3巨大芽孢桿菌生長(zhǎng)的條件為了盡可能給需氧培養(yǎng)物通氣，巨大芽孢桿菌應(yīng)培養(yǎng)于轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘的擋板搖瓶中，除非特別說(shuō)明，溫度均為30℃。厭氧培養(yǎng)物在30℃以100ml的體積在小厭氧瓶中發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘。在這兩種情況下，都應(yīng)注意使用恒定質(zhì)量的培養(yǎng)基，對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)物以1∶100的比例進(jìn)行接種，并使用同過(guò)夜培養(yǎng)一致的條件。
5.4細(xì)胞密度測(cè)定通過(guò)測(cè)定578nm波長(zhǎng)下的光密度來(lái)測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)物的細(xì)胞密度，假定1 OD578相當(dāng)于1×109個(gè)細(xì)胞。
5.5比較生長(zhǎng)研究開(kāi)展了不同的巨大芽孢桿菌菌株的需氧和厭氧生長(zhǎng)行為的比較研究，并在

圖1、圖2和圖3中加以敘述。所使用的菌株是巨大芽孢桿菌菌株DSMZ32(野生型)或“生產(chǎn)菌株”DSMZ509和DSMZ2894，它們適于在需氧條件下進(jìn)行維生素B12的生產(chǎn)。然而，本發(fā)明不局限于僅使用這些菌株。也可以想到適于制備維生素B12的其它菌株，包括用經(jīng)典的突變或特殊的分子生物學(xué)技術(shù)和恰當(dāng)?shù)暮Y選方法產(chǎn)生的遺傳學(xué)修飾的細(xì)菌菌株。
在對(duì)巨大芽孢桿菌能夠厭氧生長(zhǎng)的程度進(jìn)行研究時(shí)，將一些備選的電子受體硝酸鹽、亞硝酸鹽和富馬酸鹽加入到培養(yǎng)基中以代替需氧電子受體氧(圖4-6)。平行的研究是針對(duì)巨大芽孢桿菌是否也能夠在沒(méi)有添加這些電子受體的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵而開(kāi)展的。
從本發(fā)明的結(jié)果，在這方面很清楚地看到電子受體亞硝酸鹽對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)具有毒性效應(yīng)。富馬酸鹽也抑制生長(zhǎng)。所加入的這些潛在的電子受體沒(méi)有一個(gè)能夠刺激超出發(fā)酵生長(zhǎng)程度的厭氧生長(zhǎng)。
5.6維生素B12產(chǎn)量的比較研究對(duì)巨大芽孢桿菌在厭氧和需氧條件下維生素B12產(chǎn)量也進(jìn)行了分析。本發(fā)明所用的實(shí)施例是在厭氧條件下于含葡萄糖(LB完全)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的巨大芽孢桿菌菌株DSMZ32、DSMZ509和DSMZ2894，并且在指數(shù)生長(zhǎng)期的末期對(duì)維生素B12的含量進(jìn)行了測(cè)定，表示為pmol/OD578。作為平行，對(duì)需氧生長(zhǎng)的指數(shù)生長(zhǎng)期中期維生素B12的產(chǎn)量也進(jìn)行了研究。結(jié)果示于圖7。
5.7 5-氨基乙酰丙酸(ALA)對(duì)維生素B12產(chǎn)量的影響合成維生素B12中的四吡咯生物合成途徑的中心調(diào)節(jié)點(diǎn)是5-氨基乙酰丙酸(ALA)的形成，因此本發(fā)明研究了ALA對(duì)巨大芽孢桿菌中維生素B-12產(chǎn)量的影響。加入或不加入外源的添加物ALA時(shí)巨大芽孢桿菌的需氧維生素B-12產(chǎn)量描繪于圖8。在此應(yīng)用的培養(yǎng)基中ALA濃度大約為50μg/ml。
根據(jù)本發(fā)明，ALA的添加對(duì)細(xì)菌在需氧和厭氧發(fā)酵時(shí)維生素B-12的產(chǎn)量可能沒(méi)有影響。據(jù)此，維生素B-12生物合成的調(diào)節(jié)似乎表現(xiàn)為不單獨(dú)受ALA形成的限制。
5.8維生素B12的定量分析測(cè)定OD578后，收獲巨大芽孢桿菌需氧生長(zhǎng)的指數(shù)生長(zhǎng)期的中期培養(yǎng)物和厭氧生長(zhǎng)的指數(shù)生長(zhǎng)期末期的培養(yǎng)物，5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘(Centrifuge 5403，Eppendorf)收獲培養(yǎng)物。用40ml鹽水洗滌，然后5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘(Centrifuge 5403，Eppendorf)。所得到的細(xì)胞沉淀物被最終冷凍干燥。鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌metE cysG雙突變體(Raux，E.等人，1996，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)，178753-767)接種在含有甲硫氨酸和半胱氨酸的基本培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后從平板上刮下來(lái)并用40ml等滲的鹽水洗滌。離心后，細(xì)胞沉淀物重懸于等滲的鹽水。將洗滌后的細(xì)菌培養(yǎng)物小心地與400ml含有半胱氨酸的基本培養(yǎng)基瓊脂在47-48℃混合。已經(jīng)重懸于無(wú)菌去離子水并經(jīng)沸水浴15分鐘后的10μl巨大芽孢桿菌樣本涂于冷的平板上，37℃孵育18小時(shí)。長(zhǎng)出的沙門(mén)氏菌的菌落直徑與所用的巨大芽孢桿菌樣本的維生素B12含量成比例。通過(guò)加入0.01、0.1、1、10和40pmol的維生素B12做出校準(zhǔn)圖，通過(guò)與此相比較可以推測(cè)出所研究的樣本中維生素B12的含量。這種標(biāo)準(zhǔn)方法可對(duì)生物材料中小量維生素B12進(jìn)行快速和可重復(fù)性的監(jiān)測(cè)。
6.分子生物學(xué)技術(shù)如DNA制備、DNA限制性酶切、連接、PCR、測(cè)序、功能互補(bǔ)、蛋白質(zhì)表達(dá)等普通技術(shù)是常規(guī)實(shí)驗(yàn)室操作的一部分并且由Sambrook J.等人(1989，分子克??；實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)描述。
6.1巨大芽孢桿菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體制備將1ml巨大芽孢桿菌過(guò)夜培養(yǎng)物接種于50ml LB培養(yǎng)基中，置37℃進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)OD578為1時(shí)，4℃，15 000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘(RC 5B Plus，Sorvall)，并將細(xì)胞重懸于5ml SMMP緩沖液中。在SMMP緩沖液中加入溶菌酶后，將懸浮物37℃培養(yǎng)60分鐘，并在顯微鏡下監(jiān)測(cè)原生質(zhì)體的形成。室溫3000轉(zhuǎn)/分鐘離心(Centrifuge 5403，Eppendorf)收獲細(xì)胞，然后將細(xì)胞沉淀物小心重懸于5ml SMMP緩沖液中，重復(fù)離心和洗滌步驟一次。當(dāng)加入10％(v/v)甘油后，可以將原生質(zhì)體懸浮物分裝成小份凍于-80℃。
轉(zhuǎn)化將500μl的原生質(zhì)體懸浮物與0.5-1μg在SMMP緩沖液中的DNA進(jìn)行混合，并加入1.5ml PEG-P溶液。室溫孵育2分鐘后，加入5ml SMMP緩沖液，小心混勻后將懸浮物室溫3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘(Centrifuge5403，Eppendorf)。之后，立即去除上清液并且將幾乎看不見(jiàn)的沉淀物重懸于500μl SMMP緩沖液中。懸浮物在37℃輕輕振蕩孵育90分鐘。然后將50-200μl轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞與2.5ml cR5上層瓊脂混合，鋪到含有適于選擇的抗生素的LB-瓊脂平板上。37℃培養(yǎng)兩天后可見(jiàn)到轉(zhuǎn)化了的菌落。
6.2巨大芽孢桿菌hemAXCDBL操縱子的鑒定和測(cè)序所選擇的克隆hemAXCDBL操縱子的策略是血紅素營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌突變體的功能互補(bǔ)。為了達(dá)到該目的，通過(guò)常規(guī)方法制備了巨大芽孢桿菌基因文庫(kù)。通過(guò)大腸桿菌hemB突變體RP523與已經(jīng)構(gòu)建到質(zhì)粒中的巨大芽孢桿菌基因組文庫(kù)進(jìn)行功能互補(bǔ)分析，來(lái)分離那些又能夠完成四吡咯生物合成即表型上表現(xiàn)為血紅素原養(yǎng)野生型的菌落是可能的。制備質(zhì)粒DNA并將存在于質(zhì)粒上的巨大芽孢桿菌DNA進(jìn)行測(cè)序后，可鑒定到編碼我們所尋找的hemAXCDBL操縱子的大小為3855bp的插入片段。相應(yīng)的核苷酸序列列于SEQ ID No.1，由此推導(dǎo)出的氨基酸序列列于SEQ IDNo.2-6。
用功能互補(bǔ)法得到的DNA片段的上下游序列可以用Sigma Genosis公司的Vectorette TM系統(tǒng)得到。Strategene公司的Turbo Pfu DNA聚合酶，由于具有校對(duì)功能，因此錯(cuò)誤率極其低。
6.3轉(zhuǎn)化和表達(dá)系統(tǒng)用于在巨大芽孢桿菌中轉(zhuǎn)化并過(guò)表達(dá)基因的合適質(zhì)粒是pWH1510和pWH1520，且無(wú)質(zhì)粒的過(guò)表達(dá)菌株是巨大芽孢桿菌WH320(Rygus T.等人，1991，在巨大芽孢桿菌中異源基因的可誘導(dǎo)型高效表達(dá)(InducibleHigh-Level Expression of heterologous genes in Bacillus megaterium)，應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)(Appl.Microbiol And.Biotechnol.)，35，5594-599)。
對(duì)照質(zhì)粒pWH1510在打斷的xylA閱讀框中包含spoVG-lacZ融合結(jié)構(gòu)。在本例中，spoVG-lacZ融合結(jié)構(gòu)是指枯草芽孢桿菌芽孢形成蛋白的非常強(qiáng)的核糖體結(jié)合序列(spoVG)與大腸桿菌編碼β半乳糖苷酶的基因(lacZ)融合。因此這種質(zhì)粒非常適于研究對(duì)于巨大芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化效率和過(guò)表達(dá)條件。
質(zhì)粒pWH1520是真正的能夠起作用的克隆和表達(dá)載體。這兩種載體具有四環(huán)素抗性和氨芐青霉素抗性，并含有在大腸桿菌和芽孢桿菌亞種(Bacillus spp)中復(fù)制至關(guān)重要的元件。因此，對(duì)于建立在大腸桿菌基礎(chǔ)上的用于操作質(zhì)粒pBR322衍生物的所有技術(shù)也同樣適用于它們。這兩個(gè)載體均包含巨大芽孢桿菌xyl操縱子的xylA和xylR基因和它們的調(diào)節(jié)序列(Rygus等人，1991，分子克隆，結(jié)構(gòu)；用于轉(zhuǎn)錄巨大芽孢桿菌中編碼木糖應(yīng)用型調(diào)節(jié)子的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)元件(MolecularCloning，Structure；Promoters and Regulatory Elements for Transcriptionof the Bacillus megaterium Encoded Regulon for Xylose Utilization)，微生物學(xué)文獻(xiàn)(Arch.Microbiol.)，155535-542)。xylA編碼木糖異構(gòu)酶而xylR編碼一種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，這種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)對(duì)xylA進(jìn)行強(qiáng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控。當(dāng)缺乏木糖時(shí)，xylA受到抑制。當(dāng)加入木糖時(shí)，通過(guò)xylA的去抑制作用可以產(chǎn)生約200倍的誘導(dǎo)。處于xylA閱讀框的多接頭使得將基因與xylA融合在一起成為可能，同樣，所述基因也處于XylR的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄控制之下。而且，由于位于多接頭上游的xylA閱讀框是完整的，所以選擇是形成轉(zhuǎn)錄融合還是形成翻譯融合也是可能的。
圖表說(shuō)明所使用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒列于表1和表2中。
表1所使用的細(xì)菌菌株表2所使用的質(zhì)粒用下列圖進(jìn)一步解釋本發(fā)明。
圖1顯示30℃下巨大芽孢桿菌DSMZ32(野生型)在需氧和厭氧條件下生長(zhǎng)情況的比較。測(cè)定了在加入10mM硝酸鹽(空心菱形)、10mM亞硝酸鹽(空心三角形)和10mM富馬酸鹽(十字叉)條件下的厭氧生長(zhǎng)情況。測(cè)定了在不含添加物的LB培養(yǎng)基中的發(fā)酵(空心圓形)和需氧(實(shí)心菱形)生長(zhǎng)情況。在所示時(shí)間抽取樣本并測(cè)定578nm波長(zhǎng)下的光密度值。
圖2顯示30℃下巨大芽孢桿菌DSMZ509在需氧和厭氧條件下生長(zhǎng)情況的比較。測(cè)定了在加入10mM硝酸鹽(空心菱形)、10mM亞硝酸鹽(空心三角形)和10mM富馬酸鹽(十字叉)條件下的厭氧生長(zhǎng)情況。測(cè)定了在不含添加物的LB培養(yǎng)基中的發(fā)酵(空心圓形)和需氧(實(shí)心菱形)生長(zhǎng)情況。在所示時(shí)間抽取樣本并測(cè)定578nm波長(zhǎng)下的光密度值。
圖3顯示30℃下巨大芽孢桿菌DSMZ2894在需氧和厭氧條件下生長(zhǎng)情況的比較。測(cè)定了在加入10mM硝酸鹽(空心菱形)、10mM亞硝酸鹽(空心三角形)和10mM富馬酸鹽(十字叉)條件下的厭氧生長(zhǎng)情況。測(cè)定了在不含添加物的LB培養(yǎng)基中的發(fā)酵(空心圓形)和需氧(實(shí)心菱形)生長(zhǎng)情況。在所示時(shí)間抽取樣本并測(cè)定578nm波長(zhǎng)下的光密度值。
圖4顯示30℃下巨大芽孢桿菌DSMZ32(野生型)在加入10mM硝酸鹽(菱形)、10mM亞硝酸鹽(三角形)和10mM富馬酸鹽(十字叉)條件下的厭氧生長(zhǎng)情況。在不含添加物的LB培養(yǎng)基中的發(fā)酵(圓形)生長(zhǎng)情況。在所示時(shí)間抽取樣本并測(cè)定578nm波長(zhǎng)下的光密度值。
圖5顯示30℃下巨大芽孢桿菌DSMZ509在加入10mM硝酸鹽(菱形)、10mM亞硝酸鹽(三角形)和10mM富馬酸鹽(十字叉)條件下的厭氧生長(zhǎng)情況。在不含添加物的LB培養(yǎng)基中的發(fā)酵(圓形)生長(zhǎng)情況。在所示時(shí)間抽取樣本并測(cè)定578nm波長(zhǎng)下的光密度值。
圖6顯示30℃下巨大芽孢桿菌DSMZ2894在加入10mM硝酸鹽(菱形)、10mM亞硝酸鹽(三角形)和10mM富馬酸鹽(十字叉)條件下的厭氧生長(zhǎng)情況。在不含添加物的LB培養(yǎng)基中的發(fā)酵(圓形)生長(zhǎng)情況。在所示時(shí)間抽取樣本并測(cè)定578nm波長(zhǎng)下的光密度值。
圖7顯示在需氧和厭氧生長(zhǎng)條件下，巨大芽孢桿菌維生素B12的產(chǎn)量。對(duì)需氧生長(zhǎng)的(1)和厭氧生長(zhǎng)的(2)野生型巨大芽孢桿菌菌株DSMZ32、需氧生長(zhǎng)的(3)和厭氧生長(zhǎng)的(4)巨大芽孢桿菌DSMZ509、需氧生長(zhǎng)的(5)和厭氧生長(zhǎng)的(6)巨大芽孢桿菌DSMZ2894進(jìn)行了生物量中維生素B12含量測(cè)定，以pmol/OD578為單位表示。
圖8顯示添加和不添加50μg/ml外源ALA的條件下巨大芽孢桿菌的需氧維生素B12的產(chǎn)量。對(duì)不添加(1)和添加(2)ALA的野生型巨大芽孢桿菌DSMZ32、不添加(3)和添加(4)ALA的巨大芽孢桿菌DSMZ509、不添加(5)和添加(6)ALA的巨大芽孢桿菌DSMZ2894進(jìn)行了每生物量中維生素B12含量的測(cè)定，以pmol/OD578為單位表示。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>制備維生素B12的方法<130>Sample File Reference<140>j<141>2001-08-01<160>7<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>7193<212>DNA<213>巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)<220>
<221>CDS<222>(439)..(1779)<223>hemA<220>
<221>CDS<222>(1794)..(2627)<223>hemX<220>
<221>CDS<222>(2641)..(3570)<223>hemC<220>
<221>CDS<222>(3573)..(4346)<223>hemD<220>
<221>CDS<222>(4364)..(5344)<223>hemB<220>
<221>CDS<222>(5361)..(6650)<223>hemL<400>1caggccacgt gtataccttt gctgcaatgc tcatatgtag ttcattcagt aaaaaaaaga 60ttccaaatcc aactagtaag acaccaaaaa acattgattg ctttttcata gtaacctcca 120ggtgtttcaa aacagaaaac gtgataaaac gctgcttttt tgatacaatt tattacggaa 180taacagttaa tatcttaaca catgttttca aagactgttc acattttttt ttcgaatgac 240ttatagaaca tgttataata gttagagata aggcgaagct tacacctgtg taatgtacgc 300
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475 480 485tgg tta ctt tct att gtg tgg gtt ttg caa aca gcc ttt tta att tta1961Trp Leu Leu Ser Ile Val Trp Val Leu Gln Thr Ala Phe Leu Ile Leu490 495 500cga atg ttt gag acg gga agg ttt cct att ctt acc gtt tct gaa ggg2009Arg Met Phe Glu Thr Gly Arg Phe Pro Ile Leu Thr Val Ser Glu Gly505 510 515ctg tat ttt tac gcg tgg gtg tta att act ctt tca ctt gtg att aat2057Leu Tyr Phe Tyr Ala Trp Val Leu Ile Thr Leu Ser Leu Val Ile Asn520 525 530 535cgc ctg ttc cgc gtt gat ttt atg gtg ttt ttt aca aat gtg att ggt2105Arg Leu Phe Arg Val Asp Phe Met Val Phe Phe Thr Asn Val Ile Gly540 545 550ttc tta att atg gct att cat acg ttt gct cca ctt gaa aca tac act2153Phe Leu Ile Met Ala Ile His Thr Phe Ala Pro Leu Glu Thr Tyr Thr555 560 565gct gtc cag tcg gag cgc ctt gtg tca gaa tta tta atc atc cat att2201Ala Val Gln Ser Glu Arg Leu Val Ser Glu Leu Leu Ile Ile His Ile570 575 580acc atg gct att tta tct tac ggc gct ttt tca gtc tct ttt gtt ttt2249Thr Met Ala Ile Leu Ser Tyr Gly Ala Phe Ser Val Ser Phe Val Phe585 590 595tcc gct ctg tat ctt gtt cag tat aat tta ttg aaa aag aag aaa tgg2297Ser Ala Leu Tyr Leu Val Gln Tyr Asn Leu Leu Lys Lys Lys Lys Trp600 605 610 615ggc aag cgc ttg cta aga att gaa gat tta aca aag cta gat tac atg2345Gly Lys Arg Leu Leu Arg Ile Glu Asp Leu Thr Lys Leu Asp Tyr Met620 625 630tcc tat gta tta att tta att ggt gta ccg ctg tta ttg ctt tcg tta2393Ser Tyr Val Leu Ile Leu Ile Gly Val Pro Leu Leu Leu Leu Ser Leu635 640 645atc tta gga atc ata tgg gct tat atc aaa tac gta gat ttt cat tgg2441Ile Leu Gly Ile Ile Trp Ala Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Phe His Trp650 655 660tac gat aca aaa gtg tta ggt tca ttt tta atg ttt gtt gca tac agc2489Tyr Asp Thr Lys Val Leu Gly Ser Phe Leu Met Phe Val Ala Tyr Ser665 670 675gct tac ttg tat gct aga ctg cgt aga ggt att caa gga aag gca atc2537Ala Tyr Leu Tyr Ala Arg Leu Arg Arg Gly Ile Gln Gly Lys Ala Ile680 685 690 695gcg atg tgg aat att gga ttg ttt tta gtc tta ctt att aat ttc ttt2585ALa Met Trp Asn Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Phe700 705 710tta ttt ggc agt tta tcg aac ttt cac ttt tgg ggt tcg taa2627Leu Phe Gly Ser Leu Ser Asn Phe His Phe Trp Gly Ser715 720 725ttaggaggac aac atg cga aaa att att gtc ggc tct cgt cga agc aaa 2676
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1.使用包含巨大芽孢桿菌的培養(yǎng)物制備維生素B12的方法，其特征在于在厭氧條件下進(jìn)行發(fā)酵。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于巨大芽孢桿菌首先在需氧條件下發(fā)酵，然后在厭氧條件下發(fā)酵。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于從需氧發(fā)酵到厭氧發(fā)酵的轉(zhuǎn)變發(fā)生在需氧發(fā)酵細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)期。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于從需氧發(fā)酵到厭氧發(fā)酵的轉(zhuǎn)變發(fā)生在需氧生長(zhǎng)細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)期的中期或末期，優(yōu)選地在末期。
5.如權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于向培養(yǎng)基中至少添加鈷。
6.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于發(fā)酵其中hemAXCDBL操縱子或其部分顯示表達(dá)增強(qiáng)的巨大芽孢桿菌菌株。
7.如權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于發(fā)酵其細(xì)胞中hemAXCDBL操縱子以增加的拷貝數(shù)存在的巨大芽孢桿菌菌株。
8.編碼如SEQ ID No.2-6所示的參與尿卟啉原III生物合成的酶或它們的同工型的分離的核苷酸序列或它們的等位基因，所述分離的核苷酸序列被組織在hemAXCDBL操縱子中，所述操縱子具有示于SEQ ID No.1中的核苷酸序列。
9.基因結(jié)構(gòu)，其包含如權(quán)利要求8所述的分離的核苷酸序列或其部分并包含與其可操作連接的且具有調(diào)節(jié)功能的核苷酸序列。
10.載體，其包含如權(quán)利要求8所述的分離的核苷酸序列或其部分或包含如權(quán)利要求9所述的基因結(jié)構(gòu)，并包含用于選擇、在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和/或整合入宿主細(xì)胞基因組的額外的核苷酸序列。
11.如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述用于維生素B12生產(chǎn)的方法中的經(jīng)轉(zhuǎn)化巨大芽孢桿菌菌株，其特征在于它表現(xiàn)出如權(quán)利要求8所述核苷酸序列或其部分的表達(dá)增強(qiáng)和/或拷貝數(shù)增加。
12.如權(quán)利要求11所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化巨大芽孢桿菌菌株，其特征在于它包含了以復(fù)制型存在的如權(quán)利要求9所述的基因結(jié)構(gòu)或如權(quán)利要求10所述的載體。
13.如權(quán)利要求8所述的分離的核苷酸序列或其部分或如權(quán)利要求9所述的基因結(jié)構(gòu)或如權(quán)利要求10所述的載體的用途，用于產(chǎn)生如權(quán)利要求11或12所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化巨大芽孢桿菌菌株。
14.如權(quán)利要求11或12所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化巨大芽孢桿菌菌株的用途，用于產(chǎn)生維生素B12。
全文摘要
本發(fā)明涉及用巨大芽孢桿菌制備維生素B12的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1636066SQ02816345
公開(kāi)日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2002年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月22日
發(fā)明者A·金克爾, J－H·馬騰斯, D·耶恩, H·巴爾格, M·瓦倫 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司