專利名稱：白細(xì)胞介素－2基因轉(zhuǎn)移的淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療癌癥或病毒感染的轉(zhuǎn)移的淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞，其中導(dǎo)入了白細(xì)胞介素-2基因。更具體地，本發(fā)明涉及用攜帶白細(xì)胞介素-2基因的重組載體轉(zhuǎn)染的淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞，通過(guò)用攜帶白細(xì)胞介素-2基因的重組載體轉(zhuǎn)染衍生自哺乳動(dòng)物外周血的淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，和包含轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于治療癌癥或病毒感染的藥物組合物。本發(fā)明轉(zhuǎn)染的淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞具有持續(xù)分泌低濃度白細(xì)胞介素-2和顯示選擇性破壞癌細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞的特性。
背景技術(shù)：
淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(下文表示為L(zhǎng)AK細(xì)胞)通常在用于治療惡性黑色素瘤和結(jié)腸癌等的過(guò)繼免疫治療中使用。利用LAK細(xì)胞的過(guò)繼免疫治療是為了治療特別是癌癥，其中從患者去除淋巴細(xì)胞，與白細(xì)胞介素-2一起培養(yǎng)以誘導(dǎo)它們轉(zhuǎn)化成LAK細(xì)胞，并與白細(xì)胞介素-2一起回到患者體內(nèi)。
在最近10年期間已經(jīng)發(fā)展了過(guò)繼免疫治療，其集中于修復(fù)先天免疫功能或增強(qiáng)患者對(duì)癌癥的抵抗力。通常，已經(jīng)了解過(guò)繼免疫治療對(duì)于治療相對(duì)強(qiáng)烈抗免疫的癌癥如惡性黑色素瘤等是有效的。
除了LAK細(xì)胞，在免疫治療中通常使用的免疫治療劑包括BCG，干擾素，白細(xì)胞介素-2，腫瘤壞死因子，單克隆抗體，Picibanil，Helix等。BCG，一種結(jié)核的減毒株(attenuated strain)，在免疫治療的初期使用，已經(jīng)已知BCG通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞消化癌細(xì)胞的功能和增強(qiáng)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫而有效抗惡性黑色素瘤。干擾素通過(guò)影響除了癌細(xì)胞以外的正常細(xì)胞產(chǎn)生各種副作用，因此目前幾乎不使用。
在例如Leung的美國(guó)專利號(hào)4,849,329中公開(kāi)了一種生產(chǎn)LAK細(xì)胞的方法。
Irr的美國(guó)專利號(hào)5,108,760公開(kāi)了一種其中外周血單核細(xì)胞用氨基酸酰胺處理的增強(qiáng)LAK細(xì)胞激活的方法和一種包含所述LAK細(xì)胞用于治療癌癥的藥物組合物。
Rosenberg的美國(guó)專利號(hào)4,690,915公開(kāi)了一種通過(guò)共同給藥LAK細(xì)胞和IL-2治療人癌癥的方法。
同時(shí)，LAK細(xì)胞也能用于治療HIV感染，并且該研究已經(jīng)在體外實(shí)施。已經(jīng)提供證據(jù)表明LAK細(xì)胞對(duì)于體外去除HIV感染的細(xì)胞是有效的(Tyler DS等.，J.Surg.Res.，79，115-120(1998)；和Wang L.，等.，Virology，241，169-180(1998))。
盡管近年來(lái)HIV感染的療法已經(jīng)迅速開(kāi)發(fā)，但直至今日HIV感染仍未最終治愈。在迄今開(kāi)發(fā)的療法中，共同給藥至少3種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒試劑，稱為HAART(高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法)，其表示HIV感染的標(biāo)準(zhǔn)療法(Hammer S.等.，N.Engl.J.Med.，337，725-733(1997)；和Staszewski S.，N.Engl.J.Med.，341，1865-1873(1999))。然而，HAART受限于完全治愈HIV感染，因?yàn)榭共《緞┘床蛔饔糜跐摲腍IV細(xì)胞，也不能通過(guò)解剖學(xué)屏障如腦血管和睪丸血管屏障。備選的HIV療法是結(jié)合上述抗逆轉(zhuǎn)錄病毒試劑共同給藥IL-2(Chun TW等.，Nature Med.，5(6)，651-655(1999))。同樣，該療法也不足以治愈HIV感染。
在使用LAK細(xì)胞治療癌癥和HIV感染過(guò)程中，應(yīng)克服幾種問(wèn)題以臨床應(yīng)用LAK細(xì)胞。LAK細(xì)胞應(yīng)與高濃度的IL-2同時(shí)常規(guī)注射以在體內(nèi)保持存活。已經(jīng)報(bào)道高濃度的IL-2瞬時(shí)活化血液中的HIV病毒(病毒標(biāo)記(viral blips))，其次增加潛伏細(xì)胞(Ramratnam B等.，Nat Med，6(1)，82-5(2000))。另外，已經(jīng)提示另一種問(wèn)題，即持續(xù)給藥高濃度的IL-2導(dǎo)致包括細(xì)胞因子滲漏綜合征的各種副作用。
我們制備了一種用攜帶IL-2基因的重組載體轉(zhuǎn)化的淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞持續(xù)分泌低濃度的IL-2，并選擇性破壞癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞，而幾乎不影響正常細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示依照本發(fā)明的重組載體LNC/IL-2/IRES/TK的示意圖。(LNCLTR啟動(dòng)子/新霉素標(biāo)記/CMV啟動(dòng)子；IRES內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，TK胸苷激酶；MSV小鼠肉瘤病毒；MLV小鼠白血病病毒；SD剪接供體；SA剪接受體)。
圖2顯示其中LAK細(xì)胞的活力與本發(fā)明的I-LAK細(xì)胞相比較的圖表。
圖3顯示其中LAK細(xì)胞對(duì)各種靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性與本發(fā)明的I-LAK細(xì)胞相比較的圖表。
圖4顯示其中在共培養(yǎng)LAK細(xì)胞或I-LAK細(xì)胞和HIV感染的細(xì)胞后通過(guò)EIA分析定量HIV生產(chǎn)的圖表。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了導(dǎo)入重組載體的轉(zhuǎn)化的淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞，所述重組載體攜帶對(duì)其可操作連接的IL-2基因。該轉(zhuǎn)化的細(xì)胞下文表示為I-LAK細(xì)胞。
優(yōu)選地，本發(fā)明的I-LAK細(xì)胞是用攜帶對(duì)其可操作連接的IL-2的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的I-LAK細(xì)胞是用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNC/IL-2/IRES/TK轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)用于治療癌癥或病毒感染的I-LAK細(xì)胞的方法，其包含(a)從哺乳動(dòng)物收集外周血并從外周血去除紅細(xì)胞以獲得包含淋巴細(xì)胞的白細(xì)胞級(jí)分，(b)在含IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的含淋巴細(xì)胞的白細(xì)胞級(jí)分，以產(chǎn)生LAK細(xì)胞，(c)用攜帶對(duì)其可操作連接的分泌IL-2的基因的重組載體轉(zhuǎn)染得到的LAK細(xì)胞，并在培養(yǎng)基中和在適于分化它們的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，和(d)從培養(yǎng)液中篩選和回收具有分泌IL-2的能力的細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療癌癥或病毒感染的藥物組合物，其包含足夠量的I-LAK細(xì)胞以激發(fā)免疫應(yīng)答。
發(fā)明詳述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括導(dǎo)入重組載體的I-LAK細(xì)胞，所述重組載體攜帶對(duì)其可操作連接的IL-2基因。本發(fā)明的I-LAK細(xì)胞特征在于通過(guò)持續(xù)分泌調(diào)節(jié)量的IL-2恒定保持體內(nèi)低水平IL-2蛋白，從而選擇性破壞癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞。一旦將本發(fā)明的I-LAK細(xì)胞給藥于遭受癌癥或病毒感染的哺乳動(dòng)物，它們體內(nèi)持續(xù)分泌低濃度IL-2蛋白，結(jié)果低濃度的分泌的IL-2蛋白保持I-LAK細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞的細(xì)胞毒性而幾乎不影響正常細(xì)胞。
LAK細(xì)胞是能夠通過(guò)非MHC限制性機(jī)制消化病毒感染的細(xì)胞和各種轉(zhuǎn)化細(xì)胞的非特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞。通過(guò)與IL-2蛋白培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞生產(chǎn)LAK細(xì)胞，其可用于治療癌癥，病毒感染疾病，自身免疫疾病等。
美國(guó)專利號(hào)4,690,915描述了聯(lián)合給藥LAK細(xì)胞和IL-2在治療惡性黑色素瘤，肺癌，腎癌，結(jié)腸癌和直腸癌中是有效的。同樣，它描述了LAK細(xì)胞具有各種抗結(jié)腸癌，胰腺癌，食管癌等的殺傷腫瘤活性(Rayner等.，Cancer，55，1327-1333(1985))。
IL-2蛋白是作為能促進(jìn)抗原特異性效應(yīng)T-淋巴細(xì)胞的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的淋巴因子的有效免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子(Morgan等.，Science，193，1007-1008(1976))。IL-2蛋白由CD4 T-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，非常少量的IL-2由CD8 T-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。IL-2蛋白作為刺激分泌細(xì)胞自身的自分泌生長(zhǎng)因子發(fā)揮作用。同樣，IL-2蛋白作為旁分泌生長(zhǎng)因子發(fā)揮作用，因?yàn)樗绊懓–D4和CD8細(xì)胞的臨近的T-淋巴細(xì)胞。也已知IL-2蛋白調(diào)節(jié)各種免疫功能，包括影響細(xì)胞毒性T細(xì)胞，NK細(xì)胞和活化的B細(xì)胞，并通過(guò)產(chǎn)生LAK細(xì)胞增強(qiáng)細(xì)胞溶解功能。
依照本發(fā)明導(dǎo)入LAK細(xì)胞的IL-2基因負(fù)責(zé)IL-2蛋白的天然活性，以使LAK細(xì)胞在體內(nèi)保持存活。已克隆了編碼人IL-2蛋白的cDNA(Taniguchi等.，Nature，302，305(1983))并從其推導(dǎo)出了氨基酸序列。在真核細(xì)胞中，IL-2蛋白首次作為由153個(gè)氨基酸殘基組成的前體多肽而被生產(chǎn)，然后缺失20個(gè)氨基酸殘基，被修飾為成熟IL-2。利用分子生物學(xué)技術(shù)，具有天然活性的人重組IL-2已在大腸桿菌(Rosenberg等.，Science，223，1412(1984))，昆蟲(chóng)細(xì)胞(Smith等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82，8404(1985))和哺乳動(dòng)物COS細(xì)胞(Taniguchi等.，Nature，302，305 (1983))中生產(chǎn)。
依照本發(fā)明導(dǎo)入LAK細(xì)胞的IL-2基因可源自任何合適的來(lái)源，包括已知的重組IL-2基因。具體地，IL-2基因包括天然和重組IL-2基因和其生物功能等價(jià)物。生物功能等價(jià)物表示具有相同或非常類似的生物活性的多肽，例如在美國(guó)專利號(hào)4,518,584中描述的rIL-2突變蛋白，和具有代替NH2-末端丙氨酸的甲硫氨酸的rIL-2蛋白。
作為此處使用，術(shù)語(yǔ)“低濃度IL-2蛋白”或“低水平IL-2蛋白”表示能刺激和活化LAK細(xì)胞而無(wú)副作用如臨時(shí)增加的病毒活性誘導(dǎo)和細(xì)胞因子滲漏綜合征的量的IL-2蛋白。優(yōu)選的在人體內(nèi)日分泌自LAK細(xì)胞的IL-2蛋白的量為約500,000 IU或以下。如上述提及，已經(jīng)提示使用LAK細(xì)胞的免疫治療需要聯(lián)合LAK細(xì)胞注射高濃度的IL-2蛋白以保持LAK細(xì)胞存活。然而，高濃度IL-2蛋白的全身給藥導(dǎo)致具有次生潛伏HIV病毒的LAK細(xì)胞增加或?qū)е卵軆?nèi)流體滲漏到血管外空間(毛細(xì)血管滲漏綜合征)(Rosenstein M.等.，Immunology，137，1735-1742(1986)；Ohkubo C.等.，Cancer Res.，51，1561-1563(1991)；Edwards，M.J.等.，Cancer Res.，52，3425-3431(1992)；Damle N.K.等.，J.Immunol.，142，2660-2669(1989))。由給藥IL-2蛋白導(dǎo)致的毛細(xì)血管滲漏綜合征包括，例如形成水腫，低血壓和腎功能異常。當(dāng)將IL-2給藥于人用于治療腫瘤時(shí)，通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)獲得的不超過(guò)10％最佳劑量是可接受的。然而，即使常規(guī)劑量也可導(dǎo)致無(wú)力，胃灌洗，嘔吐，腹瀉，低血壓和器官功能異常，甚至于不死亡。
作為此處使用，術(shù)語(yǔ)“癌細(xì)胞”表示不象正常細(xì)胞，它異常分裂和再生，不受控制的生長(zhǎng)，并可脫離周圍組織和發(fā)展成浸潤(rùn)。癌細(xì)胞的實(shí)例包括胰腺癌細(xì)胞，肺癌細(xì)胞，結(jié)腸癌細(xì)胞，肝癌細(xì)胞，乳腺癌細(xì)胞，前列腺癌細(xì)胞，膀胱癌細(xì)胞，皮膚癌細(xì)胞和軟組織癌細(xì)胞。優(yōu)選的癌細(xì)胞包括惡性黑色素瘤細(xì)胞，肺癌細(xì)胞，腎癌細(xì)胞，結(jié)腸癌細(xì)胞和直腸癌細(xì)胞。
作為此處使用，術(shù)語(yǔ)“病毒感染的細(xì)胞”表示通過(guò)感染病毒被突變改變的正常細(xì)胞，并具有下述性質(zhì)。它易于在體外生長(zhǎng)。它的生長(zhǎng)比正常細(xì)胞快。許多改變發(fā)生在細(xì)胞表面，例如增加離子通過(guò)的能力，喪失結(jié)合毒性激素，產(chǎn)生新的抗原等。改變了染色體，并形成抗病毒劑如干擾素。尤其是，此處通過(guò)病毒感染表示正常細(xì)胞被人免疫缺陷病毒(HIV)感染。HIV是稱為AIDS的獲得性免疫綜合征的誘因劑(casual agent)。HIV攻擊的主要靶目標(biāo)是調(diào)節(jié)免疫功能的T細(xì)胞中的輔助T細(xì)胞。一旦輔助T細(xì)胞被HIV感染并發(fā)展成壞死，人免疫功能被損壞，發(fā)生免疫缺陷，導(dǎo)致致命性感染和惡性腫瘤。
作為此處使用，術(shù)語(yǔ)“選擇性破壞”或“選擇性殺傷”表示本發(fā)明的I-LAK細(xì)胞顯示對(duì)癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞而非正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果溶解并去除所述細(xì)胞。我們研究了I-LAK細(xì)胞對(duì)各種細(xì)胞的細(xì)胞毒性，所述細(xì)胞包括HIV感染的外周血單核細(xì)胞，K562，CEM，ACH.2，H9，H9/HTLV-IIIMN等，發(fā)現(xiàn)I-LAK細(xì)胞選擇性殺傷HIV感染的細(xì)胞和惡性細(xì)胞(實(shí)施例5，圖3)，但不影響正常細(xì)胞。
本發(fā)明的I-LAK細(xì)胞具有下述性質(zhì)1)LAK細(xì)胞依賴于IL-2蛋白，即可在存在IL-2蛋白的條件下存活(Grimm EA等.，J Exp Med 158(4)，1356-61(1983))。作為對(duì)比，在未加入IL-2蛋白的條件下，攜帶IL-2基因的I-LAK細(xì)胞可以保持存活。該事實(shí)首次由本發(fā)明人證實(shí)，其是基于在缺乏IL-2蛋白情況下，當(dāng)單獨(dú)培養(yǎng)LAK細(xì)胞和I-LAK細(xì)胞60天時(shí)，LAK細(xì)胞和I-LAK細(xì)胞在培養(yǎng)第60天的生存力分別為0％和約90％(實(shí)施例4，圖2)。
2)分泌自I-LAK細(xì)胞的IL-2蛋白刺激HIV感染的細(xì)胞，幫助它在潛伏期脫逸，降低人體內(nèi)潛伏細(xì)胞的總數(shù)(Chun TW等.，J.Exp.Med.188(1)，83-91(1998.12))。
3)I-LAK細(xì)胞以低濃度分泌IL-2蛋白，防止病毒的瞬時(shí)活化。已經(jīng)報(bào)道當(dāng)依照現(xiàn)有技術(shù)時(shí)對(duì)HIV感染的人給藥LAK細(xì)胞和高濃度IL-2蛋白時(shí)可發(fā)生病毒的這種瞬時(shí)活化(Ramratnam B.等.，Nat.Med.6(1)，82-5(2000.09))。
4)I-LAK細(xì)胞持續(xù)分泌IL-2蛋白，增強(qiáng)HIV感染的人的免疫力。已經(jīng)提示IL-2蛋白長(zhǎng)期增加對(duì)CD4+T細(xì)胞的免疫而言關(guān)鍵的細(xì)胞的數(shù)目(Davey RT Jr.等.，JAMA，284(2)，92074(2000))。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了一種生產(chǎn)導(dǎo)入了重組載體的I-LAK細(xì)胞的方法，所述重組載體攜帶對(duì)其可操作連接的IL-2基因，所述方法包含(a)從哺乳動(dòng)物收集外周血，并從外周血去除紅細(xì)胞，以獲得含淋巴細(xì)胞的白細(xì)胞級(jí)分，(b)在含IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的含淋巴細(xì)胞的白細(xì)胞級(jí)分，以產(chǎn)生LAK細(xì)胞，(c)用攜帶對(duì)其可操作連接的分泌IL-2的基因的重組載體轉(zhuǎn)染得到的LAK細(xì)胞，并在培養(yǎng)基中和在適于分化它們的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，和(d)從培養(yǎng)液篩選和回收具有分泌IL-2的能力的細(xì)胞。
更具體地，從哺乳動(dòng)物收集外周血并離心。添加菲可帕克，并再次離心以提供外周血單核細(xì)胞。將得到的外周血單核細(xì)胞懸浮在含IL-2蛋白的LAK活化培養(yǎng)基中，以生產(chǎn)LAK細(xì)胞。
用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，優(yōu)選重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNC/IL-2/IRES/TK轉(zhuǎn)染如此獲得的LAK細(xì)胞，以同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因，即IL-2基因和單純皰疹病毒的胸苷激酶基因。在含G418(新霉素類似物)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以獲得G418抗性細(xì)胞，其被再次培養(yǎng)。例如ELISA檢測(cè)培養(yǎng)物上清的IL-2蛋白，以篩選具有高度分泌IL-2蛋白的能力的細(xì)胞。將篩選的細(xì)胞表示為I-LAK細(xì)胞。
本發(fā)明舉例說(shuō)明質(zhì)粒LNC/IL-2/IRES/TK作為攜帶IL-2基因的重組載體。已知該重組載體可易于制備，也可非限制地獲自韓國(guó)科學(xué)和技術(shù)高等研究所(Korea Advanced Institute of Science and Technology)(韓國(guó)，大田)的Kim，Yeon-Soo博士。
重組載體LNC/IL-2/IRES/TK攜帶IL-2基因，位于CMV啟動(dòng)子和胸苷激酶(TK)基因下游。TK基因使得可用具有抗病毒劑的重組載體處理轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。TK基因的表達(dá)產(chǎn)物顯著增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)鳥(niǎo)嘌呤的敏感性。優(yōu)選地，LTR啟動(dòng)子/新霉素標(biāo)記/CMV啟動(dòng)子，IL-2基因，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)基因和酪氨酸激酶基因順序可操作連接(圖1)。
如此處使用，術(shù)語(yǔ)“重組載體”表示能指導(dǎo)對(duì)其可操作連接的另一核酸分子，即IL-2基因表達(dá)的核酸分子。本發(fā)明的重組載體包括適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸的形式的IL-2基因，其表示重組載體包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，在用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的基礎(chǔ)上選擇，其操作連接到待表達(dá)的編碼IL-2的核酸序列上。一種類型的重組載體能夠在導(dǎo)入其的宿主細(xì)胞中自發(fā)復(fù)制。另一類型的重組載體在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后被整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨著宿主基因組一起復(fù)制。在本發(fā)明中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞用作宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明中可使用各種載體，其通常表示能轉(zhuǎn)運(yùn)它已經(jīng)連接的另一核酸分子。適于本發(fā)明的病毒載體的實(shí)例包括SV40，牛乳頭瘤病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，單純皰疹病毒，痘病毒，慢病毒屬，腺伴隨病毒和巨細(xì)胞病毒。
在本發(fā)明中尤其優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒科家族中的任何病毒，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒科具有RNA作為它的核酸并利用酶-逆轉(zhuǎn)錄酶將它的基因組拷貝到宿主細(xì)胞染色體的DNA中。衍生自MoMLV(莫洛尼鼠類白血病毒)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在本領(lǐng)域中是最有用的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是有利的，是因?yàn)轶w外操作方便，基因的遞送是有效的，整合到宿主細(xì)胞染色體中是穩(wěn)定的，使得它可穩(wěn)定轉(zhuǎn)移到子代細(xì)胞。在本發(fā)明中舉例說(shuō)明的LNCX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體特征在于neor標(biāo)記基因在5’LTR啟動(dòng)子控制下表達(dá)，并且包括人巨細(xì)胞病毒(CMV)的立即早期啟動(dòng)子作為內(nèi)部啟動(dòng)子，導(dǎo)致外源基因的高表達(dá)。
作為此處使用，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”表示對(duì)于對(duì)其可操作連接的編碼基因在某些宿主細(xì)胞中表達(dá)基本的DNA序列。它意圖包括RNA聚合酶結(jié)合和引發(fā)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，任選能控制這種轉(zhuǎn)錄的操作子，編碼mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。對(duì)于真核細(xì)胞調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括啟動(dòng)子，多腺苷酸化信號(hào)，增強(qiáng)子等。
在重組載體內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“可操作連接”意圖表示目的核苷酸序列以當(dāng)適當(dāng)分子(例如，轉(zhuǎn)錄激活蛋白)結(jié)合到調(diào)節(jié)序列時(shí)允許核苷酸序列表達(dá)的方式結(jié)合到調(diào)節(jié)序列上。例如，在它表達(dá)為參與多肽分泌的前體蛋白的情況下，對(duì)于前序列或前導(dǎo)序列的DNA可操作連接到對(duì)于多肽的DNA上；在它影響轉(zhuǎn)錄的情況下，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作連接到編碼序列上；或在它影響轉(zhuǎn)錄的情況下，核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作連接到編碼序列上；或在它被定位以便促進(jìn)翻譯的情況下，核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作連接到編碼序列上。通?！翱刹僮鬟B接，”表示DNA序列是鄰接的，并且前導(dǎo)序列在讀框內(nèi)。然而，增強(qiáng)子不需要鄰接。這些序列的連接是通過(guò)在方便的限制位點(diǎn)連接而實(shí)施。然而，如果不存在這種限制位點(diǎn)，依照常規(guī)方法使用合成的寡核苷酸連接物或接頭。
可通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化方法例如DEAE-葡聚糖，磷酸鉀和電穿孔將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中表達(dá)克隆的外源DNA序列的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是熟知的(Maniatis等.，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)；Sambrook等.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1989)；Gene Expression Technology，Method in Enzymology，Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Guthrie&Fink (編輯)，Academic Press，San Diego，Calif.(1991)；Hitzeman等.，J.Biol.Chem.，255，12073-12080(1980)；和美國(guó)專利號(hào)4,935,349)。優(yōu)選地，本發(fā)明的重組載體通過(guò)磷酸鉀沉淀轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了一種用于治療癌癥或病毒感染的藥物組合物，其包含足夠量的攜帶IL-2基因的I-LAK細(xì)胞以激發(fā)免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的藥物組合物可包括藥用載體，尤其是，在本發(fā)明中可使用各種載體或稀釋劑，所述稀釋劑包括鹽水，緩沖的鹽水和鹽水與非特異血清白蛋白的混合物。藥物組合物可包含，例如添加劑，緩沖劑，抗氧化劑，糖類例如葡萄糖，蔗糖和糊精，和螯合劑如EDTA。另外，藥物組合物可包括水，鹽水，甘油，乙醇，乳化劑，潤(rùn)濕劑或pH調(diào)節(jié)劑。藥物組合物還可包括增強(qiáng)免疫應(yīng)答的佐劑。佐劑的實(shí)例包括，但不限于，氫氧化鋁(明礬)，thr-MDP，nor-MDP和MPT-PE。
可胃腸外，肌內(nèi)，皮下，真皮內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)或通過(guò)其它適于治療患者的腫瘤或感染和疾病的途徑給藥本發(fā)明的藥物組合物。由于可發(fā)生低水平的炎癥或痙攣，優(yōu)選選擇相對(duì)無(wú)損傷的方法。尤其優(yōu)選皮下途徑。
以對(duì)受試者而言足以引發(fā)免疫應(yīng)答的量給藥本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物的劑量典型地為約105-1011I-LAK細(xì)胞，優(yōu)選約106-1010I-LAK細(xì)胞，更優(yōu)選約1×107-2×109I-LAK細(xì)胞。然而，依賴于需要保護(hù)的程度，受試者的年齡或體重，組合物的劑型，給藥方法等可改變劑量。
在一些特定實(shí)施的實(shí)施例的基礎(chǔ)上現(xiàn)在將解釋本發(fā)明，然而，所述實(shí)施例不能被認(rèn)為是限制。
實(shí)施例實(shí)施例1制備LAK細(xì)胞通過(guò)靜脈穿刺從HIV陰性健康供體(HIV抗體陰性)收集外周血。向外周血中添加菲可帕克，并將得到的混合物離心以獲得外周血單核細(xì)胞。在補(bǔ)充以15％胎牛血清(FBS)，青霉素，鏈霉素和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞。用1,000IU/ml rIL-2(aldesleukin，Chiron BV Amsterdam，Netherland)處理得到的培養(yǎng)液以生產(chǎn)LAK細(xì)胞。
實(shí)施例2構(gòu)建重組載體LNC/IL-2/IRES/TK為將IL-2基因?qū)胪ㄟ^(guò)實(shí)施例1獲得的LAK細(xì)胞，構(gòu)建多個(gè)基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNC/IL-2/IRES/TK，以便同時(shí)表達(dá)IL-2基因和單純皰疹病毒的胸苷激酶基因(HSV TK基因)。
如圖1所示，通過(guò)將HSV TK基因，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和IL-2基因順序插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNCX構(gòu)建重組載體LNC/IL-2/IRES/TK。
通過(guò)PCR從pTK3(BRL，Gaithersburg，MD)合成缺失啟動(dòng)子和poly(A)信號(hào)位點(diǎn)的HSV TK基因的片段。將合成片段的兩個(gè)末端制成磷酸化平端。將得到的平頭片段插入到已被限制性內(nèi)切酶HpaI消化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNCK中。LNCX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括neor標(biāo)記基因，其在5’LTR啟動(dòng)子控制下表達(dá)，和人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子(CMV啟動(dòng)子)作為內(nèi)部啟動(dòng)子，因此，期待高度表達(dá)外源基因。通過(guò)限制酶切消化和核苷酸測(cè)序分析得到的重組載體，以篩選其中HSV TK基因在CMV啟動(dòng)子控制下表達(dá)的LNC/TK克隆。從質(zhì)粒pCITE-1(Novagen，WI)切除約600bpEcoRI-NcoI片段，并亞克隆到重組載體LNC/TK，使得將包括腦心肌炎病毒(EMC)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的帽一非依賴性翻譯增強(qiáng)子序列導(dǎo)入到HSV-TK基因的上游。將得到的亞克隆表示為L(zhǎng)NC/IRES/TK。將約700bp HindIII-BamHI IL-2 DNA片段(Invivogen，美國(guó))亞克隆到CMV啟動(dòng)子和IRES序列間，以構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNC/IL-2/IRES/TK。
實(shí)施例3制備逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的細(xì)胞系通過(guò)磷酸鈣共沉淀將質(zhì)粒LNC/IRES/TK或LNC/IL-2/IRES/TK轉(zhuǎn)染到兼嗜性包裝細(xì)胞系PA317(ATCC，USA)以生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系產(chǎn)生編碼HSV TK基因和/或IL-2基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒。48小時(shí)后，將培養(yǎng)基換為包含600μg/ml G418的新鮮培養(yǎng)基，將其培養(yǎng)10-14天以形成G418-抗性克隆。分離得到的克隆并通過(guò)大量培養(yǎng)富集。順序單獨(dú)稀釋PA317/LNC/IRES/TK細(xì)胞和PA317/LNC/IL-2/IRES/TK細(xì)胞的培養(yǎng)物。在具有60mm直徑的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)5×105NIH/3T3細(xì)胞24小時(shí)。將1ml培養(yǎng)物接種到上述獲得的每個(gè)稀釋物，其被感染4小時(shí)。添加4ml新鮮的培養(yǎng)液，并將它培養(yǎng)48小時(shí)。用胰蛋白酶處理培養(yǎng)的細(xì)胞，并接種在具有100mm直徑的培養(yǎng)皿上，其在含400μg/ml G418的培養(yǎng)液中培養(yǎng)10-14天。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。從3次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定病毒效價(jià)并選擇具有最高病毒效價(jià)的細(xì)胞系。
實(shí)施例4制備I-LAK細(xì)胞在生產(chǎn)LAK細(xì)胞后培養(yǎng)第10天，用具有CMV啟動(dòng)子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNCX/IL-2/IRES/TK轉(zhuǎn)化LAK細(xì)胞。將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體添加到LAK細(xì)胞中。48小時(shí)后，洗滌細(xì)胞，并在含G418(新霉素類似物)的RPMI-1640上培養(yǎng)，使得攜帶neor基因的細(xì)胞可以生長(zhǎng)。獲得G418抗性細(xì)胞并培養(yǎng)。通過(guò)ELISA測(cè)量培養(yǎng)上清，以檢測(cè)細(xì)胞分泌IL-2的能力。通過(guò)RT-PCR在包含IL-2基因的基礎(chǔ)上證實(shí)I-LAK細(xì)胞。
實(shí)施例5確定LAK細(xì)胞和I-LAK細(xì)胞的生存力在無(wú)細(xì)胞刺激物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)LAK細(xì)胞和I-LAK細(xì)胞60天。通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)排除測(cè)量細(xì)胞的生存力。作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，LAK細(xì)胞在培養(yǎng)第10天的生存力為98％，培養(yǎng)第20天為63％，培養(yǎng)第30天為40％，培養(yǎng)第40天為3％，培養(yǎng)第50天為2％，培養(yǎng)第60天為0％。作為對(duì)比，I-LAK細(xì)胞在培養(yǎng)第10天生存力為97％，培養(yǎng)第20天為97％，培養(yǎng)第30天為95％，培養(yǎng)第40天為95％，培養(yǎng)第50天為90％，培養(yǎng)第60天為90％(圖2)。
實(shí)施例6確定LAK細(xì)胞和I-LAK細(xì)胞對(duì)各種靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性通過(guò)51鉻釋放試驗(yàn)確定LAK細(xì)胞和I-LAK細(xì)胞對(duì)各種靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
將正常外周血單核細(xì)胞，HTLV-IIIMN-感染的外周血單核細(xì)胞，K562，CEM，ACH.2，H9和H9/HTLV-IIIMN用作靶細(xì)胞。在LAK細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，將K562，LAK細(xì)胞的靶細(xì)胞系用作陽(yáng)性對(duì)照。將CEM細(xì)胞系用于比較CD4+人細(xì)胞系A(chǔ)CH.2的LAK細(xì)胞活性水平。ACH.2是HIV-1-潛伏感染的T細(xì)胞亞克隆A3.01，其衍生自HIVLAV-CEM。上述人T細(xì)胞系分離自患有急性成淋巴細(xì)胞淋巴瘤的4歲caucasin女性患者。H9和H9/HTLV-IIIMN是衍生自特定HUT 78細(xì)胞系的單核克隆。ACH.2，H9和H9/HTLV-IIIMN獲自NIH AIDS研究和Reference Regent Program。將所有上述細(xì)胞在補(bǔ)充以1％FBS，青霉素，鏈霉素和L-谷氨酰胺的RPMI-1640中培養(yǎng)。
在37℃水浴中，將上述靶細(xì)胞(3×106)培養(yǎng)在0.5ml含150μl的51Cr的培養(yǎng)基中。將51Cr標(biāo)記的細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基洗滌4次，并以104細(xì)胞/孔將50μl細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板上劃線。以20∶1，1∶1和1∶20的比率向培養(yǎng)板中添加LAK細(xì)胞和I-LAK細(xì)胞。于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)效應(yīng)物和靶細(xì)胞8小時(shí)。從每孔中取50μl上清，并在同位素計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。將這些實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并通過(guò)下式計(jì)算溶胞的百分比 通過(guò)培養(yǎng)50μl 0.5％trypton X-100和50μl靶細(xì)胞確定最大釋放。通過(guò)培養(yǎng)50μl細(xì)胞培養(yǎng)液和50μl靶細(xì)胞確定自發(fā)釋放。自發(fā)釋放通常不超過(guò)最大釋放的20％(Antonelli P等.，Clin.Immunol.Immunopath.19，161-169(1981))。通過(guò)利用student’s T-檢驗(yàn)比較LAK細(xì)胞和I-LAK細(xì)胞之間的各種參數(shù)。當(dāng)p為0.05或0.05以下時(shí)，認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。
結(jié)果揭示LAK和I-LAK細(xì)胞對(duì)所有腫瘤細(xì)胞，K562，CEM，ACH.2，H9和H9/HTLV-IIIMN具有有效的細(xì)胞毒性。這考慮為在破壞惡性細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞過(guò)程中涉及LAK細(xì)胞。所有的惡性細(xì)胞和HIV感染的細(xì)胞被選擇性殺傷和去除，而正常細(xì)胞未被損傷。盡管未發(fā)現(xiàn)相對(duì)的統(tǒng)計(jì)差異，ACH.2細(xì)胞和H9/HTLV-IIIMN的特定溶胞作用分別高于CEM細(xì)胞和H9細(xì)胞。同時(shí)，對(duì)HIV感染的細(xì)胞的LAK和I-LAK細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒性之間無(wú)顯著差異(圖3)。
實(shí)施例7比較LAK細(xì)胞或I-LAK細(xì)胞與HIV感染的細(xì)胞的共培養(yǎng)過(guò)程中HIV生產(chǎn)為制備HIV感染的外周血單核細(xì)胞，生產(chǎn)HIV病毒原液，然后用HIV病毒原液感染外周血細(xì)胞。在當(dāng)它們產(chǎn)生最高病毒效價(jià)時(shí)培養(yǎng)感染的H9細(xì)胞。從得到的培養(yǎng)液中回收上清，以提供HIV病毒(HTLV-IIIMN)原液。在用HIV病毒原液感染細(xì)胞后7天通過(guò)確定TCID50終點(diǎn)測(cè)定HIV病毒原液的效價(jià)。通過(guò)在37℃用1.0的moi(感染復(fù)數(shù))培養(yǎng)12小時(shí)誘導(dǎo)外周血細(xì)胞的HIV感染。通過(guò)培養(yǎng)未感染的H9細(xì)胞培養(yǎng)物的上清獲得對(duì)照細(xì)胞。離心感染的外周血細(xì)胞，洗滌，并懸浮在新鮮培養(yǎng)基中。以3天的間隔用新鮮培養(yǎng)基替代一半培養(yǎng)上清。通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)排除測(cè)定細(xì)胞的生存力。
將LAK細(xì)胞或I-LAK細(xì)胞與上述獲得的HIV感染的外周單核細(xì)胞共培養(yǎng)，并使用HIV-1 p24抗原捕獲EIA試劑盒(Organon Teknika，Boxtel，Netherlands)在3天的間隔定量細(xì)胞培養(yǎng)液中病毒的量。制備每個(gè)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在樣本稀釋數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線和OD值的基礎(chǔ)上計(jì)算p24的量。從分離自H9/HTLV-IIIMN細(xì)胞系(MN)的培養(yǎng)上清的HIV p24抗原的量可以看出，大多數(shù)病毒的復(fù)制發(fā)生在培養(yǎng)的第6天。在H9/HTLV-IIIMN細(xì)胞系與LAK細(xì)胞共培養(yǎng)的情況下，直至培養(yǎng)的第15天，p24抗原的值下降，并在培養(yǎng)的第18天升高。認(rèn)為p24抗原值的升高(病毒復(fù)制的恢復(fù))是由于在從第二周至第三周的時(shí)間IL-2刺激物被耗盡，LAK細(xì)胞的生存力降低。對(duì)于共培養(yǎng)H9/HTLV-IIIMN細(xì)胞系和I-LAK細(xì)胞，直至約第21天，p24抗原的值穩(wěn)定下降。用H9/HTLV-IIIMN細(xì)胞系感染的外周血細(xì)胞的共培養(yǎng)導(dǎo)致直至培養(yǎng)的第6天病毒復(fù)制的增加。HIV感染的外周血細(xì)胞(PBLinf)與LAK細(xì)胞或I-LAK細(xì)胞的共培養(yǎng)導(dǎo)致在培養(yǎng)的第9-12天間p24抗原值的顯著降低。體外結(jié)果顯示LAK細(xì)胞殺傷HIV感染的細(xì)胞的能力幾乎等同于I-LAK細(xì)胞(圖4)。
工業(yè)實(shí)用性由于通過(guò)篩選低濃度的IL-2蛋白本發(fā)明的I-LAK細(xì)胞顯示選擇性殺傷癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞的活性，它在治療癌癥和病毒感染過(guò)程中是有用的。
從先前的詳細(xì)描述，很明顯，在未脫離本發(fā)明的精神或范圍的條件下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可進(jìn)行修改。與之關(guān)聯(lián)，應(yīng)當(dāng)理解前述實(shí)施例是為了舉例說(shuō)明的目的，而不是為了限制本發(fā)明。因此，意圖希望未脫離本發(fā)明的精神的所有修改和改變?cè)跈?quán)利要求和它們的等同體的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于治療癌癥或病毒感染的轉(zhuǎn)化的淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(I-LAK細(xì)胞)，其中導(dǎo)入了攜帶對(duì)其可操作連接的IL-2基因的重組載體。
2.權(quán)利要求1的I-LAK細(xì)胞，其中所述重組載體包含逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
3.權(quán)利要求2的I-LAK細(xì)胞，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是載體LNC/IL-2/IRES/TK。
4.一種生產(chǎn)用于治療癌癥或病毒感染的轉(zhuǎn)化的淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(I-LAK細(xì)胞)的方法，所述細(xì)胞中導(dǎo)入了攜帶對(duì)其可操作連接的IL-2基因的重組載體，所述方法包含(a)從哺乳動(dòng)物收集外周血并從外周血去除紅細(xì)胞以獲得包含淋巴細(xì)胞的白細(xì)胞級(jí)分，(b)在含IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的含淋巴細(xì)胞的白細(xì)胞級(jí)分，以產(chǎn)生LAK細(xì)胞，(c)用攜帶對(duì)其可操作連接的IL-2基因的重組載體轉(zhuǎn)染所述得到的LAK細(xì)胞，并在培養(yǎng)基中和在適于分化它們的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，和(d)從培養(yǎng)基中篩選和回收具有分泌IL-2的能力的細(xì)胞。
5.一種用于治療癌癥或病毒感染疾病的藥物組合物，其包含足以激發(fā)免疫應(yīng)答的量的權(quán)利要求1的I-LAK細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述癌癥包含惡性黑色素瘤，肺癌，腎癌，結(jié)腸癌和直腸癌。
7.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述病毒包含HIV病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療癌癥或病毒感染的轉(zhuǎn)化的淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(I－LAK細(xì)胞)，所述細(xì)胞中導(dǎo)入了攜帶對(duì)其可操作連接的IL－2基因的重組載體。還涉及一種用于治療癌癥或病毒感染疾病的藥物組合物，其包含足以激發(fā)免疫應(yīng)答的量的I－LAK細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/22GK1628167SQ02823304
公開(kāi)日2005年6月15日 申請(qǐng)日期2002年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月22日
發(fā)明者柳來(lái)春, 張京喜, 金演秀, 金俊明 申請(qǐng)人:醫(yī)學(xué)基因公司