国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      重組人紅細(xì)胞生成素的層析純化的制作方法

      文檔序號:603978閱讀:795來源:國知局
      專利名稱:重組人紅細(xì)胞生成素的層析純化的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及以高度純化形式,即具有低量宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)具有確定糖基形式組成的重組人紅細(xì)胞生成素(Epo)的方法。通過特定順序的純化步驟并且結(jié)合用于定量所分離的同種型(isoform)的分析工具可以達(dá)到該目的。
      背景技術(shù)
      紅細(xì)胞生成素是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞祖細(xì)胞增殖和分化及循環(huán)紅細(xì)胞生理水平維持的主要激素。在胎兒中,主要在肝臟中產(chǎn)生紅細(xì)胞生成素(Epo),出生后,其約90%產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到腎臟中生產(chǎn)。當(dāng)由于慢性或急性腎衰竭使紅細(xì)胞生成素(Epo)下降時,必須外部給予紅細(xì)胞生成素(Epo)以防止正在發(fā)展的貧血的發(fā)生。因?yàn)榧t細(xì)胞生成素(Epo)基因的發(fā)現(xiàn)和它在嚙齒動物細(xì)胞中的表達(dá),已經(jīng)可以獲得治療活性的人紅細(xì)胞生成素。
      人紅細(xì)胞生成素(Epo)基因編碼27個氨基酸的信號肽和具有18396道爾頓的計算分子量的166個氨基酸的蛋白質(zhì)。成熟的蛋白質(zhì)通常有一個氨基酸的N-末端缺失,是165個氨基酸長度。信號序列將肽引導(dǎo)到參與正確糖基化的細(xì)胞區(qū)室,產(chǎn)生了具有三個N-和一個O-糖基化位點(diǎn)的成熟蛋白質(zhì)。占總分子量約40%的糖部分對于紅細(xì)胞生成素(Epo)的全部生物學(xué)活性是必要的。幾項(xiàng)研究表明盡管體外活性,即與受體的結(jié)合在非或部分糖基化形式中最高,但是末端唾液酸殘基的數(shù)量對體內(nèi)半衰期具有積極的作用(Takeuchi和Kobata,1991,Glycobiology 1(4)337-346).。唾液酸化的程度直接與半衰期成比例,其中具有較少唾液酸的同種型會快得多地從生物體清除,因此顯示出較小的活性。
      產(chǎn)生高活性重組紅細(xì)胞生成素的目的在于通過良好的優(yōu)化發(fā)酵策略和利用選擇性純化方法產(chǎn)生具有大量末端唾液酸殘基的產(chǎn)物。
      存在關(guān)于不同來源紅細(xì)胞生成素(Epo)的純化的大量出版物。在紅細(xì)胞生成素克隆和重組DNA技術(shù)應(yīng)用以前,大多數(shù)描述的純化利用人尿作為天然來源。下面所有的人紅細(xì)胞生成素(Epo)純化方案都以純的產(chǎn)物告終,而沒有強(qiáng)調(diào)確定同種型的積累。T.Miyake等,1977,J.Biol.Chem252(15)5558-5564描述了通過七個步驟方法的尿紅細(xì)胞生成素(Epo)的純化,包括離子交換層析,乙醇沉淀,凝膠過濾和吸附層析。N.Inoue等,1994,Biol.Pharm.Bull.,17(2)180-184描述了利用陰離子交換層析,凝膠過濾,凝集素層析和反相層析純化來源于人尿的紅細(xì)胞生成素(Epo)的不同方法。尿也是G.Krystal等,1986,Blood,67(1)71-79描述的用于Affi-Blue,層析聚焦,凝集素層析,反相層析和制備型SDS-PAGE五步純化的來源。H.Yianagi等,1987,J.Chromatogr.417178-182公開了上述純化步驟的不同聯(lián)合。他們的下游處理(DSP)方法開始于尿,并通過乙醇沉淀、兩個凝集素層析步驟、羥基磷灰石和反相層析純化。
      V.Broudy等,1988,Arch.Biochem.Biophys.265(2)329-336通過Affi-Gel blue層析、陰離子層析和反相層析,利用轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞系純化紅細(xì)胞生成素(Epo)。純化的紅細(xì)胞生成素(Epo)未針對特定同種型進(jìn)行富集。
      A.B.Ghanem,1994,Prep.Biochem.24(2)127-142和A.Gokana等,1997.J.Chromatogr.791109-118利用DEAE-Sephacel在親和層析步驟后分離B-類淋巴母細(xì)胞系中產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素的同種型。他們通過等電聚焦分析了純化產(chǎn)物,但是沒有合并具有確定同種型的級分。
      J.Burg等,WO99/28346對紅細(xì)胞生成素(Epo),就碳水化合物結(jié)構(gòu)中的N-乙?;?乳糖胺單元和/或四天線分枝(tetra-antenna branch),進(jìn)行了高度純化。DSP順序開始于細(xì)胞培養(yǎng)物上清液,通過親和層析捕獲,通過疏水相互作用層析、羥基磷灰石和反相層析純化。這種方法的缺點(diǎn)是Blue-sepharose捕獲基質(zhì)的Cibacron Blue 3G染料-配體可能泄漏,通過HIC步驟對宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的分離相當(dāng)弱,和硅基RPC樹脂對于NaOH消毒處理不穩(wěn)定。
      發(fā)明概述本發(fā)明提供了從包含宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基回收和純化重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的方法,該方法包括步驟(a)通過選自(i)離心后深度過濾(depth filtration)步驟,(ii)深度過濾步驟,和(iii)離心步驟的方法,從細(xì)胞培養(yǎng)基除去宿主細(xì)胞、細(xì)胞成分和碎片以獲得澄清的培養(yǎng)基上清液;(b)調(diào)節(jié)上清液的電導(dǎo)率到5mS/cm或以下,及調(diào)節(jié)pH至約7.0到8.0之間;(c)將步驟(b)得到的上清液施加到包含陰離子交換層析介質(zhì)的柱上,洗柱子,從柱上洗脫重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo),收集含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的峰級分;(d)利用樹脂,將步驟(c)得到的合并峰級分進(jìn)行反相層析步驟,該樹脂可以在中等壓力(<10bar)下運(yùn)行并且可以抵抗高濃度的NaOH,利用有機(jī)溶劑的線性梯度洗脫重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo);(e)將步驟(d)中洗脫的一個或多個含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的級分加到包含陰離子交換層析介質(zhì)的柱上,洗柱子,利用線性鹽梯度洗脫重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo);(f)根據(jù)重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的唾液酸化程度,選擇步驟(e)中洗脫的含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的一個或多個級分;和(g)利用凝膠過濾介質(zhì),將步驟(f)中洗脫的含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的一個或多個級分進(jìn)行一個或多個大小排阻層析步驟以除去潛在的二聚體和更大的聚集體;收集含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的洗脫物。
      發(fā)明的詳細(xì)描述已經(jīng)開發(fā)出利用現(xiàn)代聚合樹脂的新的純化方法,該樹脂為剛性的(rigid)并且耐受原位苛刻清洗過程,包括1M NaOH或醋酸。而且,對于生產(chǎn)規(guī)模的有效方法,這些樹脂有高結(jié)合容量并允許高的流率。不使用具有潛在可泄漏配體(如凝集素或染料)由此可能對患者造成問題的樹脂。
      所實(shí)施的純化步驟有不同的選擇性,從而產(chǎn)生具有低量來源于宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)或DNA的非常純產(chǎn)物。而且,在根據(jù)這里概述的本發(fā)明純化方法中,幾個、優(yōu)選至少3個層析步驟有分離單獨(dú)的同種型的潛力。特別地,在合并第二陰離子交換層析步驟(即,步驟(e),參見下文)的級分及通過最后凝膠過濾層析進(jìn)一步處理前可以通過CZE(毛細(xì)管區(qū)帶電泳)進(jìn)行分析。此外,或者備選地,可以通過CZE(毛細(xì)管區(qū)帶電泳)分析反相層析步驟(即步驟(d),參見下文)的級分,并且相應(yīng)地處理該級分。另一種可能性是用第一次陰離子交換層析(即步驟(c),參見下文)獲得的級分進(jìn)行(備選地或額外地)CZE(毛細(xì)管區(qū)帶電泳)。利用CZE(毛細(xì)管區(qū)帶電泳),可以將在所分析級分中含有的同種型混合物或組合物形式的糖基化蛋白質(zhì)或多肽分離為特定的同種型。通過和已知同種型標(biāo)準(zhǔn)比較,特別是比較糖基化模式,例如唾液酸化模式,可以確定通過CZE(毛細(xì)管區(qū)帶電泳)分離的每個同種型的特定結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明上下文中,這導(dǎo)致具有確定的高糖基化同種型組成的合并級分,而不依賴于來源的質(zhì)量。更一般而言,在本發(fā)明的過程中,確立了CZE(毛細(xì)管區(qū)帶電泳)是獨(dú)立于蛋白質(zhì)或多肽本身的屬性而生產(chǎn)包含蛋白質(zhì)或多肽的糖基化同種型的蛋白質(zhì)性組合物時的有價值工具。因此,本發(fā)明提供了CZE(毛細(xì)管區(qū)帶電泳)作為分析工具在具有確定的同種型組成的糖基化蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)中的用途。特別地,該用途可以有利地應(yīng)用在具有確定同種型組成的重組人紅細(xì)胞生成素的生產(chǎn)中。因此,本發(fā)明包括具有確定同種型組成的糖基化蛋白質(zhì)或多肽,特別是重組人紅細(xì)胞生成素的生產(chǎn)方法,所述方法包括利用CZE(毛細(xì)管區(qū)帶電泳)分析包含糖基化蛋白質(zhì)或多肽的一種或多種同種型的樣品(其可以是層析純化步驟的級分),并且,當(dāng)期望時合并含有該糖基化蛋白質(zhì)或多肽的期望同種型的樣品,特別地,其中所述糖基化蛋白質(zhì)或多肽的同種型是重組人紅細(xì)胞生成素的同種型。
      而且,可以設(shè)計本方法,通過降低剪切應(yīng)力和細(xì)胞裂解在最初分離期間僅僅釋放非常低量的細(xì)胞蛋白酶,并且利用殘余蛋白酶沒有活性和對產(chǎn)物無害的條件。這可以通過如下方式達(dá)到首先,通過密閉設(shè)計的盤疊式離心機(jī)(disc stack centrifage)進(jìn)行細(xì)胞分離以保持細(xì)胞完整,其次,利用在中性pH工作的陰離子交換層析實(shí)施捕獲步驟。低于6的pH將引起內(nèi)源低pH活性蛋白酶的切割作用。
      最后,此下游處理(DSP)順序中的幾個步驟在病毒除去和/或病毒失活方面是有力的。對于哺乳動物細(xì)胞來源的治療劑而言,因?yàn)椴荒芘懦《疚廴荆@是重要的要求。實(shí)施的納米過濾(nanofiltration)特別有助于除去甚至非常小的無包膜病毒,如細(xì)小病毒。反相層析期間和/或之后的溶劑暴露是另一個引起包膜病毒失活的有效步驟。
      因此,本發(fā)明提供了從包含宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基回收和純化重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的方法,該方法包括步驟(a)通過選自(i)離心后深度過濾步驟,(ii)深度過濾步驟,和(iii)離心步驟的方法,從細(xì)胞培養(yǎng)基除去宿主細(xì)胞、細(xì)胞成分和碎片以獲得澄清的培養(yǎng)基上清液;(b)調(diào)節(jié)上清液的電導(dǎo)率到5mS/cm或以下,并調(diào)節(jié)pH至約7.0到8.0之間;(c)將步驟(b)得到的上清液施加到包含陰離子交換層析介質(zhì)的柱上,洗柱子,從柱上洗脫重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo),收集含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的峰級分;(d)利用樹脂,將合并的步驟(c)得到的峰級分進(jìn)行反相層析步驟,該樹脂可以在中等壓力(<10bar)下運(yùn)行并且可以抵抗高濃度的NaOH,利用有機(jī)溶劑的線性梯度洗脫重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo);(e)將步驟(d)中洗脫的一個或多個含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的級分施加到包含陰離子交換層析介質(zhì)的柱上,洗柱子,利用線性鹽梯度洗脫重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo);(f)根據(jù)重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的唾液酸化程度,選擇步驟(e)中洗脫的一個或多個含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的級分;和(g)利用凝膠過濾介質(zhì),將步驟(f)中一個或多個洗脫的含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的級分進(jìn)行一個或多個大小排阻層析步驟以除去潛在的二聚體和更大的聚集體;收集含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的洗脫物。
      優(yōu)選地,利用盤疊式分離器進(jìn)行步驟(a)中的離心。
      在優(yōu)選實(shí)施方式中,在步驟(b)中將電導(dǎo)率調(diào)節(jié)到2至5mS/cm之間,優(yōu)選達(dá)到約3mS/cm。
      有利地,用在步驟(c)中的陰離子交換介質(zhì)是基于陶瓷的離子交換介質(zhì)Q-HyperD FTM,可從BioSepra獲得。有利地,用在步驟(d)中的樹脂是可以抗約0.5M NaOH濃度的樹脂;優(yōu)選地其是聚苯乙烯樹脂,有利地其是Source 30RPCTM(可從Amersham Biosciences獲得),而用在步驟(e)中的陰離子交換介質(zhì)優(yōu)選瓊脂糖凝膠(Sepharose)陰離子交換層析介質(zhì),有利地它是Q Sepharose High PerformanceTM(可從AmershamBiosciences獲得)。用在步驟(g)中的凝膠過濾介質(zhì)優(yōu)選Superdex 75 prepgradeTM(可從Amersham Biosciences獲得)。
      在優(yōu)選實(shí)施方式中,在步驟(d)前,步驟(c)的峰級分(優(yōu)選地,可以合并)進(jìn)行硫酸銨沉淀步驟以沉淀污染的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì),然后將上清液的硫酸銨濃度調(diào)到與步驟(d)相容的濃度。在向步驟(d)的反相柱上樣前,優(yōu)選地,該濃度小于0.24M硫酸銨。
      通常,在步驟(b)中調(diào)節(jié)pH到約pH7.5。優(yōu)選地,用適合的含有鹽,如NaCl的含水緩沖液,例如Tris緩沖液進(jìn)行步驟(c)中的洗滌。在優(yōu)選實(shí)施方式中,利用20mM pH7.5含有50mM NaCl的Tris緩沖液。類似地,用適合的含有鹽,如NaCl的含水緩沖液,例如Tris緩沖液進(jìn)行洗脫。通常利用有100mM至1M,特別是大于125mM,優(yōu)選150mM鹽濃度的緩沖液進(jìn)行步驟(c)中的洗脫步驟。在優(yōu)選實(shí)施方式中,在該洗脫步驟中利用20mM pH7.5含有150mM NaCl的Tris緩沖液。優(yōu)選地,步驟(d)中的有機(jī)溶劑選自乙腈、乙醇和己二醇(即,2-甲基-2,4-戊二醇),最優(yōu)選是乙腈。優(yōu)選地,在將包含紅細(xì)胞生成素的級分施行反相層析前,用含有有機(jī)溶劑,優(yōu)選乙腈的含水緩沖液,如20mM Tris/HCl,pH7.0,稀釋級分。在將稀釋的級分加到反相柱上后,優(yōu)選地,用含有有機(jī)溶劑,優(yōu)選乙腈的含水緩沖液,如20mM Tris/HCl,pH7.0,洗滌柱子。優(yōu)選地,利用約10%到約100%的有機(jī)溶劑線性梯度在步驟(d)中洗脫紅細(xì)胞生成素(Epo)多肽。在其特別優(yōu)選的實(shí)施方式中,在步驟(d)中,通常利用約25%到50%的乙腈線性梯度進(jìn)行洗脫。步驟(e)中線性鹽梯度通常為0到300mM。優(yōu)選地,步驟(c)和(e)中的鹽是NaCl。
      在本發(fā)明一個實(shí)施方式中,用適合的含水緩沖液稀釋步驟(d)中洗脫的含有有機(jī)溶劑,優(yōu)選乙腈的級分,該緩沖液與下面的陰離子交換層析步驟相容。為了失活病毒污染物,在步驟(e)前,放置稀釋的級分一段適合的時間,該段時間將足以達(dá)到這種期望的病毒污染物失活效果。例如,可以用0.5倍體積的含水緩沖液(特別是20mM Tris/HCl,pH7.0)稀釋該級分,溫育至少約20分鐘到約40分鐘,或者甚至更長,然后用級分原始體積的3.5倍體積的含水緩沖液進(jìn)一步稀釋。
      在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式中,在步驟(a)中方法(i),(ii)和(iii)之任一后是無菌過濾步驟。通常地,通過利用0.2μm過濾裝置進(jìn)行該無菌過濾步驟。
      在本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施方式中,在本發(fā)明方法中,來源于層析柱的級分可以進(jìn)行超濾步驟,特別是用于濃縮。因此,在優(yōu)選實(shí)施方式中,在步驟(g)中,在大小排阻層析步驟前對級分進(jìn)行超濾步驟。在另一個優(yōu)選實(shí)施方式中,在步驟(d)中,在反相層析前,對級分進(jìn)行超濾步驟。在類似的優(yōu)選實(shí)施方式中,如果本發(fā)明的方法包括如上所述的硫酸銨沉淀步驟,那么在該硫酸銨沉淀步驟前,對來自步驟(c)的單個或合并的峰級分進(jìn)行超濾步驟。優(yōu)選地,本發(fā)明方法利用這里提到的所有三個超濾步驟。例如,具有5kDa至10kDa截斷值,例如10kDa,優(yōu)選5kDa截斷值的膜可以用在該超濾方法中。
      在優(yōu)選的實(shí)施方式中,在步驟(g)前或優(yōu)選地在步驟(g)后,包括死端(dead-end)納米過濾步驟以除去病毒。裝置的例子包括Planova 15N(Asahi),PALL Ultipor VF Grade DV20或Millipore Viresolve NFP柱體或囊。
      如上所述,可能期望在純化步驟期間能篩選優(yōu)選的同種型,而利用本發(fā)明的純化方法可以達(dá)到該目的。具體地,因?yàn)椴煌耐N型會在反相層析步驟和第二個陰離子交換層析步驟期間解析,所以能達(dá)到該目的。通過毛細(xì)管區(qū)帶電泳作為生產(chǎn)過程中的控制手段可以測定不同級分的內(nèi)容物,并在適合時合并或棄去選定級分。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中,如上所概述,利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳進(jìn)行如上所述步驟(f)中的一個或多個篩選或步驟(d)和步驟(e)間的一個或多個篩選。
      在本發(fā)明上下文中,這里所述優(yōu)選或特定的實(shí)施方式可以彼此組合,由此產(chǎn)生其進(jìn)一步的優(yōu)選的實(shí)施方式。
      因此,在優(yōu)選的實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了從收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的方法,該方法包括步驟(a)收獲細(xì)胞培養(yǎng)物,通過進(jìn)行選自(i)利用盤疊式分離器的離心及隨后的深度過濾步驟,(ii)深度過濾步驟,和(iii)離心步驟的方法,接著通過0.2μm過濾步驟,從培養(yǎng)基除去宿主細(xì)胞、細(xì)胞成分和碎片,以獲得澄清的培養(yǎng)基上清液;和(b)調(diào)節(jié)上清液的電導(dǎo)率到5mS/cm或以下,并調(diào)節(jié)pH至約7.0到8.0之間;(c)將步驟(b)得到的上清液施加到用Q-HyperD F填裝的陰離子交換柱上,洗柱子,從柱上洗脫重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo),收集含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的峰級分;(d)利用聚苯乙烯樹脂,將步驟(c)得到的合并峰級分進(jìn)行反相層析步驟,該樹脂可以在中等壓力(<10bar)下運(yùn)行并且可以抵抗NaOH CIP條件,如Source 30RPC,利用乙腈線性梯度洗脫重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo);和(e)根據(jù)重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的唾液酸化程度,選擇步驟(d)中洗脫的一個或多個含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的級分,將所述級分施加到用Q-Sepharose HP填裝的高效陰離子交換柱上,洗柱子,利用線性鹽梯度洗脫重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo);(f)根據(jù)重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的唾液酸化程度,選擇步驟(e)中洗脫的一個或多個含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的級分,利用Superdex 75 prep grade對所述級分進(jìn)行大小排阻層析以除去潛在的二聚體和更大的聚集體;收集含有重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的洗脫物。
      優(yōu)選地,通過毛細(xì)管區(qū)帶電泳確定分別在步驟(d)和步驟(e)中獲得的哪一個或多個級分可以被選擇分別在步驟(e)和/或步驟(f)中用于進(jìn)一步層析純化。作為指導(dǎo),已證實(shí)RPC步驟中重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)較高的糖基化形式存在于洗脫峰的前半部分中,而在Q-Sepharose HP步驟中,高度糖基化和唾液酸化同種型存在于洗脫峰的后半部分中。如上所述,在優(yōu)選實(shí)施方式中,在步驟(d)前,對來自步驟(c)的合并峰級分進(jìn)行硫酸銨沉淀步驟以沉淀污染的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì),然后調(diào)整上清液的硫酸銨濃度以和步驟(d)相容。優(yōu)選地,所述濃度小于0.24M硫酸銨。在本發(fā)明上下文中同樣優(yōu)選地,本發(fā)明優(yōu)選的方法進(jìn)一步包括在步驟(f)前,優(yōu)選在步驟(f)后進(jìn)行死端納米過濾步驟以除去病毒。
      關(guān)于用于純化方法的來源材料,優(yōu)選在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。也優(yōu)選利用不連續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵方法培養(yǎng)宿主細(xì)胞。特別地,宿主細(xì)胞具有表達(dá)重組人紅細(xì)胞生成素和將紅細(xì)胞生成素分泌到培養(yǎng)基中的能力。通常宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
      本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明方法產(chǎn)生的純化重組人紅細(xì)胞生成素的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了可以通過本發(fā)明方法獲得的純化重組人紅細(xì)胞生成素和包含所述純化紅細(xì)胞生成素的組合物,特別是藥物組合物。
      優(yōu)選地,組合物有確定含量的重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)糖基化/唾液酸化同種型。因?yàn)椴煌耐N型會在反相層析步驟和第二個陰離子交換層析步驟期間解析,所以可以達(dá)到該目的。通過毛細(xì)管區(qū)帶電泳作為生產(chǎn)過程的控制手段可以測定不同級分的內(nèi)容物,并在適合時合并或棄去選定的級分。特別地,從RPC步驟合并第一半洗脫峰,因?yàn)樵撎幨禽^高糖基化形式存在的地方。相反地,Q Sepharose HP步驟中的第二半洗脫峰通常含有高度糖基化和唾液酸化的同種型。
      優(yōu)選地,在包含利用本發(fā)明方法表達(dá)和純化的重組多肽,特別是紅細(xì)胞生成素(Epo)的組合物中,重組多肽基本是純的,如至少90%,95%,99%或99.5%的純度。
      可以體外和/或體內(nèi)測定純化的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。在Hammering等,1996,J Pharm Biomed Anal 14(11)1455-69中描述了適宜的體外測定法,該方法包括測定類紅細(xì)胞系的增殖刺激。在Ghanem等,1994,同上引文中描述了合適的體內(nèi)測定法,該方法包括測定紅細(xì)胞增多癥小鼠的紅細(xì)胞中摻入的59Fe。
      在一個優(yōu)選方面,可以聯(lián)合核酸載體和宿主細(xì)胞進(jìn)行本發(fā)明,其中,(a)第一多核苷酸載體包含(i)編碼重組目的多肽的第一核苷酸序列;和(ii)編碼選擇標(biāo)記的第二核苷酸序列,當(dāng)宿主細(xì)胞與選擇試劑接觸時第二核苷酸序列擴(kuò)增,和(b)第二多核苷酸載體,除了用編碼不同選擇標(biāo)記的第三核苷酸序列置換第二核苷酸序列外,第二多核苷酸載體有與第一多核苷酸載體基本相同的核苷酸序列;第一多核苷酸載體和第二多核苷酸載體整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組中。
      優(yōu)選地,宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞,更優(yōu)選中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
      優(yōu)選地,第二核苷酸序列編碼二氫葉酸還原酶多肽,該選擇試劑是氨甲蝶呤。優(yōu)選地,重組目的多肽是人紅細(xì)胞生成素。在本文件的實(shí)施例部分描述了此類系統(tǒng)。
      有利地,通過(a)提供包含編碼重組目的多肽并可指導(dǎo)重組目的多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)的核苷酸序列的宿主細(xì)胞;和(b)提供(i)包含水、植物來源的胨、摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)劑、緩沖液、能源、氨基酸、脂源或前體、鐵源、非鐵的金屬離子和一種或多種維生素和輔因子;和(ii)不含有任何全長的多肽的無血清培養(yǎng)基;和(c)在使得重組目的多肽能夠表達(dá)的條件下,在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞,以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
      優(yōu)選地,重組目的多肽是人紅細(xì)胞生成素。宿主細(xì)胞可以是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在本文件的實(shí)施例部分描述了該技術(shù)。
      除非另外定義,這里所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語有與本領(lǐng)域(例如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué))普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于分子、遺傳和生物化學(xué)方法(通常參見Sambrook等,Molecular CloningA Laboratory Manual,第二版.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.和Ausubel等,Short Protocols in Molecular Biology(1999)第四版,JohnWiley &amp; Sons,Inc.-和名稱為Current Protocols in Molecular Biology的完全版本,這里將其并入作為參考文獻(xiàn))和化學(xué)方法。
      參考如下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明,實(shí)施例僅僅是示例性的而非限制性的。特別地,實(shí)施例涉及本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式。
      實(shí)施例材料宿主細(xì)胞系二氫葉酸還原酶缺陷型的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(ATCCCRL-9096)。它們根據(jù)布達(dá)佩斯條約在2001年8月29日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),(Rockville,Md.20852,USA),保藏號ATCCPTA-3672。
      細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)基補(bǔ)加了4mM L-谷氨酰胺,10%FCS,1x HT(次黃嘌呤,胸苷)的DMEM,選擇培養(yǎng)基補(bǔ)加了4mM L-谷氨酰胺,10%透析的FCS,和0.5mg/mlG418的DMEM,擴(kuò)增培養(yǎng)基補(bǔ)加了4mM L-谷氨酰胺,10%透析的FCS,0.5mg/mlG418和4.8×10-8M-1.54×10-6M的MTX(氨甲喋呤)的DMEM,冷凍培養(yǎng)基補(bǔ)加了4mM L-谷氨酰胺,10%FCS和10%DMSO的DMEM,用于重組細(xì)胞系的無血清適應(yīng)培養(yǎng)基補(bǔ)加了6mM L-谷氨酰胺,0.25%大豆胨/UF,1x雜交瘤補(bǔ)料,0.1%Pluronic-F68,0.5mg/ml G418,1.54×10-6M的MTX的1∶1 DMEM/Ham’s F12,無血清的生產(chǎn)培養(yǎng)基補(bǔ)加了0.25%大豆胨/UF,1x雜交瘤補(bǔ)料,0.1%Lutrol,1.54×10-6M的MTX,1g/l葡萄糖,2.5g/l NaHCO3的1∶1DMEM/Ham’s F12,用于重組細(xì)胞系的無血清冷凍培養(yǎng)基PBS,20% PVP-10,5%DMSO,100x雜交瘤補(bǔ)料,2.5×10-3M乙醇胺,2.5×10-2M檸檬酸鐵,2.0×10-3M L-抗壞血酸,5.0×10-6M亞硒酸鈉。
      質(zhì)粒構(gòu)建體pEpo/neo該質(zhì)粒編碼紅細(xì)胞生成素(Epo)的編碼區(qū)和新霉素抗性基因作為兩個不同表達(dá)盒子,每個表達(dá)盒子受SV40早期啟動子/終止序列控制。在實(shí)施例1中提供了構(gòu)建細(xì)節(jié)。
      pEpo/dhfr該質(zhì)粒編碼紅細(xì)胞生成素(Epo)的編碼區(qū)和dhfr作為兩個不同表達(dá)盒子,每個表達(dá)盒子受SV40早期啟動子/終止序列控制。在實(shí)施例2中提供了構(gòu)建細(xì)節(jié)。
      細(xì)胞培養(yǎng)中的方法CHO-dhfr-的生長在DMEM培養(yǎng)基中以一周兩次1∶10傳代率培養(yǎng)二氫葉酸還原酶缺陷的CHO細(xì)胞(Urlaub等,1980,PNAS 77(7)4216-4220)(稱為CHOdhfr-)。
      CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染在進(jìn)行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染前一天,在25cm3T-燒瓶或96孔板中接種1-5×104細(xì)胞/cm2。以適合的比率混合相應(yīng)的質(zhì)粒,根據(jù)制造商的程序向脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(GIBCO/BRL)中加入該質(zhì)粒(0.5-1μl/cm2)。然后,用轉(zhuǎn)染混合物在無血清的DMEM中覆蓋細(xì)胞4到16小時,之后用培養(yǎng)基取代含有DNA的培養(yǎng)基。在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24到48小時后,將細(xì)胞轉(zhuǎn)換到選擇培養(yǎng)基中。在通過ELISA針對紅細(xì)胞生成素(Epo)的產(chǎn)生篩選細(xì)胞培養(yǎng)物上清液前,首先在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞池(pool)至鋪滿,然后在擴(kuò)增培養(yǎng)基(4.8×10-8M的MTX)中培養(yǎng)。確定最高的生產(chǎn)者,MTX濃度增加了兩倍,最好的生產(chǎn)者用于進(jìn)一步培養(yǎng)。
      分析方法在不同基質(zhì)中以ELISA檢測紅細(xì)胞生成素(Epo)抗體多克隆血清生物素化的兔抗紅細(xì)胞生成素(Epo)(R&amp;D Systems;Catalog # AB-286-NA)單克隆抗體小鼠抗紅細(xì)胞生成素(Epo)(Genezyme;Cat.codeAE7A5)。
      ELISA緩沖液包被緩沖液8.4g/l NaHCO3,4.2g/l Na2CO3,pH9.6-9.8洗滌緩沖液0.2g/l KCl,1.15g/l Na2HPO4×2H2O,0.2g/l KH2PO4,8g/l NaCl,0.1% Tween 20稀釋緩沖液洗滌緩沖液中2%PVP(Sigma Cat.No.PVP-40T)樣品緩沖液稀釋緩沖液中0.5%α-單-硫代-甘油染色緩沖液7.3g/l檸檬酸×2H2O,11.86g/l Na2HPO4×2H2O,pH4.8-5.0染色溶液100μl OPD溶液/10ml染色緩沖液,5μl H2O2/10ml染色緩沖液OPD母液PPL0017方法所用的ELISA方法檢測在ng/ml濃度范圍中的紅細(xì)胞生成素(Epo),特別地具有約10ng/ml范圍的檢測限,其中所述Epo從500ng/ml開始,8次兩倍稀釋。一種抗紅細(xì)胞生成素的頭26個氨基酸的單克隆抗體作為包被層,結(jié)合紅細(xì)胞生成素(Epo)。在下步中,紅細(xì)胞生成素(Epo)被捕獲抗體特異地結(jié)合。通過生物素化的識別紅細(xì)胞生成素(Epo)的兔抗血清進(jìn)行檢測。在鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶偶聯(lián)到板上后,用OPD染色進(jìn)行可見觀察。
      免疫熒光在6孔板中于蓋片上,用5×104細(xì)胞/200μl接種表達(dá)紅細(xì)胞生成素(Epo)的CHO細(xì)胞,并且溫育24-72小時。用PBS洗滌附著的細(xì)胞2次,用-20℃甲醇固定5分鐘,然后空氣干燥,然后再一次浸在PBS中。通過與20%FCS在PBS中溫育15分鐘飽和非特異性蛋白質(zhì),然后,溫育抗紅細(xì)胞生成素(Epo)1小時。用綴合FITC的抗小鼠IgG顯色反應(yīng)。在488nm激發(fā)波長,隨后在高于515nm發(fā)射波長下通過共聚焦顯微術(shù)檢測熒光。
      核大小的檢測材料Coulter CounterModel ZM(Coulter Electronics Inc.)Coulter ChannelyzesModel 256溫育溶液0.1M檸檬酸,2%Triton X 100,電解質(zhì)Isoton II(Kat-No.844 8011;Coulter Euro Diagnostic GmbH)Coulter Counter定量電導(dǎo)液中懸浮的顆粒大小和數(shù)量。用真空吸引液體通過兩側(cè)帶有電極的毛細(xì)管。電阻的改變引起電壓脈沖,CoulterChannelizer可以數(shù)字化該電壓脈沖。核的大小與細(xì)胞DNA含量相關(guān),因此可能區(qū)分出二倍體和多倍體染色體組。
      方法在PBS中洗約1×106CHO-細(xì)胞一次,在2ml溫育溶液中重懸浮并且放置4-5小時。下面的步驟是特別針對C0ulter Counter的。
      SDS聚丙烯酰胺電泳和Western印跡材料SDS凝膠Novex Tris-甘氨酸4-20%樣品緩沖液Tris甘氨酸SDS 2x(Novex LC 2676)電泳緩沖液Tris甘氨酸SDS(Novex LC 2675)印跡緩沖液50mM Na2B4O7×10H2O,0.1%SDS,20%甲醇印跡基質(zhì)PVDF Immobilon P 0.45μM Millipore;K8JM8238H洗滌緩沖液參見ELISA洗滌緩沖液稀釋緩沖液洗滌緩沖液中1%奶粉檢測緩沖液0.1M NaCl0.1M Tris-HCl,pH9.5方法在lx樣品緩沖液中,用1%α-MTG將含有紅細(xì)胞生成素(Epo)的樣品調(diào)整到30ng/20ul,加到SDS凝膠上。在電泳結(jié)束后,在PVDFImmobilon膜上印跡蛋白質(zhì)2小時,然后用檢測紅細(xì)胞生成素(Epo)頭26個氨基酸的單克隆抗體特異地染色紅細(xì)胞生成素(Epo)。用綴合堿性磷酸酶的抗小鼠IgG和NBT/BCIP染色完成顯色。
      等電聚焦材料系統(tǒng)Multiphor II,Amersham BiosciencesIPG凝膠pH2.5-7重新溶脹緩沖液9g尿素,0.5g CHAPS,0.04g DTE,0.5ml Resolytes(pH3.5-10),10μl溴酚藍(lán)(0.1%),用H2O調(diào)節(jié)到25ml樣品緩沖液625μl H2O中25μl IPG樣品緩沖液,pH3-10
      印跡緩沖液2.93g甘氨酸,5.81g Tris,20ml甲醇,0.375g SDS,用H2O調(diào)節(jié)到1000ml印跡基質(zhì)PVDF Immobilon P 0.45μM Millipore;K8JM8238H洗滌緩沖液參見ELISA洗滌緩沖液稀釋緩沖液洗滌緩沖液中0.1%奶粉檢測緩沖液0.1M NaCl,0.1M Tris-HCl,pH9.5方法將含有紅細(xì)胞生成素(Epo)的樣品調(diào)整到500-1000ng/50μl,脫鹽,1∶1稀釋在樣品緩沖液中,加到重新溶脹的IPG凝膠上。電泳條件是最初1分鐘300V,然后線性增加到3500V,最后1小時3500V。在整個聚焦過程期間,設(shè)定10mA和10W的限定。然后,通過過夜擴(kuò)散或通過電印跡將蛋白質(zhì)印跡到PVDF Immobilon膜上,然后用檢測紅細(xì)胞生成素(Epo)頭26個氨基酸的單克隆抗體特異地染色紅細(xì)胞生成素(Epo)。用綴合堿性磷酸酶AP的抗小鼠IgG和NBT/BCIP染色完成顯色。
      DNA含量的測定通過FACS分析比較重組細(xì)胞系和CHO-dhfr-宿主細(xì)胞系的DNA含量。
      材料洗滌緩沖液0.1M Tris-HCl,pH7.4,2mM MgCl2,0.1%Triton X 100染色緩沖液洗滌緩沖液中0.3μg/ml DAPI(Hoechst)方法在PBS中洗5×105細(xì)胞,并且用冰冷的70%乙醇固定。然后,用洗滌緩沖液洗細(xì)胞2次,然后在室溫下在染色緩沖液中溫育30分鐘。用FACSVantage(Becton和Dickinson)在359nm激發(fā)波長和450nm發(fā)射波長下測定DNA含量。
      體外特異性檢測人紅白血病細(xì)胞系TF-1(German Collection of Microorganisms andCell Cultures)依賴于IL3或hGM-CSF生長。這些細(xì)胞因子顯示了對增殖的協(xié)同效應(yīng),而紅細(xì)胞生成素(Epo)可以維持生存能力一段時間。細(xì)胞常規(guī)地在含有GM-CSF和紅細(xì)胞生成素(Epo)的培養(yǎng)基中生長。
      檢測補(bǔ)料培養(yǎng)基補(bǔ)加了4mM Gln,10%FCS,20μg/ml運(yùn)鐵蛋白,10μM β-巰基乙醇,12ng/ml rhGM-CSF,3U/ml rh Epo的RPMI 1640檢測培養(yǎng)基補(bǔ)加了4mM Gln,100μg/ml運(yùn)鐵蛋白,2mg/ml BSA的RPMI 1640方法在96孔板中以MTT生存力檢測進(jìn)行功能性檢測(Hammerling等,1996,J Pharm Biomed Anal 14(11)1455-69)。在檢測培養(yǎng)基中從100ng紅細(xì)胞生成素(Epo)/ml開始以1∶2倍稀釋樣品8次。將50μl每個樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)稀釋液或空白轉(zhuǎn)移到96孔檢測板。用冷PBS洗TF-1細(xì)胞3次,在檢測培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)到2×105細(xì)胞/ml。用50μl細(xì)胞懸浮液鋪在96孔檢測板的每個孔中,在CO2培養(yǎng)箱中放置細(xì)胞72小時。之后加入10μlMTT溶液(6mg/ml,于PBS中)并37℃溫育4小時。在黑暗中,用100μl SDS/HCl(0.1M HCl中10%SDS)溶解染料另外4小時,在550/690nm光度測定紅細(xì)胞生成素依賴性生存力。
      實(shí)施例1-質(zhì)粒Epo/neo的構(gòu)建1.p2-neo的構(gòu)建1.1從含有SV40早期啟動子的pSV2neo制備載體片段載體構(gòu)建的基礎(chǔ)是包含在pSV2neo中的pBR322質(zhì)粒骨架。較小的EcoRI-PvuII限制片段包含該pBR322骨架,并且來自SV40的鄰近PvuII-HindIII片段具有SV40早期啟動子的相關(guān)片段。
      用限制酶EcoRI和HindIII切割質(zhì)粒pSV2neo(ATCC 37149)。由此得到的片段大小是3092bp和2637bp。2637bp片段的組成為含有pBR322骨架的EcoRI-PvuII限制片段和含有SV40早期啟動子片段的鄰近PvuII-HindIII片段。通過凝膠電泳制備和純化2637bp片段。
      1.2新霉素抗性基因的制備從pSV2neo的轉(zhuǎn)座子Tn5提取neo基因。以含有僅基因編碼區(qū)的片段形式擴(kuò)增該基因。作為克隆策略的一部分,在兩個末端引入限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點(diǎn)。在上游擴(kuò)增引物中建立HindIII位點(diǎn),而EcoRI和SpeI位點(diǎn)建立在下游引物中。擴(kuò)增區(qū)對應(yīng)于pSV2neo序列中核苷酸第2846到1938位(Genbank記錄號U02434)。設(shè)計寡核苷酸如下寡2004-01長度38mer5′-ggg gga agc ttg ttg gga agc cct gca aag taa act gg -3′ SEQ ID No.15′HindIIIaagctt-g(=pSV2neo中位置2846)ttgggaagccctg....... SEQ ID No.2寡2004-02長度42mer5′-ggg gaa ttcactagtgag tcc cgc tca gaa gaa ctc gtc aag -3′ SEQ ID No.35′EcoRI/SpeIgaa ttcactagt-g(=pSV2neo中位置1938)agtcccgctcagaa......... SEQ ID No.4利用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-01和2004-02的擴(kuò)增產(chǎn)物。該方法的參數(shù)是在所提供的緩沖液中20ng pSV2neo,每種引物10pmol,10mmol dNTPs,2.5U Pwo聚合酶,總體積50μl;溫度模式95℃,5分鐘,35次(95℃,30秒;65℃,20秒;72℃,90秒),72℃,3分鐘,在4℃冷卻直到下一步使用。
      通過DNA分離柱(Mini,Wizard Promega GmbH)純化由此得到的935bp DNA片段,用EcoRI和HindIII消化,通過瓊脂糖凝膠純化,用SpinColumns(Supelco)洗脫。
      1.3 p1-neo的構(gòu)建利用Ligation Express(Clontech)將擴(kuò)增的EcoRI-HindIII neo基因片段與來自pSV2-neo的EcoRI-HindIII載體片段連接,并且轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌(E.coli)宿主(E.coli SURE(Stratagene))。通過在補(bǔ)加50mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長篩選轉(zhuǎn)化體。
      從克隆分離質(zhì)粒DNA,利用EcoRI加NcoI,通過限制分析進(jìn)行檢查(分別是2527bp,780bp和251bp三個片段)。通過測序構(gòu)建體的相關(guān)部分進(jìn)一步檢查顯示預(yù)期片段的質(zhì)粒DNA。命名含有證實(shí)的SV40早期啟動子和新霉素抗性基因的質(zhì)粒DNA為p1-neo。
      1.4 SV40終止區(qū)SV40LTpolyA/IVS的制備設(shè)計PCR引物擴(kuò)增pSV2neo中存在的SV40終止區(qū)域片段(核苷酸751到1598位)。上游引物也含有SpeI限制位點(diǎn)。除了BamHI位點(diǎn)已經(jīng)包含在pSV2-neo位置751處外,將EcoRI位點(diǎn)引入下游引物中距離BamHI位點(diǎn)6個核苷酸間隔區(qū)。兩個引物的序列如下寡2004_05長度40mer5′-ggggactagttt gtg aag gaa cct tac ttc tgt ggt gtg a -3′ SEQ ID No.55′ SpeIactag-t(=pSV2neo中位置1598)ttgtgaagga.............SEQ ID No.6寡2004_06長度46mer5′-ggg ggaattcgg agg gggatccag aca tga taa gat aca ttg atg a-3′ SEQ ID No.75′EcoRI/BamHIgaattc-g(=pSV2neo中位置751)gatccagacatgataag..... SEQ ID No.8利用上述Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-05和2004-06的擴(kuò)增產(chǎn)物。利用DNA分離柱純化由此得到的873bp DNA片段,用EcoRI和SpeI消化,凝膠純化。
      1.5 p2-neo的制備用EcoRI+Spel消化p1-neo質(zhì)粒DNA。純化所得線性化片段,與含有SV40LTpolyA/IVS的擴(kuò)增片段連接,并且轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌(E.coli)宿主細(xì)胞。通過在補(bǔ)加50mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長篩選轉(zhuǎn)化體。從克隆分離質(zhì)粒DNA,利用EcoRI(1個4411bp片段)和NcoI(3631bp和780bp大小2個片段)和SphI(3499bp,840bp和72bp大小3個片段),通過限制分析檢查該質(zhì)粒DNA。通過測序構(gòu)建體的相關(guān)部分進(jìn)一步檢查顯示預(yù)期片段的質(zhì)粒DNAs。命名含有證實(shí)的SV40LTpolyA/IVS的質(zhì)粒DNA為p2-neo。
      2.質(zhì)粒p3的構(gòu)建2.1 SV40早期啟動子片段的制備質(zhì)粒pSV2neo用作SV40早期啟動子片段的來源。片段大小幾乎與用于構(gòu)建p2質(zhì)粒的片段相同。然而,對片段的末端進(jìn)行了修飾以引入BamHI和NotI識別位點(diǎn)。用于擴(kuò)增啟動子的寡核苷酸引物設(shè)計如下寡2004-07長度38mer5′-ggg gggatcctg tgg aat gtg tgt cag tta ggg tgt gg -3′ SEQ ID No.95′BamHIggatcc-t(=pSV2neo中位置3435)gtggaat.............SEQ ID No.10寡2004-08長度46mer5′-ggg ggcggccgcagc ttt ttg caa aag cct agg cct cca aaa aag c-3′SEQ ID No.115′NotIgcggccgc-a(=pSV2neo中位置3093)gctttttgcaaaag...............SEQ ID No.12利用上述Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-07和2004-08的擴(kuò)增產(chǎn)物。利用DNA分離柱純化由此得到的365bp DNA片段,用BamHI和NotI消化,凝膠純化。
      2.2 pBluescript載體部分的制備分別利用BamHI和NotI相繼限制切割pBluescript II SK+DNA。利用堿性磷酸酶將DNA去磷酸化。在連接前通過瓊脂糖凝膠電泳從小片段純化BamHI/NotI片段。
      2.3質(zhì)粒p3的制備和驗(yàn)證利用T4 DNA連接酶(Promega GmbH)將含有SV40早期啟動子的擴(kuò)增BamHI/NotI片段連接到制備的pBluescript II SK+載體中。從補(bǔ)加100mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上的菌落分離和純化大腸桿菌SURE(Stratagene)轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA。
      利用EcoRI加NcoI,通過限制分析檢查由此得到的DNA(2個3039bp和253bp大小的片段)。
      通過測序進(jìn)一步檢查顯示預(yù)期片段的兩個質(zhì)粒DNA。測序SV40早期啟動子的雙鏈以證實(shí)每個位置。命名該質(zhì)粒為p3。
      3.人紅細(xì)胞生成素(Epo)cDNA的分離3.1 TRIZol試劑分離總RNA
      用于從人腎組織(從Laizner Krankenhaus醫(yī)院獲得)分離紅細(xì)胞生成素(Epo)RNA的TRIZol試劑是苯酚和異硫氰酸胍的單相溶液。在細(xì)胞裂解期間,當(dāng)細(xì)胞破壞時,異硫氰酸胍與RNA形成水溶性復(fù)合物。添加氯仿后離心,將溶液分成含有RNA的水相和有機(jī)相。水相分離后,用異丙醇沉淀RNA,用乙醇洗,空氣中干燥并在無RNAse的水中重懸浮。
      將人腎組織塊切成小片,施力使其通過100μm細(xì)胞濾器,離心(179xg/10分鐘),用PBS洗由此產(chǎn)生的沉淀3次。然后在PBS中重懸浮沉淀,等份置于無菌試管中,冷凍到-196℃,在使用前貯藏在-80℃。
      通過添加1ml TRIZol試劑裂解冷凍組織,勻漿并在15-30℃溫育5分鐘確保完全解離。加入200μl氯仿后,震蕩試管并在15-30℃溫育2-3分鐘,以12000xg離心試管10分鐘。離心后,將上層水相小心地轉(zhuǎn)移到新試管中與500μl異丙醇混合,在15-30℃溫育10分鐘。離心(12000xg,10分鐘)沉淀的RNA,用乙醇洗沉淀,再次離心,空氣干燥并在無RNAse的DEPC水中溶解。在260nm光度地測定總RNA含量。
      1OD260nm=40μg RNA/ml通過計算OD260nm和OD280nm(蛋白質(zhì)最大吸收)的比率,人們可以估計出RNA分離物的純度。范圍應(yīng)該在1.6和1.8之間。
      3.2用Dynabeads寡(dT)25分離mRNADynabeads寡(dT)25mRNA DIRECT試劑盒利用真核生物mRNA的聚腺苷尾RNA和超磁性聚苯乙烯顆粒雜交,該顆粒含有與其表面共價連接的25個核苷酸長的脫氧胸苷酸鏈。利用Dynal磁性顆粒濃縮器(DynalMPC)分離與磁珠結(jié)合的mRNA。
      洗滌緩沖液 Tris-HCl 10mM,pH8.0;LiCl 0.15mM;EDTA 1mM2x結(jié)合緩沖液 Tris-HCl 20mM,pH7.5;LiCl 1mM;EDTA 2mM對于10μg總RNA,在Dynal MPC中分離100μl Dynabeads寡(dT)25,并且用2x洗滌緩沖液洗2次。同時用1x洗滌緩沖液將總RNA調(diào)整到200μl的體積,并且通過在65℃溫育4分鐘變性。然后,將RNA與磁珠混合,在室溫溫育5分鐘,在Dynal MPC中分離。用1x洗滌緩沖液洗磁珠2次。通過在65℃與洗脫緩沖液(2×10μl)溫育4分鐘從Dynabeads寡(dT)25洗脫聚腺苷酸化RNA。在Dynal MPC中分離Dynabeads,立即將上清液轉(zhuǎn)移到新的無RNAse的微量離心管中。洗脫物直接用于反轉(zhuǎn)錄。
      3.3 反轉(zhuǎn)錄通過在80℃溫育4分鐘變性紅細(xì)胞生成素(Epo)的特異引物,通過在65℃溫育5分鐘變性mRNA。在冰上,將下面的成分加到1.5ml無菌微量離心管中試劑 終濃度mRNA 10μlMMLV(200U/μl)0.25μlBoehringer PCR緩沖液(10×)2μldNTPs(10mM) 2μlMgCl2(50mM) 1μlEpo正向引物(100pmol/μl) 1μlDTT(0.1M) 0.25μlRNAse抑制劑(40U/μl) 0.25μlH2O 3.25μl37℃溫育60分鐘,100℃失活5分鐘。
      3.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在4℃,將下列成分加入到無菌1.5ml微量離心管中。PCR條件如下試劑 Epo模板 cDNA Epo 5μl聚合酶Vent 1U(0.5μl)聚合酶緩沖液(10×)Vent緩沖液1×(10μl)dNTPs(10mM) 200μM(2μl)MgCl2(50mM) /正向引物(10pM)30pM(3μl)反向引物(10pM)30pM(3μl)DMSO /H2O 76.5μl
      PCR循環(huán)1變性 95℃2分鐘2變性 94℃45秒3引物退火 58℃30秒4延伸 72℃1分鐘5最后延伸 72℃10分鐘6循環(huán) 30個通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
      3.5 瓊脂糖凝膠電泳6×BX緩沖液 溴酚藍(lán)0.25%;二甲苯腈藍(lán)0.25%;甘油30%TAE緩沖液Tris堿242g;冰醋酸57.1ml;EDTA(0.5M,pH8.0)100ml;水調(diào)整到1000mlλ標(biāo)記III10μg野生型λ噬菌體Dann(2.5μl HindIII+2.5μl EcoRI+20μl緩沖液R(Fermentas),用水補(bǔ)充到200μl;在37℃消化1小時,在65℃失活20分鐘;用40μl BX-上樣緩沖液補(bǔ)充)在微波爐中溶化1g瓊脂糖和99g 1×TAE緩沖液,冷卻到約60℃,補(bǔ)加3μl溴乙錠母液(10mg/ml)。根據(jù)待分離DNA片段的長度,在1×TAE緩沖液中,在100-300V進(jìn)行凝膠電泳約30分鐘。每泳道含有10μl與2μl 6×BX緩沖液混合的樣品。根據(jù)與λ/HindIII消化分子量標(biāo)準(zhǔn)比較鑒定DNA片段。
      3.6用于連接的載體和PCR產(chǎn)物的制備3.6.1載體DNA和用于粘性末端克隆的插入片段的限制消化根據(jù)制造商的說明書,10u限制酶和適合的限制緩沖液與1μg載體DNA和插入片段混合。根據(jù)所用的酶、載體和插入片段,在37℃(對于Smal是30℃)溫育混合物30至60分鐘。然后通過加熱到65℃,10分鐘失活酶,通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)混合物。
      3.6.2連接pIRESneoSV40載體pIRESneo載體(Clontech Laboratories)含有腦心肌炎病毒(ECMV)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES),其允許從一個信使RNA翻譯兩個開放讀框。pIRESneo表達(dá)盒子含有人巨細(xì)胞病毒(CMV)主要立即早期啟動子/增強(qiáng)子,其后是多克隆位點(diǎn)(MCS)、ECMV IRES,之后是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和牛生長激素的聚腺苷酸化信號。在該載體中,用SV40早期啟動子置換CMV啟動子。
      用T4 DNA連接酶連接載體和PCR產(chǎn)物。對于最佳的連接,以約1∶10的摩爾比率利用約20ng載體和200ng插入片段(根據(jù)長度),在總體積10μl的水中與下面試劑混合。15℃過夜并在室溫進(jìn)行溫育3小時。然后通過在65℃溫育10分鐘熱失活連接酶。

      3.6.3細(xì)菌和培養(yǎng)基JM109(Promega,USA)LB培養(yǎng)基 酪蛋白胨10g;酵母提取物5g;NaCl 10g,用水調(diào)整到1000ml,用5M NaOH將pH調(diào)到7.0。
      LB瓊脂1000ml LB培養(yǎng)基中15g瓊脂LB-Amp1000ml LB培養(yǎng)基中100μl氨芐青霉素(100mg/ml)SOC培養(yǎng)基 細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨20g;酵母提取物5g;NaCl 10mM;KCl 3mM;MgCl210mM;葡萄糖20mM,MgSO410mM3.6.4利用CaCl2轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109)的制備用大腸桿菌(JM109)接種10ml LB培養(yǎng)基,在37℃過夜生長。在LB培養(yǎng)基中以1∶100稀釋4ml細(xì)菌培養(yǎng)物,生長到OD260nm達(dá)到0.8。在4℃,4500rpm離心細(xì)菌10分鐘,以10ml 0.1M CaCl2(4℃)/50ml所用細(xì)菌懸浮液重懸浮細(xì)胞沉淀。離心細(xì)胞,在2ml 0.1M CaCl2中重懸浮沉淀,等份為100μl的總體積,液氮中冷凍,在-80℃貯藏。
      轉(zhuǎn)化在預(yù)冷卻的17×100mm聚丙烯培養(yǎng)管中將5-10ng質(zhì)粒DNA加入到JM109感受態(tài)細(xì)菌中,輕輕混合,在冰上放置30分鐘。然后在精確地42℃,不要振蕩,水浴熱激細(xì)胞45秒,之后立即置冰上2分鐘。向試管中加入900μl SOC培養(yǎng)基,并且在37℃溫育30分鐘,之后在LB-Amp平板上涂100μl細(xì)菌懸浮液。
      3.6.5篩選和確立甘油培養(yǎng)物通過PCR技術(shù)篩選具有插入DNA片段的氨芐青霉素抗性菌落。將氨芐青霉素抗性菌落的一部分和PCR反應(yīng)混合物及特異于克隆的DNA片段的引物(參見下文)混合。在瓊脂糖凝膠電泳中陽性菌落顯示PCR擴(kuò)增的DNA帶。然后,在LB-Amp培養(yǎng)基中增殖這些菌落用于進(jìn)一步分析和質(zhì)粒純化。為了進(jìn)一步使用和貯藏,1ml期望的細(xì)菌培養(yǎng)物與500μl甘油(87%)混合,并在-80℃貯藏。
      3.6.6 WizardPlus SV小量制備DNA純化系統(tǒng)細(xì)胞重懸浮溶液 Tris-HCl 50mM,pH7.5;EDTA 10mM,RNase A 100μg/ml細(xì)胞裂解溶液NaOH 0.2M,SDS 1%中和溶液鹽酸胍4.09M,醋酸鉀0.759M,冰醋酸2.12M,pH4.2柱洗滌溶液 醋酸鉀60mM,Tris-HCl 10mM,pH7.5;乙醇60%用單菌落接種2-3ml LB-Amp培養(yǎng)基,在37℃過夜溫育。離心(12000xg,5分鐘)溶液,以250μl重懸浮溶液及隨后以250μl細(xì)胞裂解液完全重懸浮由此得到的沉淀,通過顛倒試管4次混合,在室溫溫育1-5分鐘。此后加入10μl堿性蛋白酶溶液(在室溫溫育5分鐘)和350μl中性溶液。通過顛倒試管4次立即混合試管,室溫,12000xg離心細(xì)菌裂解液10分鐘。將澄清的裂解液轉(zhuǎn)移到Spin Columns,離心(12000xg,5分鐘),用洗滌溶液(750μl/250μl)洗柱2次。用100μl無核酸酶的水洗脫DNA。
      3.6.7質(zhì)粒的測序通過IBL(Gerasdorf,Austria)和通過GenXpress(Maria Wrth,Austria),用特異性引物測序插入的序列。下面列出了用于紅細(xì)胞生成素(Epo)和SV40早期啟動子擴(kuò)增和序列分析的寡核苷酸引物。
      寡核苷酸引物序列SV40早期啟動子SV40早期ClaI正向 5’-aga tcg atc aag ctt ttt gca aaa gcc tag-3 SEQ ID No.13SV40早期NruI反向 5′-agt cgc gag cgc agc acc atg gcc tg-3′ SEQ ID No.14SV40早期281反向 5′-gcc cag ttc cgc cca ttc-3′ SEQ ID No.15EpoEpo BamHI正向 5′-tag gat cct cat ctg tcc cct gtc ctg c-3′ SEQ ID No.16Epo EcoRI反向 5′-tag aat tcc gcc atg ggg gtg cac gaa tgt cc-3′ SEQ ID No.17Epo221正向5′-taa ctt tgg tgt ctg gga-3′ SEQ ID No.18Epo204反向5′-tcc cag aca cca aag tt-3′ SEQ ID No.19PIRESneopIRESneo 181反向 5′-tta ggg tta ggc gtt ttg cg-3′ SEQ ID No.20pIRESneo 1016正向 5′-act cac ccc aac agc cg-3′ SEQ ID No.21pIRESneo 2786正向 5′-ggcc aaa caa cag atg gct-3′SEQ ID No.22pIRES-20000反向 5′-tgg aaa gag tca aat ggc-3′ SEQ ID No.234.質(zhì)粒p5的構(gòu)建4.1 Epo基因片段的制備利用pSVGPIRNEO作為模板DNA,通過PCR擴(kuò)增Epo(人紅細(xì)胞生成素)的結(jié)構(gòu)基因。在GenBank記錄號M11319.1中給出了Epo序列。分別將限制位點(diǎn)NotI和KspI引入上游和下游引物中。設(shè)計引物如下寡2004-09長度45mer
      5′-ggg ggcggccgcatg ggg gtg cac gaa tgt cct gcc tgg ctg tgg -3′ SEQ ID No.245′NotIgcggccgca(=PSVGPIRNEO中位置665)tgggggtg.............. SEQ ID No.25寡2004-10長度44mer5′ggg gccgcggtc atc tgt ccc ctg tcc tgc agg cct ccc ctg tg-3′ SEQ ID No.265′KspIccgcgg-t(=PSVGPIRNEO中的位置1246)catctgtcccct............... SEQ ID No.27利用上述Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-09和2004-10的擴(kuò)增產(chǎn)物。利用DNA分離柱純化由此得到的604bp DNA片段,用KspI和NotI消化,凝膠純化。由此得到的592bp KspI/NotI片段用在下述的三重連接中。
      4.2終止區(qū)SV40LTpolyA/IVS的制備除了將引物設(shè)計為具有不同限制核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)外,用與上述1.4部分中p2-neo構(gòu)建方法相似的方法,通過PCR,從pSV2neo再次克隆終止區(qū)SV40LTpolyA/IVS上游引物包含KspI(=SacII)位點(diǎn),下游引物包含SacI和EcoRI位點(diǎn)。
      寡2004-11長度42mer5′ggg gccgcggtt tgt gaa gga acc tta ctt ctg tgg tgt gac-3′SEQ ID No.285′KspIccgcgg-t(=pSV2neo中位置1598)ttgtgaaggaa.............SEQ ID No.29寡2004-12長度46mer5′-ggg ggagctcgaattcga tcc aga cat gat aag ata cat tga g-3′ SEQ ID No.305′SacI/EcoRIgagctcgaattc-g(=pSV2neo中位置752)atccagacatg.....SEQ ID No.31利用上述Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-11和2004-12的擴(kuò)增產(chǎn)物。利用DNA分離柱純化由此得到的873bp DNA片段,用KspI和SacI消化。凝膠純化由此得到的858bp DNA片段。
      4.3 p3載體部分的制備分別利用NotI和SacI相繼消化p3質(zhì)粒DNA。用堿性磷酸酶處理DNA,凝膠純化載體片段。
      4.4質(zhì)粒p5的三重連接和分離在一個連接反應(yīng)中連接質(zhì)粒p3的NotI/SacI載體部分、KspI/NotI Epo基因和KspI/SacI終止區(qū)SV40LTpolyA/IVS(Ligation Express,Clontech)。在補(bǔ)加100mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化體。
      利用兩個擴(kuò)增片段2004-09/2004-10和2004-11/2004-12作為標(biāo)記探針,通過菌落雜交篩選含有兩個片段的陽性轉(zhuǎn)化體。選擇使用兩個探針均給出陽性雜交信號的10個克隆用于“中等”規(guī)模的質(zhì)粒制備(Qiagen)。
      利用酶BamHI(1個4723bp片段),EcoRI(2913,1810bp的2個片段)和PvuII(2513,1204,903,103bp的4個片段)進(jìn)行限制分析。選擇顯示正確限制片段的兩個克隆,通過測序進(jìn)行檢查。測序克隆進(jìn)入pBluescript IISK+中的整個盒子,并且與預(yù)期的核苷酸序列比較??梢猿晒Φ刈C實(shí)每個單獨(dú)的核苷酸。命名質(zhì)粒為p5。
      5.pEpo/neo的構(gòu)建5.1 pEpo/neo 12-1的構(gòu)建用BamHI和EcoRI消化p5質(zhì)粒DNA,凝膠純化由此產(chǎn)生的代表SV40啟動子-Epo基因-SV40終止子的1792bp片段。
      也用BamHI和EcoRI消化質(zhì)粒p2-neo,凝膠純化線性化載體。此外,用堿性磷酸酶去磷酸化DNA,用Amicon Micropure酶去除器純化。
      連接4411bp p2-neo載體和來源于p5的1792bp盒子此兩個片段(Ligation Express,Clontech),轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌SURE。從生長在補(bǔ)加70mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上的各種轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA,通過利用限制內(nèi)切核酸酶PvuII,EcoRI和NcoI消化分析該質(zhì)粒DNA。
      選擇顯示期望片段(EcoRI6191bp,NcoI4085,1326和780bp,PvuII3273,2130,685和103bp)的克隆,命名為pEpo/neo-12。
      為了進(jìn)一步純化,將DNA重新轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌SURE(參見上文)并利用“Midi-prep”方法(Qiagen)從單菌落接種的培養(yǎng)物制備質(zhì)粒DNA(pEpo/neo 12-1),利用酶BamHI,HindIII,EcoRI,NcoI,NotI,PstI,SpeI,SphI,PvuII,NarI進(jìn)行限制分析??梢园l(fā)現(xiàn)預(yù)期的片段和大小,證實(shí)克隆為正確的pEpo/neo克隆。
      5.2 pEpo/neo的最后構(gòu)建在從起始ATG起的-3位置改變pEpo/neo-12-1中Epo基因的上游區(qū)。將另外核苷酸A引入以在從起始ATG起的-3位置產(chǎn)生嘌呤堿基G。在該位置的嘌呤可以改進(jìn)基因的表達(dá)水平。為了該目的,利用修改的上游引物2004-09-a再次擴(kuò)增Epo基因。
      寡2004-09-a長度46mer5′-gggggcggccgcaatgggggtgcacgaatgtcctgcctggctgtgg-3′SEQ ID No.32如上所述,利用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-09-a和2004-10的擴(kuò)增產(chǎn)物。利用DNA分離柱純化由此得到的605bp DNA片段,用KspI和NotI消化。然后凝膠純化由此得到的593bp DNA片段。
      分別用KspI和NotI消化pEpo/neo-12-1質(zhì)粒DNA以除去Epo基因。然后凝膠純化5599bp片段。連接兩個制備的DNA(Ligation Express,Clontech)。從補(bǔ)加70mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上的菌落分離和純化轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA。在第一次篩選中,利用NcoI限制分析DNA。
      選擇陽性克隆利用“Midi-prep”方法(Qiagen)分離DNA。利用BamHI,HindIII,EcoRI,NcoI,NotI,PstI,SpeI,SphI,PvuII,NarI進(jìn)行深入的限制分析。可以發(fā)現(xiàn)預(yù)期的片段和大小,證實(shí)正確的pEpo/neo克隆。也通過測序證實(shí)插入在pBR322載體部分中的整個盒子的每一個核苷酸(SV40早期啟動子-neo基因-SV40LTpolyA/IVS-SV40早期啟動子-Epo基因-SV40LTpolyA/IVS)。
      實(shí)施例2-質(zhì)粒Epo/dhfr的構(gòu)建1.p2-dhfr-CDS的構(gòu)建1.1 dhfr基因的制備從存在于質(zhì)粒pLTRdhfr26(ATCC 37295)中的小鼠cDNA獲取用于載體構(gòu)建的dhfr基因??梢砸訥enBank記錄號L26316.得到小鼠dhfrcDNA核苷酸序列(MUSDHFR)。
      利用設(shè)計的引物從pLTRdhfr26擴(kuò)增dhfr,該設(shè)計的引物產(chǎn)生含有從位置56起始ATG到位置619終止密碼子TAA的編碼區(qū)的片段??紤]到上述新霉素抗性基因的擴(kuò)增,在上游和下游擴(kuò)增引物中分別引入HindIII和SpeI位點(diǎn)。在反向引物中除了SpeI位點(diǎn)外也引入了EcoRI位點(diǎn)。寡核苷酸的序列如下寡2004-13長度39mer5′-ggg gaagcttat ggt tcg acc att gaa ctg cat cgt cgc-3′ SEQ ID No.335′HindIIIaagctt-A(=MUSDHFR中位置56)TGgttcgaccattg.............SEQ ID No.34寡2004-14長度42mer5′ggggaa ttcactagttag tct ttc ttc tcg tag act tca aac-3′SEQ ID No.355′EcoRI/SpeIgaattcactag-t(=MUSDHFR中位置619)tagtctttcttctcgtagacttcaaact..... SEQ ID No.36如上所述,利用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-13+2004-14的擴(kuò)增產(chǎn)物。利用DNA分離柱純化由此得到的588bp DNA片段,用HindIII和EcoRI消化,凝膠純化。
      1.2 p1-dhfr-CDS的制備利用Ligation Express(Clotech),連接擴(kuò)增的EcoRI-HindIII dhfr基因片段和來源于pSV2-neo的EcoRI-HindIII載體片段,轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌宿主。通過在補(bǔ)加50mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長篩選轉(zhuǎn)化體。從補(bǔ)加50mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上的菌落分離和純化轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA。
      從克隆分離質(zhì)粒DNA,并且利用EcoRI加ScaI,通過限制分析檢查質(zhì)粒DNA(2225bp,514bp和473bp大小的3個片段)。
      通過測序構(gòu)建體的相關(guān)部分進(jìn)一步檢查顯示預(yù)期片段的質(zhì)粒DNA。命名含有證實(shí)的SV40早期啟動子和二氫葉酸還原酶基因的質(zhì)粒DNA為p1-dhfr-CDS。序列的分析揭示了dhfr基因內(nèi)不同于MUSDHFR公開序列的一個差異,具體是在MUSDHFR序列位置451從T到C的改變。隨后的測序表明該變化也存在于源質(zhì)粒中。因?yàn)镃TT和CTG都編碼亮氨酸,所以由此得到的改變沒有引起核苷酸序列編碼的氨基酸序列的改變。
      1.3 p2-dhfr-CDS的制備用EcoRI+SpeI消化p1-dhfr-CDS質(zhì)粒DNA。純化由此得到的線性片段,并且與含有SV40LTpolyA/IVS的擴(kuò)增片段連接(見上述)。接著轉(zhuǎn)化和篩選,利用AccI,通過限制分析(2994,855和216bp的3個片段)由此得到的質(zhì)粒。選擇幾個質(zhì)粒,利用HincII(分別是3466bp和599bp的2個片段),A f IIII(分別是2872bp和1193bp的2個片段)和BgII(分別是2371bp和1694bp 2個片段)進(jìn)一步分析。
      通過測序進(jìn)一步檢查顯示所有預(yù)期正確大小片段的質(zhì)粒DNA。命名證實(shí)的質(zhì)粒為p2-dhfr-CDS。
      2.pEpo/dhfr的構(gòu)建2.1 pEpo/dhfr 21的制備用BamHI和EcoRI消化p5質(zhì)粒DNA,凝膠純化由此得到的1792bp片段,其為SV40啟動子-Epo基因-SV40終止子盒子。
      也用BamHI和EcoRI消化質(zhì)粒p2-dhfr-CDS,凝膠純化線性化載體,用Supelco spin柱洗脫。此外,用堿性磷酸酶去磷酸化DNA,用AmiconMicropure酶去除器純化。
      連接4053bp p2-dhfr-CDS載體和來源于p5的1792bp盒子此兩個片段(Ligation Express,Clontech),轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌SURE。利用Epo基因(PCR產(chǎn)物)作為探針,雜交生長在補(bǔ)加70mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化體菌落,從各種陽性克隆分離質(zhì)粒DNA,通過利用限制內(nèi)切核酸酶NcoI消化分析該質(zhì)粒DNA。
      選擇顯示預(yù)期片段(NcoI4085bp和1760bp)的克隆,命名為pEpo/dhfr-21。
      為了進(jìn)一步純化,將DNA重新轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌SURE(參見上文),利用“Midi-prep”方法(Qiagen)從單菌落接種的培養(yǎng)物制備質(zhì)粒DNA(pEpo/dhfr-21-1)。
      利用酶BamHI,HindIII,EcoRI,NcoI,NotI,PstI,SpeI,SphI,PvuII,NarI進(jìn)行限制分析??梢园l(fā)現(xiàn)所有預(yù)期的片段和大小,證實(shí)克隆為正確pEpo/dhfr-21。
      2.2 pEpo/dhfr的最后構(gòu)建用與pEpo/neo相同的方法,在相對于起始ATG的-3位置改變Epo/dhfr-21中Epo基因上游區(qū)。將另一個核苷酸A引入以在從起始ATG起-3位置產(chǎn)生嘌呤堿基G。如實(shí)施例1之4.2部分所述再次擴(kuò)增Epo基因。
      用KspI和NotI消化Epo/dhfr-21質(zhì)粒DNA以除去Epo基因。然后凝膠純化5259bp片段。
      連接兩個制備的DNA(Ligation Express,Clontech)。從補(bǔ)加70mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上的菌落分離和純化轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA。利用NcoI在第一篩選中限制分析DNA。
      選擇陽性克隆,利用“Midi-prep”方法(Qiagen)分離DNA。利用BamHI,HindIII,EcoRI,NcoI,NotI,PstI,SpeI,SphI,PvuII,NarI進(jìn)行深入的限制分析??梢园l(fā)現(xiàn)預(yù)期的片段和大小,證實(shí)克隆為正確的pEpo/dhfr。
      也通過測序證實(shí)插入在pBR322載體部分中的整個盒子的每一個核苷酸(SV40早期啟動子-dhfr基因-SV40LTpolyA/IVS-SV40早期啟動子-Epo基因-SV40LTpolyA/IVS)。
      實(shí)施例3-從pEpo/neo和pEpo/dhfr產(chǎn)生重組CHO細(xì)胞在進(jìn)行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染前一天,在25cm3T-燒瓶或96孔板中接種1-5×104細(xì)胞/cm2。以50∶1=Epo/neo∶Epo/dhfr的比率混合兩種質(zhì)粒,根據(jù)制造商的程序,使該質(zhì)粒吸附到脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(GIBCO/BRL)上。
      簡而言之,我們利用0.25μg DNA/cm2和1.5μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑/cm2,并且調(diào)整該DNA/脂質(zhì)混合物到200μl/cm2細(xì)胞層。在無血清的DMEM中用轉(zhuǎn)染混合物鋪在細(xì)胞上4小時,然后用培養(yǎng)基置換含有DNA的培養(yǎng)基。在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后,將細(xì)胞轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基。開始在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞池至鋪滿,然后在擴(kuò)增培養(yǎng)基中(4.8×10-8MMTX)培養(yǎng),之后通過針對Epo產(chǎn)生的ELISA篩選細(xì)胞培養(yǎng)上清液。確定最高的生產(chǎn)細(xì)胞株,MTX濃度增加2倍,最好的生產(chǎn)細(xì)胞株用于進(jìn)一步培養(yǎng)。選擇7個重組細(xì)胞池,并且比較生長特性、Epo生產(chǎn)力、蛋白質(zhì)帶型(通過Western印跡分析),Epo功能性和染色體穩(wěn)定性。
      在T25燒瓶中,用每個T25燒瓶中2.5μg pEpo/neo、0.05μg pEpo/dhfr和15μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(09/T25/1和09/T25/2)及每個T25燒瓶中2μgpEpo/neo、0.4μg pEpo/dhfr和15μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(09/T25/3和09/T25/4)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
      此外,用每平板10μg pEpo/neo、0.2μg pEpo/dhfr和60μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染5個平板(09/96/1-09/96/5),用每平板8μg pEpo/neo、1.6μgpEpo/dhfr和60μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染5個平板(09/96/6-09/96/10)。用6.25μg pEpo/neo、0.08μg pEpo/dhfr和35.5μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染平板11和12。
      簡而言之,利用了0.25μg DNA/cm2和1.5μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑/cm2,并且將該DNA/脂質(zhì)混合物調(diào)整到200μl/cm2細(xì)胞層。
      因?yàn)橐郧暗脑囼?yàn)表明一個培養(yǎng)單元中克隆數(shù)最大是3到5,所以主要是在微量滴定板上進(jìn)行一系列轉(zhuǎn)染。這意味著單克隆轉(zhuǎn)染體的分離比從T燒瓶中數(shù)百個克隆的分離更容易。表1描述了每個96孔板的克隆數(shù)及有擴(kuò)增壓力和無擴(kuò)增壓力下的ELISA效價。開始在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞池至鋪滿,然后在擴(kuò)增培養(yǎng)基中(4.8×10-8M MTX)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞集合,之后通過針對Epo產(chǎn)生的ELISA篩選細(xì)胞培養(yǎng)上清液。篩選了大約1000個生長孔,用增加的MTX濃度檢測50個這種培養(yǎng)物的Epo比生產(chǎn)力。確定最高的生產(chǎn)細(xì)胞株,MTX濃度增加2倍,最好的生產(chǎn)細(xì)胞株用于進(jìn)一步培養(yǎng)。
      在96孔板中進(jìn)行篩選和最初的擴(kuò)增步驟,篩選所有克隆后,在4.8×10-8M MTX中生長,選擇7個克隆,命名為09/96/1F5,09/96/3D5,09/96/3H5,09/96/5D4,09/96/5H1,09/96/6C5和09/96/7E6,比較它們的生長特性、Epo生產(chǎn)力、Western印跡分析中的蛋白質(zhì)帶型,Epo功能性檢測和染色體穩(wěn)定性。
      細(xì)胞倍增的時間看來對所有克隆是相同的,它們可以一周兩次以1∶2到1∶5比率傳代。從9.6×10-8M到1.9×10-7M增加MTX濃度也改進(jìn)生產(chǎn)力,但是進(jìn)一步倍增MTX濃度不影響ELISA值。因此在3.8×10-7MMTX下進(jìn)行亞克隆。在1.9×10-7M MTX時分析免疫熒光,各單個培養(yǎng)物沒有顯著性不同。
      通過光學(xué)顯微術(shù)和Coulter Counter核DNA分析比較細(xì)胞形態(tài)學(xué)??寺?9/96/7E9,09/96/6C5,09/96/5H1,09/96/5D4和09/96/3D5特征是與宿主細(xì)胞系CHO-DHFR-有相同的核大小分布。與此相比,細(xì)胞系09/96/1F5和09/96/3H5有較大的核。從以前的試驗(yàn)得知,這是增加染色體數(shù)量的結(jié)果。因此,為了進(jìn)一步穩(wěn)定化,決定利用克隆09/96/3D5。
      與重組藥物產(chǎn)品比較,所有7個培養(yǎng)上清液在Epo對TF-1細(xì)胞的功能性檢測中產(chǎn)生了相同的斜率。
      在每個MTX濃度通過SDS PAGE和western印跡檢測重組蛋白質(zhì),并且在所有重組培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)僅僅微小的改變。這些克隆產(chǎn)生Epo。
      總結(jié)和討論在此描述了表達(dá)Epo的重組CHO細(xì)胞系的選擇,從真核生物表達(dá)載體構(gòu)建到哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染和多克隆Epo表達(dá)細(xì)胞池的分離。主要用ELISA、免疫熒光、Western印跡和體外功能性檢測設(shè)定分析的基礎(chǔ)。所有這些方法均建立在能夠篩選僅僅ng/ml量的低生產(chǎn)細(xì)胞池培養(yǎng)上清液和更穩(wěn)定的重組細(xì)胞的濃度范圍內(nèi)。
      產(chǎn)生重組CHO池,其中用高達(dá)3.8×10-7M的MTX逐步地擴(kuò)增基因拷貝數(shù)。這些細(xì)胞一周兩次以1∶3到1∶4的比率傳代,并且每次在ELISA中檢測升高的Epo水平。
      實(shí)施例4-重組細(xì)胞系的進(jìn)一步篩選重組細(xì)胞池09/96/3D5用于進(jìn)一步穩(wěn)定化。MTX濃度逐步增加到0.38μM MTX。在該擴(kuò)增水平,用每孔10和20個細(xì)胞亞克隆重組3D5細(xì)胞。通過ELISA進(jìn)行具有單克隆的孔的培養(yǎng)上清液篩選。表2顯示在0.38μMMTX存在的情況下,重組細(xì)胞池3D5的亞克隆條件和效率。檢測300個單克隆的上清液。用0.77μM MTX,在24孔板中選擇傳代后4天有升高Epo效價的克隆。
      在液氮中保藏這些克隆中的7個克隆,通過增加MTX濃度到1.54μM,通過基因拷貝數(shù)的進(jìn)一步擴(kuò)增進(jìn)行克隆選擇。
      表3匯編了第二輪穩(wěn)定化的鋪板條件和效率,這里,最后一次用1.54μM MTX亞克隆克隆09/96/3D5/1H9和09/96/3D5/18E5。每孔細(xì)胞數(shù)降低到4個細(xì)胞。篩選260個單克隆,將其中每個亞培養(yǎng)的20個以上克隆轉(zhuǎn)移到T燒瓶,并且篩選比生產(chǎn)力。通過標(biāo)準(zhǔn)如比表達(dá)速率、生長條件和核大小分布,確定最終生產(chǎn)克隆。棄掉顯示4倍性的克隆,因?yàn)榻?jīng)驗(yàn)中這種細(xì)胞在生物反應(yīng)器中傾向于顯示復(fù)雜的生長模式。篩選后,選定下面的6個亞克隆(4個1H9和2個18E5亞克隆),在液氮中將其冷凍。
      09/96/3D5/1H9/4C2 09/96/3D5/1H9/6C2 09/96/3D5/1H9/6D409/96/3D5/1H9/15B4 09/96/3D5/18E5/7A6 09/96/3D5/18E5/15C3實(shí)施例5-適應(yīng)無血清的培養(yǎng)基在最后的亞克隆步驟后,選定實(shí)施例4的最后6個重組細(xì)胞系用于適應(yīng)無血清的培養(yǎng)條件。用約5×104細(xì)胞/cm2將亞克隆后第7-12代中的細(xì)胞接種到T25燒瓶中,培養(yǎng)3-4天至鋪滿。在該時間點(diǎn),用無血清的適應(yīng)培養(yǎng)基完全取代培養(yǎng)基,以后每天更新80%的培養(yǎng)基。將所有懸浮細(xì)胞返回到培養(yǎng)物中。適應(yīng)時間后,當(dāng)幾乎所有的細(xì)胞都在懸浮液中生長時,一周傳代克隆2次,并且作為懸浮培養(yǎng)物培養(yǎng)。
      在深低溫保藏前,在無血清的適應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)克隆11-13代。用無血清冷凍培養(yǎng)基在液氮中冷凍每個細(xì)胞系,共6個安瓿,每個安瓿5×106個細(xì)胞。融化后,在無血清的生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)克隆。在融化后于第二或第三代中用上清液進(jìn)行分析性表征以篩選生產(chǎn)克隆。
      分析檢測包括比生長速率[μ]-(μ=ln(×2/×1)/天數(shù))比生產(chǎn)力[qp]-(Qp=產(chǎn)生的產(chǎn)物×106/(細(xì)胞數(shù)×天數(shù)))Western印跡等電聚焦
      DNA含量和穩(wěn)定性克隆穩(wěn)定性所有6個細(xì)胞系均可以在無血清生長培養(yǎng)基中生長,一周2次傳代。在沒有血清時也進(jìn)行深低溫保藏,融化后,將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為無血清的生產(chǎn)培養(yǎng)基。此制劑富含葡萄糖和氨基酸。
      5代后測定不同的蛋白質(zhì)和細(xì)胞參數(shù),選定一個生產(chǎn)克隆(09/96/3D5/1H9/6C2;縮寫6C2)和一個備用克隆(09/96/3D5/1H9/4C2;縮寫4C2)。
      實(shí)施例6-重組細(xì)胞系的比較經(jīng)幾周,通過測定培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)和傳代期間的傳代比率(splittingratio),計算來自實(shí)施例4和5的6個細(xì)胞系的生長特性。通過ELISA檢測Epo生產(chǎn)力。從該數(shù)據(jù)計算上述比生產(chǎn)力和比生長速率。
      表4概括了在1∶3傳代比率下標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下3天培養(yǎng)后得到的數(shù)據(jù)。
      示出了傳代后和再3天后細(xì)胞數(shù)(通過Coulter Counter測定)。
      還原條件下的SDS-PAGE通過SDS-PAGE分離6個細(xì)胞系的上清液,比較分子量的差異。6個上清液顯示了相同SDS帶型,具有在這種高度糖基化蛋白質(zhì)中通常可觀察到的成片條帶(未示出數(shù)據(jù))。
      類似的商購產(chǎn)品遷移為較為清楚的條帶,這可能是在下游處理期間不同條帶分離的結(jié)果。
      IEF-Western印跡IEF-Western印跡分析應(yīng)該反映糖蛋白潛在的微不均一性。根據(jù)加載在凝膠上的蛋白質(zhì)的量,可以觀察到14條帶。在Western印跡上,大約于凝膠中部有一條可以觀察到的特征性雙帶;將該雙帶下面的下一條帶定為條帶1,在該凝膠的酸性部分可以觀察到9至10條帶。類似商購產(chǎn)品產(chǎn)生了相應(yīng)于此異質(zhì)產(chǎn)物中的條帶6到9的4條主要條帶。
      重組細(xì)胞的DNA含量
      DNA含量與細(xì)胞系的染色體數(shù)成比例。重組細(xì)胞系的穩(wěn)定性部分受染色體數(shù)的影響,并且通過與宿主細(xì)胞系(CHO dhfr-)比較可以證實(shí)DNA含量的身份。
      總結(jié)和討論這里描述了重組Epo表達(dá)CHO細(xì)胞系的分離。2輪亞克隆后,比較6個細(xì)胞系的不同特性作為指定一個最終生產(chǎn)克隆的基礎(chǔ)。分析基礎(chǔ)主要是ELISA,western印跡和IEF檢測及通過FACS分析的DNA測定。
      與商購純化蛋白質(zhì)比較,重組培養(yǎng)物上清液的Western印跡模式顯示了幾條另外的較低分子量條帶。一種解釋是這些另外條帶為在產(chǎn)生用于比較的商購產(chǎn)品的下游處理期間被除去的同種型。另一種可能是由于SDS的不完全攝取檢測到的人為條帶。所有細(xì)胞培養(yǎng)上清液的等電聚焦產(chǎn)生了相同同種型分布,而與它們的Qp無關(guān)。
      最好的生產(chǎn)克隆和最容易處理的克隆是克隆6C2,選定該克隆作為生產(chǎn)克隆。選定4C2作為備份克隆。在滾瓶中增殖兩個克隆。
      實(shí)施例7-T燒瓶中CHO細(xì)胞的培養(yǎng)在無血清條件下,在T燒瓶中,在中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)中產(chǎn)生重組人紅細(xì)胞生成素。用2.67×105細(xì)胞/mL接種這些培養(yǎng)物。3天溫育期后,達(dá)到9.35×105細(xì)胞/mL的最終細(xì)胞密度(=>μ=0.42天-1)。
      實(shí)施例1到6描述了多種表達(dá)Epo的CHO克隆的制備。在實(shí)施例4和5中獲得6個克隆,由于克隆CHO 6C2較高的細(xì)胞比生產(chǎn)力和高的比生長速率,所以選定該克隆。
      實(shí)施例8-生物反應(yīng)器中CHO細(xì)胞的培養(yǎng)在150L生物反應(yīng)器中,在補(bǔ)料分批(T43C6C2)模式中培養(yǎng)CHO細(xì)胞系6C2。利用組成為補(bǔ)加了氨基酸的50∶50 DMEM/Hams F12并含有0.25%植物肽、0.1%lutrol、1.54μM氨甲蝶呤(MTX)、4g/L葡萄糖、2.5g/LNaHCO3、乙醇胺、檸檬酸鐵、抗壞血酸和亞硒酸鈉的細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不含有任何昂貴的功能性蛋白質(zhì)(重組或來源于天然來源的)。存在來源于動物來源的成分。在56L培養(yǎng)基中以約5×105細(xì)胞/ml接種細(xì)胞。pO2設(shè)為50%空氣飽和度,溫度37℃及pH7.0,并且在發(fā)酵過程中保持恒定。
      葡萄糖濃度保持在1g/L以上。4天后,將新鮮培養(yǎng)基加入反應(yīng)器到150L。9天后,通過添加1875ml含有氨基酸、碳水化合物和植物來源的胨的營養(yǎng)濃縮物延長分批培養(yǎng)。10天后,添加另外的1875mL營養(yǎng)濃縮物。2天后(第12天)收獲含有紅細(xì)胞生成素的上清液。
      實(shí)施例9-沒有氨甲蝶呤時生物反應(yīng)器中紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生在5L生物反應(yīng)器中,在補(bǔ)料分批(Kamp 4 B5-1和2)模式中培養(yǎng)CHO細(xì)胞系6C2。培養(yǎng)基如實(shí)施例9所述。第一生物反應(yīng)器(Kamp 4 B5-1)培養(yǎng)基中提供1.54μm MTX,第二生物反應(yīng)器(Kamp 4 B5-2)沒有MTX。
      葡萄糖濃度保持在1g/L以上。在1250ml培養(yǎng)基中以約5×105細(xì)胞/ml接種細(xì)胞。pO2設(shè)為50%空氣飽和度,溫度37℃和pH7.0,并且在發(fā)酵過程中保持恒定。2天后,用新鮮培養(yǎng)基將生物反應(yīng)器加到5L。第6,7,8,9和10天后,通過添加50到122mL含有氨基酸、碳水化合物和植物來源的胨的營養(yǎng)濃縮物延長分批培養(yǎng)。11天時,收獲含有紅細(xì)胞生成素的上清液。
      發(fā)現(xiàn)由于較好的糖基化模式,沒有氨甲蝶呤的培養(yǎng)更佳。
      實(shí)施例10-利用豐富培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器中紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生在5L生物反應(yīng)器中,在補(bǔ)料分批(Kamp 11 B5-1和2)模式中培養(yǎng)CHO細(xì)胞系6C2。如實(shí)施例10(Kamp 4 B5-2)中所述操作生物反應(yīng)器1。在生物反應(yīng)器2中,利用組成為豐富的補(bǔ)加了氨基酸的50∶50DMEM/Hams F12并含有0.325%植物肽、0.1%lutrol、6.4g/L葡萄糖、2.5g/LNaHCO3、乙醇胺、檸檬酸鐵、抗壞血酸、亞硒酸鈉和0.6g/L磷酸鹽的細(xì)胞培養(yǎng)基。在1250ml培養(yǎng)基中以約5×105細(xì)胞/ml接種細(xì)胞。pO2設(shè)為50%空氣飽和度,溫度37℃。在開始時,將pH設(shè)為7.1。在發(fā)酵過程中將其逐步降低到6.9。
      在培養(yǎng)過程中,保持生物反應(yīng)器2中的葡萄糖濃度在3到4g/L之間。2.5天后,用新鮮培養(yǎng)基將生物反應(yīng)器加到5L。6,7,8,9和10天后,通過添加含有氨基酸、碳水化合物和植物來源的胨的豐富營養(yǎng)濃縮物延長此分批培養(yǎng)。11天時,收獲含有紅細(xì)胞生成素的上清液。
      發(fā)現(xiàn)用營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基(氨基酸、葡萄糖、植物胨和磷酸鹽)和從7.1到6.9的pH遷移實(shí)施的培養(yǎng)具有雙倍以上的最終Epo濃度,而Epo的糖基化模式相當(dāng)。
      實(shí)施例11-在缺少來源于動物的成分的生物反應(yīng)器中紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生在5L生物反應(yīng)器中,在補(bǔ)料分批(Kamp 17 B5-1和3)模式中培養(yǎng)CHO細(xì)胞系6C2。如果沒有相反的說明,如實(shí)施例10(Kamp 4 B5-2)所述設(shè)定所有參數(shù)。在生物反應(yīng)器2中,利用不含有任何來源于動物的成分的細(xì)胞培養(yǎng)基。例如,用合成氨基酸取代通常來源于動物(如鮭魚或人發(fā))的氨基酸酪氨酸或半胱氨酸。
      2.5天后,用新鮮培養(yǎng)基將生物反應(yīng)器加到5L。第5,6,7,8和9天后,通過添加含有氨基酸、碳水化合物和植物來源的胨的營養(yǎng)濃縮物延長此分批培養(yǎng)。在9到10天時,收獲含有紅細(xì)胞生成素的上清液。
      發(fā)現(xiàn)不含有任何動物來源的成分的培養(yǎng)基產(chǎn)生了可比的最終Epo濃度。但是培養(yǎng)物生長較慢,并且需要額外添加營養(yǎng)濃縮物。
      實(shí)施例12-在具有豐富培養(yǎng)基(維生素、微量元素)的生物反應(yīng)器中紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生在10L生物反應(yīng)器中,在補(bǔ)料分批(Kamp 12 C)模式中培養(yǎng)CHO細(xì)胞系6C2。除了下面的例外,如實(shí)施例11(Kamp 11 B5-2)所述操作該生物反應(yīng)器所用細(xì)胞培養(yǎng)基之組成為補(bǔ)加氨基酸的豐富的50∶50 DMEM/HamsF12,其中含有0.325%植物肽、0.1%lutrol、6.4g/L葡萄糖、2.5g/L NaHCO3、乙醇胺、檸檬酸鐵、維生素、微量元素、亞硒酸鈉和0.6g/L磷酸鹽。加倍濃縮物中的含量,并且使其富含維生素。
      在4500ml培養(yǎng)基中以約5×105細(xì)胞/mL接種細(xì)胞。pO2設(shè)為50%空氣飽和度,溫度37℃。在開始時,將pH設(shè)為7.1。在發(fā)酵過程中將其逐步降低到6.9。
      在培養(yǎng)過程中,保持生物反應(yīng)器中的葡萄糖濃度在3到4g/L之間。3天后,用新鮮培養(yǎng)基將生物反應(yīng)器加到10L。第6,7,8,9,10,11和12天后,通過添加豐富營養(yǎng)濃縮物延長分批培養(yǎng)。13天時,收獲含有紅細(xì)胞生成素的上清液。
      實(shí)施例13-Epo的分離細(xì)胞分離在無血清條件下,通過不連續(xù)的補(bǔ)料分批培養(yǎng),在中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)中產(chǎn)生重組人紅細(xì)胞生成素。發(fā)酵后(2個不同生物反應(yīng)器中4x約1+2分批模式擴(kuò)展階段),冷卻具有約200-300mg rhEpo/L的收獲肉湯到2-8℃,不經(jīng)任何間歇的貯藏期,首先通過盤疊式分離器離心,接著通過深度過濾(PP Polygard 0.1μm,Seitz Bio10或Cuno A90M08,通量約300L/m2過濾器面積)和0.2μ過濾(Sartobran P,Sartorius或Duropore 0.22μ,Millipore)澄清該肉湯。為了避免高的細(xì)胞裂解和由此造成的HCP(宿主細(xì)胞蛋白質(zhì))的高產(chǎn)物污染,重要的是首先在最適時間點(diǎn)(在主要培養(yǎng)中大約12天,氧耗停滯)收獲,其次利用專門設(shè)計用于易碎真核生物細(xì)胞分離的細(xì)胞分離設(shè)備,例如具有水密封進(jìn)料口(hydrohermetic feed inlet)的CSC6(6000m2ECA,15500xg,約200L/h Westfalia)或者具有g(shù)entledisc進(jìn)口和porcupine出口的BTPX 250(11000m2ECA,13000xg,300L/h,Alfa Laval)。不同分離技術(shù),包括切向流過濾和離心,的比較揭示了剪切應(yīng)力引起的細(xì)胞裂解的差異(通過細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記酶LDH的釋放來測定)。離心產(chǎn)生了最柔和的分離(<3U LDH/mg rhEpo),優(yōu)選這種離心。
      在可替代的實(shí)施方式中,如上所述,僅僅通過盤疊式分離器的離心(沒有深度過濾步驟)用于細(xì)胞分離步驟。在另一個可替代實(shí)施方式中,利用如上所述的深度過濾步驟(沒有離心步驟)。
      通過陰離子交換(AEX)層析進(jìn)行捕獲澄清后,加樣到AEX捕獲樹脂上前,用約3體積的水稀釋粗上清液達(dá)到小于或等于5mS/cm的最終電導(dǎo)率,并用Tris堿調(diào)節(jié)到pH7.5。
      所用的AEX-柱有約10-20cm的床高,并且填裝有良好流動特征的QCeramic HyperD F(Biosepra)。用20mM Tris pH7.5和50mM NaCl平衡。然后以4-8cm/分鐘的流速在柱上加載稀釋的細(xì)胞上清液(10-15mg rhEpo/每mL樹脂),用10-15柱體積(cv)的平衡緩沖液洗柱子。通過改變到較高的電導(dǎo)率緩沖液,即,具有150mM NaCl的20mM Tris pH7.5,通過洗脫步驟洗脫產(chǎn)物。合并峰級分,產(chǎn)生了約50-60%的產(chǎn)率。
      在可替代實(shí)施方式中,通過超濾濃縮合并的級分以減少中間體積并標(biāo)準(zhǔn)化下面的沉淀?xiàng)l件。優(yōu)選地,利用5到10kDa截斷膜,調(diào)節(jié)約20mg/ml的靶產(chǎn)物濃度。
      硫酸銨沉淀通常,用2.4M(NH4)2SO4,通過污染的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的沉淀進(jìn)一步純化前步的捕獲合并物。在該AS-濃度,在沉淀物中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物,留下純的無HCP的上清液,在進(jìn)行下面的RPC純化前,必須將此上清液稀釋,達(dá)到RPC上樣中<240mM(NH4)2SO4。
      通過向1體積的捕獲合并物添加1.5體積的硫酸銨母液(4M(NH4)2SO4,20mM Tris pH7.5)進(jìn)行沉淀,在10-15℃溫育30分鐘,通過深度過濾(Seitz Bio10或Cuno A90M08)和0.2μ過濾(Sartobran P,Sartorius或Duropore 0.22μ,Millipore)分離沉淀物。在高洗脫體積=稀釋的rhEpo洗脫合并物(<5mg rhEpo/ml)的情況下,通過可選的UF-濃縮步驟(10kDa截斷值)可以改進(jìn)HCP沉淀。
      硫酸銨沉淀比疏水相互作用層析更有效。
      為了降低來自前面的沉淀步驟的硫酸銨含量,如上所述必須稀釋含有產(chǎn)物的上清液。可替代的方案是超濾/滲濾(diafiltration)步驟。優(yōu)選地,利用5到10kDa截膜,并調(diào)節(jié)小于240mM的靶硫酸銨濃度及約30mg/ml的產(chǎn)物濃度。滲濾步驟所用的緩沖液是20mM Tris/HCl pH7.0。
      反相層析下一個純化步驟是反相層析,其在幾個方面是有用的a)不同同種型可以根據(jù)它們的的糖骨架很好地分離(高度糖基化/唾液酸化形式洗脫在較少糖基化/唾液酸化形式之前),b)用該高效層析可以除去殘留的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和c)通過有機(jī)溶劑,此層析是除去病毒和失活病毒的有力步驟。Source 30RPC(Amersham Biosciences)是可以a)在中等壓力(<10bar)下運(yùn)行和b)用高濃度NaOH消毒處理的聚合樹脂。優(yōu)選的床高是10至15cm之間,每ml填裝的樹脂的推薦載荷范圍是8-12mg rhEpo。
      在RPC步驟前,需要將含有產(chǎn)物的上清液調(diào)整到小于0.24M硫酸銨的最終濃度。這種調(diào)整可以通過如下方式進(jìn)行a)在RPC上樣過程中進(jìn)行隨后的在線式稀釋步驟(1體積rhEpo上清液+4體積20mM Tris/HClpH7.0+5體積20mM Tris/HCl pH7.0中50vv%ACN),或b)為了節(jié)省昂貴的有機(jī)溶劑,優(yōu)選地,在上樣步驟前再次相對于20mM Tris/HCl pH7.0進(jìn)行滲濾/濃縮(具有10kDa截斷值的UF)。用20mM Tris/HCl pH7.0中25vv%乙腈(ACN)在上樣前平衡該柱子并在上樣后洗柱。用從25%到50%的線性梯度ACN洗脫產(chǎn)物,以小級分(特別是約0.2CV,在可替代方案中約0.3-0.2CV)在預(yù)先裝有4體積稀釋緩沖液(50mM Tris/HClpH7.0)的管中收集該產(chǎn)物以立即降低溶劑濃度,該溶劑濃度可以誘導(dǎo)聚集作用并且損害下面的AEX層析。合并洗脫峰的大約最初一半的級分以產(chǎn)生進(jìn)一步處理的RPC池。該池包含具有有利的較高糖基化程度的同種型。通過該分級分離方法,除去細(xì)胞培養(yǎng)物中以高達(dá)20%水平存在的、在位置Ser126丟失O-聚糖的脫-O-糖基化rhEpo產(chǎn)物。
      在可替代方案中,為通過暴露于有機(jī)溶劑誘導(dǎo)病毒失活,用0.5體積的20mM Tris/HCl pH7.0,而不是4體積的上述相同緩沖液預(yù)先加入級分,溫育20到40分鐘或更長。在該溫育步驟后,再加入相對于原始未稀釋級分體積的3.5體積的20mM Tris/HCl pH7.0,由此終止病毒失活。
      合并經(jīng)或未經(jīng)病毒失活的級分用于進(jìn)一步純化。通常合并起始于上升位置處最高OD的50-100%,約結(jié)束于下降位置處70-80%以上的級分。較早的洗脫級分可能含有宿主細(xì)胞蛋白質(zhì),而稍后的洗脫級分含有較少的唾液酸化、較少活性的同種型。此外,可以進(jìn)行CZE分析以支持某些同種型的合并。
      陰離子交換層析然后在高效AEX柱上加樣稀釋的RPC-合并物,這又可以有助于篩選特定同種型和除去宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。這時根據(jù)等電點(diǎn),即根據(jù)與糖基化程度成比例的唾液酸數(shù)目分離同種型。利用高效樹脂Q-Sepharose HP(Amersham Biosciences),其顯示了優(yōu)良的分離效率。床高在15和20cm之間。限定所有條件,如加樣、梯度和床高以保持相當(dāng)?shù)偷漠a(chǎn)物濃度,否則該濃度會導(dǎo)致洗脫過程中因溶劑誘導(dǎo)的產(chǎn)物聚集而造成的后峰。
      在用20mM Tris/HCl pH7.0平衡的Q-Sepharose HP上以2-4mgEpo/mL樹脂加樣PRC合并物。在用平衡緩沖液的洗滌步驟后,以平衡緩沖液中含有0到300mM NaCl的10CV線性鹽梯度洗脫產(chǎn)物。以0.1CV或0.25CV級分收集洗脫峰,通過CZE分析分析性合并物以找到含有期望紅細(xì)胞生成素同種型的正確級份合并物。通常,AEX合并物由第二半洗脫峰組成,在此處高度糖基化和唾液酸化同種型被洗脫。
      通過利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)作為生產(chǎn)過程中的控制,即使來源由于不同的發(fā)酵條件或宿主系統(tǒng)而含有僅僅少數(shù)高度唾液酸化的同種型,也可以產(chǎn)生精確地限定的紅細(xì)胞生成素同種型混合物。
      CZE是能分離具不同電荷的同種型的高分辨率方法。它給出了每個級份中每個單個同種型的定量結(jié)果。該信息使得可以合并特定級分,從而在批和批之間導(dǎo)致一致的同種型分布圖。通常,通過僅僅合并后來的洗脫級份,避免早期洗脫的較少唾液酸化的同種型。
      大小排阻層析在最后的層析步驟中,通過大小排阻精處理AEX合并物,其除去潛在二聚體和更高的聚集體,并完成對最后制品的緩沖液更換。用在該步驟中的Superdex 75Prep Grade(Amersham Biosciences)即使在達(dá)到15%柱體積的較高加樣體積時也有良好的分辨率。優(yōu)選的床高是60至80cm。
      因?yàn)椴豢赡茉谶M(jìn)行先前步驟的AEX層析時于AEX合并物中獲得高產(chǎn)物濃度,所以在凝膠過濾前不得不濃縮合并物。用5-10kDa UF膜,通過超濾步驟進(jìn)行該濃縮,該超濾步驟得到具有約10mg紅細(xì)胞生成素/mL的約10倍濃縮的UF-保留物。
      將約3-7CV%的UF-保留物直接加樣到用pH7.0,20mM磷酸鈉,75mM NaCl預(yù)平衡的Superdex 75pg柱上。在約1-1.5CV后,開始從柱上洗脫產(chǎn)物,收集洗脫峰以得到SEC-合并物。
      納米過濾為了除去潛在的病毒,另外實(shí)施的死端病毒過濾步驟。用設(shè)計以除去小至15nm的顆粒的特定膜,如Planova 15N(Asahi)進(jìn)行該過濾??蛇x擇的死端納米過濾裝置是PALL Ultipor VF Grade DV20或MilliporeViresolve NFP柱體或囊。特別是對于小的無包膜病毒,如細(xì)小病毒,幾乎沒有其它的病毒除去和失活的工具。
      使無菌濾過的SEC合并物通過具有適合膜的最終過濾器,濾液為最終的成批藥物物質(zhì)??商娲?,納米過濾可以插在UF濃縮和大小排阻層析之間。
      表1重組CHO細(xì)胞用Epo/neo和Epo/dhfr轉(zhuǎn)染T25轉(zhuǎn)染

      96孔轉(zhuǎn)染

      不同克隆的擴(kuò)增

      表2在0.38μM MTX存在下細(xì)胞池3D5的亞克隆條件和鋪板效率

      表3在1.54μM MTX存在下亞克隆3D5/1H9和3D5/18E5的亞克隆條件和鋪板效率3D5/1H9

      3D5/18E5

      表4重組CHO克隆的比生產(chǎn)力和生長特性

      這里并入上面說明書中提到的所有出版物為參考文獻(xiàn)。所述本發(fā)明方法和系統(tǒng)的各種修改和改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的,且不背離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明結(jié)合特定的優(yōu)選實(shí)施方式已作出描述,但應(yīng)該理解所要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)該不適當(dāng)?shù)叵拗朴谶@些特定的實(shí)施方式。實(shí)際上,對分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的用于實(shí)施本發(fā)明的所述模式的各種修改均旨在下面權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
      權(quán)利要求
      1.一種從包含宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基回收和純化重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的方法,該方法包括步驟(a)通過進(jìn)行選自(i)離心后深度過濾,(ii)深度過濾,和(iii)離心的方法,從細(xì)胞培養(yǎng)基除去宿主細(xì)胞、細(xì)胞成分和碎片以獲得澄清的培養(yǎng)基上清液;(b)調(diào)節(jié)上清液的電導(dǎo)率到5mS/cm或以下,并調(diào)節(jié)pH至約7.0到8.0之間;(c)將步驟(b)得到的上清液加到包含陰離子交換層析介質(zhì)的柱上,洗柱子,從柱上洗脫rhEpo,收集含有rhEpo的峰級分;(d)利用可在中等壓力(<10bar)下運(yùn)行并且可以抵抗高濃度NaOH的樹脂,將來自步驟(c)的合并的峰級分進(jìn)行反相層析步驟,利用有機(jī)溶劑的線性梯度洗脫rhEpo;(e)將步驟(d)中洗脫的一個或多個含有rhEpo的級分加到包含陰離子交換層析介質(zhì)的柱上,洗柱子,利用線性鹽梯度洗脫rhEpo;(f)根據(jù)rhEpo的唾液酸化程度,選擇步驟(e)中洗脫的一個或多個含有rhEpo的級分;和(g)利用凝膠過濾介質(zhì),將一個或多個步驟(f)中洗脫的含有rhEpo的級分進(jìn)行一個或多個大小排阻層析步驟以除去潛在的二聚體和更高的聚集體;收集含有rhEpo的洗脫物。
      2.如權(quán)利要求1所述的方法,其中用盤疊式分離器進(jìn)行步驟(a)中的離心。
      3.如權(quán)利要求1所述的方法,其在步驟(d)和步驟(e)之間還包括另一步驟根據(jù)重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的唾液酸化程度,選擇一個或多個在步驟(d)中洗脫的含有rhEpo的級分。
      4.如權(quán)利要求1所述的方法,其中在步驟(d)之前,將來自步驟(c)的峰級分進(jìn)行硫酸銨沉淀步驟以沉淀污染的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì),然后將上清液的硫酸銨濃度調(diào)節(jié)到與步驟(d)相容的濃度。
      5.如權(quán)利要求4所述的方法,其中所述的濃度小于0.24M硫酸銨。
      6.如權(quán)利要求1所述的方法,其中步驟(b)中pH是約pH7.5。
      7.如權(quán)利要求1所述的方法,其中利用有大于125mM的鹽濃度的緩沖液進(jìn)行步驟(c)中的洗脫步驟。
      8.如權(quán)利要求1所述的方法,其中步驟(d)中的有機(jī)溶劑選自乙腈、乙醇和己二醇。
      9.如權(quán)利要求1所述的方法,其中在步驟(d)中利用約10%到約100%的有機(jī)溶劑線性梯度洗脫紅細(xì)胞生成素(Epo)多肽。
      10.如權(quán)利要求8所述的方法,其中步驟(d)中的有機(jī)溶劑是乙腈,并且利用從約25%到約50%的梯度洗脫紅細(xì)胞生成素(Epo)多肽。
      11.如權(quán)利要求1所述的方法,其中在步驟(e)之前,用適當(dāng)?shù)暮彌_液稀釋步驟(d)中洗脫的級分。
      12.如權(quán)利要求11所述的方法,其中在步驟(e)之前,放置稀釋的級分一段足以失活病毒污染物的適當(dāng)時間。
      13.如權(quán)利要求1所述的方法,其中在步驟(g)中,在大小排阻層析步驟前對級分進(jìn)行超濾步驟。
      14.如權(quán)利要求1或4所述的方法,其中在步驟(d)中,在反相層析前對級分進(jìn)行超濾步驟。
      15.如權(quán)利要求4所述的方法,其中在硫酸銨沉淀步驟之前,對來自步驟(c)的合并的峰級分進(jìn)行超濾步驟。
      16.如權(quán)利要求1所述的方法,其在步驟(g)前或后還包括死端納米過濾步驟以除去病毒。
      17.如權(quán)利要求1所述的方法,其中步驟(a)中在方法(i),(ii)和(iii)之任一個之后是0.2μm過濾步驟。
      18.如權(quán)利要求1或3所述的方法,其中利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳在步驟(f)中或在步驟(d)和步驟(e)之間進(jìn)行一個或多個選擇。
      19.一種從包含宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基回收和純化重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的方法,該方法包括步驟(a)通過進(jìn)行選自(i)離心后深度過濾,(ii)深度過濾,和(iii)離心的方法,從細(xì)胞培養(yǎng)基除去宿主細(xì)胞、細(xì)胞成分和碎片以獲得澄清的培養(yǎng)基上清液,其中利用盤疊式分離器進(jìn)行所述離心;(b)調(diào)節(jié)上清液的電導(dǎo)率到5mS/cm或以下,并調(diào)節(jié)pH至約7.0到8.0之間;(c)將步驟(b)得到的上清液加到包含Q-HyperD F(BioSepra)陰離子交換層析介質(zhì)的柱上,洗柱子,從柱上洗脫rhEpo,收集含有rhEpo的峰級分;(d)利用可以在中等壓力(<10bar)下運(yùn)行并且可以抵抗高濃度NaOH的聚苯乙烯樹脂,如Source 30RPC(Amersham Biosciences),將步驟(c)得到的合并的峰級分進(jìn)行反相層析步驟,利用乙腈線性梯度洗脫rhEpo;和(e)根據(jù)rhEpo的唾液酸化程度,選擇一個或多個在步驟(d)中洗脫的含有rhEpo的級分,將所述級分加到包含Q-Seph HP(AmershamBiosciences)陰離子交換層析介質(zhì)的柱上,洗柱子,利用線性鹽梯度洗脫rhEpo;和(f)根據(jù)rhEpo的唾液酸化程度,選擇一個或多個步驟(e)中洗脫的含有rhEpo的級分,利用Superdex 75 prep grade(AmershamBiosciences)對所述級分進(jìn)行大小排阻層析以除去潛在的二聚體和更高的聚集體;收集含有rhEpo的洗脫物。
      20.如權(quán)利要求19所述的方法,其中通過毛細(xì)管區(qū)帶電泳在步驟(e)和/或步驟(f)中選擇一個或多個級分。
      21.如權(quán)利要求20所述的方法,其中在步驟(d)之前,將步驟(c)得到的合并的峰級分進(jìn)行硫酸銨沉淀步驟以沉淀污染的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì),然后將上清液的硫酸銨濃度調(diào)節(jié)到與步驟(d)相容的濃度。
      22.如權(quán)利要求21所述的方法,其中所述的濃度小于0.24M硫酸銨。
      23.如權(quán)利要求19所述的方法,其在步驟(f)前或后還包括死端納米過濾步驟以除去病毒。
      24.如權(quán)利要求19所述的方法,其中培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基,且利用不連續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵方法培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
      25.一種具有確定同種型組成的糖基化蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)方法,所述方法包括利用CZE分析包含糖基化蛋白質(zhì)或多肽的一種或多種同種型的樣品。
      26.如權(quán)利要求25所述的方法,其中所述糖基化蛋白質(zhì)或多肽的同種型是重組人紅細(xì)胞生成素的同種型。
      全文摘要
      本發(fā)明提供了一種從包含宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基回收和純化重組人紅細(xì)胞生成素(rhEpo)的方法,該方法包括步驟(a)通過利用盤疊式分離器離心,接著深度過濾步驟,從細(xì)胞培養(yǎng)基除去宿主細(xì)胞、細(xì)胞成分和碎片以獲得澄清的培養(yǎng)基上清液;(b)調(diào)節(jié)上清液的電導(dǎo)率到5mS/cm或以下,而調(diào)節(jié)pH至約7.0到8.0之間;(c)將步驟(b)得到的上清液加到包含陰離子交換層析介質(zhì)的柱上,洗柱子,從柱上洗脫rhEpo,收集含有rhEpo的峰級分;(d)利用可以在中等壓力(<10bar)下運(yùn)行并且可以抵抗高濃度NaOH的聚苯乙烯樹脂,如Source 30 RPC,將步驟(c)得到的合并的峰級分進(jìn)行反相層析步驟,利用有機(jī)溶劑的線性梯度洗脫rhEpo;(e)將步驟(d)中洗脫的一個或多個含有rhEpo的級分加到包含Q-Seph HP陰離子交換層析介質(zhì)的柱上,洗柱子,利用線性鹽梯度洗脫rhEpo;(f)根據(jù)rhEpo的唾液酸化程度,選擇一個或多個步驟(e)中洗脫的含有rhEpo的級分;和(g)利用Superdex 75 prep grade,將一個或多個步驟(f)中洗脫的含有rhEpo的級分進(jìn)行一個或多個大小排阻層析步驟以除去潛在的二聚體和更高的聚集體;收集含有rhEpo的洗脫物。
      文檔編號C12P21/02GK1596268SQ02823601
      公開日2005年3月16日 申請日期2002年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月28日
      發(fā)明者P·埃利格爾, N·帕爾馬 申請人:桑多斯有限公司
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點(diǎn)贊!
      1