專利名稱：微生物及其類胡蘿卜素化合物類產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一個屬于Labyrinthula屬Thraustochytrium種的新微生物菌株，及一種使用微生物制備蝦青素(astaxanthin)和斑蝥素(canthaxanthin)之類天然類胡蘿卜素化合物的方法。
背景技術(shù)：
蝦青素和斑蝥素屬于染料化合物，廣泛分布于微生物細胞、巨藻、微藻和多種動植物體內(nèi)，常用作抗衰老藥、解毒藥、抗癌藥及魚苗的顏色改進劑。
已經(jīng)從甲殼類動物的殼里提取出天然類胡蘿卜素中的蝦青素，但這些動物體內(nèi)此類化合物的含量相當(dāng)?shù)?，而且提取相?dāng)困難。此外，甲殼類動物作為生物資源存在于有限的海域且難于保證其穩(wěn)定的供給，這類資源不適于工業(yè)化生產(chǎn)。
利用紅色酵母菌Phaffia rhodozyma可制得蝦青素，但該類酵母菌的生長速度慢，蝦青素的產(chǎn)率很低。此外，由于該類酵母菌具有堅硬的細胞壁，制備出的蝦青素很難提取出來。另外，由于一種化學(xué)結(jié)構(gòu)上與天然蝦青素取向相反的異構(gòu)體(3R，3R’)的含量很高，蝦青素的產(chǎn)率不可避免的變低。
已知Haematococcus pluvialis可用于制備蝦青素。但由于該藻類的生長速度緩慢而且細胞壁堅硬，蝦青素的產(chǎn)率也很低。此外，該藻類的生長受很多限制易被細菌污染，要求采用特殊的培養(yǎng)設(shè)備在強光照射條件下進行培養(yǎng)，因而，蝦青素的工業(yè)生產(chǎn)涉及很多的問題。
斑蝥素分布于某些種類的蘑菇、魚和甲殼類動物中，已知可通過Brevibacterium屬和Rhodococcus屬的某些微生物來制備。化學(xué)合成斑蝥素的方法也在發(fā)展，但由于產(chǎn)率低而無法在工業(yè)上應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
基于以上情況，本發(fā)明的目的是提供一種能夠從容易獲得的原料中簡單、有效、大規(guī)模地制備蝦青素和斑蝥素的方法，克服了常規(guī)方法的弊端。
本發(fā)明的發(fā)明人對從日本內(nèi)海收集的海里微生物的生態(tài)學(xué)進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)了新的微生物，在這些微生物的細胞內(nèi)蝦青素和斑蝥素有較高的產(chǎn)率。通過培養(yǎng)這些微生物能有效制備蝦青素和班蟊素，基于這一點完成了本發(fā)明。
因而，本發(fā)明提供了一種新分離出的Labyrinthula屬Thraustochytrium種的微生物——Thraustochytrium sp.CHN-3(FERM P-18556)，可用于制備蝦青素和斑蝥素，本發(fā)明還提供了一種制備蝦青素和斑蝥素的方法，包括下述步驟微生物培養(yǎng)；使蝦青素和斑蝥黃在微生物細胞內(nèi)積聚；從培養(yǎng)基中分離出微生物細胞；通過溶劑提取從分離出的細胞中得到蝦青素和斑蝥素。


圖1是本發(fā)明的微生物在電子顯微鏡下的照片。
圖2顯示了Thraustochytrium種微生物的生命周期。
圖3是實施例1中培養(yǎng)物的高效液相色譜。
圖4是一張圖表，顯示了蝦青素的產(chǎn)量和培養(yǎng)基的pH值之間的關(guān)系。
圖5圖示了例6中蝦青素的產(chǎn)量和生物量和培養(yǎng)基的pH值之間的關(guān)系。圖中，AX表示蝦青素，BM表示生物量，下列各圖中的含義與之相同。
圖6圖示了蝦青素的產(chǎn)量和氮源種類之間的關(guān)系。在該圖中，CX表示斑蝥素，PX表示酚黃素。下列各圖中的含義與之相同。
圖7圖示了類胡蘿卜素的產(chǎn)量和光的有/無以及光源的種類之間的關(guān)系。
圖8圖示了類胡蘿卜素的產(chǎn)量和堿的濃度之間的關(guān)系。在該圖中，CT表示胡蘿卜素。
圖9圖示了類胡蘿卜素的產(chǎn)量和鹽的濃度之間的關(guān)系。
圖10圖示了類胡蘿卜素的產(chǎn)量和加入的硫胺素的量之間的關(guān)系。在該圖中，ES表示蝦青素脂肪酸酯。
本發(fā)明的具體實施方式
下面將參照附圖詳細描述本發(fā)明。
圖1是電子顯微鏡下的照片，顯示了本發(fā)明的微生物的形狀。如圖所示，本發(fā)明的微生物有細胞組成，具有Thraustochytrids Thraustochytrium微生物特有的球形或橢圓形細胞外網(wǎng)(net)。細胞只在一個位點上有sagenogenetosome，并且通過細胞外網(wǎng)的擴增侵入或粘著于底物上。參照這一特征，斷定該微生物屬于Thraustochytrids。
確立圖2所示的生命周期，阿米巴樣細胞在培養(yǎng)基中出現(xiàn)，該培養(yǎng)基富含糖類，如葡萄糖和果糖，富含有機質(zhì)，如蛋白質(zhì)類的酵母提取物和玉米浸泡液。在形成有兩種鞭毛的游動孢子時，由于該微生物的上述特征極大不同于Ulkenia屬的微生物，也不同于Schizochytrium種的微生物，因此認定其屬于Thraustochytrium種。在基于18SrDNA的進化樹中，進一步確認了該微生物屬于Thraustochytrium種。
本發(fā)明的微生物之所以被分到Labyrinthula屬Thraustochytrium種，是因為本發(fā)明的微生物的營養(yǎng)細胞是卵形或球形的，很容易與紡錘形的Labyrinthula種的微生物區(qū)別開來。這一類型的微生物廣泛分布于海洋環(huán)境，是已知的所謂的異養(yǎng)增殖的海里微生物。
從下述微生物特征看，本發(fā)明的微生物很容易與已知的微生物區(qū)別開。
I.形態(tài)學(xué)特征(1)胞呈卵形，直徑10μm。
(2)10μm的卵形游走孢子，有不等鞭毛以便運動。
II.培養(yǎng)的特點(1)細胞呈粉色，表面光滑，在糖類瓊脂培養(yǎng)基中迅速生長。
(2)液體培養(yǎng)基在24小時內(nèi)變渾濁，且培養(yǎng)基變成粉色。
從每公升培養(yǎng)基中至少獲得30g生物量。
III.生理學(xué)特征(1)含有蝦青素和斑蝥素，細胞呈粉色。
(2)細胞增殖使用有機或無機氮源。
(3)最佳生長條件包括使pH值在5-9之間，溫度在15-35℃之間。
(4)細胞使用葡萄糖和果糖制備出大量的DHA和EPA。
迄今為止，已知Labyrinthula屬Thraustochytrium種的菌株都不含有高濃度的DHA和染料。細菌學(xué)上的測試結(jié)果都是陰性的，進一步確認了本發(fā)明的微生物不屬于細菌。
本發(fā)明的微生物，或Thraustochytrium sp.CHN-3，已在國際專利生物保藏單位，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)總合研究所(Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，305-8566，Japan)進行了保藏，保藏號FERM P-18556。
本發(fā)明的微生物是一種在海中生存的單細胞微生物，約10μm大小，從海水，如日本內(nèi)海(Inland Sea)的海水中，很容易收集到。為了收集這些細胞，應(yīng)使黑松樹(Pinus thunbergii)的花粉懸浮于海水中，保持幾天，然后從海水中分離出花粉并收集沉積于花粉上的微生物體。
上述方法收集到的花粉應(yīng)進行純化培養(yǎng)，可以用糖類培養(yǎng)基或者也可以用富含糖和蛋白胨的培養(yǎng)液(例如，每升海水中含30到50g葡萄糖和1g蛋白胨的培養(yǎng)基)。純化培養(yǎng)優(yōu)選在通風(fēng)、攪拌、有持續(xù)光照(優(yōu)選波長420-470nm的藍光)的條件下進行。波長600-700nm的紅光可與藍光同時作為照射光源。
按該方法，將培養(yǎng)所得的Thraustochytrium細胞置于研缽研磨中，用100％的丙酮對這些研磨細胞進行提取。提取物通過裝備有ODSC18柱的高效液相色譜分離，通過液質(zhì)聯(lián)用加以鑒定。所得液相色譜的色譜見圖3(參見例1)。分析結(jié)果顯示染料由α-和β-胡蘿卜素，海膽酮，斑蝥素、酚黃素和蝦青素組成。
本發(fā)明的Thraustochytrium sp.CHN-3產(chǎn)生α-和β-胡蘿卜素，海膽酮，斑蝥素、酚黃素和蝦青素，并在細胞中通過積聚大量的蝦青素和斑蝥素產(chǎn)生紅色。現(xiàn)在已知的Thraustochytrium種所屬的Labyrinthula屬的微生物都不具有這種能力。
Thraustochytrium sp.CHN-3，歸類為Labyrinthula屬Thraustochytrium種的微生物——可以在含有糖、有機氮和無機鹽的培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)中進行培養(yǎng)。
糖的例子包括葡萄糖、蔗糖、果糖和那些含有它們的，如濃麥芽糖汁。有機氮的例子包括蛋白胨和酵母提取物，無機鹽的例子包括氯化鈉、氯化鉀和無機磷酸鹽。
微生物Thraustochytrium sp.CHN-3的生長要利用到葡萄糖、有機氮、光能和無機磷，光照強度、溫度、培養(yǎng)基中的營養(yǎng)組合物及供氧量應(yīng)適當(dāng)控制以使產(chǎn)率最高。
在含有高濃度鹽的強堿性培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)可以得到最佳結(jié)果。
純化培養(yǎng)條件包括，如攪拌通風(fēng)，照度為1000lux或更高的藍光照射，以及在20-30℃之間、優(yōu)選約28℃的溫度。培養(yǎng)基中磷的供應(yīng)源優(yōu)選KH2PO4，且其濃度在0.1到3g/L之間。細胞在特定的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有一定范圍內(nèi)允許Labyrinthula屬微生物生長的組合物(每升海水中含60g葡萄糖、1g蛋白胨和1g KH2PO4或每升海水中含30g葡萄糖、1g蛋白胨和1g酵母提取物)。在細胞生長末期，通過把培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的濃度調(diào)至給定范圍內(nèi)，蝦青素或斑蝥素的產(chǎn)率均可有選擇性的提高。
本發(fā)明的方法中使用的無機鹽包括氯化鈉和氯化鉀，且鹽的濃度按重量比優(yōu)選在4至10％之間。
本發(fā)明的方法中使用的堿性物質(zhì)的例子包括碳酸鉀和碳酸鈉。培養(yǎng)基的pH值希望為9或更高，優(yōu)選約為10。當(dāng)培養(yǎng)基的適宜pH值在4到12之間，或優(yōu)選6到10之間時，pH值提高，產(chǎn)率提高。在添加維生素化合物，尤其是硫胺素時，蝦青素的收率顯著提高，而且在加入上述添加劑時硫胺素在培養(yǎng)基中的濃度高達5mg/升。當(dāng)加入大量的硫胺素時會生成蝦青素的脂肪酸酯，盡管產(chǎn)物脂肪酸酯的量很小。
如上所述，通過改變培養(yǎng)條件，尤其是改變氮源組合物，強烈刺激Thraustochytrium種微生物的增殖，蝦青素和斑蝥素的產(chǎn)率能進一步提高。例如，本發(fā)明所使用的氮源的包括尿素、氨水和硝酸鉀，它們的加入量按重量比高達2％，優(yōu)選不超過1％。
相應(yīng)地，使得微生物生產(chǎn)蝦青素和斑蝥素的能力最大化是相當(dāng)有利的，可通過把Thraustochytrium種微生物的生長環(huán)境維持在一種高鹽濃度的最終條件下，以獲得較高產(chǎn)率的蝦青素和斑蝥素。將酵母提取物的最終濃度調(diào)低對于該目標而言是有效的。
通過還原培養(yǎng)基中作為氮源的一定量的酵母提取物，每克干燥的細胞中蝦青素的含量提高至1.537mg。當(dāng)蝦青素的含量提高時，培養(yǎng)基變?yōu)椴缓湍柑崛∥锏呐囵B(yǎng)液。這時，因為培養(yǎng)基中不含已被引入Thraustochytrium種微生物細胞中的氮，每克干燥的細胞中蝦青素的含量提高至大約2mg。
按本發(fā)明的方法制備蝦青素時，在最初階段，細胞在添加了酵母提取物的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，而在酵母提取物消耗完之后不再補充氮源，在不含氮源的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。如上述方法在不含氮源的介質(zhì)中培養(yǎng)使得蝦青素的產(chǎn)率成五倍或更多倍的提高，相對在培養(yǎng)基中加入氮源所獲得的收率。在富含氧的通氣條件下培養(yǎng)細胞，蝦青素的收率可以進一步提高。
為了制備斑蝥素，最初階段微生物在添加了酵母提取物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在酵母提取物消耗完之后補充氮源以維持培養(yǎng)條件，在該條件下氮源一直存在且呈弱酸性。在加入無機氮如硝酸鉀作為氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，斑蝥素的產(chǎn)率提高(參見圖6)。斑蝥素的收率成四、五倍或更多倍的提高，如同細胞在不含氮介質(zhì)中培養(yǎng)所獲得的收率。
為了從含有大量蝦青素和斑蝥素的微生物細胞中有效提取所得的蝦青素和斑蝥素，對細胞進行提取時優(yōu)選使用丙酮、氯仿、甲醇和正己烷或它們的混合物。
于是，制得的蝦青素和斑蝥素從細胞中分離至提取物中。接著，提取物上硅膠柱吸附類胡蘿卜素，以甲醇或正己烷/氯仿混合溶劑洗脫，得到收率為100％的蝦青素和斑蝥素。所用的甲醇混合溶劑含有90至95％體積比的甲醇，其余為氯仿。當(dāng)正己烷-氯仿混合溶劑用于洗脫時，該混合溶劑包括60至65％體積比的氯仿，其余為正己烷。
下面參照實施例詳細描述本發(fā)明，但本發(fā)明絕不限于這些實施例。
實施例1從日本內(nèi)海沿岸Nagahama區(qū)的海岸取樣的海水，使Pinus Thunbergii的花粉懸浮于其中，以該方式從Thraustochytrium sp.CHN-1中純化得到純Thraustochytrium sp.CHN-3微生物，將其接種于糖類培養(yǎng)基(pH5.0)，該培養(yǎng)基是含60g/L的葡萄糖、1g/L的蛋白胨、1g/L的磷酸二氫鉀和1g/L的磷酸鹽離子形式的磷的海水。細胞在28℃、通風(fēng)、攪拌、以1000lux的白光照射的條件下培養(yǎng)6天(光來自熒光燈)。所得培養(yǎng)液離心分離收集微生物細胞。上述細胞的電子顯微照片見圖1。
細胞用丙酮、氯仿和甲醇提取，提取物過硅膠柱(商品名Wako gel，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)以吸附產(chǎn)物。接著，硅膠柱以正己烷和甲醇成功洗脫，每升培養(yǎng)液得到8.8mg的蝦青素和6.5mg的斑蝥素。每克干燥的細胞中蝦青素和斑蝥素的含量分別是2.8mg和2.0mg。圖3顯示例1所得類胡蘿卜素的高效液相色譜圖。圖中指示的數(shù)字相應(yīng)于下列化合物。
1蝦青素，2酚黃素，3蝦青素，4海膽酮，5α-胡蘿卜素，6β-胡蘿卜素。
實施例2Thraustochytrium sp.CHN-3微生物在23℃培養(yǎng)6天，培養(yǎng)基是含有50g/L的葡萄糖、1g/L的蛋白胨、1g/L的磷酸二氫鉀的海水，依下述條件培養(yǎng)；(a)照度1000lux的白光照射并旋轉(zhuǎn)振動，轉(zhuǎn)速100rpm，(b)在黑暗條件下旋轉(zhuǎn)振動，轉(zhuǎn)速100rpm，(c)照度1000lux條件下靜態(tài)培養(yǎng)，和(d)照度1000lux條件下通風(fēng)攪拌。結(jié)果見表1。
表1

表1充分顯示了靜態(tài)培養(yǎng)不能制得蝦青素。在旋轉(zhuǎn)振動培養(yǎng)時光照產(chǎn)出更多蝦青素。通過通風(fēng)提高氧的濃度，蝦青素的產(chǎn)率可提高1.8倍。采用通風(fēng)條件，或增加培養(yǎng)基中氧的濃度，使得蝦青素的產(chǎn)率提高。
實施例3通過相同試驗，培養(yǎng)方式同實施例1，繼續(xù)培養(yǎng)14天，除了所用富含糖的培養(yǎng)基的pH用鹽酸水溶液和氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)改變，蝦青素的產(chǎn)率在每一pH時是一定的。結(jié)果見圖4的表。圖表顯示pH值提高，蝦青素的產(chǎn)率提高。
實施例4富含糖的培養(yǎng)基(以下稱作糖培養(yǎng)基)是含有30g/L的葡萄糖、1g/L的蛋白胨、1g/L的酵母提取物的海水(氯化鈉濃度3.2％)，在其中加入氯化鈉制備各種培養(yǎng)液，各培養(yǎng)液在氯化鈉濃度級上都不相同，接著，實施例1所用的Thraustochytrium sp.CHN-3微生物接種引入培養(yǎng)液，在通風(fēng)攪拌、28℃和1000lux的白光照射下培養(yǎng)6天。接著，離心分離每一培養(yǎng)液收集微生物細胞。所得生物量和類胡蘿卜素分別為2到5g/L和0.5-1mg/g。
所得細胞用丙酮提取、氯仿和甲醇，提取物用裝備有ODSC18柱的高效液相分析。細胞中蝦青素和斑蝥素的含量(干燥的細胞中的含量)是每1g干燥的細胞中分別含1.0-2.0mg和0.3-0.5mg。
實施例5Thraustochytrium sp.CHN-3微生物使用每一升海水含50g葡萄糖、1g蛋白胨和1g磷酸二氫鉀的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以100rpm的轉(zhuǎn)速搖動加入空氣攪拌介質(zhì)，在23℃條件下，以熒光燈白光或1000lux的藍光(波長470nm)照射或在黑暗中進行培養(yǎng)。結(jié)果見圖7。
該圖顯示黑暗中產(chǎn)生少量的蝦青素。通過蘭光照射得到的蝦青素比在光照下旋轉(zhuǎn)振動培養(yǎng)中的照射白光更多。這表示提高照射到培養(yǎng)基的藍光強度可以增強蝦青素產(chǎn)率。
實施例6除了糖培養(yǎng)基的pH被改變，在與實施例4相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)14天。結(jié)果見圖5。顯示在pH值4到10內(nèi)蝦青素的產(chǎn)率隨pH值提高而提高。
實施例7除了糖介質(zhì)中Na2CO3的加入量被改變，在與實施例4相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)7天，測定生物量、蝦青素、斑蝥素的產(chǎn)率。結(jié)果見圖8的表。表格顯示當(dāng)Na2CO3的濃度提高至1.6％時生物量和蝦青素的產(chǎn)率提高。
實施例8除了糖介質(zhì)中NaCl的加入量被改變，在與實施例4相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)7天，測定生物量、蝦青素、斑蝥素的產(chǎn)率。每一次NaCl濃度增加時的產(chǎn)率見圖9。顯示在NaCl的濃度提高至6％時生物量和蝦青素的產(chǎn)率提高。
實施例9繼續(xù)進行培養(yǎng)試驗7天，培養(yǎng)條件同實施例4，測定生物量、蝦青素、斑蝥素的產(chǎn)率，除了在糖介質(zhì)中加入作為維生素化合物的硫胺素并改變其加入量。結(jié)果見圖10的表。表格顯示硫胺素的加入量提高，生物量和蝦青素的產(chǎn)率提高。還顯示作為副產(chǎn)物的蝦青素的脂肪酸酯(以ES表示)隨著硫胺素濃度的提高而提高。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供一種大規(guī)模培養(yǎng)純Thraustochytrium種微生物尤其是含有高濃度蝦青素和斑蝥素的微生物的方法，和一種簡單的提取和分離蝦青素和斑蝥素的方法。本發(fā)明能用來提供高收率和高濃度的蝦青素、斑蝥素或含有預(yù)期比例的蝦青素和斑蝥素的混合物。
權(quán)利要求
1.一種Labyrinthula屬Thraustochytrium種微生物菌株Thraustochytriumsp.CHN-3(保藏編號FERM P-18556)。
2.制備蝦青素和斑蝥素的方法，其中包括下述步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的微生物菌株，使蝦青素和斑蝥素在微生物細胞內(nèi)積聚。從培養(yǎng)基中分離出微生物細胞，和分離出的微生物細胞經(jīng)溶劑提取法回收蝦青素和斑蝥素。
3.根據(jù)權(quán)利要求制備2的方法，其中培養(yǎng)基的pH值維持在4到12，且微生物細胞在通風(fēng)條件下培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其中培養(yǎng)基含糖，其選自蔗糖、葡萄糖和果糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其中微生物細胞在光照條件下培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的制備方法，其中用來的照射的光是波長420到470nm的藍光。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的制備方法，其中用來照射的光是藍光和紅光的混合光，藍光波長420-470nm、紅光波長600-700nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其中培養(yǎng)基含有一種維生素化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的制備方法，其中維生素化合物是硫胺素。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其中培養(yǎng)基含有選自尿素，氨水和硝酸鉀的氮化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物菌株的培養(yǎng)產(chǎn)物、微生物細胞或加工產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從易得原料中簡便、有效地制備大量蝦青素和斑蝥黃的方法。一種能制備蝦青素和斑蝥黃的微生物Thraustochytrium sp.CHN－3(FERM P－18556)，屬于Labyrinthula屬Thraustochytrium種，將其進行培養(yǎng)，蝦青素和斑蝥素在微生物細胞內(nèi)積聚。然后從培養(yǎng)液中分離出細胞，通過溶劑提取從分離出的細胞收集蝦青素和斑蝥黃。
文檔編號C12P23/00GK1571832SQ0282039
公開日2005年1月26日 申請日期2002年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月16日
發(fā)明者山岡到保 申請人:獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)總合研究所