專利名稱：用熒光蛋白作為標(biāo)記物使感染成像的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物和病毒感染的研究。具體地，本發(fā)明涉及用于研究脊椎動(dòng)物體內(nèi)感染的進(jìn)程和控制系統(tǒng)，以及用于評(píng)價(jià)候選藥物和靶定腫瘤的方法。
背景技術(shù)：
目前，綠色熒光蛋白在顯現(xiàn)癌癥進(jìn)程和轉(zhuǎn)移中的用途已經(jīng)確定下來。見報(bào)道如，Hoffman，R.M.，Methods in Enzymology(1999)30220-31(P.Michael Conn，ed.，Academic Press，San Diego)。整體成像(whole body imaging)在繪制實(shí)時(shí)進(jìn)程和評(píng)估腫瘤治療的建議方案的功效中的用途，已公布于美國(guó)專利6,251,384，其中的內(nèi)容插入在這里作參考。
綠色熒光蛋白的優(yōu)勢(shì)在于，它不需要任何底物或輔因子，而且其在活細(xì)胞中的表達(dá)不會(huì)明顯造成任何生物學(xué)損害。另外，發(fā)射的熒光使其成為一種特別敏感的技術(shù)。確實(shí)，完整的身體圖像可以使用簡(jiǎn)單的設(shè)備，例如從氙或汞燈激發(fā)490nm光，并用CCD彩色錄像機(jī)捕捉圖像，看獲得完整體像，這樣就能夠?qū)崟r(shí)研究腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。見報(bào)道如，Yang，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)971206-1211。
本發(fā)明將在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移成像中發(fā)展起來的技術(shù)擴(kuò)展到感染研究中。微生物和病毒感染能夠通過用一種明亮的熒光蛋白標(biāo)記感染因子來監(jiān)測(cè)，而且感染的進(jìn)程也可以監(jiān)測(cè)。另外，用于處理微生物或病毒感染的方案可以利用此技術(shù)來評(píng)估。用于獲得適宜的熒光蛋白表達(dá)的原料和方法很容易得到。例如，Cheng，L.等在Gene Therapy(1997)41013-1022中，描述了用一種反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子控制下的綠色熒光蛋白(GFP)編碼序列修飾造血干細(xì)胞的方法。盡管作者聲明用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)染人干細(xì)胞有困難，但利用GFP的一種增強(qiáng)形式，可以得到滿意的亮度。Grignani，F(xiàn).等人在Cancer Res(1998)5814-19中，報(bào)道了利用一種表達(dá)GFP的雜合型EBV/反轉(zhuǎn)錄病毒載體，將基因高效轉(zhuǎn)移到人造血始祖細(xì)胞中。
包含GFP的不同修飾形式、能產(chǎn)生不同顏色的載體已由Clontech出售。用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的Clontech載體，將GFP置于巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制下，這種表達(dá)系統(tǒng)也可用于標(biāo)記病毒感染因子。
已有人嘗試?yán)脽晒馑孛缸鳛闃?biāo)記物觀察哺乳動(dòng)物受試者體內(nèi)的細(xì)菌，但由于這一系統(tǒng)的發(fā)光度低，不能實(shí)施整體成像。見報(bào)道如，Contag，P.R.等，Nat.Med.(1998)4245-247。
表達(dá)GFP的細(xì)菌之前已在很多研究中使用過，但都不是在完好的活體動(dòng)物中(Wu，H.等，微生物學(xué)(2000)1462481-2493；Ling，S.H.M.等，微生物學(xué)(2000)1467-19；Badger，J.L等，分子微生物學(xué)(2000)36(1)174-182；Kohler，R.等，Mol.Gen.Genet.(2000)2621060-1069；Valdivia，R.H.等，基因(1996)17347-52；Valdivia，R.H.等，科學(xué)(1997)2772007-2011；Scott，K.P.，等，F(xiàn)EMS Microbiol.Ltrs.(2000)18223-27；Prachaiyo，P.等，食物保護(hù)雜志(2000)63427-433；Geoffroy，M-C.，應(yīng)用和環(huán)境微生物(2000)66383-391)。此類研究中的一個(gè)實(shí)例是觀察致病性大腸桿菌O157H GFP對(duì)肌肉組織的體外感染(Prachaiyo，P.等，如上述)。另一種方法通過取出并固定胃腸道組織，來檢測(cè)經(jīng)灌胃(gavage)感染后的小鼠胃腸道(Geoffroy，M-C.，如上述)。用GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)感染的魚，在取出它的器官后對(duì)感染進(jìn)行成像(Ling，S.H.M.等，如上述)。與毒力及其它感染過程相關(guān)的基因通過與GFP表達(dá)連鎖來評(píng)價(jià)(Ling，S.H.M.等，如上述；Badger，J.L.等，如上述；Kohler，R.等，如上述；Valdivia，R.H.等，如上述(1996)。
本發(fā)明還可擴(kuò)展至，利用熒光、經(jīng)由微生物等感染因子靶定腫瘤，以使治療劑運(yùn)送到那里。已有人嘗試將諾氏梭菌(Clostridia novyi)運(yùn)送至腫瘤壞死區(qū)域(Dang，L.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001)9815155-15160)。另外，有人用長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)來靶定腫瘤壞死區(qū)域(Yazawa，K.等，癌癥基因治療(2000)7(2)269-274和Yazawa，K.等，乳腺癌研究和治療(2001)66165-170)。這些方法依賴于anarobes，且僅靶定壞死組織和/或僅用于大型腫瘤。此外，有人用喪失毒素的沙門氏菌(Salmonella)靶定腫瘤(Low，K.B.等，自然生物技術(shù)(1999)1737-41)。另有研究報(bào)道了在患轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和腎細(xì)胞癌的病人體內(nèi)沙門氏菌的腫瘤靶定能力(Toso，J.F.等，臨床癌癥雜志(2002)20(1)142-152)。這些方法沒有提供在活動(dòng)物體內(nèi)觀察細(xì)菌的手段。
細(xì)菌和其它微生物有很多能將治療劑運(yùn)送至腫瘤的特性。例如他們可以很容易經(jīng)轉(zhuǎn)化來生產(chǎn)人類蛋白和特定的細(xì)菌蛋白。但是，細(xì)菌蛋白包括很多種強(qiáng)效毒素。為了利用如此強(qiáng)有力的分子，具有本發(fā)明所示運(yùn)送治療劑的細(xì)菌的精確腫瘤靶定機(jī)制是很有用的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了多種模型，它們能夠在現(xiàn)實(shí)而實(shí)時(shí)的環(huán)境中細(xì)致研究微生物或病毒感染的形成。通過采用熒光蛋白，諸如綠色熒光蛋白(GFP)作為穩(wěn)定且易用的觀測(cè)標(biāo)記，可模擬感染的進(jìn)程并闡明其機(jī)制。本發(fā)明還在一定程度上涉及腫瘤靶定，它取決于觀測(cè)細(xì)菌或微生物及其治療分子的能力。
因此，一方面本發(fā)明涉及在脊椎動(dòng)物模型系統(tǒng)中監(jiān)測(cè)感染過程的方法，該方法是檢測(cè)熒光在該脊椎動(dòng)物受試者中的空間和時(shí)間變化過程，其中所述受試者被微生物或病毒感染，該微生物或病毒表達(dá)熒光蛋白。
另一方面，本發(fā)明涉及在受試者中評(píng)價(jià)用于抑制感染的候選方案或藥物的方法，該方法包括將該方案或藥物施與被表達(dá)熒光蛋白的微生物或病毒感染的脊椎動(dòng)物受試者，通過觀察在受感染的受試者不同部位、不同時(shí)間熒光的有無或強(qiáng)弱，監(jiān)測(cè)感染隨著時(shí)間和空間的變化過程。此外，在該方法中，還要監(jiān)測(cè)不同時(shí)間里在對(duì)照受試者不同部位熒光的有無或強(qiáng)弱，以便使其與經(jīng)該方案或藥物處理過的受試者進(jìn)行比較。將經(jīng)處理的受試者中隨時(shí)空變化的感染過程與對(duì)照受試者中的相比，在處理過的受試者中感染強(qiáng)度與對(duì)照相比有所減弱，可因此鑒定出一個(gè)成功的方案或藥物。
在又一個(gè)方面，本發(fā)明是指一種在脊椎動(dòng)物受試者中用治療性感染因子靶定腫瘤的方法，包括將表達(dá)熒光蛋白的感染因子施與脊椎動(dòng)物受試者，觀察該受試者不同部位熒光的有無或強(qiáng)弱相對(duì)于時(shí)間的函數(shù)變化。優(yōu)選所述治療性感染因子靶定腫瘤并將治療產(chǎn)物運(yùn)送到腫瘤。
本發(fā)明的方法也可以用于監(jiān)測(cè)那些在感染過程中起重要作用的微生物或病毒系統(tǒng)的特性，具體是通過將編碼熒光蛋白的核苷酸序列連接在微生物或病毒基因組的不同位置，通過監(jiān)測(cè)熒光來監(jiān)測(cè)熒光蛋白的表達(dá)。
最后，本發(fā)明涉及表達(dá)熒光蛋白并靶定腫瘤的感染因子，其能夠在完好的哺乳動(dòng)物活體中靶定腫瘤，而不是正常細(xì)胞。


圖1A-1H顯示在經(jīng)灌胃(gavage)感染1011大腸桿菌-GFP的小鼠不同部位的熒光分布。圖1A顯示了在剛剛灌胃之后，胃部出現(xiàn)的感染跡象。圖1B-1G分別顯示了在灌胃10、20、30、40、50和60分鐘后小腸中出現(xiàn)的熒光。圖1H顯示在灌胃120分鐘后，結(jié)腸中出現(xiàn)的熒光。
圖2A-2C顯示在用1011大腸桿菌-GFP灌胃后，大腸桿菌的活體成像(intravital imaging)結(jié)果。如圖2A所示，剛剛灌胃之后，GFP感染立刻出現(xiàn)在胃部和十二指腸；圖2B顯示在灌胃40分鐘后感染出現(xiàn)在小腸；圖2C顯示在灌胃120分鐘后，感染出現(xiàn)在結(jié)腸。
圖3A-3B顯示灌胃后胃、小腸和結(jié)腸感染的整體成像以及活體成像。圖3A顯示在用3×1011大腸桿菌-GFP等分樣品多次灌胃后，在胃(箭頭)、小腸(細(xì)箭頭)和結(jié)腸(粗箭頭)中的整體圖像。圖3B顯示經(jīng)類似標(biāo)記后相應(yīng)的活體成像。
圖4顯示剛剛用1011大腸桿菌-GFP灌腸后，結(jié)腸感染的整體成像結(jié)果。
圖5A-5D顯示抗生素應(yīng)答中腹膜腔感染的整體成像結(jié)果。圖5A和5C顯示在剛剛腹膜內(nèi)(i.p.)注射109大腸桿菌-GFP后，腹腔中的感染。圖5B顯示在注射后6小時(shí)后的一只未經(jīng)處理的小鼠；該動(dòng)物在6小時(shí)后死亡。圖5D顯示在i.p.注射6小時(shí)后的一只經(jīng)卡那霉素處理過的小鼠，該動(dòng)物存活。
圖6顯示如圖5中描述的腹膜內(nèi)感染的活體成像結(jié)果。
圖7A顯示生長(zhǎng)在裸鼠中的、經(jīng)RFP標(biāo)記的U-87人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的整體成像。圖7B顯示在熒光導(dǎo)向下注射含有GFP標(biāo)記的沙門氏菌的PBS溶液。圖7C顯示剛剛注射之后，GFP標(biāo)記的沙門氏菌在RFP標(biāo)記的U-87人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的整體成像。圖7D顯示在注射1天后，生長(zhǎng)在RFP標(biāo)記的U-87人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的GFP標(biāo)記的沙門氏菌。
圖8A顯示在裸鼠中(小鼠1)，RFP標(biāo)記的DU-145人前列腺腫瘤的整體成像。圖8B顯示在剛剛注射后，注射到小鼠1腫瘤中的GFP標(biāo)記的沙門氏菌。圖8C顯示在裸鼠(小鼠2)中RFP標(biāo)記的DU-145人前列腺腫瘤的整體成像。圖8D顯示將GFP標(biāo)記的沙門氏菌注射到RFP標(biāo)記的DU-145人前列腺腫瘤中的結(jié)果，該腫瘤在注射小鼠2后馬上進(jìn)行成像。
圖9A顯示生長(zhǎng)在裸鼠中的、經(jīng)RFP標(biāo)記的MDA MB-435人乳房腫瘤的整體成像。圖9B顯示GFP標(biāo)記的沙門氏菌在被注入腫瘤后立即進(jìn)行的整體成像。
圖10A顯示裸鼠中GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤的整體成像。圖10B顯示將RFP標(biāo)記的沙門氏菌注入所述腫瘤后立即進(jìn)行的成像。圖10C顯示GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤在注射RFP標(biāo)記的沙門氏菌的一天后的整體成像。
圖11A顯示裸鼠中GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤的整體成像。圖11B顯示將RFP標(biāo)記的沙門氏菌注入GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤后立即進(jìn)行的成像。圖11C顯示GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤在注射RFP標(biāo)記的沙門氏菌的一天后的整體成像。圖11D顯示GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤在注射RFP標(biāo)記的沙門氏菌的4天后的整體成像。
圖12A顯示裸鼠中GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤的整體成像。圖12B顯示將RFP標(biāo)記的沙門氏菌注入GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤后立即進(jìn)行的成像。圖12C顯示GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤在注射RFP標(biāo)記的沙門氏菌的一天后的整體成像。圖12D顯示GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤在注射RFP標(biāo)記的沙門氏菌的4天后的整體成像。
圖13顯示，經(jīng)組織學(xué)證實(shí)的、RFP標(biāo)記的沙門氏菌靶定裸鼠體內(nèi)GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤，并在該腫瘤中進(jìn)行性生長(zhǎng)。RFP標(biāo)記的沙門氏菌注射到GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤中的4天后，繼續(xù)生長(zhǎng)(圖12D)。
圖14A-14B顯示，經(jīng)組織學(xué)證實(shí)的、RFP標(biāo)記的沙門氏菌對(duì)裸鼠體內(nèi)正在生長(zhǎng)的PC-3人前列腺腫瘤的處理效果。圖14A是未經(jīng)處理的對(duì)照。圖14B是用RFP標(biāo)記的沙門氏菌進(jìn)行的處理。
施行本發(fā)明的模式 本發(fā)明提供了用于研究感染機(jī)制的模型系統(tǒng)。利用可視標(biāo)記物熒光蛋白標(biāo)記感染因子，以便隨著感染的進(jìn)程，可以跟蹤它們?cè)诮M織中的遷移和定居。
這里使用的“感染進(jìn)程”是指感染因子和感染細(xì)胞在感染機(jī)體中遷移和/或增殖的一般性、時(shí)間依賴性方式。感染進(jìn)程可以僅僅是感染因子或感染細(xì)胞的位置的函數(shù)，但通常也是感染因子和感染細(xì)胞的增殖的函數(shù)。因此，熒光的位置和強(qiáng)度在監(jiān)測(cè)進(jìn)程中都是重要的。
由于在完好動(dòng)物體內(nèi)可以得到足夠的強(qiáng)度來觀察熒光細(xì)胞遷移，因此除了取出器官或組織確定感染因子的遷移以外，如果需要，可以在完好的受試者中觀測(cè)轉(zhuǎn)移進(jìn)程。這兩種方法之一或全部都可用于觀察感染進(jìn)程，并在模型體系中評(píng)價(jià)潛在的方案和藥物的功效。
此外，本發(fā)明利用了通過感染因子向腫瘤運(yùn)送治療劑的優(yōu)勢(shì)，并提供了一種精確的腫瘤靶定機(jī)制。在腫瘤靶定中能夠觀察感染因子和治療分子是有益的。經(jīng)熒光引導(dǎo)注射腫瘤的一些優(yōu)點(diǎn)是，對(duì)所處理的腫瘤的大小沒有最低限制，而且，本方法不依賴于腫瘤的壞死。此外，感染因子不限于厭氧菌(anaerobes)以及感染因子的無毒株。這里使用的“治療劑”、“治療分子”、或“治療產(chǎn)物”是指包含在感染因子中的所需基因，或是感染因子的分泌產(chǎn)物，例如毒素或其它治療性蛋白，或雖不是感染因子的分泌物但被其用于對(duì)腫瘤施加治療作用的產(chǎn)物。所需基因是指對(duì)腫瘤有治療作用的任何基因，如表達(dá)抗瘤因子的基因。治療分子的實(shí)例如美國(guó)專利6,231,854公開的表達(dá)甲硫氨酸酶的基因或甲硫氨酸酶本身。其它實(shí)例包括p53、BAX、毒素、腫瘤壞死因子(TNF)、TNF相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)性配體，F(xiàn)as配體以及抗死亡受體的抗體等。
在本發(fā)明的各個(gè)方面使用的標(biāo)記物是一種熒光蛋白。編碼這一類中的基本蛋白(seminal protein)即綠色熒光蛋白(GFP)的天然(native)基因，已從生物發(fā)光水母維多利亞發(fā)光水母(Aquorea Victoria)中克隆出來(Morin，J.等，細(xì)胞生理學(xué)雜志(1972)77313-318)。有了該基因，就有可能用GFP作為基因表達(dá)的標(biāo)記。最初的GFP本身是具有283個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其分子量為27kD。在產(chǎn)生熒光時(shí)，該蛋白既不需要其它來自其天然來源的蛋白，也不需要僅在其天然來源中才有的底物或輔因子(Prasher，D.C.等，基因(1992)111229-233；Yang，F(xiàn).等，自然生物技術(shù)(1996)141252-1256；Cody，C.W.等，Biochemistry(1993)321212-1218.)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)最初的GFP基因突變體可用于增強(qiáng)表達(dá)、改變激發(fā)和熒光，由此獲得了包括紅、藍(lán)等多種顏色的“GFP”。GFP-S65T(其中第65位的絲氨酸被蘇氨酸代替)在本發(fā)明方法中尤其有用，其在490nm處有單一激發(fā)峰(Heim，R.等，自然(1995)373663-664)；美國(guó)專利5,625,048。其它突變體公開在，Delagrade，S等，生物技術(shù)(1995)13151-154；Cormack，B.等，基因(1996)17333-38以及Cramer，A.等，自然生物技術(shù)(1996)14315-319。另一些突變體公開在美國(guó)專利5,625,048中。通過適當(dāng)?shù)男揎?，GFP發(fā)射的光譜可以改變。因此，雖然術(shù)語(yǔ)“GFP”在本申請(qǐng)中頻繁使用，但該定義中包含的蛋白在觀察時(shí)不一定是綠的。GFP的多種形式表現(xiàn)出除了綠色以外的顏色，而它們也包括在“GFP”的定義中，并可用于本發(fā)明的方法和材料中。另外，還要注意，落在此處“GFP”定義中的綠色熒光蛋白，已從其它生物中分離得到的，如海生三色堇(sea pansy)，腎海鰓(Renillareniformis)。任何適當(dāng)?shù)暮捅憷腉FP形式都可以用于修飾本發(fā)明中采用的感染因子，天然的和突變的形式均可。
為了避免混淆，將使用簡(jiǎn)單的術(shù)語(yǔ)“熒光蛋白”；一般來講，該術(shù)語(yǔ)是指，由各種生物，如腎海鰓(Renilla)和發(fā)光水母(Aequorea)等產(chǎn)生的熒光蛋白，以及這些天然熒光蛋白的能產(chǎn)生各色可見光的修飾形式，如紅色、黃色以及深藍(lán)色等，它們分別是由紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)或深藍(lán)色熒光蛋白(CFP)等展現(xiàn)出來的。一般來說，“熒光蛋白”和“GFP”或“RFP”等術(shù)語(yǔ)是可交替使用的。
因?yàn)橛懈鞣N顏色的熒光蛋白，故可以同時(shí)使用一種以上的顏色來成像。例如，可以將各自表現(xiàn)一種特征性熒光的兩種或三種不同感染因子施用于生物，從而評(píng)價(jià)多個(gè)處理方案的不同效果。另外，單個(gè)感染性生物可以用單一色和另一種不同顏色進(jìn)行組成型標(biāo)記，后者用于與細(xì)胞內(nèi)的或分泌型的基因產(chǎn)物形成融合體。因此，可以將編碼熒光蛋白的核苷酸序列插入待查座位或是在載體中與待查蛋白形成融合蛋白，所述熒光蛋白的顏色不同于用來標(biāo)記生物本身的熒光蛋白。另一個(gè)例子是，通常將毒素和其它潛在的治療性蛋白與RFP相連，以便標(biāo)記并顯現(xiàn)GFP標(biāo)記細(xì)菌的治療性產(chǎn)物，反之亦然。雙色成像可用于觀察細(xì)菌對(duì)腫瘤的靶定以及它們分泌的治療性產(chǎn)物。這些靶定腫瘤的細(xì)菌經(jīng)過適應(yīng)可以在腫瘤中選擇性生長(zhǎng)，通過它們的熒光可以進(jìn)行觀察。再者，可以使一或多個(gè)感染因子各自帶上單色標(biāo)記，將所需基因用另一種顏色標(biāo)記，而腫瘤用第三種顏色標(biāo)記。例如，實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中表達(dá)熒光的腫瘤，使得能夠通過整體成像，觀察熒光標(biāo)記感染因子的腫瘤靶定，以及感染因子的治療性產(chǎn)物。
如這里所例舉的，GFP和RFP標(biāo)記的細(xì)菌通過熒光導(dǎo)向的注射，運(yùn)送進(jìn)裸鼠中定植的被GFP和RFP標(biāo)記的腫瘤，繼而所述細(xì)菌被靶定至GFP標(biāo)記的腫瘤，在那里誘導(dǎo)腫瘤的壞死。特別是，用GFP和RFP標(biāo)記的大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌對(duì)小鼠中表達(dá)RFP和GFP的腫瘤的靶定，可以通過雙色整體成像觀察。在本文實(shí)施例中，生長(zhǎng)在已靶定的RFP和RFP標(biāo)記腫瘤中的GFP和RFP標(biāo)記細(xì)菌，通過雙色整體成像顯現(xiàn)出來。這樣，熒光標(biāo)記細(xì)菌的腫瘤靶定已經(jīng)得以展示。而本發(fā)明的方法還可以用于監(jiān)測(cè)感染因子的錯(cuò)誤靶定，從而最終選擇出能夠靶定腫瘤的細(xì)菌。
通常用GFP標(biāo)記細(xì)胞的技術(shù)公布于U.S.5,491,084(前已述及)。
本發(fā)明的方法使用了經(jīng)修飾能夠表達(dá)編碼熒光蛋白的核苷酸序列的感染因子，所述蛋白優(yōu)選具有足夠熒光強(qiáng)度，使其不需要任何侵入性技術(shù)就可以在受試者中展現(xiàn)。整體成像因能進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察而為優(yōu)選，但可以使用，例如，內(nèi)窺鏡技術(shù)，或者在需要時(shí)，取出組織或器官進(jìn)行直接觀察或組織化學(xué)觀察。
可以將編碼熒光蛋白的核苷酸序列通過直接修飾導(dǎo)入感染因子中，或者可以利用適宜的表達(dá)載體導(dǎo)入微生物系統(tǒng)中，所述直接修飾例如，修飾病毒基因組，使熒光蛋白編碼序列位于該病毒內(nèi)源性控制序列之后的適當(dāng)位點(diǎn)。感染因子可以是細(xì)菌、真核生物如酵母、原生動(dòng)物如瘧原蟲，或病毒。適合于特定類型的細(xì)菌、原生動(dòng)物和真核微生物系統(tǒng)的多種表達(dá)載體在本領(lǐng)域中眾所周知。很多可以在這些系統(tǒng)中操作的控制序列目前已經(jīng)很清楚了。因此，感染因子經(jīng)過最初的修飾能在組成型啟動(dòng)子控制下表達(dá)熒光蛋白，并將這作為細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的一個(gè)穩(wěn)定特征，或者可以將其置于微生物或病毒基因組中的具體目標(biāo)位置，代替可能涉及毒力或感染進(jìn)程的內(nèi)源序列，從而研究這些內(nèi)源基因表達(dá)的時(shí)間和空間參數(shù)特征。因此，有可能通過適當(dāng)選擇放置位點(diǎn)，來探究該微生物或病毒中引起感染效力的內(nèi)源性因素的類型。類似地，也可以將表達(dá)熒光蛋白的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中，從而使實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物包含有可以被顯示出來的腫瘤。另一種制備熒光性腫瘤的方法是通過光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)，在該法中腫瘤吸收發(fā)熒光的因子，諸如經(jīng)臨床認(rèn)可的因子，例如血卟啉。
然后將適當(dāng)修飾的感染因子施用于受試者，所采用的施用方式，必要時(shí)，可以模擬據(jù)信為該因子所采用的感染途徑或任意途徑。施用方式可以是注射、灌胃、口服、經(jīng)氣霧劑施用到呼吸系統(tǒng)中、栓劑、與粘膜表面接觸、或本領(lǐng)域已知能導(dǎo)入感染因子的任何方式。在對(duì)表達(dá)熒光蛋白的腫瘤進(jìn)行靶定的過程中，可以通過熒光導(dǎo)向的注射來給藥。與用熒光研究腫瘤轉(zhuǎn)移的情況不同，受試者不必是免疫低下的，因?yàn)樵诰哂型旰妹庖呦到y(tǒng)的生物中感染是很容易發(fā)生的。但是，在研究病情進(jìn)展時(shí)，免疫低下的受試者可能也是有用的。
盡管可以采用內(nèi)窺鏡檢查法以及取出單個(gè)組織的方法，但通過熒光光學(xué)腫瘤成像(FOTI)來顯現(xiàn)感染因子和被感染的細(xì)胞在完好動(dòng)物中的遷移仍是特別方便的。這允許持續(xù)地實(shí)時(shí)觀察和監(jiān)測(cè)感染過程，尤其是在模型系統(tǒng)中，在評(píng)價(jià)潛在的抗感染藥物和方法時(shí)。因此，施用候選藥物或方案的試驗(yàn)動(dòng)物，與沒有施用該藥物或方案的對(duì)照相比，直接觀察到感染抑制，可說明該候選物的功效及其治療潛力。在接受抗感染治療的受試者中，F(xiàn)OTI的運(yùn)用使得能夠持續(xù)獲取所設(shè)計(jì)的治療方案的信息，從而為修改或不修改該方案提供建議。一個(gè)具體實(shí)施方案中，為了確定熒光標(biāo)記的細(xì)菌靶定腫瘤的可行性，將GFP標(biāo)記的細(xì)菌注入生長(zhǎng)在裸鼠中的Lewis肺腫瘤中。該腫瘤區(qū)域變成高度熒光化，在配備有CCD相機(jī)和GFP濾片的光箱(light box)中經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后，可以很方便地觀察。
適于用作模型的脊椎動(dòng)物受試者優(yōu)選哺乳動(dòng)物受試者，最優(yōu)選方便的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物如兔子、大鼠、小鼠諸如此類。為了與人類受試者更近似，也可以使用靈長(zhǎng)類。任何適宜的脊椎動(dòng)物受試者都可以使用，這種選擇主要取決于便利性以及與最終目標(biāo)的相似性。最后，該脊椎動(dòng)物受試者可以是人。
優(yōu)選腫瘤靶定細(xì)菌能夠經(jīng)過適應(yīng)而在腫瘤中選擇性生長(zhǎng)，作為腫瘤選擇性基因治療的載體。
下述實(shí)施例目的在于闡明而不是限制本發(fā)明。
預(yù)備A感染因子的修飾 將腎海鰓綠色熒光蛋白的變體(RMV-GFP)(Zhao，M.，Xu，M.，Hoffinan，R.M.，未發(fā)表的數(shù)據(jù))克隆進(jìn)pUC19衍生質(zhì)粒pPD16.38(Clontech，Palo Alto，CA)的BamHI和NotI位點(diǎn)，其中GFP在lac啟動(dòng)子控制下表達(dá)。該載體命名為pRMV-GFP。將pRMV-GFP通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM 109感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene，San Diego，CA)中，然后在瓊脂平板上利用氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。高表達(dá)的大腸桿菌-GFP克隆通過熒光顯微鏡來篩選。
大腸桿菌也用RFP來標(biāo)記，另外，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)用GFP和RFP來標(biāo)記。
實(shí)施例1灌胃法感染小鼠 4周齡、雌性Nu/nu/CD-1小鼠，用20號(hào)barrel tip飼喂針(FineScience ToolsInc.，F(xiàn)oster City，CA)以及不含乳膠的注射器(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)，灌胃0.5ml大腸桿菌-GFP懸液(5×1010/ml)。
灌胃之后，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠進(jìn)行成像。成像在一個(gè)被藍(lán)色光纖燈照亮的光箱(Lightools Research，Inc.，Encinitas，CA)中完成。圖像用Hamamatsu C5810 3-chip cooled彩色CCD照相機(jī)(Hamamatsu PhotonicsSystems，Bridgewater，NJ)來捕捉。1024×724像素的圖像直接在捕捉在IBMPC上，或者通過視頻信號(hào)連續(xù)地輸出到高分辨率Sony VCR SLV-1000(SonyCorp.，Tokyo，Japan)上。圖像經(jīng)對(duì)比度和亮度處理，然后用Image Pro Plus 3.1軟件(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)進(jìn)行分析。
大腸桿菌-GFP通過灌胃法導(dǎo)入小鼠胃腸道后，幾乎馬上就可以在胃部整體成像中顯現(xiàn)出來(圖1A)。在灌胃后的10分鐘內(nèi)，胃排空，而大腸桿菌-GFP接著出現(xiàn)在小腸中(圖1B-G)。小腸中的細(xì)菌數(shù)量在灌胃的40分鐘后出現(xiàn)高峰(圖1E)，120分鐘后消失(圖1G)。120分鐘后，大腸桿菌-GFP出現(xiàn)在結(jié)腸中(圖1H)。
在灌胃后的適當(dāng)時(shí)間，腹腔被打開并用大腸桿菌-GFP熒光進(jìn)行活體成像。如活體成像所見，胃(圖2A)、小腸(圖2B)和結(jié)腸(圖2C)都由大腸桿菌-GFP產(chǎn)生明亮的熒光。用大腸桿菌-GFP多次灌胃，能夠同時(shí)接種胃、小腸和結(jié)腸，從而能進(jìn)行整體成像(圖3A)和活體成像(圖3B)。比較大腸桿菌-GFP在胃、小腸和結(jié)腸中的整體和活體成像，它們顯示出高度一致性。
實(shí)施例2大腸桿菌-GFP導(dǎo)向的結(jié)腸感染 每只小鼠，用20號(hào)barrel tip飼喂針(Fine Science ToolsInc.，F(xiàn)osterCity，CA)以及不含乳膠的注射器(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)，灌腸給藥1.5ml含3×1010大腸桿菌-GFP的溶液到結(jié)腸直接。用實(shí)施例1中的技術(shù)對(duì)這些小鼠成像。結(jié)果見圖4。
實(shí)施例3大腸桿菌-GFP的腹腔感染以及抗生素應(yīng)答 用1ml 29G1無乳膠注射器(Becton Dickinson)給每組小鼠腹腔(i.p.)注射109-1010大腸桿菌-GFP。在剛剛注射以后，通過外部整體成像看到熒光細(xì)菌分布于注射位點(diǎn)周圍(圖5A，C)。六小時(shí)后，可看到大腸桿菌-GFP蔓延遍及腹膜(圖5B)，伴隨著動(dòng)物的死亡。在第6小時(shí)，對(duì)開放的腹膜腔進(jìn)行大腸桿菌-GFP活體成像(圖6)，顯示出與外部整體成像相似的細(xì)菌分布。
另一組腹膜內(nèi)感染的動(dòng)物在接種后用2mg 100μl卡那霉素處理。對(duì)照組的感染小鼠i.p.注射100μl PBS而不是抗生素。接受處理的小鼠的整體成像顯示，在接下來6小時(shí)內(nèi)細(xì)菌數(shù)量明顯減少(圖5C，D)。
實(shí)施例4用整體成像靶定腦癌 將含有1×108個(gè)帶有GFP標(biāo)記的鼠傷寒沙門氏菌的PBS溶液(10μl)，采用熒光導(dǎo)向注射(圖7B)方式注入裸鼠中RFP標(biāo)記的U-87人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中(圖7A)。采用與實(shí)施例1中相似的技術(shù)，在注射后立即對(duì)RFP標(biāo)記的U-87人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中GFP標(biāo)記的沙門氏菌成像(圖7C)。注射的一天以后，觀察到生長(zhǎng)在RFP標(biāo)記的U-87人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的GFP標(biāo)記沙門氏菌，其表明GFP標(biāo)記的沙門氏菌定位在腫瘤周圍，且腫瘤的大小減少(圖7D)。
實(shí)施例5用整體成像靶定前列腺腫瘤 在第一個(gè)帶有RFP標(biāo)記的DU-145人前列腺腫瘤的裸鼠中(圖8A)，將l×108GFP標(biāo)記的鼠傷寒沙門氏菌注入該腫瘤，在注射后馬上進(jìn)行整體成像(圖8B)?？梢奊FP標(biāo)記的沙門氏菌定位在該腫瘤周圍(圖8B)。熒光導(dǎo)向注射的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可以使用有毒力的沙門氏菌，且可以靶定任何大小的腫瘤。
在第二個(gè)帶有RFP標(biāo)記的DU-145人前列腺腫瘤的裸鼠中(圖8C)，將含有2×108GFP標(biāo)記鼠傷寒沙門氏菌的溶液注入該腫瘤，在注射后馬上進(jìn)行整體成像?？梢奊FP標(biāo)記的鼠傷寒沙門氏菌定位于該腫瘤(圖8D)。
實(shí)施例6用整體成像靶定乳房腫瘤 將含有2×108GFP標(biāo)記鼠傷寒沙門氏菌的溶液注入生長(zhǎng)在裸鼠中的，RFP標(biāo)記的MDA MB-435人乳房腫瘤中(圖9A)，在注射后馬上用類似于實(shí)施例1中的的技術(shù)成像，結(jié)果顯示圍繞所述腫瘤的定位(圖9B)，且腫瘤大小明顯縮小，說明腫瘤壞死。
實(shí)施例7用整體成像靶定前列腺腫瘤 將含有3×108RFP標(biāo)記鼠傷寒沙門氏菌的溶液注入生長(zhǎng)在裸鼠中的，GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤中(圖10A)，注射后馬上用類似于實(shí)施例1中的的技術(shù)成像(圖10B)。注射的一天以后，觀察RFP標(biāo)記鼠傷寒沙門氏菌在GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤中的生長(zhǎng)(圖10C)，表明RFP標(biāo)記的沙門氏菌在所述腫瘤周圍生長(zhǎng)，而且腫瘤的大小減少。
實(shí)施例8用整體成像靶定前列腺腫瘤 將含有2×108RFP標(biāo)記鼠傷寒沙門氏菌的溶液注入生長(zhǎng)在裸鼠中的，GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤中(圖11A)，注射后馬上用類似于實(shí)施例1中的的技術(shù)成像(圖11B)。注射的一天以后，檢測(cè)到RFP標(biāo)記沙門氏菌，其在GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤中生長(zhǎng)(圖11C)，在注射的4天后，該菌在所述腫瘤中繼續(xù)生長(zhǎng)(圖11D)，并且腫瘤的大小減小。
實(shí)施例9用整體成像靶定前列腺腫瘤 將含有2×108RFP標(biāo)記鼠傷寒沙門氏菌的溶液注入生長(zhǎng)在裸鼠中，GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤中(圖12A)，注射后馬上用類似于實(shí)施例1中的的技術(shù)成像(圖12B)。注射的1天以后，發(fā)現(xiàn)RFP標(biāo)記沙門氏菌在GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤中生長(zhǎng)(圖12C)，在注射的4天后(圖12D)，發(fā)現(xiàn)腫瘤縮小。
注射的4天后，對(duì)生長(zhǎng)在GFP標(biāo)記的PC-3人前列腺腫瘤中的RFP標(biāo)記沙門氏菌(圖12D)進(jìn)行組織學(xué)研究，用10％福爾馬林緩沖液固定所述腫瘤組織、加工成石蠟切片，然后用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行HE染色。RFP標(biāo)記的沙門氏菌(在圖13中用白色箭頭指出的小藍(lán)點(diǎn)，放大400倍)在PC-3腫瘤組織中進(jìn)行性生長(zhǎng)，并且靶定了所述腫瘤細(xì)胞。
對(duì)于未經(jīng)處理的對(duì)照(其表現(xiàn)出生長(zhǎng)在裸鼠中的良好維持的PC-3人前列腺腫瘤結(jié)構(gòu))(圖14A)，以及經(jīng)RFP標(biāo)記沙門氏菌注射處理4天后、生長(zhǎng)在裸鼠中的PC-3人前列腺腫瘤(圖14B)，比較它們的組織學(xué)研究(HE染色，放大200倍)。結(jié)果顯示，腫瘤組織的主要部分已被破壞，而且腫瘤中出現(xiàn)廣泛壞死(圖14B中的箭頭)。
權(quán)利要求
1.一種用于監(jiān)測(cè)脊椎動(dòng)物受試者中感染進(jìn)程的方法，該方法包括觀察該受試者不同部位的熒光的有、無或強(qiáng)度大小，其中所述熒光的有、無或強(qiáng)度大小為時(shí)間的函數(shù)，所述脊椎動(dòng)物受試者已用表達(dá)熒光蛋白的感染因子處理。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該觀察是在完好的受試者中進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢查或熒光光學(xué)腫瘤成像。
3.權(quán)利要求1的方法，其中的熒光蛋白有綠色熒光或紅色熒光。
4.權(quán)利要求1的方法，其中的感染因子是細(xì)菌、原生動(dòng)物或病毒。
5.權(quán)利要求1的方法，其中的感染因子是真核單細(xì)胞生物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中的受試者是哺乳動(dòng)物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中的受試者是小鼠、大鼠或兔子。
8.權(quán)利要求1的方法，其中的受試者是免疫低下的。
9.一種評(píng)價(jià)用于抑制感染的候選方案或藥物的方法，該方法包括將該方案或藥物施用于已被表達(dá)熒光蛋白的感染因子處理過的脊椎動(dòng)物受試者，通過觀察，隨著時(shí)間的改變，在該受試者中不同部位的熒光的有、無或強(qiáng)弱，來監(jiān)測(cè)感染進(jìn)程；在已用表達(dá)熒光蛋白的感染因子進(jìn)行類似處理的對(duì)照受試者中，監(jiān)測(cè)感染隨著時(shí)間改變的進(jìn)程；和將所述經(jīng)處理的受試者的感染進(jìn)程與所述對(duì)照受試者的感染進(jìn)程對(duì)比；所述經(jīng)處理的受試者的感染進(jìn)程比所述對(duì)照受試者的感染進(jìn)程減弱，則表明該方案或藥物可以有效抑制感染。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述監(jiān)測(cè)是在完好受試者中進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢查或熒光光學(xué)腫瘤成像。
11.權(quán)利要求9的方法，其中的感染因子是細(xì)菌、原生動(dòng)物或病毒。
12.權(quán)利要求9的方法，其中的感染因子是真核單細(xì)胞生物。
13.權(quán)利要求9的方法，其中的受試者是哺乳動(dòng)物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中的受試者是小鼠、大鼠或兔子。
15.權(quán)利要求9的方法，其中的受試者是免疫低下的。
16.一種鑒定與感染相關(guān)的基因的方法，該方法包括，觀察該受試者體內(nèi)熒光的有、無或強(qiáng)弱，所述熒光的有、無或強(qiáng)弱是相對(duì)于時(shí)間以及該受試者中的部位的函數(shù)，其中該受試者已被帶有改變的基因組的感染因子感染，其中所述基因組的改變包括用編碼熒光蛋白的核苷酸序列替換需要測(cè)定功能的核苷酸序列。
17.權(quán)利要求16的方法，其中的感染因子是細(xì)菌、原生動(dòng)物或病毒。
18.權(quán)利要求16的方法，其中的感染因子是真核單細(xì)胞生物。
19.權(quán)利要求16的方法，其中的受試者是哺乳動(dòng)物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中的受試者是小鼠、大鼠或兔子。
21.權(quán)利要求16的方法，其中的受試者是免疫低下的。
22.權(quán)利要求16的方法，其中所述觀察是在完好受試者體內(nèi)進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢查或熒光光學(xué)腫瘤成像。
23.一種用治療性感染因子在脊椎動(dòng)物受試者中靶定腫瘤的方法，包括將表達(dá)熒光蛋白的感染因子施用于該攜有腫瘤的脊椎動(dòng)物受試者；和觀察該受試者中熒光的有、無或強(qiáng)弱，所述熒光的有、無或強(qiáng)弱為時(shí)間的函數(shù)。
24.權(quán)利要求23的方法，其中的治療性感染因子向該腫瘤傳送治療產(chǎn)物。
25.權(quán)利要求23的方法，其中的腫瘤顯示與感染因子的顏色不同的熒光顏色。
26.權(quán)利要求24的方法，其中治療性產(chǎn)物顯示與感染因子和腫瘤的顏色不同的熒光顏色。
27.權(quán)利要求23的方法，其中的感染因子是細(xì)菌、原生動(dòng)物或病毒。
28.權(quán)利要求23的方法，其中的感染因子是真核單細(xì)胞生物。
29.權(quán)利要求23的方法，其中的受試者是哺乳動(dòng)物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中的受試者是小鼠、大鼠或兔子。
31.權(quán)利要求23的方法，其中的受試者是免疫低下的。
32.權(quán)利要求23的方法，其中所述觀察是在完好受試者體內(nèi)進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢查或熒光光學(xué)腫瘤成像。
33.權(quán)利要求23的方法，其中誘導(dǎo)了腫瘤壞死。
34.一種腫瘤靶定感染因子，含有表達(dá)熒光蛋白的感染因子，這種感染因子能在完好的哺乳動(dòng)物活體內(nèi)優(yōu)先靶定腫瘤而不是正常細(xì)胞。
35.權(quán)利要求34的腫瘤靶定感染因子，其中的感染因子含有或分泌治療性分子或含有目的基因。
全文摘要
一種利用經(jīng)修飾可表達(dá)熒光蛋白的感染因子，來跟蹤脊椎動(dòng)物受試者中的感染進(jìn)程的方法。該方法也可以監(jiān)測(cè)在感染期間與感染因子相關(guān)的基因的表達(dá)。該方法還可包括用所述經(jīng)過修飾的感染因子來靶定腫瘤。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1738649SQ02817626
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2002年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月9日
發(fā)明者趙明, 楊萌, 徐明旭 申請(qǐng)人:抗癌公司