專利名稱：關(guān)于hpv－11和hpv－16l1衣殼蛋白的載體,構(gòu)建體,和轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及載體和/或構(gòu)建體，和轉(zhuǎn)基因生物。
在本說明書中下列術(shù)語，短語和/或子句應(yīng)當(dāng)理解為是指“構(gòu)建體”-如本文所用與術(shù)語如“偶聯(lián)物”，“盒”，和“雜化物”同義，包括直接或間接與啟動子連接的核苷酸序列。構(gòu)建體可包含或表達標(biāo)記，其允許在宿主細胞中選擇構(gòu)建體。
“表達載體”-如本文所用是指能夠體內(nèi)或體外表達的構(gòu)建體。
“表達”-應(yīng)當(dāng)理解為是指從DNA模板通過轉(zhuǎn)錄和翻譯生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
“遺傳修飾的生物”-如本文所用是指由于以通過交配或自然重組或兩者天然不發(fā)生的方式作為人為干預(yù)的結(jié)果已經(jīng)被導(dǎo)入核苷酸序列的生物。
“在硅片上(In silico)”-本文所述的部分測定和/或方法可以通過使用適當(dāng)?shù)挠嬎丬浖M行。如此進行的這些測定和/方法應(yīng)當(dāng)理解為被包含其中。
“核苷酸序列”-如本文所用與術(shù)語“核苷酸序列”和/或術(shù)語“多聚核酸”和/或術(shù)語“多核苷酸”同義，并包括基因組DNA，cDNA，重組DNA，合成DNA，和RNA，和上述的任何組合，此外核苷酸序列可以是雙鏈或單鏈無論表示有義鏈或反義鏈。優(yōu)選地，術(shù)語“核苷酸序列”是指DNA。
“可操作性連接”-如本文所用是指并列，其中將與編碼序列“可操作性連接”的啟動子以這樣方式即編碼序列的表達是在與控制序列(即尤其啟動子，增強子和其它表達調(diào)節(jié)信號)相適合的條件下實現(xiàn)來連接。
“啟動子”-如本文所用是指導(dǎo)核苷酸序列可調(diào)型轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。
“蛋白質(zhì)”-如本文所用是用來表示肽和多肽。
“重組生物”-如本文所用是指包含載體和/或表達核苷酸序列的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因生物。
“轉(zhuǎn)基因生物”-如本文所用包括遺傳修飾的生物，其包含載體和/或構(gòu)建體，按照本發(fā)明，其中啟動子可允許在生物內(nèi)表達按照本發(fā)明的載體和/或構(gòu)建體的核苷酸序列，或其部分。
“載體”-如本文所用包括表達載體，可復(fù)制載體，轉(zhuǎn)化載體，穿梭載體，粘粒，質(zhì)粒，噬菌體，病毒和酵母人工染色體或其任何組合。
“VLP”-如本文所用是指病毒樣顆粒。
乳頭瘤病毒(PVs)屬于分類科乳頭瘤病毒亞科(Papilomaviridae)，是小的、無包被的、雙鏈(ds)DNA病毒。這些病毒感染各種各樣的高等脊椎動物并且是高度種特異性的。經(jīng)感染后，人乳頭瘤病毒(HPVs)對未分化的鱗狀上皮細胞具有特別的向性，除與足底疣，扁平疣，和生殖疣(尖銳濕疣)相關(guān)以外。HPV感染還與稱為疣狀表皮發(fā)育不良的疾病有關(guān)，該疾病為一種稀見的終生疾病，其特征在于散布的乳頭狀瘤。此外，已經(jīng)存在某些乳頭瘤病毒分離株與包括子宮頸癌，外陰癌，陰莖癌的泌尿生殖癌，和疣狀表皮發(fā)育不良損害的惡性轉(zhuǎn)移的流行病學(xué)和生物化學(xué)聯(lián)系。在表征的各型HPV中，已經(jīng)將大約27種鑒定為肛殖感染的病原體。6，11，16，18，31，35和42型HPV已經(jīng)被鑒定是最普遍的，而16，18，31，33，51和54型已經(jīng)與肛殖癌有關(guān)，被認(rèn)為是高危，更特別地HPV-16已經(jīng)在95％子宮頸癌中發(fā)現(xiàn)。
直到最近認(rèn)為高危生殖HPVs僅在性交期間傳播，然而研究表明嬰兒在出生時從他們母親獲得高危HPV感染。除了非性母嬰傳播，研究者在來源于婦女的陰道拭子中，在來源于少女的子宮頸-陰道標(biāo)本中，和在來源于61位聲稱無性接觸歷史的婦女中的9位的外陰拭子中檢測到HPVDNA。
最初的HPV感染導(dǎo)致頸上皮內(nèi)腫瘤形成(CIN)，更通常已知為癌前病變。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些婦女中存在CIN的自發(fā)消退，但這并非總是如此，病變可持續(xù)多年，增加向子宮頸癌進展的可能性。
從冷凍療法，外科切除和局部治療范圍的治療方法經(jīng)常不減輕問題，對于對治療應(yīng)答的患者，復(fù)發(fā)經(jīng)常是個問題。最終破壞所有感染組織似乎不可行，因為多病灶疾病和潛伏是感染的常見特征。靶向設(shè)計和抑制病毒復(fù)制的抗病毒藥物似乎在HPV感染的情形中無效，首先因為該病毒不在保持感染的細胞中復(fù)制和其次由于病毒復(fù)制基因似乎通過整合，重排和缺失而消失的事實。
常規(guī)上大多數(shù)預(yù)防疫苗已由活的減毒病毒或福爾馬林滅活的病毒組成。由于涉及產(chǎn)生大量的這些常規(guī)疫苗的困難和風(fēng)險，已經(jīng)很強調(diào)開發(fā)病毒蛋白亞單位疫苗和生產(chǎn)其的方法。
發(fā)明概述按照本發(fā)明提供載體和/或構(gòu)建體，其選自a.HPV11 L1 NLS-；b.HPV11 L1；c.HPV16 L1 NLS-；d.HPV16 L1；e.pART7；f.pART27；特別是(i)HPV11或HPV16 L1基因(504氨基酸)；(ii)缺少核定位信號的HPV11或HPV16 L1基因(NLS-，Δ483)；(iii)缺少10個N-末端密碼子的HPV11或HPV16 L1基因(ΔN10)；(iv)缺少10個N-末端密碼子和NLS的HPV11或HPV16 L1基因(ΔN10Δ483)；(v)在氨基酸428位具有C至G突變(pen)的HPV11或HPV16 L1基因(pen504)；(vi)具有pen和ΔN10修飾的HPV11或HPV16 L1基因；(vii)具有pen和Δ483修飾的HPV11或HPV16 L1基因；和(viii)具有pen和ΔN10Δ483修飾的HPV11或HPV16 L1基因。
此外，按照本發(fā)明提供載體和/或構(gòu)建體在轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法中的應(yīng)用。
另外，按照本發(fā)明提供用載體和/或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其中轉(zhuǎn)化的宿主細胞優(yōu)選為
a.細菌；b.酵母細胞；c.真菌細胞；d.昆蟲細胞；e.哺乳動物細胞；f.植物細胞，其在允許至少一種由載體和/或構(gòu)建體編碼的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的片段自發(fā)裝配成誘發(fā)免疫原性應(yīng)答的病毒樣顆粒的條件下培養(yǎng)，所述病毒樣顆粒針對人乳頭瘤病毒，更具體地人乳頭瘤病毒-11和/或人乳頭瘤病毒-16，最優(yōu)選載體和/或構(gòu)建體被穩(wěn)定整合于宿主細胞的基因組中。
還有，按照本發(fā)明提供由載體和/或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的非人多細胞轉(zhuǎn)基因生物，其在允許至少一種由載體和/或構(gòu)建體編碼的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的片段自發(fā)裝配成誘發(fā)免疫原性應(yīng)答的病毒樣顆粒的條件下培養(yǎng)，所述病毒樣顆粒針對人乳頭瘤病毒，更具體地人乳頭瘤病毒-11和/或人乳頭瘤病毒-16，優(yōu)選轉(zhuǎn)基因生物選自1.煙草(Nicotiana tabacum)cv Xanthi；2.煙草cv Soulouk；3.番茄(Lycopersicon esculentum)cv Tiny Tom；和4.擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)cv Columbia。
此外，本發(fā)明提供通過轉(zhuǎn)基因生物系統(tǒng)表達蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的片段。
附圖簡述本發(fā)明的特征將從僅通過實施例，和參考附圖的以下所述本發(fā)明某些實施方案的下列描述中變得明顯，在所述附圖中

圖1顯示pART7的質(zhì)粒圖；圖2顯示pART27的質(zhì)粒圖；圖3顯示從轉(zhuǎn)基因煙草中分離的、用HPV-16-特異的Mab捕獲的HPV-16 VLP的電子顯微鏡照片；和圖4顯示從轉(zhuǎn)基因擬南芥屬(Arabidopsis)中分離的HPV-11 VLP的電子顯微鏡照片。
本發(fā)明優(yōu)選實施方案詳述制備轉(zhuǎn)基因生物的方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的，在本說明書中將不深入展開。
克隆和制備農(nóng)桿菌屬克隆利用HIND III和EcoR I限制位點將HPV-11 L1和HPV-16 L1基因片段單獨克隆到原始載體pART7的多克隆位點(MCS)中以提供構(gòu)建體HPV11 L1 NLS-，HPV11 L1，HPV16 L1 NLS-，和HPV16 L1。
通過Not I消化從pART7載體(圖1)中切除完整的盒，并克隆到二元載體pART27(圖2)中。
將各個pART27克隆轉(zhuǎn)染到根癌農(nóng)桿菌菌株C58C1中。
葉盤轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)用農(nóng)桿菌屬克隆轉(zhuǎn)化煙草cv Xanthi和Soulouk葉盤，在卡那霉素組織培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體，如Turpen等所述(Transfection of whole plants fromwounds inoculated with Agrobacterium tumefaciens containing cDNA oftobacco mosaic virus.J.Virol.Meth.42227-240)。
用農(nóng)桿菌屬克隆轉(zhuǎn)化番茄cv Tiny Tom子葉，如Pfitzner所述(Transformation of tomato.J.Mol.Biol.Meth.81359-363)。
用農(nóng)桿菌屬克隆轉(zhuǎn)化開花擬南芥菜cv Columbia植物，如Clough和Bent所述(在http//www.cropsci.uiuc.edu/～a-bent/protocol.hmtl可獲得的簡化的擬南芥屬轉(zhuǎn)化方案)，在卡那霉素組織培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體，如Turpen等所述(Transfection of whole plants from wounds inoculated withAgrobacterium tumefaciens containing cDNA of tobacco mosaic virus.J.Virol.Meth.42227-240)。
篩選轉(zhuǎn)基因植物使用Dellaporta等所述方法(A plant DNA minipreparationVersion II.Cold Spring Harbour Laboratory.Cold Spring Harbour)從轉(zhuǎn)化體中提取植物基因組DNA，通過PCR證實整合基因的存在。
從轉(zhuǎn)基因植物中提取VLP在1∶2體積(植物材料緩沖液)的緩沖液(對于HPV使用含有0.5MNaCl的PBS)中攪勻植物葉子材料，并在漏斗上壓緊通過粗棉布直至漿干燥。在4℃下將提取物離心10分鐘(3000rpm)。將10％PEG(MW8000)加入上清液并讓在4℃溶解過夜。然后將這在4℃下3000rpm離心10分鐘。在4℃下將沉淀重懸浮在1/10原始體積的PBS(0.5M NaCl)中。然后在3000rpm下將混合物離心15分鐘以便去除所有變性的不溶性組分。將提取物覆蓋在40％的蔗糖墊(在含有0.5M NaCl的PBS中制備)上，并在100 000xg(對于Sorvall SW28，24000rpm)下在10℃下離心2.5小時。將沉淀重懸浮在少量PBS(0.5M NaCl)中并將懸浮液通過18&26規(guī)格的針以降低它的粘度。將該懸浮液加樣到10-40％的線性蔗糖梯度上并在10℃下100 000xg(對于SW28，24000rpm)旋轉(zhuǎn)3小時。用針和注射器去除在散射光下觀察到的條帶，并在4℃下對PBS(0.5M NaCl)透析12-24小時。
電子顯微鏡分析將VLP捕獲于包被多克隆抗體(對于HPV-11 L1特異性的)R399的銅網(wǎng)上，并用2％乙酸雙氧鈾負(fù)染。在200CX電子顯微鏡下觀察網(wǎng)格。
在R0中(第一轉(zhuǎn)基因系)L1基因被穩(wěn)定地整合到煙草cv Xanthi和Soulouk的基因組中。對于T1代(第一代)的自花傳粉轉(zhuǎn)基因植物的L1基因觀察到常規(guī)的3∶1孟德爾式遺傳。另外在轉(zhuǎn)基因擬南芥菜植物的T2(第二代)至T5(第五代)中檢測到L1基因。
在電子顯微鏡下觀察到的VLP(用抗體捕獲或未捕獲)外表上類似于使用桿狀病毒昆蟲細胞系統(tǒng)的L1基因表達產(chǎn)生的那些。觀察到顆粒的直徑大小約為50-60nm(擬南芥菜)，并在檢查煙草蛋白質(zhì)提取物時觀察到部分降解的顆粒。
在轉(zhuǎn)基因植物中乳頭瘤病毒基因的表達在進一步的研究中，制備包含HPV-16 L1基因的轉(zhuǎn)基因系，其現(xiàn)在至少是選擇的第二代。另外，用HPV-11 NLS-L1基因轉(zhuǎn)化擬南芥菜和煙草植物。最近還用CRPV L1轉(zhuǎn)化煙草植物。所有這些植物系顯示生產(chǎn)VLP，盡管濃度低。包含或缺少NLS序列似乎對于HPV-16 L1 VLP表達幾乎沒有區(qū)別，盡管如果定位到植物細胞核上HPV-11 L1可能有毒性的。通過V5 MAb捕獲HPV-16 L1 VLP，如圖3所示(條＝70nm)，顯示它們在抗原性上適合于疫苗應(yīng)用。
在圖4(條＝70mm)中顯示從轉(zhuǎn)基因擬南芥屬中分離的HPV-11 VLP。
缺少核定位信號的HPV-11 L1蛋白(NLS-，Δ483)和許多不同的HPV-16 L1和L1 NLS-蛋白構(gòu)建體已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因植物中表達，已經(jīng)測定這些制備T＝7二十面體的顆粒VLP，經(jīng)注射后在兔中是免疫原性的，在形態(tài)學(xué)上似乎與在昆蟲細胞的桿狀病毒表達系統(tǒng)中制備的VLP相同。另外，已經(jīng)測定在轉(zhuǎn)基因植物中制備的HPV-16 VLP與構(gòu)象特異的單克隆抗體(MAb V5)結(jié)合，并阻止中和抗體結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)顯示在植物中制備的VLP在功能上與在昆蟲細胞中制備的VLP相同。另外，下列構(gòu)建體已經(jīng)通過重組桿狀病毒在昆蟲細胞中表達，其與被未改變的L1蛋白結(jié)合的、相同的構(gòu)象特異和序列特異的Mab結(jié)合a.缺少10個N-末端密碼子的HPV16 L1基因(ΔN10)，其裝配成T＝1和此外T＝7的二十面體顆粒；b.缺少10個N-末端密碼子和NLS的HPV16 L1基因(ΔN10Δ483)，其裝配成T＝1和此外T＝7的二十面體顆粒；c.在氨基酸428處具有C至G突變(pen)的HPV16 L1基因(pen504)，其裝配成五聚體；d.具有pen和ΔN10修飾的HPV16 L1基因，其裝配成五聚體；e.具有pen和Δ483修飾的HPV16 L1基因，其裝配成五聚體；和f.具有pen和ΔN10Δ483修飾的HPV16 L1基因，其裝配成五聚體。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是這些構(gòu)建體可以在轉(zhuǎn)基因植物中表達并應(yīng)該以完全相同的方式起作用。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員緊接著明顯的是盡管本文已經(jīng)只列舉本發(fā)明的某些實施方案，本發(fā)明的其它修改和/或變體是可能的。這些修改和/或變體應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種載體和/或基因構(gòu)建體，其選自a.HPV11L1NLS-；b.HPV11L1；c.HPV16L1NLS-；d.HPV16L1；e.pART7；和f.pART27。
2.按照權(quán)利要求1的載體和/或基因構(gòu)建體，其選自(i)HPV11或HPV16L1基因(504氨基酸)；(ii)缺少核定位信號的HPV11或HPV16L1基因(NLS-，Δ483)；(iii)缺少10個N-末端密碼子的HPV11或HPV16L1基因(ΔN10)；(iv)缺少10個N-末端密碼子和NLS的HPV11或HPV16L1基因(ΔN10Δ483)；(v)在氨基酸428位具有C至G突變(pen)的HPV11或HPV16L1基因(pen504)；(i)具有pen和ΔN10修飾的HPV11或HPV16L1基因；(vii)具有pen和Δ483修飾的HPV11或HPV16L1基因；和(viii)具有pen和ΔN10Δ483修飾的HPV11或HPV16L1基因。
3.權(quán)利要求1或2的載體和/或基因構(gòu)建體在轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法中的應(yīng)用。
4.一種用權(quán)利要求1或2的載體和/或基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其選自細菌，酵母細胞，真菌細胞，昆蟲細胞，哺乳動物細胞，和植物細胞。
5.按照權(quán)利要求4的宿主細胞，其在允許至少一種由所述載體和/或基因構(gòu)建體編碼的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段自發(fā)裝配成誘發(fā)免疫原性應(yīng)答的病毒樣顆粒的條件下培養(yǎng)，所述病毒樣顆粒針對人乳頭瘤病毒。
6.按照權(quán)利要求5的宿主細胞，其中所述人乳頭瘤病毒是人乳頭瘤病毒-11和/或人乳頭瘤病毒-16。
7.按照權(quán)利要求6的宿主細胞，其中所述載體和/或基因構(gòu)建體被穩(wěn)定整合于宿主細胞的基因組之中。
8.一種非人多細胞轉(zhuǎn)基因生物，其是由權(quán)利要求1或2的載體和/或基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，在允許至少一種由所述載體和/或基因構(gòu)建體編碼的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段自發(fā)裝配成誘發(fā)免疫原性應(yīng)答的病毒樣顆粒的條件下培養(yǎng)，所述病毒樣顆粒針對人乳頭瘤病毒。
9.按照權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述病毒樣顆粒針對人乳頭瘤病毒-11和/或人乳頭瘤病毒-16。
10.按照權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因生物，其選自煙草cv Xanthi，煙草cvSoulouk，番茄cv Tiny Tom；和擬南芥菜cv Columbia。
全文摘要
載體和/或人乳頭瘤病毒基因的構(gòu)建體被用于轉(zhuǎn)化宿主細胞，如細菌，酵母細胞，真菌細胞，昆蟲細胞，哺乳動物細胞和植物細胞。在允許至少一種由載體和/或基因構(gòu)建體編碼的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)片段自發(fā)裝配成誘發(fā)免疫原性應(yīng)答的病毒樣顆粒的條件下培養(yǎng)宿主細胞，所述病毒樣顆粒針對人乳頭瘤病毒。
文檔編號C12N15/82GK1578787SQ02821507
公開日2005年2月9日 申請日期2002年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月31日
發(fā)明者阿爾溫德·德夫希·瓦爾薩尼, 愛德華·彼得·雷比茨基, 安娜-利塞·威廉森 申請人:開普敦大學(xué)