專利名稱：診斷探針檢測(cè)系統(tǒng)的制作方法
本申請(qǐng)要求于2001年9月24日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)NO.60/324421的在先權(quán)益，該申請(qǐng)?jiān)诖巳恳胱鳛閰⒖肌?br> 背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)核酸序列存在或不存在的方法，其中所述核酸序列是病原體等以及基因變體和突變體的特征性序列，所述變體和突變體包括在人類移植中令人關(guān)注的人白細(xì)胞抗原(HLA)相關(guān)的變體或突變體。與T-細(xì)胞受體(TCR)基因序列相關(guān)的變體和突變體也受人所關(guān)注。
在天然狀態(tài)下，HLA位點(diǎn)(locus)具有高度多態(tài)性。在HLA因子的命名體系2000(Hum.Immunol.2001年4月，62(4)419-468)中公開了124個(gè)HLA-A等位基因、258個(gè)HLA-B等位基因、74個(gè)HLA-C等位基因、221個(gè)HLA-DRB1等位基因、19個(gè)DRB3等位基因、89個(gè)DRB4等位基因、14個(gè)DRB5等位基因、19個(gè)DQA1等位基因和39個(gè)DQB1等位基因，而且還有新的等位基因被陸續(xù)報(bào)道。作為進(jìn)展很快的證明，WHO的HLA因子體系的命名委員會(huì)(www.anthonynolan.com/HIG/)在2002年7月更新后，表明有250個(gè)HLA-A等位基因、488個(gè)HLA-B等位基因、118個(gè)HLA-C等位基因、312個(gè)HLA-DRB1個(gè)等位基因、38個(gè)DRB3等位基因、12個(gè)HLA-DRB4等位基因、25個(gè)HLA-DRB5等位基因、22個(gè)DQA1等位基因、53個(gè)DQB1等位基因、20個(gè)DPA1和99個(gè)DPB1等位基因。
所有的HLA-A、-B和-C等位基因具有相似的序列。而在DRB1、DRB3、DRB4和DRB5序列也具有相似性。由于存在相似性，當(dāng)用一對(duì)引物進(jìn)行序列特異性引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-SSP)時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)兩個(gè)或更多個(gè)等位基因被擴(kuò)增現(xiàn)象，或在診斷性序列特異性寡核苷酸探針檢測(cè)(SSO)體系中，也經(jīng)常出現(xiàn)兩個(gè)或更多個(gè)等位基因被雜交的現(xiàn)象。因此，要達(dá)到每一個(gè)等位基因具有唯一的PCR-SSP或SSO檢測(cè)模式，則需要利用多對(duì)引物或多個(gè)探針。進(jìn)而，在鑒定HLA分型(typing)中使用的診斷雜交SSO探針也由于HLA等位基因具有高度同源性而受到干擾。因此，現(xiàn)有技術(shù)中的許多分型方法，例如Bugawan等，Tissue Antigens(1994)44137-147中描述的方法，在鑒定HLA分型和其它應(yīng)用中缺乏準(zhǔn)確性。
PCR可以鑒別靶標(biāo)DNA模板上的特征序列。如果出現(xiàn)擴(kuò)增，則模板DNA包含與所引物相同的序列。如果沒有出現(xiàn)擴(kuò)增，則模板DNA的序列不同于引物序列。Newton等的美國(guó)專利No.5,595,890公開了一種用于確定基因分型的PCR診斷方法，包括利用PCR-SSP來(lái)鑒定HLA的分子分型。根據(jù)該方法，根據(jù)在多輪PCR中的陽(yáng)性或陰性反應(yīng)模式來(lái)鑒定未知等位基因。如上所述，由于HLA具有高度的多態(tài)性，Newton所公開的方法在HLA分型時(shí)，其效率是有限的。由于用兩條分別具有特定序列的引物經(jīng)常擴(kuò)增出許多個(gè)HLA等位基因，因此需要增加PCR擴(kuò)增反應(yīng)的輪數(shù)，才能鑒定一個(gè)未知的等位基因?；陬愃频睦碛桑谏衔闹兴岬降姆?PCR方法中，為了準(zhǔn)確的鑒定HLA的分型也需要很多條診斷探針。PCR要求引物對(duì)分別與在DNA模板上欲擴(kuò)增的區(qū)域兩側(cè)相應(yīng)。引物與預(yù)期序列退火能力依賴于引物的長(zhǎng)度，并要在PCR熱循環(huán)程序中設(shè)定退火溫度。為了獲得對(duì)DNA序列的特異性擴(kuò)增，引物越長(zhǎng)，則退火溫度越高。PCR-SSP利用了引物長(zhǎng)度和退火溫度之間的平衡來(lái)達(dá)到引物導(dǎo)向序列擴(kuò)增的特異性。
在臨床使用中，用于HLA分型的PCR-SSP體系需要利用有限數(shù)目的PCR反應(yīng)次數(shù)來(lái)達(dá)到盡可能高的分辨率，這樣一對(duì)引物所能擴(kuò)增出的等位基因數(shù)目將減少(即引物或探針的特異性需要提高)。共同美國(guó)專利No.6,207,379中公開的內(nèi)容對(duì)本發(fā)明有用，將其引入本申請(qǐng)中作為參考。該專利中教導(dǎo)了診斷PCR引物用于鑒定非連續(xù)(缺口(gap))序列，以在HLA分型中的對(duì)相關(guān)等位基因的分辨率更高。在可選地另一個(gè)實(shí)施例中，美國(guó)專利No.6,207,379教導(dǎo)了利用診斷引物與在靶標(biāo)核酸中的非連續(xù)序列進(jìn)行雜交和聚合酶介導(dǎo)引物延伸來(lái)擴(kuò)增靶標(biāo)。除美國(guó)專利No.6,207,379的方法在對(duì)靶標(biāo)HLA序列進(jìn)行更高特異性的擴(kuò)增是成功的之外，利用PCR和非-PCR的對(duì)HLA序列進(jìn)行檢測(cè)的方法仍然需要改進(jìn)。
在美國(guó)專利No.6,207,379中描述的PCR發(fā)明中，提到在本領(lǐng)域中存在著如此需求即對(duì)基于PCR-SSP的分子分型方法進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)而提高分型方法的特異性以便減少在每次鑒定中所要進(jìn)行PCR反應(yīng)的次數(shù)。然而，在本領(lǐng)域中也存在用非-PCR方法對(duì)特異序列進(jìn)行檢測(cè)的需求。由于基本熱動(dòng)力學(xué)的原因，探針和模板，包括完全匹配的情況，總是處在雜交和非雜交之間的平衡狀態(tài)。探針有時(shí)附著于靶標(biāo)模板上，有時(shí)卻沒有附著在上面。PCR的延伸過程中，聚合酶對(duì)于將引物鎖定在相應(yīng)位置上是非常關(guān)鍵的。在非-PCR方法中，缺乏關(guān)鍵因素即聚合酶(和接下來(lái)的延伸階段)，因此對(duì)于短的探針與靶標(biāo)形成的雜交復(fù)合體不一定總是令人滿意的長(zhǎng)時(shí)間處于的穩(wěn)定狀態(tài)?；诖嗽颍ǔＵJ(rèn)為雜交探針需要比相應(yīng)的延伸引物更長(zhǎng)以確保雜交復(fù)合體的穩(wěn)定性。
在Gentalen等，Nucleic Acids Research Vol.27，No.6，pp1485-1491(1999)中所公開的內(nèi)容對(duì)本發(fā)明也是有用的，其中公開了一種鑒定DNA鏈上兩個(gè)位點(diǎn)之間的物理連鎖(linkage)的方法，它是通過在寡核苷酸陣列中同一個(gè)點(diǎn)(address)有多于一個(gè)寡核苷酸探針的高密度寡核苷酸陣列來(lái)達(dá)到的。根據(jù)該方法，協(xié)同雜交可區(qū)分靶標(biāo)序列在物理上連鎖還是不連鎖。
因此，仍然需要對(duì)基于雜交的檢測(cè)體系進(jìn)行改進(jìn)，以便能夠可靠地檢測(cè)具有高度多態(tài)性情形中的特異性靶標(biāo)，包括HLA分型和T-細(xì)胞受體(TCR)基因序列的鑒定。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種檢測(cè)樣品/靶標(biāo)核酸序列的改進(jìn)方法，尤其是檢測(cè)編碼人白細(xì)胞抗原(HLA)的核酸的方法和檢測(cè)T-細(xì)胞受體(TCR)基因序列的方法，由此診斷探針的特異性得以增加，使得至少一個(gè)探針能夠識(shí)別靶標(biāo)上的兩個(gè)或更多區(qū)域，優(yōu)選地在增加這種特異性的同時(shí)并不增加探針與樣品/靶標(biāo)核酸序列之間的退火溫度。增加探針組的特異性減少了被檢測(cè)等位基因的數(shù)量，因而提高了方法的分辨率并降低了成本。
具體地說(shuō)，本發(fā)明提供一種在樣品核酸鏈中檢測(cè)靶標(biāo)核酸序列的存在的方法，包括如下步驟在雜交條件下，將診斷探針與被懷疑包含靶標(biāo)核酸序列的樣品進(jìn)行接觸。所述診斷探針的核苷酸序列包含位于其5’端的第一探針區(qū)和位于所述第一探針區(qū)3’側(cè)的第二探針區(qū)，其中第一探針區(qū)基本上互補(bǔ)于所述靶標(biāo)核酸序列的特征性的第一靶標(biāo)區(qū)。第二探針區(qū)基本上互補(bǔ)于所述靶標(biāo)核酸鏈的靶標(biāo)核酸序列的特征性的第二靶標(biāo)區(qū)。當(dāng)在靶標(biāo)核酸鏈上的所述第一靶標(biāo)區(qū)與第二靶標(biāo)區(qū)連續(xù)時(shí)，那么用核酸間隔區(qū)(spacer)隔開診斷探針上的第一和第二探針區(qū)。當(dāng)在診斷探針上的第一和第二探針區(qū)連續(xù)時(shí)，那么在靶標(biāo)核酸鏈上的第一和第二靶標(biāo)區(qū)之間存在有間插(intervening)序列。對(duì)于特定的雜交條件，第一和第二探針區(qū)的長(zhǎng)度應(yīng)使得當(dāng)?shù)谝缓偷诙结槄^(qū)基本上分別互補(bǔ)于第一和第二靶標(biāo)區(qū)時(shí)，診斷探針能夠與靶標(biāo)核酸鏈穩(wěn)定雜交而形成可檢測(cè)的探針靶標(biāo)雜交體。然而，在所選擇的雜交條件下，當(dāng)?shù)谝换蛘叩诙结槄^(qū)不是基本上分別互補(bǔ)于靶標(biāo)核酸鏈的第一或者第二靶標(biāo)區(qū)時(shí)，診斷探針不能夠與靶標(biāo)核酸鏈穩(wěn)定雜交，不能形成高于指示穩(wěn)定雜交存在的閾值的探針靶標(biāo)雜交體。因而，可根據(jù)探針靶標(biāo)雜交體的存在與否來(lái)判斷樣品中是否存在靶標(biāo)核酸序列。
在本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用中，靶標(biāo)核酸和核酸探針可以是DNA、RNA或合成的改變了主鏈的DNA分子，如用硫酸或肽鍵替代磷酸鍵。
由于在缺乏穩(wěn)定雜交的情況下也可能產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以想到通過比較陽(yáng)性和陰性對(duì)照所產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)確定穩(wěn)定雜交存在或不存在。可以確定這樣一種閾值，用它來(lái)區(qū)分穩(wěn)定雜交與不穩(wěn)定(包括瞬時(shí))雜交，因而利用該閾值可以作為樣品中是否存在靶標(biāo)核酸序列的指標(biāo)。其中一個(gè)方法，在選擇出的預(yù)設(shè)條件下，陽(yáng)性對(duì)照樣品的最低值和陰性對(duì)照樣品的最高值之間的中間值可選擇為確定“陽(yáng)性”反應(yīng)的閾值。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，第一探針區(qū)和第二探針區(qū)分別與第一和第二靶標(biāo)區(qū)完全互補(bǔ)，但這不是必需的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，樣品/一條或多條靶標(biāo)核酸鏈源自被檢測(cè)的人體，但這也不是必需的。
雖然本發(fā)明的診斷探針上的第一和第二探針區(qū)可以是連續(xù)的，但這不是必需的。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，第一探針區(qū)和第二探針區(qū)可由間隔區(qū)分開，其中間隔區(qū)的核酸序列不互補(bǔ)于靶標(biāo)核酸鏈的位于第一靶標(biāo)區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)序列之間的序列，即所謂的“間插序列”。具體地，選擇間隔區(qū)以提供診斷探針的第一探針區(qū)和第二探針區(qū)核苷酸序列在互補(bǔ)中形成非連續(xù)互補(bǔ)，以致于只有在第一探針區(qū)和第二探針區(qū)分別基本上互補(bǔ)于第一和第二靶標(biāo)區(qū)時(shí)才形成穩(wěn)定的雜交體。根據(jù)本發(fā)明的方法另一個(gè)實(shí)施方式，不僅在第一和第二探針區(qū)之間存在間隔區(qū)，而且在所述靶標(biāo)核酸上的第一和第二靶標(biāo)區(qū)之間存在有間插序列。
探針上探針區(qū)之間的間隔區(qū)長(zhǎng)度通常多于一個(gè)核苷酸而少于350個(gè)核苷酸，優(yōu)選1到30，特別優(yōu)選3到10個(gè)核苷酸。在大部分情況下，間隔區(qū)不必超過10或20個(gè)核苷酸堿基的長(zhǎng)度。相反，靶標(biāo)核酸的靶標(biāo)區(qū)之間的間插序列長(zhǎng)度可為1到500或更多個(gè)堿基，優(yōu)選少于350個(gè)(1-350堿基)核苷酸。然而，間隔區(qū)長(zhǎng)度以及靶標(biāo)核酸鏈上的靶標(biāo)區(qū)之間的間插序列長(zhǎng)度都不應(yīng)當(dāng)過長(zhǎng)而影響探針區(qū)對(duì)它們各自相應(yīng)靶標(biāo)區(qū)的協(xié)同結(jié)合。此外，探針區(qū)和靶標(biāo)區(qū)的長(zhǎng)度也不應(yīng)當(dāng)長(zhǎng)到使任何一個(gè)探針區(qū)能獨(dú)立地與其靶標(biāo)區(qū)雜交，這種雜交依靠的是增加長(zhǎng)度(并因而增加退火溫度)而不要求其它探針區(qū)與其靶標(biāo)區(qū)進(jìn)行事先的瞬時(shí)雜交。只有當(dāng)兩個(gè)探針區(qū)均穩(wěn)定地與其各自的靶標(biāo)區(qū)雜交時(shí)才能產(chǎn)生高于指示靶標(biāo)核酸存在的閾值信號(hào)。
在另一方面，本發(fā)明教導(dǎo)了一種檢測(cè)在兩個(gè)或更多樣品核酸鏈上的兩個(gè)或更多個(gè)靶標(biāo)核酸序列的方法，其包括將被懷疑含有所述靶標(biāo)核酸序列的樣品與診斷探針在雜交條件下進(jìn)行接觸。第一靶標(biāo)核酸序列具有第一靶標(biāo)區(qū)和第一互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶(zone)。第二靶標(biāo)核酸序列具有第二靶標(biāo)區(qū)和第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶。所述診斷探針的核苷酸序列包括(1)第一探針區(qū)，基本上互補(bǔ)于所述第一靶標(biāo)核酸序列的特征性第一靶標(biāo)區(qū)，和(2)第二探針區(qū)，基本上互補(bǔ)于所述第二靶標(biāo)核酸序列的特征性第二靶標(biāo)區(qū)。對(duì)于選擇雜交條件的要求是，當(dāng)?shù)谝换パa(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶基本上互補(bǔ)于第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶，第一探針區(qū)基本上互補(bǔ)于第一靶標(biāo)區(qū)，第二探針區(qū)基本上互補(bǔ)于第二靶標(biāo)區(qū)時(shí)，則第一和第二探針區(qū)能夠使診斷探針與靶標(biāo)核酸穩(wěn)定雜交而形成可檢測(cè)的探針靶標(biāo)雜交體。然而，在選擇的雜交條件下，當(dāng)?shù)谝换パa(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶不是基本上互補(bǔ)于第二靶標(biāo)區(qū)帶，或第一探針區(qū)不是基本上互補(bǔ)于第一靶標(biāo)區(qū)，或第二探針區(qū)不是基本上互補(bǔ)于第二靶標(biāo)區(qū)時(shí)，則第一和第二探針區(qū)不能使診斷探針與靶標(biāo)核酸穩(wěn)定雜交，即不能形成高于指示穩(wěn)定雜交體存在的閾值的探針靶標(biāo)雜交體。檢測(cè)穩(wěn)定的探針靶標(biāo)雜交體的存在與否來(lái)指示在樣品中是否存在靶標(biāo)核酸序列。
在一些實(shí)施方式中，診斷探針上的第一和第二探針區(qū)由核酸序列間隔區(qū)分開。在另一些實(shí)施方式中，第一靶標(biāo)區(qū)和第一互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶被第一非互補(bǔ)區(qū)帶所隔開，或第二靶標(biāo)區(qū)和第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶由第二非互補(bǔ)區(qū)帶所隔開。
在一些包括互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶的實(shí)施方式中，第一靶標(biāo)區(qū)和第一互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶可由第一非互補(bǔ)區(qū)帶所隔開，或第二靶標(biāo)區(qū)和第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶可由第二非互補(bǔ)區(qū)帶所隔開。在這些實(shí)施方式中，第一和第二非互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶之間，以及它們與間隔區(qū)均不是基本上互補(bǔ)的。
在有間隔區(qū)的那些實(shí)施方式中，其間隔區(qū)通常多于一個(gè)核苷酸而少于350個(gè)核苷酸，優(yōu)選1到30，特別優(yōu)選3到10個(gè)核苷酸(堿基)。在大部分情況下，間隔區(qū)不必超過10或20個(gè)核苷酸堿基的長(zhǎng)度。相反，靶標(biāo)核酸上的靶標(biāo)區(qū)和互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶(CTZ)之間的非互補(bǔ)區(qū)帶(NCZ)的長(zhǎng)度可為1到500或更多個(gè)堿基，優(yōu)選少于350個(gè)(0-350堿基)核苷酸。然而，間隔區(qū)長(zhǎng)度以及在靶標(biāo)核酸鏈上的靶標(biāo)區(qū)之間非互補(bǔ)區(qū)帶的長(zhǎng)度都不應(yīng)當(dāng)過長(zhǎng)而影響探針區(qū)對(duì)它們各自相應(yīng)靶標(biāo)區(qū)的協(xié)同結(jié)合。此外，探針區(qū)、靶標(biāo)區(qū)和互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶的長(zhǎng)度也不應(yīng)當(dāng)長(zhǎng)到使任何一個(gè)探針區(qū)能獨(dú)立地與其相應(yīng)靶標(biāo)區(qū)雜交，這種雜交依靠的是增加長(zhǎng)度(并因而增加退火溫度)而不要求其它探針區(qū)與其靶標(biāo)區(qū)進(jìn)行事先的瞬時(shí)雜交，也不應(yīng)當(dāng)使互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)之間的形成穩(wěn)定雜交。只有當(dāng)兩個(gè)互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)能夠相互穩(wěn)定雜交和兩個(gè)探針區(qū)穩(wěn)定地與其各自的靶標(biāo)區(qū)雜交才能產(chǎn)生高于指示靶標(biāo)核酸存在的閾值信號(hào)。
在本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用中，靶標(biāo)核酸和核酸探針可以是DNA、RNA或合成的改變了主鏈的DNA分子，如用硫酸或肽鍵取代磷酸鍵。
由于在缺乏穩(wěn)定雜交的情況下也可能產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以想到通過比較陽(yáng)性和陰性對(duì)照所產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)確定穩(wěn)定雜交存在或不存在?？梢源_定這樣一種閾值，用它來(lái)區(qū)分穩(wěn)定雜交與不穩(wěn)定(包括瞬時(shí))雜交，因而利用該閾值可以作為樣品中是否存在靶標(biāo)核酸序列的指標(biāo)。其中一個(gè)方法，在選擇出的預(yù)設(shè)條件下，陽(yáng)性對(duì)照樣品的最低值和陰性對(duì)照樣品的最高值之間的中間值可選擇為確定“陽(yáng)性”反應(yīng)的閾值。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，第一探針區(qū)和第二探針區(qū)分別與第一和第二靶標(biāo)區(qū)完全互補(bǔ)，但這不是必需的。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方面，第一CTZ和CTZ分別與第一和第二靶標(biāo)區(qū)完全互補(bǔ)，但這不是必需的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，樣品/一條或多條靶標(biāo)核酸鏈來(lái)自被測(cè)人體，但這也不是必需的。
根據(jù)本發(fā)明，在同一探針上具有兩個(gè)(或多個(gè))序列區(qū)。在本發(fā)明中，缺口探針的兩個(gè)被隔開的部分應(yīng)當(dāng)足夠短以致它們本身不能達(dá)到充分的結(jié)合。最初的探針區(qū)可以基于欲檢測(cè)的等位基因中存在的獨(dú)特序列來(lái)設(shè)計(jì)。一旦最初設(shè)計(jì)被考慮后，探針的長(zhǎng)度通常是接下來(lái)需要考慮的重要因素。在非期望序列與預(yù)期的靶標(biāo)序列之間只有數(shù)個(gè)堿基對(duì)的差別(包括只有一個(gè)堿基對(duì)的差別)時(shí)，探針區(qū)的長(zhǎng)度尤其關(guān)鍵。兩個(gè)探針區(qū)均能與其靶標(biāo)序列結(jié)合(穩(wěn)定雜交)是產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)所必需的。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A(及1A’)和1B描述了本發(fā)明第一種實(shí)施方式，其中在靶標(biāo)樣品上的第一靶標(biāo)區(qū)是位于第二靶標(biāo)區(qū)的3’側(cè)，并由間插序列所隔開。
圖2A(及2A’)和2B描述了本發(fā)明第二種實(shí)施方式，其中在靶標(biāo)樣品上的第一靶標(biāo)區(qū)與第二靶標(biāo)區(qū)是連續(xù)的，診斷探針包括第一探針區(qū)和第二探針區(qū)及其它們之間的間隔區(qū)。
圖3A(及3A’)和3B描述了本發(fā)明第三種實(shí)施方式，其中在靶標(biāo)樣品上，第一靶標(biāo)區(qū)位于第二靶標(biāo)區(qū)的3’側(cè)，并由間插序列所隔開，診斷探針包括第一探針區(qū)和第二探針區(qū)及其它們之間的間隔區(qū)。
圖4A、4B、4C和4D描述了本發(fā)明第四種實(shí)施方式，其中在第一靶標(biāo)核酸鏈上，第一靶標(biāo)區(qū)位于第一互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶的3’側(cè)，且第二靶標(biāo)區(qū)位于第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶的5’側(cè)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及的核酸探針可以有許多種用途，但特別適用于檢測(cè)特定靶標(biāo)核苷酸序列的存在與否。不同于利用傳統(tǒng)的探針，本發(fā)明提供一種診斷探針，其包括在同一探針序列上存在兩個(gè)(或多個(gè))核酸探針區(qū)，優(yōu)選是非連續(xù)的。根據(jù)本發(fā)明，探針序列的兩個(gè)部分，即第一和第二探針區(qū)，可分別與第一和第二靶標(biāo)區(qū)特異的結(jié)合。第二探針區(qū)位于第一探針區(qū)的3’側(cè)。第二探針區(qū)優(yōu)選的位于第一探針區(qū)的下游并被隔開，但如果在樣品核酸鏈上的靶標(biāo)區(qū)之間是非連續(xù)的，則第一和第二探針區(qū)可以是連續(xù)的。
在本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用中，其中的一個(gè)探針區(qū)的功能是使探針最初和瞬時(shí)地與樣品核酸鏈的預(yù)期序列相結(jié)合。兩個(gè)探針區(qū)都具備這種功能，即任何一個(gè)探針區(qū)在開始時(shí)都能產(chǎn)生瞬時(shí)的結(jié)合。當(dāng)其中一個(gè)探針區(qū)瞬時(shí)結(jié)合后，另一個(gè)探針區(qū)則具有更合適的動(dòng)力學(xué)(依靠局部濃度效應(yīng))，以致于更容易識(shí)別附近的另一個(gè)序列(通常在數(shù)百個(gè)堿基對(duì)范圍內(nèi))。兩個(gè)探針區(qū)均能增加診斷探針對(duì)特定等位基因或其它靶標(biāo)序列的特異性。
每一個(gè)探針區(qū)的長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)短至不能使該探針區(qū)本身單獨(dú)與靶標(biāo)序列在所確定的雜交條件下形成穩(wěn)定雜交，以防止產(chǎn)生錯(cuò)誤的陽(yáng)性信號(hào)。一個(gè)探針區(qū)與其相應(yīng)的靶標(biāo)區(qū)之間的瞬時(shí)退火可導(dǎo)致其它探針區(qū)在其相應(yīng)靶標(biāo)區(qū)的局部濃度增加，進(jìn)而達(dá)到使其它探針區(qū)對(duì)其相應(yīng)的靶標(biāo)區(qū)之間的退火，最終使探針與樣品之間形成穩(wěn)定雜交。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，設(shè)計(jì)的第一和第二探針區(qū)應(yīng)當(dāng)滿足在選定的雜交條件下，當(dāng)兩個(gè)探針區(qū)基本上互補(bǔ)于各自的靶標(biāo)區(qū)時(shí)，則形成可檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，而在相同雜交條件下，如果任何一個(gè)探針區(qū)不是與其相應(yīng)的靶標(biāo)區(qū)基本上互補(bǔ)，則不形成高于指示靶標(biāo)序列存在的閾值的可檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。可以這樣理解，在實(shí)際操作中，本發(fā)明診斷探針的選擇性依賴于雜交條件的選擇。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員都知曉退火溫度越高通常要求更長(zhǎng)的探針區(qū)序列，而退火溫度越低則通常需要越短的探針區(qū)序列。其它因素如反應(yīng)物濃度、探針和樣品核酸鏈中的GC含量也影響著診斷探針的設(shè)計(jì)和雜交條件的選擇。
圖1描述了本發(fā)明的一種實(shí)施方式，用于檢測(cè)樣品核酸鏈上是否存在靶標(biāo)核酸序列的診斷探針，所包括的第一和第二探針區(qū)之間沒有間隔區(qū)所隔開。具體地，圖1A表示的是第一探針區(qū)與第一靶標(biāo)區(qū)之間形成的瞬時(shí)雜交，其中樣品核酸上第一靶標(biāo)區(qū)位于第二靶標(biāo)區(qū)的3’側(cè)，并由間插序列所隔開。圖1A’表示第二探針區(qū)與第二靶標(biāo)區(qū)之間形成的瞬時(shí)雜交，其中樣品核酸上第二靶標(biāo)區(qū)位于第一靶標(biāo)區(qū)的5’側(cè)，并由間插序列所隔開。
一個(gè)探針區(qū)與其相應(yīng)靶標(biāo)區(qū)的瞬時(shí)雜交造成局部濃度效應(yīng)，以致于在選定的雜交條件下，診斷探針上的其它探針區(qū)將能與其相應(yīng)的靶標(biāo)區(qū)形成穩(wěn)定雜交。進(jìn)一步考慮靶標(biāo)和診斷探針的同一性來(lái)選擇雜交條件，以便在第一探針區(qū)不是與第一靶標(biāo)區(qū)基本上互補(bǔ)或者第二探針區(qū)不是與第二靶標(biāo)區(qū)基本上互補(bǔ)的情況下，診斷探針不與靶標(biāo)核酸鏈穩(wěn)定雜交，即不形成可檢測(cè)探針靶標(biāo)雜交體。圖1B表示診斷探針上的兩個(gè)探針區(qū)與在樣品核酸上的各自靶標(biāo)區(qū)分別雜交，因而在與診斷探針雜交的樣品核酸鏈上形成了由樣品核酸鏈上的靶標(biāo)區(qū)之間的間插序列所構(gòu)成的環(huán)。在圖1B中，表示所形成的探針靶標(biāo)穩(wěn)定雜交體。
圖2描述了本發(fā)明第二種實(shí)施方式，其中用于檢測(cè)在靶標(biāo)核酸鏈?zhǔn)欠翊嬖诘脑\斷探針，所包括的第一探針區(qū)和第二探針區(qū)由位于中間的間隔區(qū)所隔開。在這種情況下，在靶標(biāo)樣品上的第一靶標(biāo)區(qū)與第二靶標(biāo)區(qū)是連續(xù)的。具體地，圖2A表示第一探針區(qū)與第一靶標(biāo)區(qū)之間形成的瞬時(shí)雜交，其中在靶標(biāo)核酸上的第一靶標(biāo)區(qū)位于第二靶標(biāo)區(qū)的3’端。圖2A’表示第二探針區(qū)與第二靶標(biāo)區(qū)之間形成的瞬時(shí)雜交，其中靶標(biāo)核酸的第二靶標(biāo)區(qū)位于第一靶標(biāo)區(qū)的5’端。
圖2B表示診斷探針上的第一和第二探針區(qū)與在樣品核酸上的第一和第二靶標(biāo)區(qū)分別雜交，因而在診斷探針上形成了由探針區(qū)之間的間隔區(qū)所構(gòu)成的環(huán)，這是由于間隔區(qū)不能與樣品/靶標(biāo)核酸鏈上的序列雜交所致。在圖2B中，表示所形成的探針靶標(biāo)穩(wěn)定雜交體。
圖3描述了本發(fā)明第三種實(shí)施方式，其中用于檢測(cè)在靶標(biāo)核酸鏈?zhǔn)欠翊嬖诘脑\斷探針包括了由間隔區(qū)隔開的第一探針區(qū)和第二探針區(qū)。在這個(gè)實(shí)施方式中，在靶標(biāo)樣品上的第一靶標(biāo)區(qū)與第二靶標(biāo)區(qū)之間由間插序列所隔開。相應(yīng)地，圖3表示了將圖1和圖2中所示實(shí)施方式的特征結(jié)合起來(lái)的一個(gè)實(shí)施方式。具體地，圖3A表示第一探針區(qū)與第一靶標(biāo)區(qū)之間形成的瞬時(shí)雜交，其中在靶標(biāo)核酸上的第一靶標(biāo)區(qū)位于第二靶標(biāo)區(qū)的3’側(cè)。圖3A’表示第二探針區(qū)與第二靶標(biāo)區(qū)之間形成的瞬時(shí)雜交，其中靶標(biāo)核酸上第二靶標(biāo)區(qū)位于第一靶標(biāo)區(qū)的5’側(cè)。
圖3B表示診斷探針上的第一和第二探針區(qū)與在樣品核酸鏈上的第一和第二靶標(biāo)區(qū)分別雜交，由于這兩個(gè)環(huán)之間的序列不是基本上互補(bǔ)，因而在診斷探針上形成了由探針區(qū)之間的間插區(qū)所構(gòu)成的環(huán)，同時(shí)在樣品核酸鏈上形成了靶標(biāo)區(qū)之間的間插序列所構(gòu)成的環(huán)。在圖3B中，表示所形成的探針靶標(biāo)穩(wěn)定雜交體。
雖然圖1、2和3中顯示，在靶標(biāo)核苷酸鏈上的第一靶標(biāo)區(qū)位于第二靶標(biāo)區(qū)的3’端，這只是為了說(shuō)明性目的。在其它實(shí)施方式中，第一靶標(biāo)區(qū)可以位于第二靶標(biāo)區(qū)的5’端。也可以實(shí)施包含兩個(gè)以上靶標(biāo)區(qū)和兩個(gè)以上探針區(qū)的實(shí)施方式。
在本發(fā)明另外的實(shí)施方式中，探針區(qū)可以與靶標(biāo)區(qū)雜交，其中靶標(biāo)區(qū)位于不同的靶標(biāo)核酸鏈上，且在其中一個(gè)靶標(biāo)核酸鏈上存在至少一個(gè)區(qū)帶，該區(qū)帶基本上與存在于其它靶標(biāo)核酸鏈上的一個(gè)區(qū)帶互補(bǔ)。
其中，第一靶標(biāo)核酸鏈包含至少兩個(gè)感興趣的序列。第一靶標(biāo)核酸鏈上的第一個(gè)序列作為第一靶標(biāo)區(qū)，基本上互補(bǔ)于第一探針區(qū)。第一靶標(biāo)核酸鏈上的第二個(gè)序列作為第一互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶(CTZ)，基本上互補(bǔ)于在第二核酸鏈上的第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶(CTZ)。第一CTZ與第一靶標(biāo)區(qū)之間可以由第一非互補(bǔ)區(qū)帶(NCZ)所隔開，該NCZ的長(zhǎng)度優(yōu)選少于350個(gè)核苷酸堿基(0-350個(gè)堿基)，但也可長(zhǎng)達(dá)500個(gè)核苷酸堿基或更長(zhǎng)。
在第二靶標(biāo)核酸鏈上包含至少兩個(gè)感興趣的序列。第二靶標(biāo)核酸鏈第一個(gè)序列作為第二靶標(biāo)區(qū)，基本上互補(bǔ)于第二探針區(qū)。第二靶標(biāo)核酸鏈的第二個(gè)序列是第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶(CTZ)，它基本上互補(bǔ)于第一靶標(biāo)核酸鏈上的第一互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶(CTZ)。第二CTZ與第二靶標(biāo)區(qū)之間可為第二非互補(bǔ)區(qū)帶(NCZ)所隔開，該NCZ的長(zhǎng)度優(yōu)選少于350個(gè)核苷酸堿基(0-350個(gè)堿基)，但也可長(zhǎng)達(dá)500個(gè)核苷酸堿基或更長(zhǎng)。
在本發(fā)明前面的實(shí)施方式和各個(gè)方面中所涉及的原則，至少在雜交特性方面也同樣適用于該實(shí)施方式和其它涉及CTZ的實(shí)施方式。具體地，對(duì)于穩(wěn)定雜交而言，要求第一探針區(qū)和第一靶標(biāo)區(qū)之間、第二探針區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)之間基本上互補(bǔ)。此外，在這些涉及CTZ的實(shí)施方式中，為了第一探針區(qū)和第一靶標(biāo)區(qū)之間、第二探針區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)之間形成穩(wěn)定雜交，則第一CTZ必須基本上互補(bǔ)于第二CTZ。然而，與前面的實(shí)施方式不同，在這些涉及CTZ的實(shí)施方式中，第一探針區(qū)不需要位于第二探針區(qū)的5’端。
圖4是本發(fā)明第四種實(shí)施方式，其中用于檢測(cè)在兩個(gè)靶標(biāo)核酸鏈?zhǔn)欠翊嬖诘脑\斷探針包括了由間隔區(qū)隔開的第一探針區(qū)和第二探針區(qū)，其中第一探針區(qū)位于第二探針區(qū)的5’端。在這個(gè)實(shí)施方式中，第一靶標(biāo)區(qū)和第一CTZ存在于第一靶標(biāo)核酸鏈，而第二靶標(biāo)區(qū)和第二CTZ位于第二靶標(biāo)核酸鏈上。具體地，圖4A顯示在雜交之前的第一和第二靶標(biāo)核酸鏈、診斷探針。圖4B顯示在第一和第二CTZ之間形成穩(wěn)定的雜交。圖4C顯示第一探區(qū)與第一靶標(biāo)區(qū)形成的瞬時(shí)雜交，其中在第一靶標(biāo)核酸上的第一靶標(biāo)區(qū)位于第一CTZ的3’端。在圖4D中，表示所形成的探針靶標(biāo)穩(wěn)定雜交體。
雖然圖4顯示，第一CTZ位于第一靶標(biāo)區(qū)的5’端，第二CTZ位于第二靶標(biāo)區(qū)的3’端，但在其它的實(shí)施方式中，CTZ不一定是這種位置關(guān)系。即，在同一核酸鏈上，CTZ可以相對(duì)于靶標(biāo)區(qū)位于不同的位置。例如，第一CTZ可在第一探針區(qū)的3’端，而不是5‘端。另外的實(shí)施方式中，第二CTZ可位于第二靶標(biāo)區(qū)的5’端，而不是3’端。還可采用這樣實(shí)施方式，即第一CTZ位于第一探針區(qū)的3’端，而第二CTZ位于第二靶標(biāo)區(qū)的5’端。此外，雖然在圖4中顯示的是第一探針區(qū)位于第二探針區(qū)的5’端，但并不是非得如此。例如，在別的實(shí)施方式中，第一探針區(qū)可以位于第二探針區(qū)的3’端。而且，在涉及CTZ的實(shí)施方式中，診斷探針可以含有也可以不含間隔區(qū)，或在兩個(gè)靶標(biāo)核酸鏈中的一個(gè)或兩個(gè)不包括NCZ。
在涉及CTZ的實(shí)施方式中，CTZ可以多于一對(duì)，也就是說(shuō)，在兩個(gè)(或更多個(gè))靶標(biāo)核酸鏈之間可以有多個(gè)互補(bǔ)區(qū)帶。在有些實(shí)施方式中，可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)將一個(gè)或多個(gè)CTZ整合到一個(gè)靶標(biāo)核酸鏈中。具體地，當(dāng)PCR反應(yīng)用于產(chǎn)生靶標(biāo)核酸鏈時(shí)，利用一個(gè)或多個(gè)PCR引物可以摻入一個(gè)核酸區(qū)域，該區(qū)域與與另一個(gè)靶標(biāo)核酸鏈上的區(qū)域互補(bǔ)。在這些有多對(duì)CTZ的實(shí)施方式中，在所述核苷酸鏈中的兩個(gè)CTZ之間為一個(gè)NCZ所隔開。
圖1-4中顯示，診斷探針的5’端附著于固體支持物上。然而，這只是說(shuō)明性的。根據(jù)本發(fā)明的診斷探針也可以在3’端或其它位置進(jìn)行附著。
根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)核酸鏈可以源自任何天然材料或人工材料，包括人。
使用本發(fā)明方法的診斷探針，可以增加雜交分析的選擇性，因?yàn)樗昧藘蓚€(gè)以上獨(dú)特序列來(lái)作為檢測(cè)的選擇性標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)本發(fā)明，選擇合適的診斷探針使得可以分辯在雜合情況中出現(xiàn)的模棱兩可，這種導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不明確的原因是只利用常規(guī)設(shè)計(jì)的探針時(shí)，對(duì)兩個(gè)不同等位基因構(gòu)成的等位基因?qū)Φ臋z測(cè)結(jié)果完全同于對(duì)另外的等位基因?qū)Φ臋z測(cè)結(jié)果。
利用本發(fā)明方法的診斷探針，通過應(yīng)用多于一個(gè)的與感興趣核酸序列同源的序列區(qū)，可以達(dá)到在對(duì)特定等位基因或等位基因?qū)?set)的識(shí)別中具有更高的特異性。增加核酸序列同源性的特異性識(shí)別提高了許多基于DNA的檢測(cè)方法的檢測(cè)能力。這些檢測(cè)方法包括基于核酸序列的存在與否而進(jìn)行的HLA組織分型(tissue typing)、遺傳性疾病的檢測(cè)、在組織中感染性生物體的檢測(cè)或其它各種標(biāo)記或條件的檢測(cè)(如檢測(cè)基因治療技術(shù)的有效性)。
術(shù)語(yǔ)“核苷酸”在此處是指在DNA或RNA中的核苷酸，因而包括了腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶為堿基，以脫氧核糖或核糖為糖元。然而，在本發(fā)明所使用的診斷探針中也可采用其它與常規(guī)堿基即腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的某一個(gè)配對(duì)的修飾堿基。這種修飾堿基包括，如8-氮鳥嘌呤和次黃嘌呤。
在此處所述的與核苷酸相關(guān)術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)于”是指一個(gè)核苷酸可與另一個(gè)特定的核苷酸形成堿基對(duì)。例如，腺苷三磷酸與尿苷三磷酸或胸苷三磷酸互補(bǔ)、鳥苷三磷酸與胞苷三磷酸互補(bǔ)。但在合適條件下，胸苷三磷酸與鳥苷三磷酸可以形成堿基對(duì)，這在本說(shuō)明書中不被認(rèn)為是互補(bǔ)。同樣，胞苷三磷酸與腺苷三磷酸之間在特定條件下也能形成堿基對(duì)，在本發(fā)明中也不被認(rèn)為是互補(bǔ)。這也適合于胞苷三磷酸和尿苷三磷酸之間的情況。
術(shù)語(yǔ)“順式(cis)”是指兩個(gè)(或更多個(gè))靶標(biāo)區(qū)位于同一DNA鏈上的情形，即它們是同一等位基因的一部分。相反，術(shù)語(yǔ)“反式(trans)”是指兩個(gè)(或更多個(gè))靶標(biāo)區(qū)位于不同的DNA鏈上的情形，即它們是不同等位基因的一部分。
術(shù)語(yǔ)“連續(xù)”是指位于同一核酸鏈上的兩個(gè)序列、區(qū)、區(qū)帶、段等的核酸相互之間相鄰且無(wú)任何間隔。即在兩個(gè)序列之間不存在間隔區(qū)、間插序列或非互補(bǔ)區(qū)帶。
在此處的診斷探針被選擇為“基本上”互補(bǔ)于另外的鏈上被檢測(cè)的每一個(gè)特定序列。這意指診斷探針必須與它們各自的鏈足夠互補(bǔ)以形成雜交。因此，診斷探針序列不必與樣品/靶標(biāo)核酸序列完全一致。從而，探針序列(包括診斷探針上的第一和第二探針區(qū))不必完全互補(bǔ)于靶標(biāo)序列。因而，不是所有探針都產(chǎn)生與負(fù)等位基因的陰性對(duì)照相似的完全的負(fù)信號(hào)。根據(jù)錯(cuò)配堿基的數(shù)目和錯(cuò)配堿基的類型(G-T錯(cuò)配有時(shí)也產(chǎn)生與G-C配對(duì)大致相同的信號(hào))，1個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配的等位基因產(chǎn)生熒光信號(hào)基本上高于負(fù)對(duì)照。然而，只要真正陽(yáng)性等位基因的信號(hào)明顯高于那些潛在的交叉反應(yīng)的等位基因，通?？梢源笥?0-20％作為閾值或分離點(diǎn)來(lái)區(qū)分陽(yáng)性和陰性反應(yīng)。
通常在探針序列的中部可以容忍少數(shù)的錯(cuò)配而仍然可以雜交。一般而言，容忍錯(cuò)配堿基的程度依賴于探針的長(zhǎng)度，反過來(lái)也影響變性和退火溫度的選擇。如果探針的變性溫接近或高于退火溫度(較低的嚴(yán)謹(jǐn)條件)，那么雖然有少數(shù)(通常1或2個(gè)，最多3個(gè))的錯(cuò)配堿基，其探針仍然能與靶標(biāo)序列結(jié)合。一個(gè)探針區(qū)可能在其序列的中部會(huì)容忍更多的錯(cuò)配堿基，但這種容忍程度同樣決定于探針區(qū)的變性溫度和所選擇的雜交和檢測(cè)條件中的退火溫度。類似的參數(shù)也適用于互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶序列。優(yōu)選第一和第二探針區(qū)，以及第一和第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶與它們各自的靶標(biāo)區(qū)或區(qū)帶完全互補(bǔ)。然而，這些區(qū)或區(qū)帶之間的完全互補(bǔ)并不是必需的。
診斷序列-特異性寡核苷酸探針檢測(cè)(SSO)系統(tǒng)是一種利用診斷探針分析特定靶標(biāo)核酸序列是否存在的系統(tǒng)或設(shè)計(jì)。在這種系統(tǒng)或設(shè)計(jì)中，可用接頭將診斷探針附著于支持物上，接頭是本領(lǐng)域熟知的如聚碳(poly-carbon)和聚核苷酸接頭?？蛇x地，靶標(biāo)序列可固定在固體支持物上，例如硝酸纖維素膜而診斷探針溶解在溶液中。在SSO中的診斷探針包括至少一個(gè)探針區(qū)。術(shù)語(yǔ)“探針區(qū)”指基本上互補(bǔ)于靶標(biāo)核苷酸序列一部分的存在于診斷探針上的核苷酸序列。該靶標(biāo)核苷酸鏈上與探針區(qū)基本上互補(bǔ)的部分被稱作“靶標(biāo)區(qū)”。在那些涉及多個(gè)靶標(biāo)核苷酸鏈的實(shí)施方式中，可以在每一個(gè)靶標(biāo)核苷酸鏈上具有一個(gè)特定核苷酸序列即“互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶”(CTZ)，而且一個(gè)靶標(biāo)鏈上的CTZ基本上互補(bǔ)另一個(gè)靶標(biāo)鏈上CTZ。將靶標(biāo)區(qū)與在特定靶標(biāo)核苷酸鏈上的CTZ分隔開的序列被稱為非互補(bǔ)區(qū)帶(NCZ)，且一個(gè)靶標(biāo)鏈的NCZ不是基本上互補(bǔ)于另一個(gè)靶標(biāo)鏈的NCZ。然而，NCZ不是必需的。
缺口探針(gap probe)是指特定類型的探針，即包含一個(gè)以上的探針區(qū)。缺口探針中的探針區(qū)之間可以有間隔區(qū)，也可以沒有?！伴g隔區(qū)”是指在兩個(gè)探針區(qū)之間的核苷酸序列，如果在靶標(biāo)核苷酸序列上的相應(yīng)靶標(biāo)區(qū)之間存在間插序列，則間隔區(qū)與間插序列之間不是基本上互補(bǔ)的。如果在靶標(biāo)核苷酸序列上的靶標(biāo)區(qū)與CTZ之間存在非互補(bǔ)區(qū)帶，則“間隔區(qū)”也不是基本上互補(bǔ)于非互補(bǔ)區(qū)帶。探針靶標(biāo)雜交體是包括診斷探針與靶標(biāo)核苷酸序列穩(wěn)定雜交的復(fù)合體。
可對(duì)探針或靶標(biāo)序列進(jìn)行標(biāo)記。直接的熒光化合物、生物素、FITC或地高辛(Dig)可用作標(biāo)記(tag)。對(duì)于非直接檢測(cè)，可用熒光或酶聯(lián)抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白(Avidine/Strepavidine)(用于檢測(cè)生物素)、抗-FITC抗體(用于檢測(cè)FITC)、抗-Dig抗體(用于檢測(cè)Dig)來(lái)作檢測(cè)之用。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，用羧基基團(tuán)進(jìn)行修飾的乳膠珠(latexbead)可用于固定探針。在珠上的羧基首先用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDC)進(jìn)行活化，然后EDC-活化羧基基團(tuán)與寡聚探針5’端的氨基基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。另外一個(gè)實(shí)施方式是用氨基與氨基、硫酸基與氨基進(jìn)行連接，及使用其它化學(xué)物質(zhì)。
通過下面描述性的實(shí)施例可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例1在該實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明單個(gè)的缺口探針包括第一探針區(qū)和第二探針區(qū)，用于將HLA DRB1*0308和HLA DRB1*1107等位基因與其它等位基因區(qū)別開來(lái)。而常規(guī)探針，OLR4040(5’-GCCTGATGAGGAGTACTG-3’)(SEQ ID NO5)是設(shè)計(jì)用于檢測(cè)DRB1第58位氨基酸密碼子的GAG。探針OLR4093-2(5’-AAGCGGGGCCGGGTG-3’)(SEQ ID NO6)可以識(shí)別AAG CGGGGC(SEQ ID NO8)的互補(bǔ)序列，該序列位于DRB1的第71-72位氨基酸處。然而，HLA DRB1*0308和HLA DRB1*1107等位基因均包含了這兩個(gè)探針的序列而均能發(fā)生雜交。因而，這些等位基因使得在分析DRB1雜合性反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生許多不明確的結(jié)果。表1列出了這些DRB1等位基因和缺口探針及用于檢測(cè)它們的常規(guī)探針序列之間的關(guān)系。
表1顯示等位區(qū)域和探針序列的序列特征。在該實(shí)施例中的等位基因包含兩個(gè)序列區(qū)即分別稱為“區(qū)域1”和“區(qū)域2”。并顯示了對(duì)于每一個(gè)區(qū)域的氨基酸位置。表中序列是從左到右的順序，當(dāng)達(dá)到一行的末端或雙斜線“//”時(shí)(以先終止的為準(zhǔn))則就是序列末端。而且序列是連續(xù)的。例如，參照(等位基因)包含SEQ ID NO1和SEQ IDNO2。SEQ ID NO1是連續(xù)的序列，相應(yīng)于區(qū)域1，開始于“CGG”而末端為“TGG”，并終止于“//”。SEQ ID NO2作為連續(xù)序列，相應(yīng)于區(qū)域2，開始于“GAG”而末端為“GTG”。
對(duì)于除參照序列之外的其它序列類型，當(dāng)出現(xiàn)“-”時(shí)，則表示該特定序列包含的這個(gè)核苷酸堿基與參照(等位基因)相應(yīng)的位置相同。當(dāng)出現(xiàn)核苷酸字母而不是“-”時(shí)，則表示該特定序列包含的是字母所示核苷酸堿基而不是對(duì)照(等位基因)相應(yīng)位置的堿基。當(dāng)既不是“-”也沒有出現(xiàn)字母時(shí)，則該特定序列不包括相應(yīng)位置的核苷酸堿基。表中序列直接按順閱讀直到“//”或該行的末端，不管哪一個(gè)先出現(xiàn)均形成連續(xù)序列。(在有些表中，某一行可能延續(xù)到下一頁(yè)。)。對(duì)于探針而言，由于不存在“//”，故其序列直接按順序排列而成為一個(gè)連續(xù)的序列，而不同于等位基因中被分隔開的兩個(gè)各別的連續(xù)序列。
探針OLR-4431-3包括一個(gè)中間區(qū)(inter-region)。中間區(qū)與等位基因序列不相應(yīng)，而是人工序列。人工序列的例子包括診斷探針上的“間隔區(qū)”，如探針OLR-4431-3的“TTTT”。多于一個(gè)的等位基因可能共同擁有一個(gè)特定的序列編號(hào)(ID number)，因?yàn)榈任换蛟谔囟▍^(qū)域具有共同的序列。例如，表1中的對(duì)照等位基因DRB1*0101和DRB1*03011的等位基因系列均在區(qū)域1具有共同的序列，即相應(yīng)于SEQ ID NO1。然而，這兩個(gè)等位基因在區(qū)域2相應(yīng)部分的序列有差別。
上述關(guān)于表1中的結(jié)構(gòu)說(shuō)明同樣適用于表3、5、7、9和11。
由DRB1*0308和DRB1*1107等位基因所造成的混淆(即檢測(cè)結(jié)果無(wú)法分辨)，傳統(tǒng)的解決辦法是進(jìn)行第二輪PCR，要么只擴(kuò)增DRB1*03xx，要么只擴(kuò)增DRB1*11xx，然后重復(fù)探針雜交過程。因此，將DRB1*0308和DRB1*1107與其它相似的那些等位基因在第一輪PCR和探針雜交中區(qū)別開來(lái)，以避免進(jìn)一步的PCR和雜交，這是非常有好處的。
具體地說(shuō)，HLA基因的擴(kuò)增和與固定于微球體上的探針之間的DNA雜交反應(yīng)可按如下方法進(jìn)行。用包含大約1ng/微升的基因組DNA和10微摩爾相應(yīng)的序列特異性生物素化的引物，按照事先確定的熱循環(huán)程序來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增反應(yīng)。5微升的反應(yīng)混合物中包含了擴(kuò)增的HLA-DRB1外顯子2區(qū)域，進(jìn)行變性、中和后，與存在于1M NaCl和70mM磷酸鈉緩沖液的固定有探針的微球體進(jìn)行混合(每次實(shí)驗(yàn)中每個(gè)探針用1000微球體)。于60℃溫育15分鐘以進(jìn)行雜交反應(yīng)。向混合物中加入2倍體積的50nM NaCl溶液(預(yù)熱到60℃)，并離心5分鐘。在不破壞沉淀的微球體的情況下，去除上清液。重復(fù)洗滌步驟2次。
用3倍體積5微克每微升的藻紅蛋白-鏈霉素抗生素共軛體對(duì)雜交后的DNA進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記的混合物在60℃溫育5分鐘后，按上述方法進(jìn)行洗滌。洗滌后的微球體重懸于80微升50nM NaCl中。用Luminex 100 Flow Analyzer在580nm下對(duì)注入的微球體進(jìn)行激發(fā)、檢測(cè)和計(jì)數(shù)熒光信號(hào)，而獲得雜交信號(hào)。在每次實(shí)驗(yàn)中用大約100-200微球體進(jìn)行分析以計(jì)算出每個(gè)探針的中值熒光強(qiáng)度(MFI)。獲得每個(gè)探針的MFI后即可利用合適的陽(yáng)性對(duì)照探針的MFI計(jì)算出相對(duì)雜交信號(hào)。
陽(yáng)性對(duì)照探針可以識(shí)別在所有等位基因上的非多態(tài)性區(qū)域，該區(qū)域可通過特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。本發(fā)明中所述的靶標(biāo)核酸鏈包括經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增出的等位區(qū)域。陽(yáng)性對(duì)照探針用于提供參照信號(hào)，以便估計(jì)擴(kuò)增的DNA(擴(kuò)增子，amplicon)在量上的差異。陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)用于計(jì)算所有診斷探針的相對(duì)信號(hào)，即診斷探針信號(hào)相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)的百分率。對(duì)于DRB1的外顯子2，所用的陽(yáng)性對(duì)照探針序列是5’-ggAACAgCCAgAAggAC-3’(SEQ ID NO9)。
根據(jù)本發(fā)明，稱為OLR4431-3的缺口探針具有的序列為5’-CTGATGAGGAGTACTTTTAGCAGAAGCGGGG-3’(SEQ ID NO7)，其包括了兩個(gè)探針區(qū)以對(duì)靶標(biāo)核酸序列進(jìn)行雜交(包括DRB1*0308和DRB1*1109)。第一個(gè)探針區(qū)即CTGATGAGGAGTAC(SEQ ID NO10)可以與第一靶標(biāo)區(qū)雜交，第二探針區(qū)即AGCAGAAGCGGGG(SEQ IDNO11)可以與第二靶標(biāo)區(qū)雜交。兩個(gè)探針區(qū)之間由4個(gè)T所隔開，這4個(gè)T序列不與靶標(biāo)序列雜交。對(duì)于在第58位密碼子只含有GAG而沒有第71-73位密碼子的AAG CGG GGC(SEQ ID NO8)序列的DRB1，利用該缺口探針?biāo)玫降臒晒庑盘?hào)＜1％，因而有效排除了這種DRB1所產(chǎn)生的假陽(yáng)性信號(hào)。該探針與第71-73位有AAG CGGGGC(SEQ ID NO8)而第58位不含有GAG的DRB1等位基因也可產(chǎn)生＜20％熒光信號(hào)。在下面的表2中所顯示的數(shù)據(jù)中，所述缺口探針與包含DRB1*0308的樣品可產(chǎn)生幾乎90％的陽(yáng)性對(duì)照探針信號(hào)強(qiáng)度。相應(yīng)地，可容易的建立確定陽(yáng)性反應(yīng)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)(通常是陽(yáng)性對(duì)照最低值和陰性對(duì)照最高值之間的中間值)?？紤]到在骨髓捐贈(zèng)人登記時(shí)，檢測(cè)所需要的樣品數(shù)量，根據(jù)上述提供的方法可以區(qū)分DRB1*0308和DRB1*1107是否存在，那么可明顯節(jié)約時(shí)間和成本。
實(shí)施例2在用SSO方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)中，在HLA-A位點(diǎn)的血清學(xué)水平DNA類型中有如下兩個(gè)最常導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不明確的原因。第一個(gè)是，A*03011和A*2501雜合體與A*3204和A*6601雜合體具有很高頻率的相同反應(yīng)模式。第二個(gè)是，A*3201和A*6601雜合體與A*2502和A*7401雜合體具有很高頻率的相同反應(yīng)模式。用可以識(shí)別只存在于A*2501和A*2502中的兩個(gè)靶標(biāo)區(qū)的特異性探針將極大的減少在對(duì)上述雜合體進(jìn)行檢測(cè)中的第二輪檢測(cè)。
在這個(gè)實(shí)施例中，單個(gè)的缺口診斷探針即A166-2，由一個(gè)短的間隔區(qū)所隔開的兩個(gè)探針區(qū)組成，可將A*2501-2504的一些基因型與相當(dāng)多的其它HLA-A基因型區(qū)分開來(lái)，下面的表3列出了這些HLA-A等位基因序列和用于檢測(cè)它們的缺口探針和常規(guī)探針序列之間的關(guān)系。利用其中的兩個(gè)常規(guī)探針可確定基因組中是否存在兩個(gè)靶標(biāo)區(qū)，但不能確定這些靶標(biāo)區(qū)是否位于等位基因?qū)χ械耐粭l(cis)或不同條的(trans)等位基因上。探針A104-11，具有一個(gè)識(shí)別序列，可確定約第62位密碼子到約第68位密碼子所顯示的靶標(biāo)核酸序列(表3)是否存在。探針A150-19，也只具有一個(gè)識(shí)別序列，可確定約第77位密碼子到約第85位密碼子所顯示的靶標(biāo)核酸序列(表3)是否存在。

缺口探針與兩個(gè)靶標(biāo)區(qū)的結(jié)合表明存在著兩個(gè)靶標(biāo)區(qū)以順式存在的等位基因，其中。該結(jié)果可將其與兩個(gè)靶標(biāo)區(qū)雖然都存在但為反式的等位基因區(qū)別開來(lái)。對(duì)于反式存在的兩個(gè)靶標(biāo)區(qū)，常規(guī)探針可以與它們各自的靶標(biāo)區(qū)結(jié)合，但缺口探針則不會(huì)結(jié)合，因?yàn)閷?duì)兩個(gè)靶標(biāo)區(qū)中的一個(gè)所具有的親合力不足以在這些雜交條件下形成穩(wěn)定的結(jié)合。因而，例如，可以區(qū)分基因型A*2501/A*03011的等位基因?qū)εc基因型A*3204/A*6601的等位基因?qū)?。A166-2只結(jié)合至少含有一個(gè)A*25等位基因的樣品，而A104-11和A150-19都能結(jié)合兩種等位基因?qū)Φ腄NA。
探針A104-11可以與任何包含相應(yīng)HLA-A靶標(biāo)序列(在該實(shí)驗(yàn)中的等位基因A*2501、A*68011、A*6601和A*6802)的DNA(9008、Ter250、9057和Ter259)進(jìn)行很好的結(jié)合。A150-19可以與任何包含相應(yīng)靶標(biāo)序列(在該實(shí)驗(yàn)中的等位基因A*2501和A*3201)的DNA(9008、Ter250、9035和Ter259)進(jìn)行很好的結(jié)合。單獨(dú)用這兩個(gè)常規(guī)探針A104-11和A150-19不能區(qū)分下述DNA即不能確定是以反式包含這兩種靶標(biāo)序列的雜合DNA，例如Ter259(A*2501/A*6802)，還是以順式包含這兩靶標(biāo)序列的DNA(純合A*2501)或Ter250(雜合A*2501)。然而，A166-2只對(duì)包含順式構(gòu)型DNA 9008(61.9％)和Ter(46.8％)的A*2501有很好的結(jié)合。對(duì)于A位點(diǎn)的外顯子2，所用的陽(yáng)性對(duì)照序列為5’-gCTACTACAACCAgAgCgAg-3’(SEQ ID NO20)。
實(shí)施例3在本實(shí)施例中，缺口探針即B204被用于確定識(shí)別序列是否以順式存在。下面的表5列出了這種等位基因和其它HLA-B等位基因及用于檢測(cè)它們的缺口探針和常規(guī)探針之間的序列關(guān)系。DNA#1067包含等位基因B*1521，包含了探針B106的靶標(biāo)區(qū)，但沒有B153的靶標(biāo)區(qū)。反向(conversely)DNA的#1064和Ter244純合的包含了探針B153的靶標(biāo)區(qū)的等位基因。DNA#124包含探針B106和B153在HLA-B中的靶標(biāo)區(qū)。然而，探針B204的信號(hào)對(duì)于這些DNA而言呈陰性，因?yàn)槊總€(gè)靶標(biāo)區(qū)都位于不同的等位基因上，即以反式構(gòu)型存在。探針B204的信號(hào)對(duì)于Ter250 DNA(等位基因B*1523)和9035(B*3801)而言呈陽(yáng)性，因?yàn)樗鼈儼陌袠?biāo)區(qū)在同一個(gè)等位基因上，即以順式構(gòu)型存在。
針對(duì)第64-68位氨基酸密碼子序列的探針B106可以識(shí)別至少73個(gè)HLA-B位點(diǎn)的等位基因。然而，如果針對(duì)第79-83位氨基酸密碼子序列的探針B153作為缺口探針的一部分則大約只有5個(gè)HLA-B等位基因可被B204缺口探針?biāo)R(shí)別，從而利用缺口探針提高了SSO系統(tǒng)的分辨率。
在表6中，探針B153的信號(hào)很強(qiáng)表明它可以識(shí)別存在于DNA 9035、Ter250、#124、#1064和Ter244中的HLA-B靶標(biāo)序列，這些DNA分別相應(yīng)于等位基因B*3801、B*1 523、B*5 1011、B*5301和B*51011。相似地，B106可識(shí)別存在于DNA 9035、#124、#1067中靶標(biāo)序列，這些DNA分別相應(yīng)于等位基因B*3801、B*1523、B*1401和B*1521。用這兩個(gè)常規(guī)探針不能分辨靶標(biāo)序列是以反式構(gòu)型存在如DNA#124(B*1401/B51011)，還是以順式構(gòu)型存在如DNA9035(B*3801)或Ter250(B*1523)。探針B204只針對(duì)9035(B*3801)和Ter250(B*1523)具有強(qiáng)的信號(hào)，這表明兩個(gè)分隔開的靶標(biāo)序列以順式構(gòu)型存在。對(duì)于B位點(diǎn)的外顯子2，所用的陽(yáng)性對(duì)照序列是5’-gCTACTACAACCAgAgCgA-3’(SEQ ID NO32)。
實(shí)施例4在該實(shí)施例中涉及HLA class II的DQB1位點(diǎn)。探針DQ25-8可識(shí)別靶標(biāo)序列即DQB1*05031和DQB1*06011的特征序列，而DQ33可識(shí)別分隔開的DQB1*05031和DQB1 06011的特征序列。然而，利用探針DQ54G-3只可識(shí)別以順式存在的上述兩個(gè)探針區(qū)，可確定DQB105031是否是上述兩個(gè)等位基因中的一個(gè)。下面的表7列出了這些HLA-DQB1等位基因及用于檢測(cè)它們的缺口探針和常規(guī)探針之間的序列關(guān)系。
表8中一些數(shù)據(jù)是HLA class II的DQB1位點(diǎn)中的一個(gè)例子。同樣，常規(guī)探針DQ25-8對(duì)幾個(gè)DNA-Ter145、Ter68、Ter74和Ter87的結(jié)合具有相對(duì)強(qiáng)的信號(hào)，其中這些DNA分別相應(yīng)于等位基因DQB1*05031(純合)、DQB1*05031(雜合)、DQB1*0601中存在的靶標(biāo)序列。另外，DQ33對(duì)DNA-Ter145、Ter68、Ter74和Ter123的結(jié)合具有相對(duì)強(qiáng)的信號(hào)，其中這些DNA分別相應(yīng)于等位基因DQB1*05031(純合)、DQB1*05031(雜合)、DQB1*0502和DQB1*0501中存在的靶標(biāo)序列。如前面的實(shí)施例中，利用這兩個(gè)常規(guī)探針不能分辨識(shí)別位點(diǎn)是以反式還是以順式構(gòu)型存在，即不能將Ter74(DQB1 0502/DQB10601)(反式構(gòu)型)與Ter145或Ter68區(qū)分開，而這兩種等位基因均含有DQB1*05031。缺口探針DQ54G-3只識(shí)別以順式構(gòu)型存在的兩個(gè)靶標(biāo)序列，而只對(duì)包含DQB1*05031等位基因產(chǎn)生相對(duì)強(qiáng)的信號(hào)。對(duì)于DQB1位點(diǎn)的外顯子2，所用的陽(yáng)性對(duì)照序列是5’-gTCCCgTTggTgAAgTAgCAC-3’(SEQ IDNO40)和5’-gTCCCATTggTgAAgTAgCAC-3’(SEQ ID NO41)。
實(shí)施例5與實(shí)施例1相似，該實(shí)施例也涉及DRB1*0308，利用的是“半探針(half-probes)”，即探針具有比缺口探針OLR-04431-3更短的序列，即只含有兩個(gè)探針區(qū)中的一個(gè)探針區(qū)。這些“半探針”(列于表9)與OLR-04431-3比較了對(duì)DRB1*0308、其它DRB1*03等位基因或DRB1*11等位基因作為樣品的結(jié)合特性。下面的表9列出了這些DRB1等位基因及在該實(shí)驗(yàn)中使用的用于檢測(cè)它們的缺口探針和半探針之間的序列關(guān)系。以DRB1*0308、其它DRB1*03等位基因或檢測(cè)樣品的DRB1*11等位基因，半探針不產(chǎn)生或幾乎不產(chǎn)生信號(hào)(均＜1％)。OLR-04431-3也只對(duì)DRB1*0308 DNA產(chǎn)生強(qiáng)的信號(hào)(表10)。該實(shí)施例表明，在本實(shí)驗(yàn)中，短的單個(gè)識(shí)別位點(diǎn)序列本身是不能與任何DRB1*等位基因進(jìn)行穩(wěn)定的結(jié)合，而將它們裝配起來(lái)成為單條序列時(shí)即能與DRB1*0308結(jié)合。在本實(shí)驗(yàn)中，單個(gè)的半探針對(duì)被測(cè)等位基因中識(shí)別序列的結(jié)合能力低于閾值。將“半探針”序列組合起來(lái)形成的探針，只對(duì)那些均包含了本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的兩個(gè)半探針或探針區(qū)的靶標(biāo)區(qū)的等位基因的結(jié)合能力可高于閾值。
表10顯示缺口探針OLR4431-3只對(duì)來(lái)自GN090的DNA產(chǎn)生相對(duì)強(qiáng)的信號(hào)，該DNA包含DRB1*0308，OLR4611、OLR4612、OLR4613和OLR4616只含有OLR4431-3中兩個(gè)缺口區(qū)中的一個(gè)區(qū)域。這些探針均不能對(duì)上述樣品DNA產(chǎn)生任何識(shí)別信號(hào)。該實(shí)施例表明，兩個(gè)探針區(qū)的協(xié)同結(jié)合是對(duì)預(yù)期靶標(biāo)序列產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)所必需的。對(duì)于DQB1外顯子2，所用的陽(yáng)性對(duì)照探針序列是5’-ggAACAgCCAgAAggAC-3’(SEQ ID NO46)。
實(shí)施例6在該實(shí)施例中，缺口探針OLR4029-6可識(shí)別兩個(gè)短的靶標(biāo)區(qū)，即外顯子2的近5’末端的15個(gè)堿基區(qū)(第12-16位密碼子)和外顯子2的近3’末端的12個(gè)堿基區(qū)(第68-71位密碼子)，其中所述外顯子2來(lái)自DRB1*16等位基因(表11)。這兩個(gè)識(shí)別(靶標(biāo))區(qū)相距150個(gè)堿基。DRB1*16等位基因在外顯子2的5’端與DRB1*15等位基因是相同的(表11)。(這兩群等位基因?qū)嶋H上是“斷裂基因”或者可認(rèn)為是最初的DR2等位基因群的亞群。)為了鑒定基因型，利用單個(gè)探針而將DRB1*16群中的等位基因與DRB1*15群中的等位基因區(qū)分開來(lái)是非常有好處的。下面的表11列出了這些DRB1等位基因及用于檢測(cè)它們的缺口探針之間的序列關(guān)系。

探針OLR4029-6確實(shí)顯示了明顯的信號(hào)而將DRB1*16與DRB1*15等位基因區(qū)分開來(lái)。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)DRB1*16等位基因的信號(hào)是DRB1*15等位基因的2.5倍，雖然在兩個(gè)靶標(biāo)區(qū)之間有150個(gè)堿基所隔開(表12)。在5’端的DR2特異性序列可鑒別DRB1*15或DRB1*16，但不能產(chǎn)生足夠強(qiáng)的信號(hào)(表12)。DRB1*16特異性序列與5’的DR2特異性信號(hào)協(xié)同而顯著增強(qiáng)了對(duì)DRB1*16等位基因的信號(hào)(表12)。3’探針區(qū)本身不足以對(duì)DRB1*0801、DRB1*0804、DRB1*1101、DRB1*0415和DRB1*1201產(chǎn)生高于背景的信號(hào)。對(duì)于DQB1外顯子2，所用的陽(yáng)性對(duì)照探針序列是5’-ggAACAgCCAgAAggAC-3’(SEQ ID NO9)。
序列表<110>ONE LAMBDA<120>診斷探針檢測(cè)系統(tǒng)<130>27978/37504A<140>To be assigned<141>Herewith<150>US 60/324,421<151>2001-09-24<160>53<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因DRB*0101<400>1cggcctgatg ccgagtactg g 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因DRB*0101<400>2gagcagaggc gggccgcggt g 21
<210>3<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因DRB1*0415，等位基因s DRB1*11011/01 2/041/042/05/0 6/081/082/09/10/121/122/13/15/18/19/22/24/26-30/34/37/39<400>3cggcctgatg aggagtactg g 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因DRB1*0308，DRB1*1107<400>4gagcagaagc ggggccgggt g 21<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>常規(guī)探針，OLR4040<400>5gcctgatgag gagtactg18
<210>6<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>常規(guī)探針，OLR4040<400>6aagcggggcc gggtg 15<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Gap探針，0LR4431-3<400>7ctgatgagga gtacttttag cagaagcggg g 31<210>8<211>9<212>DNA<213>人<400>8aagcggggc9<210>9<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>陽(yáng)性對(duì)照探針<400>9ggaacagcca gaaggac 17
<210>10<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針區(qū)<400>10ctgatgagga gtac 14<210>11<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針區(qū)<400>11agcagaagcg ggg 13<210>12<211>27<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因A*0101<400>12gaccaggaga cacggaatat gaaggcc27<210>13<211>25<212>DNA<213>人
<220>
<221>misc_特征<223>等位基因A*0101<400>13cctggggacc ctgcgcggct actac 25<210>14<211>27<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因A*2424，A*2501-2504<400>14gaccggaaca cacggaatgt gaaggcc27<210>15<211>27<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因A*0301<400>15gaccaggaga cacggaatgt gaaggcc27<210>16<211>25<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因A*2424，A82501~04<400>16cctgcggatc gcgctccgct actac 25<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Gap探針，A*68012<400>17cggaacacac ggattttgga tcgcgctccg 30<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針，A104-11<400>18ggaacacacg gaatgtgaag20<210>19<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針，A150-19<400>19cctgcggatc gcgctccgct actac 25
<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>陽(yáng)性對(duì)照探針<400>20gctactacaa ccagagcgag20<210>21<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因A*0101<400>21acacggaata tgaaggccca c 21<210>22<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因A*0101<400>22aacctgggga ccctgcgcgg c 21<210>23<211>21<212>DNA<213>人
<220>
<221>misc_特征<223>等位基因B*1523，B*3801<400>23acacagatct gcaagaccaa c 21<210>24<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因B*1523，B*3801<400>24aacctgcgga tcgcgctccg c 21<210>25<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因B*1401，B*1521，B*3901<400>25agcctgcgga acctgcgcgg c 21<210>26<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因B*5501<400>26acacagatct tcaagaccaa c 21<210>27<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因B*5501<400>27acacagatct acaaggccca g 21<210>28<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因B*4601<400>28acacagaagt acaagcgcca g 21<210>29<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Gap探針，B204
<400>29acacagatct gcaagtttgg atcgcgctcc g 31<210>30<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針，B153<400>30acctgcggat cgcgctcc 18<210>31<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針B106<400>31acacagatct gcaagacc 18<210>32<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>陽(yáng)性對(duì)照探針<400>32gctactacaa ccagagcga 19<210>33<211>24<212>DNA<213>人
<220>
<221>misc_特征<223>等位基因DQB1*05011<400>33ccgcaggggc ggcctgttgc cgag 24<210>34<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因DQB1*05011<400>34ctggaggggg cccgggcgtc g 21<210>35<211>24<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因DQB1*06011<400>35ccgcaggggc ggcctgacgc cgag 24<210>36<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因DQB1*06011<400>36ctggagagga cccgagcgga g 21<210>37<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Gap探針，DQ54G-3<400>37ggcctgacgc cgattttctg gagggggcc 29<210>38<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針，DQ25-8<400>38gcaggggcgg cctgacgc 18<210>39<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針，DQ33<400>39tggagggggc ccgggcgt 18
<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>陽(yáng)性對(duì)照探針<400>40gtcccgttgg tgaagtagca c 21<210>41<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>陽(yáng)性對(duì)照探針<400>41gtcccattgg tgaagtagca c 21<210>42<211>18<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因OLR-4611<400>42ctgatgagga gtactttt 18<210>43<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針，OLR-4612<400>43ctgatgagga gtac 14<210>44<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針，OLR-4613<400>44agcagaagcg ggg 13<210>45<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針，OLR-4614<400>45agcagaagcg gg12<210>46<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>陽(yáng)性對(duì)照探針<400>46ggaacagcca gaaggac 17<210>47<211>27
<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>參照序列<400>47ttgtggcagc ttaagtttga atgtcat27<210>48<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>參照序列<400>48ctcctggagc agaggcgggc c 21<210>49<211>27<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因s DRB1*1501和DRB1*1502<400>49ctgtggcagc ctaagaggga gtgtcat27<210>50<211>21<212>DNA<213>人
<220>
<221>misc_特征<223>等位基因s DRB1*1501和DRB1*1502<400>50atcctggagc aggcgcgggc c 21<210>51<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因DRB1*16011<400>51ttcctggaag acaggcgcgc c 21<210>52<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_特征<223>等位基因DRB1*16021<400>52ctcctggaag acaggcgcgc c 21<210>53<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Gap探針，OLR-4029-6<400>53cctaagaggg agtgtctgga agacagg2權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣品核酸鏈中靶標(biāo)核酸序列存在的方法，包括如下步驟在雜交條件下，將被懷疑包含靶標(biāo)核酸序列的樣品與診斷探針進(jìn)行接觸；其中所述診斷探針的核苷酸序列包含(1)位于診斷探針5’端的第一探針區(qū)，基本上互補(bǔ)于所述靶標(biāo)核酸序列的特征性第一靶標(biāo)區(qū)，和(2)位于所述第一探針區(qū)3’側(cè)的第二探針區(qū)，所述第二探針區(qū)基本上互補(bǔ)于靶標(biāo)核酸鏈的靶標(biāo)核酸序列的特征性第二靶標(biāo)區(qū)，其中當(dāng)靶標(biāo)核酸鏈上的所述第一靶標(biāo)區(qū)與第二靶標(biāo)區(qū)連續(xù)時(shí)，那么診斷探針上的第一和第二探針區(qū)由核酸間隔區(qū)所隔開，當(dāng)診斷探針上的第一和第二探針區(qū)連續(xù)時(shí)，則靶標(biāo)核酸鏈上的第一和第二靶標(biāo)區(qū)之間存在著間插序列；由此在所選擇的雜交條件下，當(dāng)?shù)谝惶结槄^(qū)基本上互補(bǔ)于第一靶標(biāo)區(qū)并且第二探針區(qū)基本上互補(bǔ)于第二靶標(biāo)區(qū)時(shí)，第一和第二探針區(qū)能夠使診斷探針與靶標(biāo)核酸鏈穩(wěn)定雜交，形成可檢測(cè)的探針靶標(biāo)雜交體；但在所選擇的雜交條件下，當(dāng)?shù)谝惶结槄^(qū)不基本上互補(bǔ)于第一靶標(biāo)區(qū)或第二探針區(qū)不基本上互補(bǔ)于第二靶標(biāo)區(qū)時(shí)，診斷探針不能夠與靶標(biāo)核酸鏈穩(wěn)定雜交，不能形成在指示穩(wěn)定雜交的閾值之上的可檢測(cè)的探針靶標(biāo)雜交體；和檢測(cè)穩(wěn)定的探針靶標(biāo)雜交體的存在或不存在，作為樣品中的是否存在靶標(biāo)核酸序列的指標(biāo)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中診斷探針上的所述第一探針區(qū)和第二探針區(qū)由間隔區(qū)所隔開，其中間隔區(qū)的核酸序列不互補(bǔ)于所述靶標(biāo)核酸上的第一靶標(biāo)區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)之間的樣品核酸鏈序列。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述間隔區(qū)長(zhǎng)度為1至30個(gè)堿基。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述間隔區(qū)長(zhǎng)度為3至10個(gè)堿基。
5.權(quán)利要求1的方法，其中在靶標(biāo)核酸序列上的所述第一靶標(biāo)區(qū)與所述第二靶標(biāo)區(qū)相距1至350個(gè)堿基。
6.權(quán)利要求1的方法，其中第一探針區(qū)和第二探針區(qū)分別與第一靶標(biāo)區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)完全互補(bǔ)。
7.權(quán)利要求2的方法，其中在所述靶標(biāo)核酸上的第一靶標(biāo)區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)之間存在有間插序列。
8.權(quán)利要求1的方法，其中靶標(biāo)核酸序列是一或多個(gè)人白細(xì)胞抗原(HLA)或T細(xì)胞受體(TCR)基因序列的特征序列。
9.一種檢測(cè)在兩個(gè)或更多樣品核酸鏈上的兩個(gè)或更多靶標(biāo)核酸序列存在的方法，其包括步驟在雜交條件下，將被懷疑含有所述靶標(biāo)核酸序列的樣品與診斷探針進(jìn)行接觸；其中第一靶標(biāo)核酸序列具有第一靶標(biāo)區(qū)和第一互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶；其中第二靶標(biāo)核酸序列具有第二靶標(biāo)區(qū)和第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶；其中所述診斷探針的核苷酸序列包括(1)第一探針區(qū)，基本上互補(bǔ)于所述第一靶標(biāo)核酸序列的特征性第一靶標(biāo)區(qū)，和(2)第二探針區(qū)，基本上互補(bǔ)于所述第二靶標(biāo)核酸序列的特征性第二靶標(biāo)區(qū)；由此在所選擇的雜交條件下，當(dāng)?shù)谝换パa(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶基本上互補(bǔ)于第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶、第一探針區(qū)基本上互補(bǔ)于第一靶標(biāo)區(qū)及第二探針區(qū)基本上互補(bǔ)于第二靶標(biāo)區(qū)時(shí)，則第一和第二探針區(qū)能夠使診斷探針與靶標(biāo)核酸鏈穩(wěn)定雜交，形成可檢測(cè)的探針靶標(biāo)雜交體；但在所選擇的雜交條件下，當(dāng)?shù)谝换パa(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶不是基本上互補(bǔ)于第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶，或第一探針區(qū)不是基本上互補(bǔ)于第一靶標(biāo)區(qū)，或第二探針區(qū)不是基本上互補(bǔ)于第二靶標(biāo)區(qū)，則診斷探針不能與靶標(biāo)核酸鏈穩(wěn)定雜交，不能形成在指示穩(wěn)定雜交的閾值之上的可檢測(cè)的探針靶標(biāo)雜交體；檢測(cè)穩(wěn)定的探針靶標(biāo)雜交體的存在或不存在，作為樣品中是否存在靶標(biāo)核酸序列的指標(biāo)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中診斷探針上的所述第一探針區(qū)和第二探針區(qū)由核酸序列間隔區(qū)所隔開。
11.權(quán)利要求9的方法，其中第一靶標(biāo)區(qū)和第一互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶由第一非互補(bǔ)區(qū)帶所隔開，或第二靶標(biāo)區(qū)和第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶由第二非互補(bǔ)區(qū)帶所隔開。
12.權(quán)利要求10的方法，其中第一靶標(biāo)區(qū)和第一互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶由第一非互補(bǔ)區(qū)帶所隔開，或第二靶標(biāo)區(qū)和第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶由第二非互補(bǔ)區(qū)帶所隔開；由此所述第一和第二非互補(bǔ)區(qū)帶之間不是基本上互補(bǔ)的，也不是基本上互補(bǔ)于間隔區(qū)。
13.權(quán)利要求10或12的方法，其中所述間隔區(qū)長(zhǎng)度為1至30個(gè)堿基。
14.權(quán)利要求10或12的方法，其中所述間隔區(qū)長(zhǎng)度為3至10個(gè)堿基。
15.權(quán)利要求9的方法，其中在第一靶標(biāo)核酸序列上的所述第一靶標(biāo)區(qū)與所述第一互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶相距0至350個(gè)堿基。
16.權(quán)利要求9的方法，其中在第二靶標(biāo)核酸序列上的所述第二靶標(biāo)區(qū)與所述第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶相距0至350個(gè)堿基。
17.權(quán)利要求9的方法，其中第一探針區(qū)和第二探針區(qū)分別與第一靶標(biāo)區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)完全互補(bǔ)。
18.權(quán)利要求9的方法，其中第一和第二互補(bǔ)靶標(biāo)區(qū)帶相互之間完全互補(bǔ)。
19.權(quán)利要求9的方法，其中靶標(biāo)核酸序列是一或多個(gè)人白細(xì)胞抗原(HLA)或T細(xì)胞受體(TCR)基因序列的特征序列。
20.權(quán)利要求1或9的方法，其中樣品核酸鏈來(lái)自于人類。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)核酸序列是否存在的方法，所用診斷探針包括基本上分別互補(bǔ)于靶標(biāo)核酸鏈的第一和第二靶標(biāo)區(qū)的第一和第二探針區(qū)，其中第一探針區(qū)位于第二探針區(qū)的5’端。第一探針區(qū)基本上互補(bǔ)于靶標(biāo)核酸鏈的第一靶標(biāo)區(qū)，靶標(biāo)核酸鏈還具有第二靶標(biāo)區(qū)，其中當(dāng)靶標(biāo)核酸鏈上的所述第一靶標(biāo)區(qū)與第二靶標(biāo)區(qū)連續(xù)時(shí)，那么在診斷探針上的第一和第二探針區(qū)用核酸間隔區(qū)隔開。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1589331SQ02823272
公開日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2002年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月24日
發(fā)明者K·塞托, J·-H·李, L·布萊爾 申請(qǐng)人:一蘭姆達(dá)公司