專利名稱：α－酮基丁酸的產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于積聚α-酮基丁酸的方法。本發(fā)明也涉及天然的突變體微生物和/或經(jīng)提取的酶的用途，用于產(chǎn)生天然的α-酮基丁酸。本發(fā)明也涉及獲得emoxyfurone的方法。
背景技術(shù)：
α-酮基丁酸為2-氧代丁酸的同物異名詞，可由多種微生物積聚。但根椐相反的報(bào)道，也顯示該分子在平衡濃度范圍內(nèi)產(chǎn)生，也因此并不適于積聚。
在JP03183476中，已知屬于假單胞菌屬的微生物能夠?qū)?，3-二羥基丁酸轉(zhuǎn)化為α-酮基丁酸。但是，假單胞菌屬不是食物級微生物，因此通過該微生物發(fā)酵獲得的α-酮基丁酸不易于應(yīng)用于食品。這對于將由此方法獲得的α-酮基丁酸進(jìn)行進(jìn)一步的處理而獲得的衍生物而言也同樣如此。
Nakahara、Nkajima-Kambe和Sato(Biotechnol.Lett.(1994)，16(3)，263-8)已顯示α-酮基丁酸可由馬紅球菌(Rhodococcus equi)菌株積聚。但在此生物轉(zhuǎn)化中，必須向培養(yǎng)基中加入1，2-丙二醇，所述1，2-丙二醇對獲得食物成分而言并非優(yōu)選。此外，并不能確保在合成食物成分中微生物對食物成分或反應(yīng)物的產(chǎn)生是無害的。
也存在重組微生物中積聚α-酮基丁酸的進(jìn)一步報(bào)道(Kisumi、Sugiura、Takagi和Chibata，抗生物雜志(J.Antibiot).(Tokyo)1977年1月；30(1)，111-7)。但當(dāng)進(jìn)一步用于香料(食物成分)的合成時，仍希望從未經(jīng)遺傳修飾的生物體中獲得α-酮基丁酸。
Sluis等(Sluis、Wolken、Giuseppin、Tramper Wijffels，″蘇氨酸、cysthionine和支鏈氨基酸對魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxi)代謝的影響″，酶微生物技術(shù)(Enzyme Microb Technol)，2000年2月1日；26(2-4)292-300)發(fā)現(xiàn)在真菌菌株中并不積聚α-酮基丁酸，這是由于在此微生物中α-酮基丁酸的代謝庫庫容始終處于平衡狀態(tài)。
也已知高水平的α-酮基丁酸可能對微生物產(chǎn)生毒性(Fisher，Eisenstein，鑒定ilvA突變體的有效方法揭示出來自大腸桿菌的生物合成的蘇氨酸脫氨酶中的氨基端催化結(jié)構(gòu)域，細(xì)菌學(xué)雜志(J Bacteriol)，1993年10月；175(20)6605-13)?？傊ㄟ^生物轉(zhuǎn)化可能難以獲得α-酮基丁酸的積聚。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的一個目的是以生物技術(shù)方法獲得α-酮基丁酸。具體地說，本發(fā)明的一個目的是從天然突變體而不是遺傳改造的微生物中獲得α-酮基丁酸。此外，適于積聚或產(chǎn)生α-酮基丁酸的微生物應(yīng)為食物級微生物，以確保應(yīng)用于食品時不會招致反對且無害。
具體而言，α-酮基丁酸為獲得特定呋喃酮的起始點(diǎn)，所述呋喃酮如″Maggi-lactone″(5-乙基-3-羥基-4-甲基-2(5H)呋喃酮)，具有濃烈且特殊的香味，并以低濃度用作″前調(diào)(top-note)″。本發(fā)明的一個目的在于發(fā)現(xiàn)化學(xué)合成的α-酮基丁酸的替代物，前述化學(xué)合成的α-酮基丁酸至今一直用作進(jìn)一步合成香料的中間體。
獲得易于培養(yǎng)的微生物也是本發(fā)明的一個目的。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是從菌株中通過生物轉(zhuǎn)化獲得α-酮基丁酸，所述生物轉(zhuǎn)化不包括營養(yǎng)可疑的反應(yīng)物。
發(fā)明概述顯然，應(yīng)用食物級微生物是可能的，所述微生物為天然突變體且能夠積聚和/或分泌足夠量的α-酮基丁酸。
因此，本發(fā)明的第一個方面提供了從在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物中通過生物轉(zhuǎn)化蘇氨酸而積聚α-酮基丁酸的方法。
本發(fā)明的第二個方面提供了通過微生物的酶提取物進(jìn)行蘇氨酸的生物轉(zhuǎn)化而積聚α-酮基丁酸的方法。
本發(fā)明的第三個方面提供了微生物的用途，用于從蘇氨酸通過生物轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生α-酮基丁酸。
本發(fā)明的第四個方面提供了產(chǎn)生5-乙基-3-羥基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮(emoxyfurone)的方法，其中用作前體的α-酮基丁酸可由本發(fā)明的方法獲得。
本發(fā)明的一個優(yōu)勢在于其提供了便利且廉價地獲得α-酮基丁酸的方法。
本發(fā)明的另一優(yōu)勢是其提供了獲得α-酮基丁酸的生物技術(shù)方法。
又本發(fā)明的另一優(yōu)勢是提供了這樣的α-酮基丁酸，其可容易地且安全地用于食品中，或其可被進(jìn)一步加工成適于添加到食品中的物質(zhì)。
一個優(yōu)勢是，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的α-酮基丁酸可由食物級微生物產(chǎn)生。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將在當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方案中描述并彰顯，所述實(shí)施方案在下面陳列且參照附圖

圖1顯示隨時間(小時)的延長每升發(fā)酵培養(yǎng)基積聚的α-酮基丁酸(OBA＝氧代丁酸)的量，單位是mg/L。兩條曲線說明了二步驟發(fā)酵法，其中在第一培養(yǎng)基中發(fā)酵72小時后將微生物的生物量轉(zhuǎn)移到適于積聚OBA的第二培養(yǎng)基中。兩條曲線中較低的一條用作對照(培養(yǎng)基中不加入蘇氨酸)。
發(fā)明詳述在本說明書的上下文中，單詞″包含″意指″包括，同時還含其它″。不應(yīng)理解為″僅由其組成″。
術(shù)語α-酮基丁酸可由其同物異名詞2-氧代丁酸或由其相應(yīng)的共軛酸的名稱替換。
表述的″天然突變體″意指突變體微生物，所述微生物由除遺傳工程之外的其它方法獲得。換言之，該表述指非-GMO(遺傳修飾的生物體)。
本發(fā)明上下文中的突變不應(yīng)理解為單一位點(diǎn)的突變或僅存在于特定基因編碼區(qū)的突變。與之相反，突變?yōu)槿我饣蜃娜我庑问降腄NA改變，所述改變影響到突變的上下文中提及的特定基因產(chǎn)物的活性。例如，不應(yīng)認(rèn)為ilv-3突變(粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)中的基因座)僅限定于ilv-3基因的編碼區(qū)。
如用于″連鎖群IV″中的術(shù)語″連鎖群″為遺傳學(xué)中使用的術(shù)語，該術(shù)語指一條染色體上具有趨向于共同遺傳的不同基因座的區(qū)域。
術(shù)語″連鎖群IV″是指粗糙脈孢菌的一個染色體區(qū)域，該區(qū)域摻入了ilv-3基因座。詳見Kuwana H和Wagner RP，粗糙脈孢菌的iv-3突變體，I.遺傳和生物化學(xué)特征，遺傳學(xué)(Genetics)62479-485，1969。
本發(fā)明上下文中的ilv-3基因意指編碼EC 4.1.3.18(酶命名號)的基因。Ilv-3為粗糙脈孢菌中基因的名稱。但是，認(rèn)為此處的術(shù)語也包括其它生物體如釀酒酵母(Saccharomyces cescerevisiae)中具有相同功能的基因，其中已知該基因縮寫為ILV-2。
此處應(yīng)用的EC編號指由生物化學(xué)和分子生物學(xué)國際聯(lián)合會(IUBM)制定的酶分類系統(tǒng)。
本發(fā)明的上下文中所表述的″不同的″培養(yǎng)基并非意在限定為完全不同的或新的培養(yǎng)基。但其意指使用的培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為具有特異的功能，所述功能與先前培養(yǎng)基之一的功能不同。可通過如加入營養(yǎng)物、改變pH值或替換全部培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此根據(jù)上下文，術(shù)語″不同的″培養(yǎng)基可替換為術(shù)語″經(jīng)修飾的″或″第二″培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，微生物為食物級微生物。更優(yōu)選地，微生物為細(xì)菌、真菌或酵母。
優(yōu)選地，微生物為細(xì)菌或真菌。如果為真菌，其優(yōu)選地屬于子囊菌(Ascomycota)門，更優(yōu)選地屬于Sordariomycetidae亞綱且更優(yōu)選地屬于Sordariales目。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，微生物屬于脈孢菌屬。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物為粗糙脈孢菌菌株。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，微生物為天然突變體微生物。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的微生物具有影響異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸生物合成途徑的突變。
優(yōu)選地，微生物為粗糙脈孢菌連鎖群IV的突變體。例如，該天然突變體為iv-3突變體。
優(yōu)選地，天然突變株選自以下引用的菌株，Kuwana H和Wagner RP，粗糙脈孢菌的iv-3突變體，I.遺傳和生物化學(xué)特征，遺傳學(xué)(Genetics)62479-485，1969。
優(yōu)選地，天然突變株為可從堪薩斯醫(yī)學(xué)中心的真菌遺傳儲存中心(Fungal genetics Stocks Centre)購買的粗糙脈孢菌菌株，其目錄號為FGSC575，且具有以下的特征接合型A、基因型ilv-3、等位基因Y7110、連鎖群IVR、遺傳背景L、誘變劑M，標(biāo)志異亮氨酸加纈氨酸-3。參考文獻(xiàn)Barrat等，1954，遺傳學(xué)進(jìn)展(Adv Genet)61-93。Perkins等，1969，遺傳學(xué)(Genetica)40247-278。該菌株具有位于ilv-3基因的突變。
因此，在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，天然突變體包含ilv-3基因產(chǎn)物的功能失調(diào)、缺陷或被抑制和/或ilv-3基因的突變。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，微生物所呈現(xiàn)的乙酰羥酸(acetohydroxy acid)合成酶活性非常低或缺失。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，微生物的脫羥酸脫水酶或乙酰羥酸合成酶缺乏或受到抑制。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法包括一步、兩步或更多的步驟。如果包括兩步或更多的步驟時，其中至少一個步驟產(chǎn)生微生物生物量且至少一個其它步驟積聚α-酮基丁酸。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法為兩步驟或多步驟的連續(xù)或不連續(xù)發(fā)酵。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在利于生物量產(chǎn)生和酶活性的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，以及之后在利于α-酮基丁酸積聚和/或分泌的不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)該生物量。
優(yōu)選地，產(chǎn)生生物量后，過濾第一培養(yǎng)基，收集殘留物(微生物)并將其轉(zhuǎn)移到不同的培養(yǎng)基中。
備選地，可在微生物存在下調(diào)整培養(yǎng)基來形成不同的培養(yǎng)基，即不經(jīng)過過濾步驟。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，利于積聚α-酮基丁酸的培養(yǎng)基(例如第二培養(yǎng)基)包含0-1％的纈氨酸、0.2-10％的蘇氨酸(重量百分比)和/或其pH調(diào)節(jié)到7-14。優(yōu)選地，培養(yǎng)基包含0.2-5％的蘇氨酸。
第一培養(yǎng)基可為化學(xué)上定義的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基利于生物量的形成以及合適的酶活性。
第二或不同的培養(yǎng)基包含額外的纈氨酸(酶觸發(fā)劑)和/或蘇氨酸(前體)。
優(yōu)選地，第一和第二培養(yǎng)基的pH值不同。
例如，第二培養(yǎng)基包含額外的纈氨酸和/或蘇氨酸。
優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括從發(fā)酵培養(yǎng)基中提取、分離和/或純化α-酮基丁酸。
例如，可用具有適宜樹脂的柱子或通過HPLC從培養(yǎng)基中分離α-酮基丁酸。
在一備選實(shí)施方案中，α-酮基丁酸僅經(jīng)過預(yù)純化，這意味著僅在不完全的、部分分離含α-酮基丁酸的培養(yǎng)基后，即直接將其用于進(jìn)一步的處理。例如，可僅過濾培養(yǎng)基以移除微生物并直接用于進(jìn)一步的處理。如果emoxyfurone或sotolon(前調(diào)香料)為終產(chǎn)物的話，該方法可獲得良好結(jié)果。完成Emoxyfurone或sotolon的合成之后可容易地對其進(jìn)行分離。
為使本發(fā)明運(yùn)轉(zhuǎn)，必須確定適宜的菌株。可根據(jù)菌株的代謝特征對其進(jìn)行篩選。通常，蘇氨酸到α-酮基丁酸的生物轉(zhuǎn)化在大多數(shù)生物體中普遍存在，所述生物體包括動物、高等植物和單細(xì)胞生物體。因此，可從大量的生物體中篩選出適宜的菌株。優(yōu)選地，在為野生型的情況下，篩選到的微生物或細(xì)胞系具有將α-酮基丁酸轉(zhuǎn)化為2-乙酰-2-羥基-丁酸的能力。換言之，如果以野生型形式出現(xiàn)，該微生物能夠合成異亮氨酸和/或纈氨酸和亮氨酸。對高等植物和許多單細(xì)胞生物體而言該條件同樣必需。如果其中纈氨酸或異亮氨酸途徑經(jīng)受了某種程度的負(fù)向影響，則任何種類的該生物體均可適于積聚α-酮基丁酸。
例如，篩選出由于乙酰羥酸合成酶(該酶的酶命名號為EC 4.1.3.18)缺乏、功能失調(diào)或受到抑制而積聚或分泌α-酮基丁酸的菌株，所述乙酰羥酸合成酶能夠在如以上所提及的野生型生物體中將α-酮基丁酸轉(zhuǎn)化為α-酮-2-羥基-丁酸。該酶也稱作乙酰乳酸合成酶，這一名稱與其將丙酮酸轉(zhuǎn)化為α-乙酰乳酸的能力對應(yīng)。因此，可篩選該酶受到抑制、缺乏、功能失調(diào)或完全不表達(dá)的菌株。例如，可應(yīng)用這樣的天然突變體，其中編碼該酶的基因或參與其表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子中存在突變使得相應(yīng)的酶不具有正常的功能。
當(dāng)然，其它突變體也能夠積聚α-酮基丁酸。特別是，可應(yīng)用包含影響纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸生物合成途徑的一個或多個突變的菌株。例如，也可篩選乙酰羥酸還原異構(gòu)酶(EC 1.1.1.86)、二羥酸脫水酶(EC 4.2.1.9)或支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.42)等缺失而具有積聚α-酮基丁酸能力的菌株，且因此前述菌株可成為本發(fā)明的適宜菌株。但是，其它突變體也可積聚α-酮基丁酸。
例如，應(yīng)用優(yōu)選地選自子囊菌亞門(ascomycotina)的真菌菌株。但是，特定細(xì)菌也是適宜的。例如可應(yīng)用酵母菌株。但是，也可應(yīng)用來自脈胞菌屬、特別是來自粗糙脈孢菌種的菌株。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，可應(yīng)用以上提及的來自堪薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的粗糙脈孢菌菌株。該特定菌株已經(jīng)在下文中被描述為Y7110-菌株Kuwana和Wagner，粗糙脈孢菌的iv-3突變體，I.遺傳和生物化學(xué)特征，遺傳學(xué)(Genetics)62479-485，1969。
通常，食物級微生物為優(yōu)選。
為獲得α-酮基丁酸，必須選擇適宜的培養(yǎng)基。根據(jù)所選擇的菌株，也可制備預(yù)培養(yǎng)物。通常，用于預(yù)培養(yǎng)物或主發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基的選擇以及所有發(fā)酵參數(shù)高度取決于所選擇的菌株。技術(shù)人員通常明曉特定菌株的最佳生長或培養(yǎng)條件。
例如，如果應(yīng)用真菌如粗糙脈孢菌，獲得孢子懸液用作起始材料即足夠，前述懸液在處理的較后階段允許進(jìn)行同步且快速的生物量生產(chǎn)。對大多數(shù)真菌菌株而言，利于形成孢子的特定發(fā)酵參數(shù)(溫度、pH、光、營養(yǎng)補(bǔ)給)為公知。例如，在粗糙脈孢菌菌株中，可應(yīng)用稱作Horowitz的培養(yǎng)基(瓊脂)(參見Deutsch，″Das ExperimentSporenmusterbildung beimSchlauchpilz N.crassa″，Biologie in unserer Zeit，1993，23(4)259-264)。將粗糙脈孢菌菌株劃線到瓊脂-錐形瓶上并在光下25℃生長120小時。通常，選擇已知可利于孢子形成(有性或無性產(chǎn)生)的條件。當(dāng)已積累起足夠的生物量時，即可將無菌水加到瓊脂平板上，在輕輕振動時前述的無菌水可懸浮孢子。由此獲得的孢子懸液可用作起始培養(yǎng)物。在選擇細(xì)菌或細(xì)胞系進(jìn)行本發(fā)明的情形下，起始材料的制備有所不同，這要考慮特定細(xì)菌菌株或細(xì)胞系的特殊性。
可應(yīng)用起始培養(yǎng)物接種培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基利于營養(yǎng)生長、生物量產(chǎn)生和/或α-酮基丁酸的積聚，同時不降低或降低孢子的形成。如果選擇粗糙脈孢菌進(jìn)行本發(fā)明，可將起始材料加到液體培養(yǎng)基如Vogel-蔗糖培養(yǎng)基中，如前所述(Deutsch，″Das ExperimentSporenmusterbildung beimSchlauchpilz N.crassa″，Biologie in unserer Zeit，1993，23(4)259-264)。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生產(chǎn)時，可將孢子加到錐形瓶中的液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于25℃并于100-200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩。
開始發(fā)酵后，例如接種后8到40小時，優(yōu)選地為接種后8到30小時，可將蘇氨酸加至培養(yǎng)基以使每升培養(yǎng)基中蘇氨酸的濃度達(dá)到0.1-5％(重量百分比)，優(yōu)選地為0.2-4％，更優(yōu)選地為0.5-3％。
如果應(yīng)用的菌株缺乏乙酰乳酸合成酶，也可將異亮氨酸和纈氨酸加到培養(yǎng)基中，這是由于該菌株不能合成這些氨基酸。當(dāng)然，對具有影響異亮氨酸/纈氨酸途徑的任何突變或缺陷的菌株而言也是如此。但是，由于反向或正向反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，這些氨基酸應(yīng)以精確調(diào)節(jié)的量加入。具體而言，高水平的異亮氨酸抑制或下調(diào)蘇氨酸脫水酶(粗糙脈孢菌中的ilv-1基因產(chǎn)物)的活性，且因此減少α-酮基丁酸的積聚。有趣的是，纈氨酸是粗糙脈孢菌的ilv-1基因產(chǎn)物的激活劑，也不能以大劑量加入。因此，加入到培養(yǎng)基的纈氨酸的起始數(shù)量為0.005到1.5％的總培養(yǎng)基重量。優(yōu)選地，加入到培養(yǎng)基的纈氨酸量為占0.01到1％的重量，更優(yōu)選地為占0.01-0.5％的重量。
但是，發(fā)酵時間取決于進(jìn)行發(fā)酵的類型。
經(jīng)過最佳發(fā)酵時間后，由以上描述的粗糙脈孢菌所發(fā)酵的培養(yǎng)基中α酮基丁酸的積聚可達(dá)到較高的量。開始發(fā)酵20到200小時后，優(yōu)選地為40到150小時后可達(dá)到最大量。
如以上描述的用于獲得α-酮基丁酸的生物量的培養(yǎng)通常是指連續(xù)的發(fā)酵過程。例如，發(fā)酵開始后可不向培養(yǎng)基中加入任何物質(zhì)。另外，可僅在特定時間如培養(yǎng)基接種10到40小時后加入蘇氨酸或營養(yǎng)物。根據(jù)另一變更，發(fā)酵開始后在不同的時間間隔加入蘇氨酸，例如在8、16、24、48和72小時后加入蘇氨酸。此外，可根據(jù)此模式加入其它代謝物或營養(yǎng)物。
如以上所描述的連續(xù)處理或具有過渡特性的分批處理的特征通常表現(xiàn)為生物量的形成基本上與關(guān)鍵代謝物的積聚同時實(shí)現(xiàn)。同時，除了通常在發(fā)酵中出現(xiàn)的pH降低外，并不導(dǎo)致pH的顯著改變。
備選地，可應(yīng)用更為復(fù)雜的連續(xù)兩步(或更多)步驟的方法。人們驚異地發(fā)現(xiàn)，此類發(fā)酵生成的α-酮基丁酸的濃度要高得多，這是由于培養(yǎng)基組分已根據(jù)特定步驟的特定效果進(jìn)行了優(yōu)化。例如，可設(shè)計(jì)第一步驟為針對生物量積聚以及隨后的步驟如第二步為實(shí)質(zhì)上進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
令人驚異地是，兩(或更多)步驟發(fā)酵方法被證實(shí)特別適于α-酮基丁酸的積聚?？蛇M(jìn)行兩步驟方法。首先，可進(jìn)行連續(xù)兩步驟發(fā)酵方法。相應(yīng)地，在特定的pH可產(chǎn)生生物量。當(dāng)積聚起足夠量的生物量時(例如0.01g濕重/ml)，改變pH(或菌株特異的其它參數(shù))，且任選地，不丟棄初始培養(yǎng)基并加入另外的培養(yǎng)基成分。
當(dāng)然，根據(jù)所應(yīng)用的經(jīng)篩選微生物，pH和其他參數(shù)可顯著不同。具體而言，用于生物量形成和α-酮基丁酸合成的最佳pH可能不同于以下給出的數(shù)值。甚至也有可能的是，菌株的兩步驟中生物量形成和α-酮基丁酸合成的最佳pH相同或類似。
如果用以上描述的粗糙脈孢菌菌株生產(chǎn)α-酮基丁酸，用于生物量積聚的起始pH可低于7，優(yōu)選地為4到6，更優(yōu)選地為4.5到6。在此pH和20到30℃溫度下，開始發(fā)酵并進(jìn)行1到10天，優(yōu)選地進(jìn)行2到5天，例如前述發(fā)酵應(yīng)用以上提及的Vogel-蔗糖培養(yǎng)基并進(jìn)行振蕩或攪動。
當(dāng)積聚到足夠的生物量后，可通過加入NaOH將pH調(diào)節(jié)到7到14，優(yōu)選地調(diào)節(jié)到9到11，以開始生物轉(zhuǎn)化過程。此外，可在此階段加入蘇氨酸、纈氨酸和/或異亮氨酸。
根據(jù)本方法，以上鑒定的粗糙脈孢菌菌株在每升培養(yǎng)基中可生產(chǎn)2到10g的α-酮基丁酸。此外，由于僅改變pH基本上足以啟動α-酮基丁酸合成的增加，因此本方法簡單且快速。
另一方面，在本發(fā)明的上下文中，不連續(xù)的兩步驟方法也是可能的。因此，積聚生物量后，將其從培養(yǎng)基中分離，例如通過過濾完成前述分離。之后，將生物量置入新培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基調(diào)整為可促進(jìn)α-酮基丁酸的積聚。
在應(yīng)用真菌粗糙脈孢菌菌株積聚α-酮基丁酸的情形中，促進(jìn)其積聚的培養(yǎng)基的pH為7到14，優(yōu)選地為9到11。與連續(xù)兩步驟方法類似，該方法生產(chǎn)大量的α-酮基丁酸(3-10g/L)。通過進(jìn)一步具體調(diào)節(jié)培養(yǎng)基甚至可獲得更高的濃度。
例如，可在同樣用于連續(xù)兩步法的Vogel-蔗糖培養(yǎng)基中進(jìn)行生物量形成。例如，可在輕輕振蕩或攪拌下，于10℃到45℃，優(yōu)選地于22℃到30℃進(jìn)行1到7天，優(yōu)選地進(jìn)行1到42天的生物量的積聚。
對于生物轉(zhuǎn)化，可從適于產(chǎn)生生物量的第一培養(yǎng)基中通過例如過濾來分離生物量，并置入適于生物轉(zhuǎn)化的緩沖液中。該緩沖液或培養(yǎng)基的特征通常為其pH和氨基酸濃度利于靶分子的積聚。技術(shù)人員知曉加到培養(yǎng)基中的因子以及為此目的而調(diào)節(jié)的參數(shù)。選擇的因子通常激活所需的生物轉(zhuǎn)化中的酶。
例如，如果應(yīng)用以上定義的粗糙脈孢菌菌株，應(yīng)用pH為7-14且優(yōu)選地為9-11的磷酸鹽緩沖液(0.1M)或甘氨酸緩沖液(0.1M)。緩沖液可補(bǔ)充以蘇氨酸，例如其濃度為0.1-10％，優(yōu)選地為0.1-5％，更優(yōu)選地為0.2-4％，以及補(bǔ)充以纈氨酸，例如其濃度為0.005-1.5％，優(yōu)選地為0.01-0.5％，以使蘇氨酸轉(zhuǎn)換為α-酮基丁酸。磷酸鹽緩沖液中用于生物轉(zhuǎn)化的發(fā)酵可進(jìn)行12小時到3天，優(yōu)選地進(jìn)行18小時到48小時，發(fā)酵溫度為10到45℃，優(yōu)選地為23到30℃。
通常，可應(yīng)用與所描述的用于以上列出的連續(xù)一步法相同的起始和液體培養(yǎng)基以及相同地添加特定氨基酸的額外補(bǔ)充物。
當(dāng)然，除了應(yīng)用完整的微生物進(jìn)行發(fā)酵外，也可應(yīng)用該微生物的酶提取物或可商業(yè)獲得的酶分離物進(jìn)行從蘇氨酸到α-酮基丁酸的生物轉(zhuǎn)化。例如，可從此處提到的粗糙脈孢菌菌株中提取酶。然后制備包含最佳pH、酶激活劑和前體的培養(yǎng)基用以積聚α-酮基丁酸。
根據(jù)α-酮基丁酸進(jìn)一步的用途，可通過例如帶有適宜樹脂的柱子或通過HPLC從培養(yǎng)基中分離α-酮基丁酸。
但是，如果α-酮基丁酸用作合成其它終產(chǎn)物的中間體，前述終產(chǎn)物如香料emoxyfurone(5-乙基-3-羥基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮)或sotolon(3-羥基-4，5-二甲基-2(5H)-呋喃酮)，那么純化或分離處理即已足夠。這兩種香料一般構(gòu)成″前調(diào)″，其應(yīng)用濃度非常低。
例如，emoxyfurone的產(chǎn)生可通過從培養(yǎng)基中過濾真菌菌絲實(shí)現(xiàn)，任選地進(jìn)一步純化培養(yǎng)基以及通過改變條件以促進(jìn)內(nèi)酯化反應(yīng)。
在第一步驟中，確定培養(yǎng)基中α-酮基丁酸的濃度即足夠。向培養(yǎng)基中加入與α-酮基丁酸相同濃度的K2CO3有利于α-酮基丁酸的烯醇互變異構(gòu)體的形成。此后，可將pH調(diào)節(jié)到8并加入磷酸鹽緩沖液。然后，例如將培養(yǎng)基于120℃加熱4小時。任選地，可在此階段加入沸石以防止沸騰濺出。在此步驟，形成了emoxyfuone(5-乙基-3-4-甲基-2(5H9-呋喃酮)，其由最初的兩分子α-酮基丁酸組成，其中的一個分子為烯醇形式。此后，可將培養(yǎng)基冷卻到低于10℃并加入10％HCl(每份α-酮基丁酸加入10份的10％HCl)。隨后，可再次加熱培養(yǎng)基1/2到3小時以降低酮水解?？稍?0-90℃應(yīng)用真空器(10到100毫巴)以最終形成環(huán)，前述真空器導(dǎo)致水和(1/2)CO2從分子中分離并導(dǎo)致形成emoxyfuran。
通過醚萃取可容易地從培養(yǎng)基中分離出emoxyfurone(一種內(nèi)酯)，例如通過在水系統(tǒng)中應(yīng)用3個循環(huán)的甲基四丁基醚并加入硫酸鈉。
以下給出的實(shí)施例僅用于例證的目的且絕不可理解為對本申請主題的限制。除非另外指出，百分比和份為重量計(jì)數(shù)。
實(shí)施例1通過生物轉(zhuǎn)化粗糙脈孢菌中的蘇氨酸積聚α-酮基丁酸材料和方法具有ilv-3(-)基因型的粗糙脈孢菌菌株的孢子從堪薩斯醫(yī)學(xué)中心購買，目錄號為FGSC 575，接合型為A，涂布在錐形瓶中的瓊脂上用于起始材料的制備。用于此目的的″Horowitz″培養(yǎng)基的組分在以下的表1中給出。
表1用于培養(yǎng)粗糙脈孢菌以獲得孢子的″Horowitz″培養(yǎng)基

*總鹽溶液25gK-Tartrat(半水合酒石酸二鉀，Merck)20g硝酸鈉5gKH2PO42.5gMgSO4×7H2O0.5gCaCl2×2H2O0.5gNaCl用蒸餾水調(diào)至1000ml。
**生物素溶液將5mg生物素溶解在100ml的50％乙醇中。
光下于25℃培養(yǎng)菌株120小時。
然后，將10ml的蒸餾水加到錐形瓶中以懸浮孢子。取4ml的懸液并置入含液態(tài)“Vogel-蔗糖”培養(yǎng)基的錐形瓶中，所述培養(yǎng)基在下表2中給出。該培養(yǎng)基從開始即強(qiáng)化以L-纈氨酸和L-異亮氨酸。此外，“Vogel-蔗糖-培養(yǎng)基”包含經(jīng)改進(jìn)的″Vogel-鹽溶液″，其成分在以下的表3中給出。于25℃、100轉(zhuǎn)/分鐘條件下發(fā)酵168小時(7天)。開始發(fā)酵24小時后加入L-蘇氨酸(10g/L)。
表2用于粗糙脈孢菌發(fā)酵的″Vogel-蔗糖″培養(yǎng)基

表3用于″Vogel-蔗糖″發(fā)酵培養(yǎng)基中的經(jīng)改進(jìn)″Vogel-鹽″溶液

***痕量元素溶液5g檸檬酸×H2O5gZnSO4×H2O1gFe(NH4)2(SO4)×6H2O0.25gCuSO4×5H2O0.05gMnSO4×H2O0.05gH3BO30.05gNa2MoO4×2H2O(二水合鉬酸鈉)用蒸餾水調(diào)至100ml。
24、48、72小時后采取培養(yǎng)基樣本并通過HPLC(高效液相色譜)進(jìn)行分析。
結(jié)果在培養(yǎng)基中，積聚的α-酮基丁酸高達(dá)400mg/L(HPLC-分析)。
總之，通過發(fā)酵天然突變體微生物，有可能獲得α-酮基丁酸在培養(yǎng)基中的積聚。在本實(shí)施例中，證明天然ilv-3突變體子囊菌亞門真菌(粗糙脈孢菌)是有效的。
實(shí)施例2兩步發(fā)酵法提高了α-酮基丁酸的積聚材料和方法應(yīng)用與實(shí)施例1中引用的相同的菌株、培養(yǎng)基和設(shè)備。
在首次發(fā)酵中，生物量的產(chǎn)生通過接種培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)，根據(jù)實(shí)施例1中的數(shù)據(jù)所述培養(yǎng)基包含強(qiáng)化的Vogel-鹽溶液、L-纈氨酸和L-異亮氨酸(稍后加入蘇氨酸)。發(fā)酵開始時pH為5.8，于26℃輕度振搖(200轉(zhuǎn)/分鐘)72小時后降至4.4。
然后過濾(0.22μm)菌絲細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移到不同的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基為額外包含蘇氨酸(2％)和纈氨酸(0.03％)的磷酸鹽緩沖液(0.1M)。用NaOH(10N)將pH調(diào)節(jié)到10。
于25℃和200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下反應(yīng)總共110小時后，通過過濾培養(yǎng)基移除生物量來打斷生物轉(zhuǎn)化，并4℃儲存濾出液用于進(jìn)一步的分析。
結(jié)果應(yīng)用粗糙脈孢菌進(jìn)行兩步發(fā)酵后在培養(yǎng)基中獲得了高含量的α-酮基丁酸(＞8g/l)。圖1表明在總發(fā)酵過程中α-酮基丁酸隨時間的積聚。蘇氨酸到α-酮基丁酸的生物轉(zhuǎn)化高達(dá)90％。
總之，應(yīng)用食物級的天然突變體微生物以適宜培養(yǎng)基進(jìn)行兩步驟發(fā)酵生成了足夠量的由蘇氨酸轉(zhuǎn)化而來的α-酮基丁酸，使工業(yè)生產(chǎn)成為可能。
權(quán)利要求
1.通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物來生物轉(zhuǎn)化蘇氨酸而積聚α-酮基丁酸的方法。
2.通過微生物的酶提取物生物轉(zhuǎn)化蘇氨酸而積聚α-酮基丁酸的方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中微生物為食物級微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中微生物為粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中微生物為天然突變體微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中微生物顯示出非常低的或沒有乙酰羥酸合成酶活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任意一項(xiàng)所述的方法，所述方法包括在利于微生物生物量產(chǎn)生的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，以及其后在利于α-酮基丁酸積聚和/或分泌的不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)該生物量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中利于α-酮基丁酸積聚和/或分泌的培養(yǎng)基包含重量百分比為0.1-10％的蘇氨酸、0-1％的纈氨酸和/或其pH調(diào)節(jié)至7-11。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任意一項(xiàng)所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括從發(fā)酵培養(yǎng)基中提取、分離和/或純化α-酮基丁酸。
10.微生物的用途，用于通過生物轉(zhuǎn)化蘇氨酸而產(chǎn)生天然的α-酮基丁酸。
11.用于產(chǎn)生5-乙基-3-羥基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮(emoxyfurone)的方法，其中用作前體的α-酮基丁酸為根據(jù)權(quán)利要求1到10中任意一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生。
全文摘要
公開了通過生物轉(zhuǎn)化獲得α－酮基丁酸的方法。該分子在培養(yǎng)基中積聚并易于隨后加工成食物組分如前調(diào)香料。適宜的菌株為粗糙脈孢菌的天然ilv－3突變體菌株，所述菌株能夠在發(fā)酵培養(yǎng)基中積聚α－酮基丁酸。通過調(diào)節(jié)特定的培養(yǎng)基參數(shù)，每升培養(yǎng)基中可積聚高達(dá)8g的α－酮基丁酸。
文檔編號C12R1/645GK1592788SQ02823306
公開日2005年3月9日 申請日期2002年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月29日
發(fā)明者B·D·祖爾布里根, N·雷克黑夫, M·梅爾曼－德－凱姆普斯, K·勒奇 申請人:雀巢產(chǎn)品有限公司