專利名稱：產(chǎn)生重組多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生表達(dá)重組多肽的宿主細(xì)胞的方法，所述重組多肽如人促紅細(xì)胞生成素，以及涉及用于產(chǎn)生該多肽的方法。特別是，本發(fā)明涉及包含多種選擇性標(biāo)記的雙載體表達(dá)系統(tǒng)和應(yīng)用該系統(tǒng)的方法。
背景技術(shù)：
紅細(xì)胞生成的調(diào)控主要由一種糖蛋白激素即促紅細(xì)胞生成素(Epo)完成，該激素于1977年發(fā)現(xiàn)。當(dāng)時(shí)，Epo的分離和純化由于起始材料的相對(duì)缺乏而受到限制，所述起始材料為再生障礙性貧血患者的尿液。僅可獲得亞微克數(shù)量的純化激素用于研究。
在19世紀(jì)70年代末，應(yīng)用親和柱子中以瓊脂糖固定的凝集素首次進(jìn)行了純化嘗試。麥芽和植物凝集素結(jié)合促紅細(xì)胞生成素，且尿的粗制備物中的Epo可濃縮達(dá)100倍。
19世紀(jì)80年代初期，已經(jīng)測(cè)定并克隆了人促紅細(xì)胞生成素的DNA序列。促紅細(xì)胞生成素為一單鏈糖蛋白，分子量約30到34kDa。該蛋白含有四個(gè)半胱氨酸殘基，并分別在Cys7、Cys161以及Cys29、Cys33間形成兩個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。已顯示Cys7和Cys161間形成的二硫鍵對(duì)生物活性至關(guān)重要。促紅細(xì)胞生成素為高度糖基化蛋白，其分子量中約35到40％由碳水化合物組成。尿液制備物間碳水化合物的量存在差異，因此該不均一性并不反映腎臟分泌后的即時(shí)狀態(tài)，而是反映由尿液制備的Epo分子；該差異受所使用的制備方法影響。尚未鑒定促紅細(xì)胞生成素的循環(huán)血漿形式的寡糖結(jié)構(gòu)，這是由于并未分離出上述這些形式的促紅細(xì)胞生成素。促紅細(xì)胞生成素具有三個(gè)提供N-糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺(Asn38、Asn24和Asn83)，以及具有一個(gè)用于O-連接糖基化的絲氨酸(Ser129)。
重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEpo)已在多種哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，所述哺乳動(dòng)物系統(tǒng)包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。在這些不同細(xì)胞類型中表達(dá)的rhEpo的糖基化方式均存在差異。(綜述見Takeuchi和Kobata，1991，糖生物學(xué)(Glycobiology)1(4)337-346)。rhEpo的商業(yè)生產(chǎn)需要具有高度體內(nèi)活性的該蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)。用于提高表達(dá)水平的一項(xiàng)技術(shù)是將含有人Epo基因且還含有二氫葉酸還原酶(dhfr)基因的載體轉(zhuǎn)染入dhfr缺陷的CHO細(xì)胞中(Lee等，1999，生物技術(shù)雜志(J.Biotech)6985-93)。培養(yǎng)基中加入氨甲蝶呤(MTX)導(dǎo)致dhfr基因以及相連的Epo基因的擴(kuò)增。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了產(chǎn)生表達(dá)如人促紅細(xì)胞生成素的重組多肽的宿主細(xì)胞系的改進(jìn)方法，已發(fā)現(xiàn)，向宿主細(xì)胞導(dǎo)入均含有可在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)如rhEpo的重組多肽表達(dá)的表達(dá)盒的兩個(gè)載體，其中一個(gè)載體含有對(duì)選擇性試劑(如dhfr)作出響應(yīng)而進(jìn)行擴(kuò)增的基因且另一載體包含選擇性標(biāo)記(如新霉素抗性基因)，兩載體的其它方面基本相同，上述操作允許根據(jù)重組多肽的表達(dá)來產(chǎn)生并篩選出具有所需特征的宿主細(xì)胞。
相應(yīng)地，本發(fā)明的第一方面提供了用于產(chǎn)生可表達(dá)目的重組多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞的方法，該方法包括將下列物質(zhì)導(dǎo)入真核宿主細(xì)胞(a)第一多核苷酸載體，其包含(i)編碼目的重組多肽的第一核苷酸序列；以及(ii)編碼選擇性標(biāo)記的第二核苷酸序列，其中當(dāng)宿主細(xì)胞與選擇性試劑接觸時(shí)所述第二核苷酸序列被擴(kuò)增，以及(b)第二多核苷酸載體，其核苷酸序列與第一多核苷酸載體基本相同，不同之處在于將第二核苷酸序列替換為編碼不同選擇性標(biāo)記的第三核苷酸序列；第一多核苷酸載體和第二多核苷酸載體整合到宿主細(xì)胞基因組中。
有利地且優(yōu)選地，第一和第二多核苷酸載體同時(shí)導(dǎo)入宿主細(xì)胞。作為備選，第一和第二多核苷酸載體依次導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
宿主細(xì)胞優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選地為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
選擇性試劑可為這樣的任意化合物或組合物，即當(dāng)宿主細(xì)胞與該選擇性試劑接觸時(shí)能夠引起第二核苷酸序列的擴(kuò)增。第二核苷酸序列優(yōu)選地編碼二氫葉酸還原酶多肽且選擇性試劑為氨甲蝶呤。目的重組多肽優(yōu)選地為人促紅細(xì)胞生成素。
通常，第三核苷酸序列編碼對(duì)抗生素的抗性，所述抗生素如G-418或新霉素(即第三核苷酸序列編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將會(huì)明曉，也可應(yīng)用新霉素組中的不同抗生素。
在一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生表達(dá)人促紅細(xì)胞生成素的經(jīng)轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞的方法，該方法包含將下列物質(zhì)導(dǎo)入CHO宿主細(xì)胞(a)第一多核苷酸載體，其包含(i)編碼人促紅細(xì)胞生成素的第一核苷酸序列，以及(ii)編碼二氫葉酸還原酶的第二核苷酸序列；以及(b)第二多核苷酸載體，該載體的核苷酸序列與第一多核苷酸載體基本相同，不同之處在于將編碼二氫葉酸還原酶的核苷酸序列替換為編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的第三核苷酸序列，所述氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶賦予對(duì)G-418、新霉素或新霉素組的不同抗生素的抗性；第一多核苷酸載體和第二多核苷酸載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
優(yōu)選地，對(duì)于根據(jù)本發(fā)明如此處公開的所有方法，第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列與強(qiáng)啟動(dòng)子可操作地連接，所述啟動(dòng)子通常為病毒啟動(dòng)子如SV40早期啟動(dòng)子。優(yōu)選地，三種核苷酸序列中的每一個(gè)均單獨(dú)可操作連接到一強(qiáng)啟動(dòng)子，優(yōu)選地為SV40早期啟動(dòng)子。但是，應(yīng)用各自的多順反子表達(dá)單元也是可能的。
同樣優(yōu)選地，對(duì)于根據(jù)本發(fā)明如此處公開的所有方法，第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列還與其它調(diào)控元件可操作地連接，所述調(diào)控元件如轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控序列。在其優(yōu)選實(shí)施方案中，該調(diào)控元件為編碼SV40大T多聚腺苷酸化信號(hào)的序列。優(yōu)選地，該SV40大T多聚腺苷酸化信號(hào)序列包括已知的天然存在的間插序列。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了可由本發(fā)明第一個(gè)方面的方法產(chǎn)生的真核宿主細(xì)胞。由宿主細(xì)胞表達(dá)的目的重組多肽優(yōu)選地為促紅細(xì)胞生成素，通常為hEpo。宿主細(xì)胞優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選地為CHO細(xì)胞。
本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含將下列物質(zhì)整合到一條或多條其染色體中；(a)第一多核苷酸載體，其包含(i)編碼目的重組多肽的第一核苷酸序列，以及(ii)編碼選擇性標(biāo)記的第二核苷酸序列，其中當(dāng)宿主細(xì)胞與選擇性試劑接觸時(shí)該第二核苷酸序列被擴(kuò)增，以及(b)第二多核苷酸載體，其核苷酸序列與第一多核苷酸載體基本相同，不同之處在于將第二核苷酸序列替換為編碼不同選擇性標(biāo)記的第三核苷酸序列。
由宿主細(xì)胞表達(dá)的目的重組多肽優(yōu)選地為促紅細(xì)胞生成素，通常為hEpo。宿主細(xì)胞優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選地為CHO細(xì)胞。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，第二核苷酸序列編碼二氫葉酸還原酶多肽。目的重組多肽優(yōu)選地為促紅細(xì)胞生成素，通常為hEpo。
在一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞在其一條或多條染色體中整合特別是穩(wěn)定整合了以下序列，(a)一多核苷酸序列，其編碼二氫葉酸還原酶多肽和促紅細(xì)胞生成素，以及(b)一多核苷酸序列，該序列與(a)的多核苷酸序列不同，其編碼促紅細(xì)胞生成素以及編碼賦予抗生素抗性的多肽。
宿主細(xì)胞優(yōu)選地為CHO細(xì)胞。抗生素優(yōu)選地為G-418、新霉素或新霉素組中不同(但類似)的抗生素。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生目的重組多肽的方法，該方法包含將根據(jù)本發(fā)明第二或第三個(gè)方面的宿主細(xì)胞在允許第一核苷酸序列表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。通常，也在導(dǎo)致第一核苷酸序列擴(kuò)增的選擇性試劑存在條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，第二核苷酸序列編碼二氫葉酸還原酶多肽且選擇性試劑為氨甲蝶呤。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，目的重組多肽為人Epo。
優(yōu)選地，重組多肽分泌到培養(yǎng)基中。通常，方法進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基中回收表達(dá)的目的重組多肽。備選地或另外地，也可從經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中回收重組多肽。
此外，此處描述了包含糖基化的重組人促紅細(xì)胞生成素的組合物，所述人促紅細(xì)胞生成素由本發(fā)明第四個(gè)方面的方法產(chǎn)生。
在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含(a)第一多核苷酸載體，該載體包含(i)編碼目的重組多肽的第一核苷酸序列，以及(ii)編碼選擇性標(biāo)記的第二核苷酸序列，其中當(dāng)宿主細(xì)胞與該選擇性試劑接觸時(shí)所述選擇性試劑能夠引起該第二核苷酸序列的擴(kuò)增，以及(b)第二多核苷酸載體，其核苷酸序列與第一多核苷酸載體的核苷酸序列基本相同，不同之處在于將第二核苷酸序列替換為編碼不同選擇性標(biāo)記的第三核苷酸序列。
目的重組多肽優(yōu)選地為人促紅細(xì)胞生成素。第二核苷酸序列優(yōu)選地編碼二氫葉酸還原酶。第三核苷酸序列優(yōu)選地編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。
本發(fā)明也提供了該組合物在產(chǎn)生真核宿主細(xì)胞的方法中的應(yīng)用，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)目的重組多肽。
在本發(fā)明的上下文中，如此處描述的優(yōu)選或特定實(shí)施方案能夠相互組合，由此導(dǎo)致其進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案。
發(fā)明詳述除非另外定義，此處應(yīng)用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與領(lǐng)域內(nèi)(如在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué)中)普通技術(shù)人員所通常理解的含義相同。分子、遺傳和生物化學(xué)方法(通常參見Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.以及Ausubel等，分子生物學(xué)簡(jiǎn)要方法(Short Protocols in MolecularBiology)(1999)第四版，John Wiley & Sons，Inc.-以及標(biāo)題為分子生物學(xué)當(dāng)前方法(Current Protocols in Molecular Biology)的全部版本，前述在此引用作為參考)以及化學(xué)方法應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。
定義如此處提及的真核宿主細(xì)胞可為真核細(xì)胞來源的任何細(xì)胞，無論其為原代細(xì)胞還是已建立的永生細(xì)胞，前述細(xì)胞可經(jīng)過調(diào)整以適于表達(dá)異源多肽。因此，在其最廣泛的實(shí)施方案中，該術(shù)語包括培養(yǎng)的原代細(xì)胞，器官培養(yǎng)中的組織和器官、組織移植物、完整的生物體和已建立的細(xì)胞系。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù)語指源自已建立細(xì)胞系的培養(yǎng)細(xì)胞，如CHO、BHK、COS和HeLa細(xì)胞。
如此處所指的表達(dá)為來自核酸編碼序列的多肽產(chǎn)物的產(chǎn)生，通常通過序列的轉(zhuǎn)錄/翻譯產(chǎn)生。表達(dá)的多肽可從宿主細(xì)胞分泌或可在其中積聚；優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)包括多肽從細(xì)胞中的分泌。表達(dá)水平可存在差異，但優(yōu)選地為高水平表達(dá)；細(xì)胞產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)中約1％，優(yōu)選地約10％、25％或50％或甚至更多可為目的表達(dá)多肽。
″重組多肽″可為通過重組核酸技術(shù)產(chǎn)生的任何所需多肽。如此處所應(yīng)用，術(shù)語″多肽″和″肽″是指這樣的多聚體，其單體為氨基酸并通過肽鍵或二硫鍵連接在一起。多肽是指全長(zhǎng)的天然存在的氨基酸鏈或″其片段″或″肽″，如目的多肽的選擇區(qū)域，或其部分或全部為非天然的氨基酸多聚體或其片段或肽。因此″其片段″是指全長(zhǎng)多肽中一部分的氨基酸序列，長(zhǎng)度在約8個(gè)到約500個(gè)氨基酸之間，優(yōu)選地在約8到約300之間，更優(yōu)選地在約8到約200個(gè)氨基酸之間，且甚至更優(yōu)選地長(zhǎng)度在約10到約50或100個(gè)氨基酸之間。多肽為Epo時(shí)，其片段長(zhǎng)度優(yōu)選地在約8到約150個(gè)氨基酸之間，優(yōu)選地在約15、20或30到約50、100或130個(gè)氨基酸之間?！咫摹迨侵付贪被嵝蛄?，其長(zhǎng)度為10-40個(gè)氨基酸，優(yōu)選地為10-35個(gè)氨基酸。此外，也可包括非天然氨基酸如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。通常遇到的非基因編碼的氨基酸也可用于本發(fā)明中。用于本發(fā)明的所有氨基酸可為D-或L-光學(xué)異構(gòu)體。L-異構(gòu)體為優(yōu)選。此外，其它肽模擬物也可應(yīng)用于如本發(fā)明多肽的接頭序列中(參見Spatola，1983，氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)和生物化學(xué)(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins)，Weinstein編輯，Marcel Dekker，New York，267頁)。
適宜的重組多肽包括用于制藥目的的蛋白質(zhì)、凝血因子如Epo，如因子VIII和因子IX，凝結(jié)劑如水蛭素，激素包括胰島素、人和動(dòng)物生長(zhǎng)激素、卵泡刺激素、促黃體激素，其它治療性蛋白質(zhì)如抗體，以及其它免疫球蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腫瘤抑制基因p53、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、干擾素、黑素瘤相關(guān)抗原或B7以及任何的需要表達(dá)特別是需要大量表達(dá)的其它蛋白質(zhì)。
″多核苷酸載體″為可用于將核酸編碼序列遞送到細(xì)胞基因組中以使序列在其中進(jìn)行整合的核酸載體。整合到宿主細(xì)胞基因組導(dǎo)致宿主細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化(與通常與游離載體維持相關(guān)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化相反)且可稱為″穩(wěn)定整合″。以下將更為詳細(xì)描述的多核苷酸載體可為質(zhì)粒、感染因子(病毒、病毒樣顆粒、病毒核酸)、粘粒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、經(jīng)包裝的DNA或適于遞送到細(xì)胞的任何其它形式的核酸。通常，應(yīng)用質(zhì)粒是由于其易于使用、為本領(lǐng)域內(nèi)所熟知以及沒有為感染因子如病毒所需的調(diào)節(jié)限制?！逭稀寤颉宸€(wěn)定整合″是指至少部分的載體核酸序列整合到宿主細(xì)胞基因組中或其維持在人工染色體中；優(yōu)選地至少第一和第二/第三核苷酸序列整合到宿主細(xì)胞基因組中。有利地，載體的全部序列整合到宿主細(xì)胞基因組中。
″轉(zhuǎn)化″此處指將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞以使遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，前述細(xì)胞稱作″經(jīng)轉(zhuǎn)化″細(xì)胞。為避免疑問，″轉(zhuǎn)化″并不指由癌基因或致癌病毒等使細(xì)胞獲得永生性。
″擴(kuò)增″是指對(duì)篩選壓力作出響應(yīng)而導(dǎo)致的編碼序列拷貝數(shù)的增加。因此，已知用MTX篩選時(shí)，作為響應(yīng)，異源dhfr基因在其整合到宿主細(xì)胞處進(jìn)行擴(kuò)增且拷貝數(shù)增加。與dhfr基因連接的序列(即物理上與其靠近的序列)與dhfr基因一同得以擴(kuò)增。這導(dǎo)致目的序列拷貝數(shù)的增加，且導(dǎo)致由其編碼的基因產(chǎn)物表達(dá)的提高。
除非減輕選擇性試劑作用的特定基因產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)，″選擇性試劑″通常為將細(xì)胞置于壓力或其它競(jìng)爭(zhēng)性不利條件下的因子。因此，氨甲蝶呤具有細(xì)胞毒性，但其毒性可由dhfr基因的基因產(chǎn)物二氫葉酸還原酶(DHFR)中和。常見的可擴(kuò)增系統(tǒng)包括二氫葉酸還原酶(DHFR)-氨甲蝶呤(MTX)、細(xì)菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(其介導(dǎo)對(duì)霉酚酸的抵抗)，并在正常功能基因存在下進(jìn)行擴(kuò)增(如在methionine sulfoximine[MSX]存在條件下擴(kuò)增谷氨酰胺合成酶)。這些系統(tǒng)的可擴(kuò)增性在于對(duì)相應(yīng)試劑施用產(chǎn)生的篩選壓力導(dǎo)致核酸自身可進(jìn)行擴(kuò)增。
通常認(rèn)為非可擴(kuò)增系統(tǒng)包括如這樣的抗生素抗性基因，即其編碼的基因產(chǎn)物賦予對(duì)抗生素如氨芐青霉素或G-418/新霉素的抗性。
根據(jù)本發(fā)明的載體除選擇性標(biāo)記外具有類似的序列。第一選擇性標(biāo)記為可擴(kuò)增基因；第二標(biāo)記不必為可擴(kuò)增基因。如此處所應(yīng)用，″基本相同″意指除選擇性標(biāo)記序列外的載體序列完全或幾乎相同。實(shí)際上，兩載體通常基于相同的起始載體，其中選擇性標(biāo)記基因被替換了。因此，除任何可能發(fā)生的自發(fā)改變之外，其余的序列可完全相同。優(yōu)選地，除包括其各自控制區(qū)的標(biāo)記基因外，序列的同一性可大于85％；優(yōu)選地同一性為90％；且優(yōu)選地同一性至少為95％、98％、99％或甚至完全相同。
A.多核苷酸載體用于產(chǎn)生宿主細(xì)胞的本發(fā)明方法包括導(dǎo)入兩個(gè)基本相同的載體，前述兩載體之間差異的本質(zhì)在于一個(gè)載體包含的編碼基因序列整合到宿主細(xì)胞染色體內(nèi)時(shí)會(huì)對(duì)篩選作出響應(yīng)而進(jìn)行擴(kuò)增，另一載體包含編碼如抗生素抗性基因的另一選擇性標(biāo)記的核苷酸序列。
優(yōu)選地，第二選擇性標(biāo)記并非具有如此的可擴(kuò)增性。
載體通常為DNA分子，盡管可為線性但載體一般為環(huán)型質(zhì)粒。載體可方便地包含原核細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)以使其可在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌中進(jìn)行繁殖。
第一載體包含第一核苷酸序列，該序列的本質(zhì)為能夠指導(dǎo)目的重組多肽(POI)如Epo在真核宿主細(xì)胞(通常為哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)盒。相應(yīng)地，該第一表達(dá)盒包含POI的實(shí)際編碼序列，該序列與能夠提供宿主細(xì)胞表達(dá)編碼序列的調(diào)控序列可操作地連接。術(shù)語″可操作地連接″意指描述的組分間的關(guān)聯(lián)使各組分能夠以特定的方式行使功能?！蹇刹僮鞯剡B接″到編碼序列的調(diào)控序列以這樣的方式進(jìn)行連接，即在與調(diào)控序列相容的條件下編碼序列獲得表達(dá)。
與編碼POI的序列可操作連接的調(diào)控序列包括啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控信號(hào)(包括轉(zhuǎn)錄終止子)?？蛇x擇與設(shè)計(jì)的表達(dá)載體所應(yīng)用的宿主細(xì)胞相容的這些調(diào)控序列。術(shù)語″啟動(dòng)子″為領(lǐng)域內(nèi)公知，且從最小啟動(dòng)子到包括上游元件和增強(qiáng)子的啟動(dòng)子其包含的核酸區(qū)域的大小和復(fù)制性均有所不同。
啟動(dòng)子通常選自在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子通常源自病毒或真核基因的啟動(dòng)子序列。例如，啟動(dòng)子可源自將發(fā)生表達(dá)的細(xì)胞的基因組。可優(yōu)選地應(yīng)用病毒啟動(dòng)子，這是由于此類啟動(dòng)子通常指導(dǎo)高水平的轉(zhuǎn)錄。示例包括SV40早期啟動(dòng)子及其活性片段、莫洛尼鼠白血病病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(MMLV LTR)啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動(dòng)子或人巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動(dòng)子。
由于載體可容易地在大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制，因此可優(yōu)選地包括大腸桿菌遺傳標(biāo)記和大腸桿菌的復(fù)制子起點(diǎn)。這些可從大腸桿菌質(zhì)粒中獲得，所述質(zhì)粒如pBR322、Bluescript載體或pUC質(zhì)粒，例如pUC18或pUC19，所述質(zhì)粒包含大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)和賦予抗生素抗性如氨芐青霉素抗性的大腸桿菌遺傳標(biāo)記。
啟動(dòng)子為可誘導(dǎo)型也是有利的，這樣POI的表達(dá)水平可在細(xì)胞的生命期內(nèi)進(jìn)行調(diào)控。可誘導(dǎo)意指可調(diào)控應(yīng)用啟動(dòng)子所獲得的表達(dá)水平。
可對(duì)調(diào)控序列進(jìn)行修飾，例如通過加入其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件如增強(qiáng)子序列進(jìn)行修飾，以使調(diào)控序列指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平更為有效地對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑作出反應(yīng)。也可應(yīng)用包含來自以上描述的兩種或多種不同啟動(dòng)子的序列元件的嵌合啟動(dòng)子。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，POI為促紅細(xì)胞生成素，特別是人Epo。人Epo的序列在GenBank中給出，登錄號(hào)為No.M 11319.1。但是，也需要修飾人Epo的序列以導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)用于連接碳水化合物的額外位點(diǎn)，如在美國專利號(hào)5,856,298中所描述的[Asn60]Epo、[Asn125，Ser127]Epo、[Thr125]Epo和[Pro124，Thr125]Epo。
第一載體也包含本質(zhì)上為表達(dá)盒的第二核苷酸序列，當(dāng)其整合入宿主細(xì)胞基因組時(shí)如果宿主細(xì)胞與引起核苷酸序列擴(kuò)增的選擇性試劑接觸，所述表達(dá)盒可進(jìn)行擴(kuò)增。真核細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，能夠?qū)Y選壓力作出響應(yīng)而擴(kuò)增特定的基因，這導(dǎo)致該基因拷貝數(shù)的增加且依次提高了基因的表達(dá)水平，所述篩選壓力通常為酶抑制劑。額外的基因拷貝可維持在染色體內(nèi)，或以染色體外遺傳物質(zhì)形式存在，所述染色體外遺傳物質(zhì)如微小染色體(綜述參見基因VI，Lewin，1997，Oxford University Press，Oxford U.K.，975-978頁)。一個(gè)充分表征的實(shí)例是對(duì)氨甲蝶呤(MTX)作出響應(yīng)而進(jìn)行擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因。其它實(shí)例包括CAD基因(編碼的蛋白質(zhì)參與UMP合成的頭三個(gè)步驟)，所述基因?qū)D(zhuǎn)氨甲酰酶的抑制劑作出響應(yīng)而進(jìn)行擴(kuò)增，以及對(duì)methionine sulphoximine作出響應(yīng)而進(jìn)行擴(kuò)增的谷氨酰胺合成酶(參見WO87/04462)。
該第二表達(dá)盒與第一表達(dá)盒的情形一樣，包含能夠被擴(kuò)增的基因的實(shí)際編碼序列，所述編碼序列與可提供宿主細(xì)胞表達(dá)該編碼序列的調(diào)控序列可操作地連接。適宜的調(diào)控序列如上描述。第一和第二核苷酸序列中的調(diào)控序列可相同或不同。
第二載體與第一載體基本相同，不同處在于對(duì)篩選壓力作出響應(yīng)而進(jìn)行擴(kuò)增的編碼基因(例如，dhfr)的編碼序列替換為選擇性標(biāo)記，所述選擇性標(biāo)記通常為編碼提供抗生素抗性的多肽的核苷酸序列，如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列。其它抗生素抗性基因包括編碼嘌呤霉素或潮霉素抗性的基因。
本發(fā)明的關(guān)鍵特征是，兩個(gè)載體的本質(zhì)區(qū)別之處僅在于其具有第二還是第三核苷酸序列。并不希望被理論所束縛，認(rèn)為兩載體間的充分同一性促進(jìn)了編碼目的重組多肽的第一核苷酸序列的擴(kuò)增。編碼選擇性標(biāo)記的第三核苷酸序列用作培養(yǎng)基中初選的標(biāo)記，而對(duì)篩選壓力作出響應(yīng)繼而進(jìn)行擴(kuò)增的第二核苷酸序列可導(dǎo)致整合序列的擴(kuò)增，所述整合序列包括編碼目的重組多肽的第一核苷酸序列。
但是，由于可允許存在輕度的差異，第二/第三核苷酸序列外的載體區(qū)域并非必須100％一致。例如，兩載體除第二/第三核苷酸序列之外的序列同一性通常至少為95％、98％或99％。
然而，應(yīng)用除第二/第三核苷酸序列之外的序列完全相同的載體更為便利，這是因?yàn)閷?shí)際上正是應(yīng)用相同的載體作為克隆第一和第二載體的基礎(chǔ)。例如，可應(yīng)用缺乏第二和第三核苷酸序列但含有適宜克隆位點(diǎn)的載體來產(chǎn)生克隆載體，其中選擇的第二或第三核苷酸序列可插入到前述的載體中。
B.表達(dá)目的重組蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞的產(chǎn)生可應(yīng)用任何適宜的技術(shù)將第一和第二多核苷酸載體導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞。例如，一些已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)可提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)核酸的攝入，所述轉(zhuǎn)染技術(shù)如電穿孔或那些包括應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑的技術(shù)。這些試劑的示例包括陽離子試劑(例如磷酸鈣和DEAE-葡聚糖)以及脂質(zhì)體(lipofectant)(例如lipofectamTM和transfectamTM)。通常，載體與轉(zhuǎn)染試劑混合以產(chǎn)生組合物?？赡苄枰^第一載體過量的第二載體。例如，第一和第二載體可以從1∶5到1∶100(第一∶第二)的比例進(jìn)行混合，更特別地比例為從1∶10到1∶50。
優(yōu)選的宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如嚙齒動(dòng)物或人細(xì)胞，包括CHO、BHK、COS和HeLa細(xì)胞。細(xì)胞特別優(yōu)選地為CHO細(xì)胞。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞最初缺乏存在于第二核苷酸序列中的基因(例如，dhfr)。缺乏dhfr的CHO細(xì)胞由以下描述Urlaub和Chasin，1980，PNAS 774216-4220，并可從ATCC獲得，目錄號(hào)為ATCC CRL-9096。這些細(xì)胞已根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，Md.20852，USA，2001年8月29日保藏，保藏號(hào)為ATCC PTA-3672?？捎糜诒景l(fā)明的DNA構(gòu)建體和方法中的永生人細(xì)胞系的示例進(jìn)一步包括但不限于HT1080細(xì)胞(ATCC CCL 121)、HeLa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的衍生細(xì)胞(ATCC CCL 2，2.1和2.2)、MCF-7乳腺癌細(xì)胞(ATCC BTH 22)、K-562白血病細(xì)胞(ATCC CCL 243)、KB癌細(xì)胞(ATCC CCL 17)、2780AD卵巢癌細(xì)胞(Van der Blick，A.M.等，癌癥研究(Cancer Res)，485927-5932(1988)、Raii細(xì)胞(ATCC CCL 86)、WiDr結(jié)腸腺癌細(xì)胞(ATCC CCL 218)、SW620結(jié)腸腺癌細(xì)胞(ATCC CCL 227)、Jurkat細(xì)胞(ATCC TIB 152)、Namalwa細(xì)胞(ATCC CRL 1432)、HL-60細(xì)胞(ATCC CCL 240)、Daudi細(xì)胞(ATCCCCL 213)、RPML 8226細(xì)胞(ATCC CCL 155)、U-937細(xì)胞(ATCC CRL1593)、Bowes黑素瘤細(xì)胞(ATCC CRL 9607)、WI-38VA13亞系2R4細(xì)胞(ATCC CLL 75.1)和MOLT-4細(xì)胞(ATCC CRL 1582)，以及通過將人細(xì)胞與其它物種的細(xì)胞融合產(chǎn)生的異種雜交瘤細(xì)胞。其次，也可應(yīng)用人成纖維細(xì)胞株如WI-38(ATCC CCL 75)和MRC-5(ATCC CCL 171)。
可在微量滴定板中方便地進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但也可應(yīng)用其它培養(yǎng)容器。轉(zhuǎn)染后，通常將細(xì)胞培養(yǎng)在篩選培養(yǎng)基中(即用于篩選表達(dá)選擇性標(biāo)記細(xì)胞的培養(yǎng)基)進(jìn)行匯片，且然后培養(yǎng)在含導(dǎo)致第二核酸序列擴(kuò)增的選擇性試劑的擴(kuò)增培養(yǎng)基中，所述選擇性試劑如MTX。通常，在為MTX的情況下，該試劑以約48nM(4.8×10-8M)的濃度存在。
然后篩選克隆，所述克隆通常培養(yǎng)在相同或類似濃度的選擇性試劑中并通過如ELISA和/或免疫熒光篩選重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。然后根據(jù)篩選結(jié)果選擇產(chǎn)量最高的克隆。
理想的情況是，對(duì)篩選的克隆進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)以確定其生長(zhǎng)特性、染色體穩(wěn)定性、重組蛋白質(zhì)產(chǎn)率以及重組蛋白質(zhì)的活性。
可通過如觀察細(xì)胞形態(tài)和/或進(jìn)行DNA含量分析測(cè)定染色體的穩(wěn)定性，所述DNA含量分析如Coulter計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞核DNA分析。通常，具有較大細(xì)胞核的克隆的染色體大于二倍體染色體組。這些克隆的穩(wěn)定性可能較低且通常被棄用。優(yōu)選的克隆其細(xì)胞核DNA含量與轉(zhuǎn)染和篩選前的親本宿主細(xì)胞胞核DNA含量基本相同。
可通過對(duì)細(xì)胞和/或培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE/Western印跡來測(cè)試重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，其中所述培養(yǎng)上清中存在分泌蛋白質(zhì)(如用于Ep0的例子)。可應(yīng)用一系列的MTX(或其它的適宜試劑)進(jìn)行測(cè)試。值得注意的是不僅要考慮蛋白質(zhì)的量也要考慮蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)(特別是當(dāng)產(chǎn)生多種同種型如不同糖基化的同種型時(shí)，如為Epo的例子)。
本發(fā)明的方法優(yōu)選地進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)亞克隆步驟，其中篩選的克隆置于其濃度逐漸增加的引起第二核苷酸序列擴(kuò)增的選擇性試劑中。當(dāng)為dhfr和MTX的情況下，通常初始克隆步驟應(yīng)用濃度為10-8M的MTX，且其濃度逐漸提高到10-6M。
這樣，在進(jìn)一步的亞克隆步驟中，測(cè)試在系列濃度的選擇性試劑(如MTX)存在條件下培養(yǎng)的細(xì)胞克隆，并確定重組蛋白質(zhì)的滴度。然后進(jìn)行亞克隆，進(jìn)行該步驟的優(yōu)選濃度為或高于這樣的濃度，即該濃度與較低濃度相比蛋白質(zhì)產(chǎn)量并未顯著增加。在為Epo和CHO細(xì)胞的情況下，該濃度為約380nM(3.8×10-7M)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)在濃度漸進(jìn)提高的接近最高所需濃度的試劑中。
然后可進(jìn)一步對(duì)亞克隆進(jìn)行試驗(yàn)以確定其特性，如以上所描述。任選地，可進(jìn)行進(jìn)一步的亞克隆步驟，通常用濃度提高的選擇性試劑(如MTX)進(jìn)行亞克隆。在實(shí)施例中，在1.54μM(1.54×10-6M)的MTX存在條件下進(jìn)行亞克隆步驟。在其它例子中，MTX濃度可提高到10μM(1×10-5M)或甚至更高。
優(yōu)選地，本發(fā)明篩選的表達(dá)Epo的宿主細(xì)胞為當(dāng)應(yīng)用濃度為7.7×10-7M或1.54×106M的MTX時(shí)其表達(dá)Epo的速率大于10μg/106個(gè)細(xì)胞/天，更優(yōu)選地大于20、25或30μg/106個(gè)細(xì)胞/天。同樣優(yōu)選地，本發(fā)明的宿主細(xì)胞其細(xì)胞核DNA含量與轉(zhuǎn)染前的親本宿主細(xì)胞基本相同(如CHO dhfr-細(xì)胞)。
使本發(fā)明的宿主細(xì)胞適應(yīng)無血清的培養(yǎng)基可能也是需要的，所述適應(yīng)通常在最終的亞克隆步驟后進(jìn)行。將種子細(xì)胞培養(yǎng)至匯片并將培養(yǎng)基置換成無血清培養(yǎng)基或幾次傳代后逐漸將血清濃度降至零可獲得上述的適應(yīng)。優(yōu)選地，也將細(xì)胞適應(yīng)為懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)。
應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可將篩選的宿主細(xì)胞系凍存于液氮中。
C.蛋白質(zhì)的產(chǎn)生本發(fā)明的宿主細(xì)胞可用于表達(dá)目的重組蛋白質(zhì)如rhEpo。應(yīng)用轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞表達(dá)多肽的方法為本領(lǐng)域內(nèi)公知?？蛇x擇培養(yǎng)條件以實(shí)現(xiàn)從第一核苷酸序列表達(dá)目的多肽。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地應(yīng)用懸浮培養(yǎng)方法或滾動(dòng)瓶培養(yǎng)方法。用于表達(dá)目的多肽的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)可在存在或不存在選擇性試劑(即MTX或適宜的等效物)的條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中。
根據(jù)需要可從適宜的培養(yǎng)上清或培養(yǎng)細(xì)胞塊中回收重組蛋白質(zhì)(在Epo表達(dá)的例子中為從培養(yǎng)上清回收)。然后，通常對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)的純化步驟(參見如Broudy等，1988，生物化學(xué)和生物物理學(xué)通訊(Archives of Biochemistry and Biophysics)265329-336；Ghanem等，1994，Preparative Biochemistry，24(2)127-142)，所述純化步驟如親和層析和/或離子交換層析。
優(yōu)選地，在包含由本發(fā)明宿主細(xì)胞表達(dá)并純化的重組多肽的組合物中，重組多肽基本為純化形式，例如純度至少為90％、95％或99％。
可體內(nèi)和/或體外測(cè)定純化蛋白質(zhì)的生物活性。一適宜的體外試驗(yàn)如下描述Hammering等，1996，藥物生物醫(yī)學(xué)年度雜志(J Pharm Biomed Anal)14(11)1455-69，其中涉及類紅細(xì)胞系細(xì)胞增殖刺激試驗(yàn)。一適宜的體內(nèi)試驗(yàn)如下描述Ghanem等，1994，同上，其中涉及測(cè)定59Fe摻入到患紅細(xì)胞增多癥小鼠的紅細(xì)胞中。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的細(xì)胞通過以下方法培養(yǎng)(a)提供宿主細(xì)胞，其包含編碼目的重組多肽的核苷酸序列和指導(dǎo)目的重組多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)的核苷酸序列；(b)提供無血清培養(yǎng)基，其包含(i)水、植物來源的蛋白胨、摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)劑、緩沖液、能源、氨基酸、脂源或前體物、鐵源、非鐵金屬離子、一種或多種維生素和輔因子；以及(ii)不包含任何的全長(zhǎng)多肽；以及(c)在允許目的重組多肽表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
目的重組多肽優(yōu)選地為促紅細(xì)胞生成素。宿主細(xì)胞可為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。該技術(shù)在此說明書的實(shí)施例部分中進(jìn)行描述。
可通過以下方法從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化促紅細(xì)胞生成素(a)通過離心從細(xì)胞培養(yǎng)物中移除宿主細(xì)胞、細(xì)胞組分和碎片以獲得清澈的培養(yǎng)物上清，所述離心應(yīng)用圓盤層疊分離器(disc stack separator)并隨后進(jìn)行深度過濾步驟；(b)將上清的傳導(dǎo)率調(diào)整到5mS/cm或更小，并將pH調(diào)整到約7.0和8.0之間；(c)將來自步驟(b)的上清加到含陰離子交換層析介質(zhì)的柱子，洗柱子，從柱子中洗脫rhEpo并收集含rhEpo的峰級(jí)分(s)；(d)將來自步驟(c)的合并峰級(jí)分進(jìn)行反向?qū)游?，所述層析?yīng)用的樹脂可在低介質(zhì)壓力(＜10巴)下應(yīng)用并可抵抗高濃度的NaOH，應(yīng)用線性梯度的有機(jī)溶劑洗脫rhEpo；(e)將步驟(d)中洗脫的一個(gè)或多個(gè)含rhEpo的級(jí)分加到含陰離子交換層析介質(zhì)的柱子，洗滌柱子，并應(yīng)用線性鹽梯度洗脫rhEpo；(f)篩選步驟(e)中洗脫的含rhEpo的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，所述篩選基于rhEpo唾液酸化的程度；以及(g)應(yīng)用凝膠過濾介質(zhì)將步驟(f)中洗脫的含rhEpo的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分進(jìn)行一次或多次的大小排阻層析步驟，以移除潛在的二聚體和更大的聚合體；以及收集含rhEpo的洗液。
優(yōu)選地，步驟(c)中應(yīng)用的陰離子交換介質(zhì)為基于陶瓷的離子交換介質(zhì)Q-HyperD FTM，所述介質(zhì)可從BioSepra獲得。步驟(d)中應(yīng)用的聚苯乙烯樹脂優(yōu)選地為Source 30RPCTM(Pharmacia)，而步驟(e)中應(yīng)用的陰離子交換介質(zhì)優(yōu)選地為Pharmacia Q Sepharose High PerformanceTM。步驟(g)中應(yīng)用的凝膠過濾介質(zhì)優(yōu)選地為Pharmacia Superdex75 prep gradeTM。
此類方法在本說明書的實(shí)施例部分中描述。
以以下的實(shí)施例為參考對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，所述實(shí)施例僅作為示例的目的并非構(gòu)成本發(fā)明的限制。特別是，實(shí)施例涉及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例材料宿主細(xì)胞系二氫葉酸還原酶缺失的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(ATCC CRL-9096)。這些細(xì)胞已根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國類型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，Md.20852，USA，于2001年8月29日保藏，保藏號(hào)為ATCCPTA-3672。
細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)用培養(yǎng)基補(bǔ)充以L-谷氨酰胺(4mM)、10％FCS、HT(次黃嘌呤，胸腺嘧啶核苷)的DMEM，1x篩選培養(yǎng)基補(bǔ)充以L-谷氨酰胺(4mM)、經(jīng)透析的FCS(10％)和G418(0.5mg/ml)的DMEM擴(kuò)增培養(yǎng)基補(bǔ)充以L-谷氨酰胺(4mM)、經(jīng)透析的FCS(10％)、G418(0.5mg/ml)和4.8×10-8M-1.54×10-6M MTX(氨甲蝶呤)的DMEM凍存用培養(yǎng)基補(bǔ)充以L-谷氨酰胺(4mM)、FCS(10％)和DMSO(10％)的DMEM用于重組細(xì)胞系的無血清適應(yīng)培養(yǎng)基1∶1DMEM/Ham′s F12，補(bǔ)充有L-谷氨酰胺(6mM)、大豆蛋白胨/UF(0.25％)、雜交瘤細(xì)胞添加物(1x)、Pluronic-F68(0.1％)、G418(0.5mg/ml)、MTX(1.54×10-6M)無血清生產(chǎn)培養(yǎng)基1∶1 DMEM/Ham′s F12，補(bǔ)充以大豆蛋白胨/UF(0.25％)、雜交瘤細(xì)胞添加物(1x)、Lutrol(0.1％)、MTX(1.54×10-6M)、葡萄糖(1g/l)、NaHCO3(2.5g/l)用于重組細(xì)胞系的無血清凍存培養(yǎng)基PBS、PVP-10(20％)、DMSO(5％)、雜交瘤細(xì)胞添加物(100x)、乙醇胺-2.5×10-3M、檸檬酸鐵-2.5×10-2M、L-抗壞血酸-2.0×10-3M、亞硒酸鈉-5.0×10-6M質(zhì)粒構(gòu)建體pEpo/neo該質(zhì)粒編碼Epo的編碼區(qū)以及編碼新霉素抗性基因，前述兩編碼序列作為兩個(gè)不同的表達(dá)盒置于SV40早期啟動(dòng)子/終止子序列的調(diào)控之下。構(gòu)建細(xì)節(jié)在實(shí)施例1中提供。
pEpo/dhfr
該質(zhì)粒編碼Epo和dhfr的編碼區(qū)，前述兩編碼序列作為兩個(gè)不同的表達(dá)盒置于SV40早期啟動(dòng)子/終止子序列的調(diào)控之下。構(gòu)建細(xì)節(jié)在實(shí)施例2中提供。
細(xì)胞培養(yǎng)方法CHO-dhfr的培養(yǎng)二氫葉酸還原酶缺失的CHO細(xì)胞(Urlaub等，1980，PNAS 77(7)4216-4220)(稱作CHO dhfr)培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)用培養(yǎng)基中，每周以1∶10的比率傳代兩次。
CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染進(jìn)行脂質(zhì)體(lipofectin)轉(zhuǎn)染前一日將細(xì)胞以1-5×104個(gè)細(xì)胞/cm2接種到25cm2的T-形瓶或96孔板。將相應(yīng)的質(zhì)粒以適宜的比例混合，根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明加入lipofectin試劑(GIBCO/BRL)(0.5-1μl/cm2)。用轉(zhuǎn)染混合物在無血清DMEM中覆蓋細(xì)胞4到16小時(shí)，然后將含DNA的培養(yǎng)基替換為培養(yǎng)用培養(yǎng)基。在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24到48小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成篩選培養(yǎng)基。首先將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)至匯片，然后培養(yǎng)在擴(kuò)增培養(yǎng)基(4.8×10-8M MTX)中，之后通過ELISA篩選細(xì)胞培養(yǎng)上清的Epo產(chǎn)生。確定產(chǎn)量最高的細(xì)胞，將MTX濃度提高兩倍并選擇最佳細(xì)胞用于進(jìn)一步的培養(yǎng)。
分析方法在不同介質(zhì)中檢測(cè)Epo的ELISA法抗體多克隆血清兔抗Epo，生物素標(biāo)記的(R & D系統(tǒng)；目錄號(hào)AB-286-NA)單克隆抗體小鼠抗Epo(Genezyme；目錄號(hào)AE7A5)ELISA緩沖液包被緩沖液8.4g/lNaHCO3，4.2g/lNa2CO3，pH9.6-9.8洗滌緩沖液0.2g/l KCl，1.15g/l Na2HPO4x2H2O，0.2g/l KH2PO4，8g/lNaCl，0.1％吐溫20
稀釋緩沖液2％PVP(Sigma目錄號(hào)PVP-4OT)，溶于洗滌緩沖液中樣本緩沖液溶于稀釋緩沖液中的0.5％α單-硫代-甘油染色緩沖液7.3g/l檸檬酸x2H2O，11.86g/l Na2HPO4x2H2O，pH4.8-5.0染色溶液100μl OPD溶液/10ml染色緩沖液，5μl H2O2/10ml染色緩沖液OPD儲(chǔ)存溶液PPL0017方法應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)ng/ml濃度范圍的Epo，特別是具有的檢出限為約10ng/ml范圍，開始用500ng/ml并進(jìn)行8次兩倍稀釋。針對(duì)Epo頭26個(gè)氨基酸的單克隆抗體用作結(jié)合Epo的包被層。下一步中Epo由捕獲抗體特異結(jié)合。通過生物素標(biāo)記的識(shí)別Epo的免抗血清進(jìn)行檢測(cè)。鏈親和素-過氧化物酶偶聯(lián)到平板后用OPD染色以進(jìn)行顯色。
免疫熒光表達(dá)Epo的CHO細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/200μl接種到6孔板中的蓋玻片上并孵育24-72小時(shí)。用PBS洗滌吸附細(xì)胞兩次并于-20℃用甲醇固定5分鐘，然后空氣干燥且隨后再次浸泡在PBS中。用含20％FCS的PBS孵育15分鐘以飽和非特異蛋白質(zhì)，然后用抗-Epo孵育1小時(shí)。與FITC連接的抗小鼠IgG反應(yīng)進(jìn)行顯色。通過共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光，檢測(cè)用的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm且發(fā)射波長(zhǎng)大于515nm。
核大小測(cè)定材料Coulter Counter；Model ZM(Coulter Electronics Inc.)Coulter ChannelyzerModel 256孵育溶液檸檬酸(0.1M)，Triton X 100(2％)Electrolyte Isoton II(目錄號(hào)844 8011；Coulter Euro DiagnosticGmbH)Coulter Counter可確定懸浮于導(dǎo)電溶液中的粒子的大小和數(shù)量。用真空器通過兩側(cè)帶有電極的毛細(xì)管真空吸附液體。阻力的變化誘導(dǎo)產(chǎn)生可由Coulter Channelizer計(jì)數(shù)的電壓脈沖。核大小與細(xì)胞的DNA含量相關(guān)，因此可由其將二倍體和多倍體染色體區(qū)別開來。
方法將約1×106個(gè)CHO-細(xì)胞用PBS洗滌一次，重懸在2ml的孵育溶液中并放置4-5小時(shí)。以下步驟特異用于Coulter Counter。
SDS聚丙烯酰胺電泳和Western印跡材料SDS凝膠Novex Tris-甘氨酸4-20％樣本緩沖液Tris甘氨酸SDS 2x(Novex LC 2676)跑膠緩沖液Tris甘氨酸SDS(Novex LC 2675)印跡緩沖液Na2B4O7×10H2O，50mM，SDS，0.1％，甲醇，20％印跡基材PVDF Immobilon P 0.45μM Millipore；K8JM8238H洗滌緩沖液參見ELISA洗滌緩沖液稀釋緩沖液1％的奶粉溶于洗滌緩沖液中檢測(cè)緩沖液NaCl，0.1M Tris-HCl 0.1M pH9.5方法在含1％α-MTG的1x樣本緩沖液中將含Epo的樣本調(diào)整為30ng/20μl并加樣到SDS凝膠上。跑膠結(jié)束時(shí)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印PVDF immobilon膜2小時(shí)，然后用檢測(cè)Epo頭26個(gè)氨基酸的單克隆抗體對(duì)Epo進(jìn)行特異染色。用與堿性磷酸酶連接的抗小鼠IgG和NBT/BCIP染色進(jìn)行顯色。
等電子聚焦材料系統(tǒng)Multiphor II，Amersham BiosciencesIPG凝膠pH2.5-7再膨脹緩沖液9g尿素，0.5g CHAPS，0.04g DTE，0.5ml resolyte(pH3.5-10)，10μl溴酚藍(lán)(0.1％)，用水調(diào)整到25ml樣本緩沖液IPG樣本緩沖液pH3-10，25μl溶于625μl的水中印跡緩沖液2.93g甘氨酸，5.81g Tris，20ml甲醇，0.375g SDS，用水調(diào)整到1000ml印跡基材PVDF Immobilon P 0.45μM Millipore；K8JM8238H洗滌緩沖液參見ELISA洗滌緩沖液稀釋緩沖液1％的奶粉溶于洗滌緩沖液檢測(cè)緩沖液NaCl，0.1M，Tris-HCl 0.1M pH9.5方法含Epo的樣本調(diào)整到500-1000ng/50μl，脫鹽，在樣本緩沖液中1∶1稀釋并加到再膨脹的IPG凝膠上。跑膠條件首先為300V1分鐘，然后線性提高到3500V并最終于3500V進(jìn)行1小時(shí)。在整個(gè)調(diào)焦過程中，設(shè)定的界限為10mA和10W。之后通過過夜擴(kuò)散或通過電轉(zhuǎn)印將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF Immobilon膜上，然后用檢測(cè)Epo頭26個(gè)氨基酸的單克隆抗體對(duì)Epo進(jìn)行特異染色。用AP連接的抗小鼠IgG和NBT/BCIP染色進(jìn)行顯色。
DNA含量測(cè)定通過FACS分析將重組細(xì)胞系和CHO-dhfr-宿主細(xì)胞系的DNA含量進(jìn)行比較。
材料洗滌緩沖液0.1M Tris-HCl，pH7.4，2mM MgCl2，0.1％ Triton X100染色緩沖液溶于洗滌緩沖液中的0.3μg/ml DAPI(Hoechst)方法用PBS洗滌5×105個(gè)細(xì)胞并用冰冷的70％乙醇進(jìn)行固定。之后用洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，然后在染色緩沖液中室溫孵育30分鐘。用FACSVantage(Becton and Dickinson)以359nm激發(fā)和450nm發(fā)射條件測(cè)定DNA含量。
體外特異性試驗(yàn)人紅白血病細(xì)胞系TF-1(德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures))的生長(zhǎng)依賴于IL3或hGM-CSF。這些細(xì)胞因子對(duì)增殖顯示出協(xié)同效應(yīng)，而Epo可將生活力維持一段時(shí)間。細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)在含GM-CSF和Epo的培養(yǎng)用培養(yǎng)基中。
試驗(yàn)補(bǔ)充培養(yǎng)用培養(yǎng)基RPML 1640，補(bǔ)充以4mM Gln、10％ FCS、20μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、10μMβ巰基乙醇、12ng/ml rhGM-CSF、3U/ml rhEpo試驗(yàn)用培養(yǎng)基RPML 1640，補(bǔ)充以4mM Gln、100μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、2mg/ml BSA方法在96孔板中用MTT存活力試驗(yàn)進(jìn)行功能性測(cè)試(Hammerling等，1996，藥物生物醫(yī)學(xué)年度雜志(J Pharm Biomed Anal)14(11)1455-69)。將樣本1∶2稀釋8次。試驗(yàn)用培養(yǎng)基中Epo的初始濃度為100ng/ml。將50μl的每一樣本稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)稀釋液或空白轉(zhuǎn)移到96孔試驗(yàn)平板上。用冷PBS洗滌TF-1細(xì)胞三次并在試驗(yàn)用培養(yǎng)基中將其調(diào)整為每毫升2×105個(gè)細(xì)胞。96孔試驗(yàn)平板中每一孔覆蓋以50μl的細(xì)胞懸液并將這些細(xì)胞在CO2孵箱中放置72小時(shí)。之后加入10μl的MTT溶液(6mg/ml，溶于PBS)并于37℃孵育4小時(shí)。用100μl的SDS/HCl(10％SDS，溶于0.1M HCl)于暗處溶解染料4小時(shí)并在550/690nm處光度測(cè)定Epo依賴的存活力。
實(shí)施例1-質(zhì)粒Epo/neo的構(gòu)建1.p2-neo的構(gòu)建1.1從含SV40早期啟動(dòng)子的pSV2neo中制備載體片段載體構(gòu)建的基礎(chǔ)為包含在pSV2neo中的pBR322載體骨架。較小的EcoRI-PvuII限制性片段包含該pBR322骨架，且鄰近的來自SV40的PvuII-HindIII片段攜帶SV40早期啟動(dòng)子的相應(yīng)片段。
用限制性酶EcoRI和HindIII切割質(zhì)粒pSV2neo(ATCC 37149)。產(chǎn)生的兩片段的大小為3092bp和2637bp。2637bp的片段由包括pBR322骨架的EcoRI-PvuII限制性片段和鄰近的含有SV40早期啟動(dòng)子的PvuII-HindIII片段組成。通過凝膠電泳制備并純化2637bp的片段。
1.2新霉素抗性基因的制備
neo基因取自pSV2neo的轉(zhuǎn)位子Tn5。其被擴(kuò)增為僅含有基因編碼區(qū)的片段。作為克隆策略的一部分，在兩末端導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。HindIII位點(diǎn)設(shè)于上游擴(kuò)增引物，EcoRI和SpeI位點(diǎn)位于下游引物。擴(kuò)增的區(qū)域與pSV2neo序列(Genbank登錄號(hào)U02434)中2846到1938位核苷酸對(duì)應(yīng)。寡核苷酸按如下設(shè)計(jì)Oligo2004-01長(zhǎng)度38mer5′-ggg gga agc ttg ttg gga agc cctgca aag taa act gg-3′SEQ.ID.No.15′HindIIIaagctt-g(＝pSV2neo中的2846位)ttgggaagccctg............ SEQ.ID.No.2Oligo2004-02長(zhǎng)度42mer5′-ggg gaa ttcactagtgag tcc cgc tca gaa gaa ctcgtcaag-3′SEQ.ID.No.35′ /SpeI actagt-g(＝pSV2neo中的1938位)agtcccgctcagaa...... SEQ.ID.No.4應(yīng)用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通過PCR制備引物2004-01和2004-02的擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR法的參數(shù)為在提供的緩沖液中加入20ng的pSV2neo、10pmol的每一引物、10mmol的dNTPs、2.5U的Pwo聚合酶，總體積為50μl；溫度參數(shù)95℃5分鐘，35循環(huán)的(95℃30秒，65℃20秒，72℃90秒)，72℃3分鐘，于4℃冷卻待用。
用DNA分離柱子(Mini，Wizard Promega GmbH)純化產(chǎn)生的935bp的DNA片段，用EcoRI和HindIII消化，并通過瓊脂糖凝膠純化并應(yīng)用Spin柱子(Supelco)洗脫。
1.3p1-neo的構(gòu)建應(yīng)用Ligation Express(Clontech)將擴(kuò)增的EcoRI-HindIII neo基因片段與來自pSV2-neo的EcoRI-HindIII載體片段連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主(E.coli SURE(Stratagene))中。在補(bǔ)充有50mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。
從克隆中分離質(zhì)粒DNA并應(yīng)用Ec0RI和Nc0I限制性分析對(duì)其進(jìn)行鑒定(3個(gè)片段分別為2527bp、780bp和251bp)。測(cè)定顯示預(yù)期片段的質(zhì)粒DNA構(gòu)建體的相關(guān)部分的序列以進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。經(jīng)證實(shí)含有SV40早期啟動(dòng)子和新霉素抗性基因的質(zhì)粒DNA被命名為p1-neo。
1.4SV40終止區(qū)SV40LTpolyA/IVS的制備設(shè)計(jì)PCR引物以擴(kuò)增pSV2neo中SV40終止區(qū)的片段(751到1598位核苷酸)。上游引物也含有SpeI限制性位點(diǎn)。除了已包括在pSV2-neo中751位的BamHI位點(diǎn)，在下游引物中導(dǎo)入一EcoRI位點(diǎn)，該ECoRI位點(diǎn)由來自BamHI位點(diǎn)的6個(gè)核苷酸間插區(qū)隔開。兩引物的序列如下Oligo2004-05長(zhǎng)度40mer5′-ggg gactagttt gtg aag gaa cct tac ttc tgt ggt gtg a-3′ SEQ.ID.No.55′SpeIactag-t(＝pSV2neo中的1598位)ttgtgaagga............. SEQ.ID.No.6Oligo2004-06長(zhǎng)度46mer5′-ggg ggaattcgg agg gggatccag aca tga taa gat aca ttg atg a-3′SEQ.ID.No.75′ /BamHI -g(＝pSV2neo中的751位)gatccagacatgataag.... SEQ.ID.No.8應(yīng)用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通過PCR制備上述引物2004-05+2004-06的擴(kuò)增產(chǎn)物。應(yīng)用DNA分離柱子純化產(chǎn)生的873bp的DNA片段，用EcoRI和SpeI消化并用凝膠進(jìn)行純化。
1.5p2-neo的制備用EcoRI+SpeI消化p1-neo質(zhì)粒DNA。純化產(chǎn)生的線性片段，與含SV40LTpolyA/IVS的擴(kuò)增片段連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主。在補(bǔ)充有50mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。
從克隆中分離質(zhì)粒DNA并應(yīng)用以下酶限制性分析進(jìn)行鑒定EcoRI(1個(gè)4411bp的片段)和NcoI(2個(gè)大小為3631bp和780bp的片段)和SphI(3個(gè)大小為3499bp、840bp和72bp的片段)。測(cè)定顯示預(yù)期片段的質(zhì)粒DNA構(gòu)建體的相關(guān)部分的序列以進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。經(jīng)證實(shí)含有SV40LTpolyA/IVS的質(zhì)粒DNA被命名為p2-neo。
2.質(zhì)粒p3的構(gòu)建2.1SV40早期啟動(dòng)子片段的制備應(yīng)用質(zhì)粒pSV2neo作為SV40早期啟動(dòng)子片段的來源。該片段大小與用于構(gòu)建p2質(zhì)粒的片段基本相同。但是，該片段末端經(jīng)過修飾以導(dǎo)入BamHI和NotI識(shí)別位點(diǎn)。用于擴(kuò)增該啟動(dòng)子的寡核苷酸引物按如下設(shè)計(jì)Oligo2004-07長(zhǎng)度38mer5′-ggg gggatcctg tgg aat gtg tgt cag tta ggg tgt gg-3′ SEQ.ID.No.95′BamHIggatcc-t(＝pSV2neo中的3435位)gtggaat.............SEQ.ID.No.10Oligo2004-08長(zhǎng)度46mer5′-ggg ggcggccgcagc ttt ttg caa aag cct agg cct cca aaa aag c-3′ SEQ.ID.No.115′NotIgcggccgc-a(＝pSV2neo中的3093位)gctttttgcaaaag.... SEQ.ID.No.12應(yīng)用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通過PCR制備上述引物2004-07+2004-08的擴(kuò)增產(chǎn)物。應(yīng)用DNA分離柱子純化產(chǎn)生的365bp的DNA片段，用BamHI和NotI消化并用凝膠進(jìn)行純化。
2.2pBluescript載體部分的制備分別用BamHI和NotI依次消化pBluescript II SK+DNA。應(yīng)用堿性磷酸酶對(duì)DNA進(jìn)行去磷酸化。連接前通過瓊脂糖凝膠電泳從小片段中純化出BamHI/NotI片段。
2.3質(zhì)粒p3的制備和確認(rèn)將擴(kuò)增的含SV40早期啟動(dòng)子的BamHI-NotI片段與制備的pBluescript II SK+載體連接，所述連接應(yīng)用T4 DNA連接酶(PromegaGmbH)。從補(bǔ)充以100mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的克隆中分離并純化來自大腸桿菌SURE(Stratagene)轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA。
應(yīng)用EcoRI和NcoI通過限制性分析鑒定產(chǎn)生的DNA(大小為3039bp和253bp的2個(gè)片段)。
顯示預(yù)期片段的兩質(zhì)粒DNA通過測(cè)序進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。SV40早期啟動(dòng)子兩條鏈均經(jīng)過測(cè)序以使每一位置均得以驗(yàn)證。該質(zhì)粒命名為p3。
3.人Epo cDNA的分離3.1用TRIZol試劑分離總RNA用于從人腎組織(從Lainzer Krankenhaus醫(yī)院獲得)中分離Epo RNA的TRIzol試劑為苯酚和異硫氰酸胍的單相溶液。在細(xì)胞裂解期間于細(xì)胞破壞的同時(shí)，異硫氰酸胍與RNA形成水溶性復(fù)合體。加入氯仿，隨后離心，將溶液分離成含RNA的水相和有機(jī)相。分離水相后，用異丙醇沉淀RNA，乙醇洗滌，空氣干燥并重懸于不含RNA酶的水中。
將人腎組織片段切成小塊，通過100μm的細(xì)胞濾網(wǎng)，離心(179xg/10分鐘)并用PBS將產(chǎn)生的沉淀塊洗滌三次。然后將沉淀塊重懸在PBS中，分裝在無菌管中，-196℃冷凍并儲(chǔ)存在-80℃待用。
加入1ml的TRIzol試劑裂解冷凍組織，勻漿化并于15-30℃孵育5分鐘以保證完全裂解。加入200μl氯仿、振搖管并于15-30℃孵育2-3分鐘后，將管于12000xg離心10分鐘。離心后，將上層液相小心轉(zhuǎn)移到新管，與500μl的異丙醇混合并于15-30℃孵育10分鐘。離心沉淀的RNA(12000xg，10分鐘)，用乙醇洗滌沉淀，再次離心，空氣干燥并溶解在無RNA酶的DEPC水中。用光度計(jì)于260nm處測(cè)定總RNA含量。
1OD260nm＝40μg RNA/ml通過評(píng)測(cè)OD260nm和OD280nm(蛋白質(zhì)的最大吸光度)的比值可估計(jì)出分離的RNA純度。該比值應(yīng)位于1.6和1.8之間。
3.2用Dynabeads Oligo(dT)25分離mRNADynabeads Oligo(dT)25 mRNA DIRECT試劑盒采用將真核mRNA的多聚腺苷酸尾雜交至其表面共價(jià)連接有包含25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的脫氧胸苷酸的超磁、聚苯乙烯顆粒?？蓱?yīng)用Dynal磁珠濃縮器(Dynal MPC)分離結(jié)合到磁珠上的mRNA。
洗滌緩沖液Tris-HCl 10mM，pH8.0；LiCl 0.15mM；EDTA 1mM2x結(jié)合緩沖液Tris-HCl 20mM，pH7.5；LiCl 1mM；EDTA 2mM對(duì)于10μg的總RNA，在Dynal MPC中分離100μl的Dynabeads oligo(dT)25并用2x洗滌緩沖液洗滌兩次。同時(shí)用1x洗滌緩沖液將總RNA的體積調(diào)整為200μl并于65℃孵育4分鐘進(jìn)行變性。然后將RNA與珠子混合，室溫孵育5分鐘并在Dynal MPC中進(jìn)行分離。用1x洗滌緩沖液洗滌珠子兩次。用洗脫緩沖液(2×10μl)于65℃孵育4分鐘將多聚腺苷酸化的RNA從Dynalbeads Oligo(dT)25上洗脫。在Dynal MPC中分離Dynabeads并立即將上清轉(zhuǎn)移到新的無RNA酶的微離心管。洗脫液直接用于反轉(zhuǎn)錄。
3.3反轉(zhuǎn)錄將用于Epo的特異引物于80℃孵育4分鐘進(jìn)行變性，并將mRNA在65℃孵育5分鐘進(jìn)行變性。冰上將以下成分加到1.5ml的無菌微離心管中試劑 終濃度MRNA 10μlMMLV(200U/μl) 0.25μlBoehringer PCR緩沖液(10x)2μldNTPs(10mM) 2μlMgCl2(50mM) 1μlEpo正向引物(100pmol/μl) 1μlDTT(0.1M)0.25μlRNA酶抑制劑(40U/μl) 0.25μlH2O 3.25μl孵育37℃ 60分鐘滅活100℃ 5分鐘3.4聚合酶鏈反應(yīng)于4℃將以下成分加到無菌的1.5ml微離心管中。PCR條件如下所列。
試劑 Epo模板 cDNA Epo 5μl聚合酶 Vent 1U(0.5μl)聚合酶緩沖液(10x) Vent緩沖液1x(10μl)dNTPs(10mM)200μM(2μl)MgCl2(50mM) /正向引物(10pM) 30pM(3μl)反向引物(10pM) 30pM(3μl)DMSO /H2O 76.5μl
PCR循環(huán)1變性 95℃ 2分鐘2變性 94℃ 45秒3引物退火 58℃ 30秒4延伸 72℃ 1分鐘5終末延伸 72℃ 10分鐘6循環(huán) 30個(gè)循環(huán)用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.5瓊脂糖膠電泳6xBX緩沖液溴酚藍(lán)0.25％；二甲苯腈藍(lán)0.25％，甘油30％TAE緩沖液 Tris堿242g；冰醋酸57.1ml；EDTA(0.5M，pH8.0)100ml；用水調(diào)整到1000mlλ-標(biāo)記物III 10μg噬菌體λ-野生型-Dann(2.5μl HindIII+2.5μl EcoRI+20μl 緩沖液R(Fermentas)，用水調(diào)整到200μl；37℃消化1小時(shí)，65℃滅活20分鐘；補(bǔ)充以40μl的BX上樣緩沖液)在微波爐中溶解1g的瓊脂糖和99g的1xTAE緩沖液，冷卻到約60℃并加入3μl的溴化乙錠母液(10mg/ml)。在1xTAE緩沖液中以100-300V進(jìn)行約30分鐘的電泳，所述時(shí)間取決于待分離的DNA片段的長(zhǎng)度。每一泳道含有10μl樣本與2μl 6xBX緩沖液的混合物。DNA片段的鑒定基于與λ/HindIII消化的分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。
3.6用于連接的PCR產(chǎn)物和載體的制備3.6.1用于粘端克隆的載體DNA和插入片段的限制性消化根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書將10μl的限制性酶和適宜的限制性酶緩沖液與1μg的載體和插入片段混合。將混合物置37℃(SmaI為30℃)孵育30到60分鐘，時(shí)間根據(jù)應(yīng)用的酶、載體和插入片段。然后將溫度提高到65℃持續(xù)10分鐘以滅活酶并通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)混合物。
3.6.2連接
pIRESneoSV40載體pIRESneo載體(Clontech實(shí)驗(yàn)室)含有腦心肌炎病毒(ECMV)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，所述位點(diǎn)允許從一條信使RNA上進(jìn)行兩開放閱讀碼框的翻譯。pIRESneo的表達(dá)盒含有人巨細(xì)胞病毒(CMV)的主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和位于其后的多克隆位點(diǎn)(MCS)、含有ECMV IRES和位于其后的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因以及含有牛生長(zhǎng)激素的多聚腺苷酸化信號(hào)。在此載體中CMV啟動(dòng)子被SV40早期啟動(dòng)子替換。
用T4 DNA連接酶連接載體和PCR產(chǎn)物。對(duì)于最佳連接，應(yīng)用摩爾比約1∶10的約20ng載體和200ng插入片段(根據(jù)長(zhǎng)度而定)并與以下試劑混合，用水調(diào)至10μl。15℃進(jìn)行過夜孵育并室溫孵育3小時(shí)。然后于65℃孵育10分鐘熱滅活連接酶。
試劑 最終量載體(pIRESneoSV40) ～20ng插入片段(Epo) ～200ngT4 DNA連接酶 1U(1μl)緩沖液(5x) 1×(2μl)H2O 加到10μl3.6.3細(xì)菌和培養(yǎng)基JM109 (Promega，USA)LB-培養(yǎng)基 酪蛋白來源的蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g，用水調(diào)整到1000ml并用5M NaOH將pH調(diào)節(jié)為7.0LB瓊脂 在1000ml LB-培養(yǎng)基中加入15g瓊脂LB-氨芐青霉素 1000ml LB-培養(yǎng)基中加入100μl的氨芐青霉素(100mg/ml)SOC培養(yǎng)基 細(xì)菌用胰蛋白胨20g；酵母提取物5g；NaCl 10mM；KCl3mM；MgCl210mM；葡萄糖20mM，MgSO410mM3.6.4用CaCl2進(jìn)行轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109)的制備將大腸桿菌(JM109)接種到10ml的LB培養(yǎng)基中并于37℃過夜培養(yǎng)。取4ml的細(xì)菌培養(yǎng)物按1∶100稀釋加到LB培養(yǎng)基中并培養(yǎng)至其OD260nm達(dá)到0.8。以4500轉(zhuǎn)/分鐘于4℃將細(xì)菌離心10分鐘并將所用的每50ml細(xì)菌懸液的沉淀重懸在10ml的0.1M CaC12(4℃)中，離心細(xì)胞并將沉淀重懸在2ml的0.1M CaCl2中并按100μl總體積分裝，液氮中冷凍并于-80℃保存。
轉(zhuǎn)化在預(yù)冷的17×100mm聚丙烯培養(yǎng)管中將5-10ng的質(zhì)粒DNA加到JM109感受態(tài)細(xì)菌，輕輕混合并置冰上30分鐘。然后在嚴(yán)格的42℃水浴中將細(xì)胞熱休克45秒，此期間不可搖動(dòng)管，并立即置冰上2分鐘。然后向管中加入900μl SOC培養(yǎng)基并于37℃孵育30分鐘，之后將100μl的細(xì)菌懸液涂布在LB-氨芐青霉素平板上。
3.6.5篩選及甘油培養(yǎng)物的建立通過PCR技術(shù)從氨芐青霉素抗性的克隆中篩選插入的DNA片段。取部分的氨芐青霉素抗性克隆與PCR反應(yīng)混合物以及對(duì)克隆的DNA片段特異的引物(參見以下)混合。陽性克隆在瓊凝糖凝膠電泳中顯示出PCR擴(kuò)增的DNA條帶。然后將這些克隆在LB-氨芐青霉素培養(yǎng)基中增殖用于進(jìn)一步的分析和質(zhì)粒純化。為用于進(jìn)一步的應(yīng)用和儲(chǔ)存，將1ml的細(xì)菌培養(yǎng)物與500μl甘油(87％)混合并保存在-80℃。
3.6.6WizardPlus SV Minipreps DNA純化系統(tǒng)細(xì)胞重懸溶液Tris-HCl 50mM，pH7.5；EDTA 10mM，RNase A 100μg/ml細(xì)胞裂解溶液NaOH 0.2M，SDS1％中和溶液鹽酸胍4.09M，乙酸鉀0.759M；冰醋酸2.12M，pH4.2洗柱溶液乙酸鉀60mM，Tris-HCl 10mM，pH7.5；60％乙醇將單克隆接種到2-3ml LB-氨芐青霉素培養(yǎng)基并于37℃過夜培養(yǎng)。離心(12000xg，5分鐘)溶液并將產(chǎn)生的沉淀塊完全重懸在250μl的重懸溶液中且然后加入250μl的細(xì)胞裂解溶液，立即顛倒管4次進(jìn)行混合并于室溫孵育1-5分鐘。之后加入10μl的堿性蛋白酶(室溫孵育5分鐘)并加入350μl的中和溶液。顛倒管4次進(jìn)行立即混合并將細(xì)菌裂解液于室溫12000xg離心10分鐘。將清澈上清轉(zhuǎn)移到Spin柱子并離心(12000xg，5分鐘)，并用洗滌溶液(750μl/250μl)洗柱子兩次。用100μl無核酸酶的水洗脫DNA。
3.6.7質(zhì)粒測(cè)序以特異引物通過IBL(Gerasdorf，Austria)和GenXpress(Maria Worth，Austria)對(duì)插入序列進(jìn)行序列測(cè)定。用于Epo和SV40早期啟動(dòng)子擴(kuò)增和序列分析的寡核苷酸引物如下所列。
寡核苷酸引物 序列SV40早期啟動(dòng)子SV40早期ClaI正向5′-aga tcg atc aag ctt ttt gca aaa gcc tag-3′SEQ.ID.No.13SV40早期NruI反向5′-agt cgc gag cgc agc acc atg gcc tg-3′SEQ.ID.No.14SV40早期281反向 5′-gcc cag ttc cgc cca ttc-3′SEQ.ID.No.15EpoEpo BamHI正向 5′-tag gat cct cat ctg tcc cct gtc ctg c-3′SEQ.ID.No.16Epo EcoRI反向 5′-tag aat tcc gcc atg ggg gtg cac gaa tgt cc-3′SEQ.ID.No.17Epo 221正向 5′-taa ctt tgg tgt ctg gga-3′SEQ.ID.No.18Epo 204反向 5′-tcc cag aca cca aag tt-3′SEQ.ID.No.19pIRESneopIRESneo 181反向5′-tta ggg tta ggc gtt ttg cg-3′SEQ.ID.No.20pIRESneo 1016正向 5′-act cac ccc aac agc cg-3′SEQ.ID.No.21pIRESneo 2786正向 5′-ggcc aaa caa cag atg gct-3′SEQ.ID.No.22pIRES-200反向 5′-tgg aaa gag tca aat ggc-3′SEQ.ID.No.234.質(zhì)粒p5的構(gòu)建4.1 Epo基因片段的制備用pSVGPIRNEO為模板DNA通過PCR擴(kuò)增Epo(人促紅細(xì)胞生成素)的結(jié)構(gòu)基因。Epo的序列在GenBank中給出，登錄號(hào)為M11319.1。分別將NotI和KspI的識(shí)別位點(diǎn)導(dǎo)入上游和下游引物。按如下設(shè)計(jì)引物Oligo2004-09長(zhǎng)度45mer
5′-ggg ggcggccgcatg ggg gtg cac gaa tgt cct gcc tgg ctg tgg-3′SEQ.ID.No.245′NotIgcggccgca(＝PSVGPIRNEO中的665位)tgggggtg............... SEQ.ID.No.25Oligo2004-10長(zhǎng)度44mer5′-ggg gccgcggtc atc tgt ccc ctg tcc tgc agg cct ccc ctg tg-3′ SEQ.ID.No.265′KspIccgcgg-t(＝PSVGPIRNEO中的1246位)catctgtcccct............ SEQ.ID.No.27應(yīng)用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通過PCR制備引物2004-09+2004-10的擴(kuò)增產(chǎn)物，如上描述。應(yīng)用DNA分離柱子純化產(chǎn)生的604bp的DNA片段，用KspI和NotI消化，并進(jìn)行凝膠純化。產(chǎn)生的592bp的KspI/NotI片段用于以下描述的三片段連接。
4.2SV40LTpolyA/IVS終止區(qū)的制備通過PCR從pSV2neo中克隆SV40LTpolyA/IVS的終止區(qū)，所用方法與以上描述的1.4部分中用于構(gòu)建p2-neo的方法基本相同，不同處在于設(shè)計(jì)的引物具有的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)不同上游引物引入KspI(＝SacII)位點(diǎn)且下游引物引物引入SacI和EcoRI位點(diǎn)。
Oligo2004-11長(zhǎng)度42mer5′ggg gccgcggtt tgt gaa gga acc tta ctt ctg tgg tgt gac-3′SEQ.ID.No.285′KspIccgcgg-t(＝pSV2neo中的1598位)ttgtgaaggaa.............SEQ.ID.No.29Oligo 2004-12長(zhǎng)度46mer5′-ggg ggagctcgaattcga tcc aga cat gat aag ata cat tga g-3′ SEQ.ID.No.305′SacI/EcoRIgagctcgaattc-g(＝pSV2neo中的752位)atccagacatg.... SEQ.ID.No.31應(yīng)用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通過PCR制備引物2004-11+2004-12的擴(kuò)增產(chǎn)物，如上描述。應(yīng)用DNA分離柱子純化產(chǎn)生的873bp的DNA片段，用KspI和SacI消化。然后對(duì)產(chǎn)生的858bp的DNA片段進(jìn)行凝膠純化。
4.3p3載體部分的制備分別應(yīng)用NotI和SacI依次消化p3質(zhì)粒DNA。用堿性磷酸酶處理DNA并對(duì)載體片段進(jìn)行凝膠純化。
4.4三片段連接和質(zhì)粒p5的分離將質(zhì)粒p3的NotI/SacI載體部分、Epo基因的KspI/NotI部分和SV40L TpolyA/IVS終止區(qū)的KspI/SacI部分置于一個(gè)連接反應(yīng)(LigationExpress，Clontech)中進(jìn)行連接。在補(bǔ)充以100mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。
通過菌落雜交篩含兩個(gè)插入片段的陽性轉(zhuǎn)化株，所述菌落雜交應(yīng)用2004-09/2004-10和2004-11/2004-12兩對(duì)引物的擴(kuò)增片段作為標(biāo)記探針。挑選用兩個(gè)探針雜交獲得陽性雜交信號(hào)的十個(gè)克隆進(jìn)行“小”規(guī)模質(zhì)粒制備(Qiagen)。
應(yīng)用以下的酶進(jìn)行限制性分析，BamHI(4723bp的1個(gè)片段)、EcoRI(2913、1810bp的2個(gè)片段)以及PvuII(2513、1204、903、103bp的4個(gè)片段)。篩選出兩個(gè)顯示正確限制性片段的克隆并通過序列測(cè)定進(jìn)行確證。對(duì)克隆到pBluescriptII SK+中的完整盒進(jìn)行測(cè)序并與預(yù)定的核苷酸序列進(jìn)行比較。每一單核苷酸均得以正確確認(rèn)。該質(zhì)粒命名為p5。
5.pEpo/neo的構(gòu)建5.1pEpo/neo 12-1的構(gòu)建BamHI和EcoRI消化p5質(zhì)粒DNA并對(duì)產(chǎn)生的代表SV40啟動(dòng)子-Epo基因-SV40終止子盒的1792bp片段進(jìn)行凝膠純化。同樣用BamHI和EcoRI消化質(zhì)粒p2-neo并凝膠純化線性化載體。此外，應(yīng)用堿性磷酸酶對(duì)DNA進(jìn)行去磷酸化并用Amicon Micropure酶去除劑進(jìn)行純化。
將4411bp的p2-neo載體和來自p5的1792bp盒子這兩個(gè)片段連接(Ligation Express，Clontech)并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌SURE。從生長(zhǎng)在補(bǔ)充以70mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上的多個(gè)轉(zhuǎn)化株中分離質(zhì)粒DNA并應(yīng)用限制性內(nèi)切酶PvuII、EcoRI和NcoI消化以對(duì)其進(jìn)行分析。
篩選顯示有預(yù)期片段(EcoRI6191bp，NcoI4085、1326和780bp，PvuII3273、2130、685和103bp)的克隆并命名為pEpo/neo-12。
為進(jìn)一步進(jìn)行純化，將DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌SURE中(參見以下)并從單克隆(pEpo/neo-12-1)接種的培養(yǎng)基中應(yīng)用″Midi-prep″方法(Qiagen)制備質(zhì)粒DNA。應(yīng)用以下的酶進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析BamHI、HindIII、EcoRI、NcoI、NotI、PstI、SpeI、SphI、PvuII、NarI?？砂l(fā)現(xiàn)預(yù)期的片段和大小，證實(shí)克隆為正確的pEpo/neo克隆。
5.2 pEpo/neo的最終構(gòu)建pEpo/neo-12-1中Epo基因的上游區(qū)在起始的ATG的負(fù)3位處進(jìn)行改變。導(dǎo)入一額外的核苷酸A導(dǎo)致在起始ATG的-3位產(chǎn)生嘌呤堿基G。該位置的嘌呤可提高基因的表達(dá)水平。為達(dá)到該目的，應(yīng)用修改的上游引物2004-09-a擴(kuò)增Epo基因Oligo2004-09-a長(zhǎng)度46mer5′gggggcggccgcaatgggggtgcacgaatgtcctgcctggctgtgg-3′SEQ.ID.No.32應(yīng)用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通過PCR制備引物2004-09-a+2004-10的擴(kuò)增產(chǎn)物，如以上所描述。應(yīng)用DNA分離柱子純化產(chǎn)生的605bp的DNA片段并用KspI和NotI進(jìn)行消化。然后對(duì)產(chǎn)生的593bp的DNA片段進(jìn)行凝膠純化。
分別用KspI和NotI消化pEpo/neo-12-1質(zhì)粒DNA，以移除Epo基因。然后凝膠純化5599bp的片段。將制備的兩條DNA連接(Ligation Express，Clontech)。從生長(zhǎng)在補(bǔ)充以70mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上的克隆中分離并純化質(zhì)粒DNA。在第一輪篩選中應(yīng)用NcoI對(duì)DNA進(jìn)行限制性分析。
篩選陽性克隆并應(yīng)用″Midi prep″方法(Qiagen)分離DNA。應(yīng)用BamHI、HindIII、EcoRI、NcoI、NotI、PstI、SpeI、SphI、PvuII、NarI進(jìn)行進(jìn)一步的限制性內(nèi)切酶分析?？砂l(fā)現(xiàn)預(yù)期的片段和大小，證實(shí)克隆為正確的pEpo/neo。插入到pBR322載體部分的完整盒子(SV40早期啟動(dòng)子-neo基因-SV40LTpolyA/IVS-SV40早期啟動(dòng)子-Epo基因-SV40LTpolyA/IVS)中的每一單核苷酸也通過測(cè)序進(jìn)行確證。實(shí)施例2-質(zhì)粒Epo/dhfr的構(gòu)建1.p2-dhfr-CDS的構(gòu)建1.1dhfr基因的制備用于載體構(gòu)建的dhfr基因取自存在于質(zhì)粒pLTRdhfr26(ATCC 37295)中的小鼠cDNA。小鼠dhfr cDNA(MUSDHFR)的核苷酸序列可從Genbank中獲得，登錄號(hào)為L(zhǎng)26316。
應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物從pLTRdhfr26擴(kuò)增dhfr，產(chǎn)生的片段所包含的編碼區(qū)為從56位的起始ATG到619位的終止密碼子TAA。對(duì)于以上描述的新霉素抗性基因的擴(kuò)增，分別在上游和下游擴(kuò)增引物中引入HindIII和SpeI位點(diǎn)。反向引物中除SpeI位點(diǎn)外也導(dǎo)入了EcoRI位點(diǎn)。寡核苷酸的序列如下Oligo2004-13長(zhǎng)度39mer5′-ggg gaagcttat ggt tcg acc att gaa ctg cat cgt cgc-3′ SEQ.ID.No.335′HindIIIaagctt-A(＝MUSDHFR中的56位)TGgttcgaccattg............. SEQ.ID.No.34Oligo2004-14長(zhǎng)度42mer5′ggggaa ttcactagttag tct ttc ttc tcg tag act tca aac-3′ SEQ.ID.No.355′ /SpeI actag-t(＝MUSDHFR中的619位)tagtctttcttctcgtagacttcaaact...............
SEQ.ID.No.36應(yīng)用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通過PCR制備引物2004-13+2004-14的擴(kuò)增產(chǎn)物，如上描述。應(yīng)用DNA分離柱子純化產(chǎn)生的588bp的DNA片段，用HindIII和EcoRI消化并進(jìn)行凝膠純化。
1.2p1-dhfr-CDS的制備應(yīng)用Ligation Express(Clontech)將擴(kuò)增的EcoRI-HindIII dhfr基因片段與來自pSV2-neo的EcoRI-HindIII載體片段連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主中。通過在補(bǔ)充以50mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化株。從補(bǔ)充以50mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的克隆中分離并純化轉(zhuǎn)化株的質(zhì)粒DNA。
從克隆中分離質(zhì)粒DNA并通過EcoRI加ScaI的限制性內(nèi)切酶分析進(jìn)行鑒定(大小為2225bp、514bp和473bp的3個(gè)片段)。
對(duì)顯示預(yù)期片段的質(zhì)粒DNA構(gòu)建體的相應(yīng)部分進(jìn)行序列測(cè)定以進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。證實(shí)含有SV40早期啟動(dòng)子和二氫葉酸還原酶基因的質(zhì)粒DNA被命名為p1-dhfr-CDS。序列分析顯示，與已發(fā)表的MUSDHFR中dhfr基因序列相比存在一個(gè)差異，具體地為MUSDHFR序列中451位T到C的改變。隨后的測(cè)序表明該改變也存在于原始質(zhì)粒中。但由于CTT和CTC均編碼亮氨酸，因此產(chǎn)生的變化并不導(dǎo)致核苷酸序列所編碼的氨基酸序列的改變。
1.3p2-dhfr-CDS的制備用EcoRI+SpeI消化p1-dhfr-CDS質(zhì)粒DNA。純化產(chǎn)生的線性片段并與擴(kuò)增的含SV40LTpolyA/IVS(以上描述)的片段連接。轉(zhuǎn)化和篩選后，通過應(yīng)用AccI的限制性內(nèi)切酶分析對(duì)產(chǎn)生的質(zhì)粒進(jìn)行分析(2994、855和216bp的3個(gè)片段)。篩選出幾個(gè)質(zhì)粒并用以下的酶進(jìn)行進(jìn)一步的分析，HincII(分別為3466bp和599bp的2個(gè)片段)、AflIII(分別為2872bp和1193bp的兩個(gè)片段)以及BglI(分別為2371bp和1694bp的2個(gè)片段)。
對(duì)顯示所有正確大小片段的質(zhì)粒DNA通過序列測(cè)定進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。經(jīng)確認(rèn)的質(zhì)粒被命名為p2-dhfr-CDS。
2.Epo/dhfr的構(gòu)建2.1pEpo/dhfr21的制備用BamHI和EcoRI消化p5質(zhì)粒并將產(chǎn)生的代表SV40啟動(dòng)子-Epo基因-SV40終止子盒子的1792bp片段進(jìn)行凝膠純化。
同樣用BamHI和EcoRI消化質(zhì)粒p2-dhfr-CDS并凝膠純化線性化的載體，并應(yīng)用Supelco spin柱子對(duì)線性化載體進(jìn)行純化和洗脫。此外，用堿性磷酸酶對(duì)DNA去磷酸化并應(yīng)用Amicon Micropure酶移除劑進(jìn)行純化。
將4053bp的p2-dhfr-CDS載體和來自p5的1792bp盒子的兩個(gè)片段連接(Ligation Express，Clontech)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE。用Epo基因(PCR產(chǎn)物)為探針對(duì)生長(zhǎng)在補(bǔ)充以70mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化株克隆進(jìn)行雜交。從多個(gè)陽性克隆中分離質(zhì)粒DNA并用限制性內(nèi)切酶NcoI消化對(duì)其進(jìn)行分析。
篩選顯示預(yù)期片段(NcoI4085bp和1760bp)的克隆并將其命名為pEpo/dhfr-21。為進(jìn)行進(jìn)一步的純化，將DNA再轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE(參見以上)并應(yīng)用″Midi-prep″方法(Qiagen)從單克隆(pEpo/dhfr-21-1)接種的培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA。
應(yīng)用以下的酶進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析BamHI、HindIII、EcoRI、NcoI、NotI、PstI、SpeI、SphI、PvuII、NarI。可發(fā)現(xiàn)所有的預(yù)期片段和大小，證實(shí)克隆為正確的pEpo/dhfr-21。
2.2pEpo/dhfr的最終構(gòu)建與用于pEpo/neo的方法相同，Epo/dhfr-21中Epo基因的上游區(qū)在相當(dāng)于起始ATG的負(fù)3位進(jìn)行改動(dòng)。導(dǎo)入一額外的A以在距起始ATG負(fù)3位處產(chǎn)生嘌呤堿基G。如實(shí)施例1的4.2中所描述的方法擴(kuò)增Epo基因。
用KspI和NotI消化pEpo/dhfr-21質(zhì)粒DNA以移除Epo基因。然后凝膠純化5259bp的片段。
將制備的兩DNA連接到一起(Ligation Express，Clontech)。從在補(bǔ)充以70mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的克隆中分離并純化質(zhì)粒DNA。在第一輪篩選中應(yīng)用NcoI限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行分析。
篩選陽性克隆以應(yīng)用″Midi prep″方法(Qiagen)分離DNA。應(yīng)用BamHI、HindIII、EcoRI、NcoI、NotI、PstI、SpeI、SphI、PvuII、NarI進(jìn)行進(jìn)一步的限制性內(nèi)切酶分析。可發(fā)現(xiàn)預(yù)期的片段和大小，證實(shí)克隆為正確的pEpo/dhfr。
也通過測(cè)序?qū)Σ迦氲絧BR322載體部分的完整盒子(SV40早期啟動(dòng)子-dhfr基因-SV40LTpolyA/IVS-SV40早期啟動(dòng)子-Epo基因-SV40LTpolyA/IVS)中的每個(gè)單核苷酸進(jìn)行確證。
實(shí)施例3-由pEpo/neo和pEpo/dhfr中產(chǎn)生重組CHO-細(xì)胞進(jìn)行l(wèi)ipofectin轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞以1-5×104個(gè)細(xì)胞/cm2接種到25cm2的T-型瓶或96孔平板。以50∶1＝Epo/neoEpo/dhfr比例將兩質(zhì)?；旌喜⒏鶕?jù)生產(chǎn)商的說明書將其吸附到lipofectin試劑(GIBCO/BRL)。
簡(jiǎn)言之，使用0.25μg DNA/cm2和1.5μllipofectin-試劑/cm2并將此DNA/脂質(zhì)混合物調(diào)整為200μl/cm2細(xì)胞層。然后在無血清DMEM中用轉(zhuǎn)染混合物覆蓋細(xì)胞4個(gè)小時(shí)，之后用培養(yǎng)用培養(yǎng)基替換含DNA的培養(yǎng)基。在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，將血清換成篩選培養(yǎng)基。首先將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞池培養(yǎng)在篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行匯片，然后在擴(kuò)增培養(yǎng)基(4.8×10-8MMTX)中培養(yǎng)，之后通過ELISA篩選產(chǎn)生Epo的細(xì)胞培養(yǎng)上清。確定產(chǎn)量最高的細(xì)胞，將MTX濃度提高兩倍并應(yīng)用產(chǎn)量最高的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)。篩選37株重組細(xì)胞并比較其生長(zhǎng)特性、Epo生產(chǎn)率、蛋白質(zhì)形式(通過western印跡分析)、Epo功能和染色體穩(wěn)定性。
在T25-培養(yǎng)瓶中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每個(gè)T25-瓶中含有2.5μg pEpo/neo、0.05μg pEpo/dhfr和15μl lipofectin(09/T25/1和09/T25/2)，以及每個(gè)T25-瓶中含有2μg pEpo/neo、0.4μg pEpo/dhfr和15μl lipofectin(09/T25/3和09/T25/4)。
另5個(gè)平板每平板用10μg pEpo/neo、0.2μg pEpo/dhfr和60μl lipofectin轉(zhuǎn)染(09/96/1-09/96/5)，5個(gè)平板每平板用8μg pEpo/neo、1.6μg pEpo/dhfr和60μl lipofectin轉(zhuǎn)染(09/96/6-09/96/10)。平板11和12每平板用6.25μgpEpo/neo、0.08μg pEpo/dhfr和37.5μl lipofectin轉(zhuǎn)染。
簡(jiǎn)言之，使用0.25μg DNA/cm2和1.5μl lipofectin-試劑/cm2且將該DNA/脂質(zhì)混合物調(diào)整到200μl/cm2細(xì)胞層。
由于先前的實(shí)驗(yàn)顯示一個(gè)培養(yǎng)單位中的克隆數(shù)最多為三到五個(gè)，因此系列轉(zhuǎn)染主要在微滴定平板中進(jìn)行。這意味著單克隆轉(zhuǎn)染體的分離較之從T型瓶中幾百個(gè)克隆中的分離更為容易。表1描述了每96平板中的克隆數(shù)以及存在或不存在擴(kuò)增壓力時(shí)的ELISA滴度。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞池首先培養(yǎng)在篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行匯片且然后在擴(kuò)增培養(yǎng)基(4.8×10-8M MTX)中培養(yǎng)，之后通過ELISA篩選生產(chǎn)Epo的細(xì)胞培養(yǎng)上清。篩選約1000個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞，將50個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞用濃度提高的MTX測(cè)試特異Epo產(chǎn)率。確定最高產(chǎn)量的細(xì)胞，將MTX濃度提高兩倍并將產(chǎn)量最高的細(xì)胞用于進(jìn)一步的培養(yǎng)。
篩選和第一擴(kuò)增步驟在96孔板進(jìn)行，篩選所有克隆后，培養(yǎng)在4.8×10-8M MTX中，篩選出7個(gè)克隆，命名為09/96/1F5、09/96/3D5、09/96/3H5、09/96/5D4、09/96/5H1、09/96/6C5和09/96/7E6，并比較其生長(zhǎng)特性、Epo產(chǎn)率、western印跡中的蛋白質(zhì)形式、Epo功能性試驗(yàn)和染色體穩(wěn)定性。
所有克隆的細(xì)胞加倍的時(shí)間似乎相同，且其可按1∶2到1∶5每周兩次進(jìn)行傳代。將MTX濃度從9.6×10-8M提高到1.9×10-7M也可提高產(chǎn)率，而進(jìn)一步將MTX濃度提高一倍并不影響ELISA值。因此以3.8×10-7M MTX的進(jìn)行亞克隆。用1.9×10-7M MTX分析免疫熒光，該濃度下的單培養(yǎng)物差異并不顯著。
用光學(xué)顯微鏡和Coulter Counter核DNA分析比較細(xì)胞形態(tài)。克隆09/96/7E9、09/96/6C5、09/96/5H1、09/96/5D4和09/96/3D5顯示的細(xì)胞核大小分布與宿主細(xì)胞系CHO-DHFR-相同。相反，細(xì)胞系09/96/1 F5和09/96/3H5具有較大的細(xì)胞核。從以往的試驗(yàn)得知，該結(jié)果源自染色體數(shù)量的提高。因此決定應(yīng)用克隆09/96/3D5用于進(jìn)一步的穩(wěn)定性試驗(yàn)。
在TF-1細(xì)胞上進(jìn)行的Epo功能性試驗(yàn)時(shí)，所有7個(gè)培養(yǎng)物上清得出的斜率與重組的藥用產(chǎn)物相同。
通過SDS PAGE和western印跡對(duì)每一MTX濃度的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，且在任何的重組培養(yǎng)上清中僅存在微小的變化。這些克隆產(chǎn)生Epo。
總結(jié)和討論描述了從真核表達(dá)載體的構(gòu)建到哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染和表達(dá)Epo的多克隆細(xì)胞池的分離從而對(duì)表達(dá)Epo的重組CHO細(xì)胞系的篩選。分析的基礎(chǔ)主要應(yīng)用ELISA、免疫熒光、western印跡和體外功能性測(cè)試。所有這些方法建立在這樣的濃度范圍內(nèi)，即其能夠篩選只有ng/ml量的低產(chǎn)量細(xì)胞池培養(yǎng)上清以及更為穩(wěn)定的重組細(xì)胞。
產(chǎn)生了重組CHO-細(xì)胞池，其中基因拷貝數(shù)用直至達(dá)3.8×10-7M MTX得以逐步擴(kuò)增。這些細(xì)胞可按1∶3到1∶4每周傳代兩次，且每次用ELISA檢測(cè)出的Epo水平均提高。
實(shí)施例4-重組細(xì)胞系的進(jìn)一步篩選用重組細(xì)胞池09/96/3D5進(jìn)行進(jìn)一步的穩(wěn)定性試驗(yàn)。MTX濃度逐步提高到0.38μM MTX。在此擴(kuò)增水平，將重組3D5細(xì)胞亞克隆成每孔10到20個(gè)細(xì)胞。通過ELISA篩選具有單克隆的孔的培養(yǎng)上清。表2顯示在0.38μM MTX存在下重組細(xì)胞池3D5的亞克隆條件和效率。測(cè)試300個(gè)單克隆的上清。用0.77μM MTX在24孔板中篩選傳代4天后Epo滴度提高的克隆。
將這些克隆中的7個(gè)保存在液氮中并通過將MTX濃度提高到1.54μM篩選基因拷貝數(shù)的進(jìn)一步擴(kuò)增。
表3匯集了第二輪穩(wěn)定性試驗(yàn)的鋪板條件和效率。此時(shí)，克隆09/96/3D5/1H9和09/96/3D5/18E5用1.54μM MTX進(jìn)行最后一次亞克隆。每孔的細(xì)胞數(shù)減至4個(gè)細(xì)胞。篩選260個(gè)單克隆，其中每一亞培養(yǎng)中多于20個(gè)克隆轉(zhuǎn)移到T型瓶并篩選比生產(chǎn)率。通過標(biāo)準(zhǔn)值確定最終的生產(chǎn)克隆，所述標(biāo)準(zhǔn)值如比表達(dá)速率、生長(zhǎng)情況和核大小分步。棄去顯示四倍體的克隆，這是由于根據(jù)經(jīng)驗(yàn)此類細(xì)胞在生物轉(zhuǎn)化器中易于呈現(xiàn)復(fù)雜的生長(zhǎng)模式。篩選后選擇以下6個(gè)亞克隆(4個(gè)1H9和2個(gè)18E5亞克隆)，將所述克隆冷凍在液氮中。
09/96/3D5/1H9/4C209/96/3D5/1H9/6C209/96/3D5/1H9/6D409/96/3D5/1H9/15B4 09/96/3D5/18E5/7A6 09/96/3D5/18E5/15C3實(shí)施例5-對(duì)無血清培養(yǎng)用培養(yǎng)基的適應(yīng)選擇來自實(shí)施例4的最終的6個(gè)重組細(xì)胞系，在末次亞克隆步驟后進(jìn)行無血清培養(yǎng)條件的適應(yīng)。
將亞克隆后7-12次傳代的細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/cm2接種到T25-瓶中并培養(yǎng)3-4天直至匯片。在此時(shí)間點(diǎn)將培養(yǎng)基完全替換為無血清適應(yīng)培養(yǎng)基且之后每日更新80％的培養(yǎng)基。所有懸浮的細(xì)胞均放回培養(yǎng)物中。適應(yīng)期過后，幾乎所有細(xì)胞均懸浮生長(zhǎng)，將克隆每周傳代兩次并以懸浮培養(yǎng)物培養(yǎng)。
將克隆在無血清適應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)11-13代后將其低溫保存。每一細(xì)胞系以5×106個(gè)細(xì)胞/瓶共6個(gè)安瓿瓶以無血清凍存培養(yǎng)基保存于液氮中。凍化后，在無血清生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)克隆。對(duì)凍化后第二和第三次傳代的上清進(jìn)行特性分析以篩選生產(chǎn)克隆。
分析試驗(yàn)包括比生長(zhǎng)速率[μ]-(μ＝In(X2/X1)/天)比生產(chǎn)率[qp]-(Qp＝產(chǎn)物生成×106/(細(xì)胞數(shù)x天))Western印跡等電聚焦DNA含量和穩(wěn)定性克隆穩(wěn)定性所有的6個(gè)克隆均可在無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并每周傳代兩次。也經(jīng)行無血清冷凍保存且凍化后將培養(yǎng)用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為無血清生產(chǎn)培養(yǎng)基。該配方中富含葡萄糖和氨基酸。
5次傳代后測(cè)定多種蛋白質(zhì)和細(xì)胞參數(shù)，并選擇出一個(gè)生產(chǎn)克隆(09/96/3D5/1H9/6C2；簡(jiǎn)寫為6C2)以及一個(gè)后備克隆(09/96/3D5/1H9/4C2；簡(jiǎn)寫為4C2)。
實(shí)施例6-重組細(xì)胞系的比較幾周后計(jì)算來自實(shí)施例4和5的6個(gè)細(xì)胞系的生長(zhǎng)特性，所述計(jì)算通過測(cè)定培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)以及傳代時(shí)的傳代比進(jìn)行。通過ELISA測(cè)定Epo生產(chǎn)率。通過這些數(shù)據(jù)計(jì)算出如上描述的比生產(chǎn)率和比生長(zhǎng)速率。
表4總結(jié)了在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下獲得的數(shù)據(jù)，所述標(biāo)準(zhǔn)條件為培養(yǎng)3天后以1∶3的比例傳代。
顯示了傳代后及額外的3天后的細(xì)胞數(shù)(通過Coulter Counter測(cè)定)。
還原條件下的SDS-PAGE通過SDS-PAGE分離6個(gè)細(xì)胞系的上清并比較分子量差異。顯示6份上清的SDS圖形相同，均帶有在此類高度糖基化蛋白質(zhì)中常見的成片條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。
用于比較的可商業(yè)獲得的產(chǎn)物以更為清晰的條帶遷移，可能是由于其源自在下游處理中分離出的更為清晰的條帶。
IEF-Western印跡IEF-western印跡分析將反應(yīng)出糖蛋白潛在的微觀不均一性。根據(jù)上樣到凝膠上的蛋白質(zhì)的量，可見到14條帶。在western印跡上見到約在凝膠中部的一條特征性雙帶；在此雙帶之下的條帶定義為1帶且在此凝膠酸性部分中可見到9至10條帶。比較用的商業(yè)產(chǎn)物在與異源產(chǎn)物中6到9帶對(duì)應(yīng)處顯示4條主要條帶。
重組細(xì)胞的DNA含量DNA含量與細(xì)胞系染色體的數(shù)目成正比。重組細(xì)胞系的穩(wěn)定性部分地受染色體數(shù)影響且DNA含量的鑒定通過與宿主細(xì)胞系(CHOdhfr-)的比較得以證實(shí)。
總結(jié)和討論在此描述了表達(dá)重組Epo的CHO細(xì)胞系的分離。兩輪亞克隆后，以6個(gè)亞克隆細(xì)胞系的不同特性的比較為基礎(chǔ)，確定了最終的生產(chǎn)克隆。分析主要基于ELISA、western印跡和IEF試驗(yàn)以及測(cè)量DNA的FACS分析。
與商售的純化蛋白質(zhì)相比，重組培養(yǎng)上清的western印跡圖形顯示有幾條額外的低分子量條帶。一個(gè)解釋是這些額外條帶代表同種型，用于比較的商售產(chǎn)物在下游處理時(shí)將所述同種型移除。另一種可能是該條帶為由于SDS的不完全攝入而檢測(cè)出的假條帶。無論其Qp大小，所有細(xì)胞培養(yǎng)上清的等電位聚焦顯示相同的同種型分布。
產(chǎn)量最佳且最易于操作的克隆為選作生產(chǎn)克隆的克隆6C2。選擇4C2作為后備克隆。兩克隆可在搖動(dòng)瓶中增殖。
實(shí)施例7-在T型瓶中培養(yǎng)CHO細(xì)胞在T型瓶中用無血清條件培養(yǎng)的中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)產(chǎn)生重組人促紅細(xì)胞生成素。培養(yǎng)物接種密度為2.67×105個(gè)細(xì)胞/mL。接種3天后，最終的細(xì)胞密度可達(dá)到9.35×105細(xì)胞/mL(＝＞μ＝0.42天-1)。
實(shí)施例1到6描述了多種表達(dá)Epo的CHO克隆的制備。在實(shí)施例4和5獲得的6個(gè)克隆中，選擇克隆CHO 6C2是由于其出眾的高細(xì)胞比生產(chǎn)率和其高的比生長(zhǎng)速率。
實(shí)施例8-在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)CHO細(xì)胞在150L的生物反應(yīng)器中以Fed-Batch(T43C6C2)模式培養(yǎng)CHO細(xì)胞系6C2。應(yīng)用的細(xì)胞培養(yǎng)基由補(bǔ)充以氨基酸的50∶50 DMEM/Hams F12組成并包含0.25％的植物肽、0.1％ lutrol、1.54μm氨甲蝶呤(MTX)、4g/L葡萄糖、2.5g/L NaHCO3、乙醇胺、檸檬酸鐵、抗壞血酸和亞硒酸鈉。培養(yǎng)基不包含任何昂貴的功能蛋白(重組或天然來源)。存在來自動(dòng)物來源的組分。細(xì)胞以約5×105細(xì)胞/mL接種到56L培養(yǎng)基中。pO2設(shè)為50％空氣飽和，溫度為37℃且pH為7.0并在發(fā)酵過程中保持恒定。
葡萄糖濃度保持在高于1g/L。4天后用新鮮培養(yǎng)基將反應(yīng)液補(bǔ)充至150L。9天后加1875mL的營養(yǎng)濃縮液擴(kuò)大批發(fā)酵，所述營養(yǎng)濃縮液包含氨基酸、糖和植物來源的蛋白胨。10天后另外加入1875mL的營養(yǎng)濃縮液。兩天后(第12天)回收含促紅細(xì)胞生成素的上清。
實(shí)施例9-在不含氨甲蝶呤的生物反應(yīng)器中生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素在5-L的生物反應(yīng)器中以Fed-Batch(Kamp 4 B5-1和2)模式培養(yǎng)CHO細(xì)胞系6C2。培養(yǎng)基如實(shí)施例9中所示。第一生物反應(yīng)器(Kamp 4 B5-1)設(shè)定為1.54μm MTX，且第二生物反應(yīng)器(Kamp 4 B5-2)不含MTX。
葡萄糖濃度保持在高于1g/L。以約5×105細(xì)胞/mL將細(xì)胞接種在1250-mL培養(yǎng)基中。pO2設(shè)定為50％空氣飽和，溫度為37℃且pH為7.0并在發(fā)酵過程中保持恒定。2天后用新鮮培養(yǎng)基將反應(yīng)液補(bǔ)充到5L。第6、7、8、9和10天后加入50-122mL的營養(yǎng)濃縮液繼續(xù)批發(fā)酵，所述營養(yǎng)濃縮液包含氨基酸、糖和植物來源的蛋白胨。在第11天回收含促紅細(xì)胞生成素的上清。
發(fā)現(xiàn)不含氨甲蝶呤進(jìn)行培養(yǎng)更為優(yōu)越，這是由于其顯示出更好的糖基化模式。
實(shí)施例10-在生物反應(yīng)器中用強(qiáng)化培養(yǎng)基生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素在5L的生物反應(yīng)器中以Fed-Batch(Kamp 11 B5-1和2)模式培養(yǎng)CHO細(xì)胞系6C2。生物反應(yīng)器1的操作如在實(shí)施例10(Kamp 4 B5-2)中所示。生物反應(yīng)器2中應(yīng)用的細(xì)胞培養(yǎng)基由補(bǔ)充以強(qiáng)化氨基酸的50∶50DMEM/HamsF12組成并含有0.325％的植物肽、0.1％ lutrol、6.4g/L葡萄糖、2.5g/L NaHCO3、乙醇胺、檸檬酸鐵、抗壞血酸、亞硒酸鈉和0.6g/L磷酸鹽。將細(xì)胞以約5×105細(xì)胞/mL接種到1250mL培養(yǎng)基中。pO2設(shè)定為50％空氣飽和，溫度為37℃。開始時(shí)的pH設(shè)為7.1。發(fā)酵過程中逐漸降至6.9。
培養(yǎng)過程中生物反應(yīng)器2中的葡萄糖濃度保持在3到4g/L之間。2.5天后用新鮮培養(yǎng)基將反應(yīng)液補(bǔ)充至5L。第6、7、8、9和10天后加入含氨基酸、糖和植物來源蛋白胨的強(qiáng)化營養(yǎng)濃縮液繼續(xù)批發(fā)酵。在第11天回收含Epo的上清。
用營養(yǎng)強(qiáng)化的培養(yǎng)基(氨基酸、葡萄糖、植物蛋白胨和磷酸鹽)以及pH從7.1到6.9移動(dòng)的條件進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)可使最終的Epo濃度以相當(dāng)?shù)奶腔Ｊ教岣邇杀兑陨稀?br> 實(shí)施例11-在不含動(dòng)物來源組份的生物反應(yīng)器中生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素在5-L的生物反應(yīng)器中以Fed-Batch(Kamp 17 B5-1和3)模式培養(yǎng)CHO細(xì)胞系6C2。除非另外指出，所有參數(shù)的設(shè)定如實(shí)施例10(Kamp 4B5-2)中所示。在生物反應(yīng)器2中，應(yīng)用的細(xì)胞培養(yǎng)基不含任何的動(dòng)物來源的組份。例如，通常源自動(dòng)物(如鮭魚或人毛發(fā))的氨基酸酪氨酸或半胱氨酸已由合成氨基酸替換。
2.5天后用新鮮培養(yǎng)基將反應(yīng)液補(bǔ)充至5L。第5、6、7、8和9天后，加入含氨基酸、糖和植物來源蛋白胨的營養(yǎng)濃縮液繼續(xù)批發(fā)酵。在第9到10天回收含促紅細(xì)胞生成素的上清。
發(fā)現(xiàn)不含任何動(dòng)物來源組份的培養(yǎng)基可產(chǎn)生相當(dāng)?shù)淖罱KEpo濃度。但培養(yǎng)物生長(zhǎng)較慢并需要加入額外的營養(yǎng)濃縮液。
實(shí)施例12-在生物反應(yīng)器中以強(qiáng)化培養(yǎng)基(維生素、痕量元素)生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素在10L的生物反應(yīng)器中以Fed-Batch(Kamp 12 C)模式培養(yǎng)CHO細(xì)胞系6C2。除以下的不同，生物反應(yīng)器按實(shí)施例11(Kamp 11 B5-2)操作應(yīng)用的細(xì)胞培養(yǎng)基由補(bǔ)充有強(qiáng)化氨基酸的50∶50 DMEM/HamsF12組成并包含0.325％的植物肽、0.1％lutrol、6.4g/L葡萄糖、2.5g/L NaHCO3、乙醇胺、檸檬酸鐵、維生素、痕量元素、亞硒酸鈉和0.6g/L磷酸鹽。濃縮液中的濃度加倍并富含維生素。
將細(xì)胞以約5×105細(xì)胞/mL接種到4500mL的培養(yǎng)基中。pO2設(shè)為50％空氣飽和，溫度為37℃。起始的pH設(shè)為7.1。在發(fā)酵過程中逐漸降至6.9。
在培養(yǎng)過程中生物反應(yīng)器中的葡萄糖濃度保持在3到4g/L之間。3天后用新鮮培養(yǎng)基將反應(yīng)液補(bǔ)充至10L。第6、7、8、9、10、11和12天后加入強(qiáng)化的營養(yǎng)濃縮液繼續(xù)批發(fā)酵。在第13天回收含促紅細(xì)胞生成素的上清。
實(shí)施例13-Epo的分離細(xì)胞分離通過不連續(xù)飼料分批發(fā)酵無血清條件下培養(yǎng)的中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成素。發(fā)酵(在2個(gè)不同生物反應(yīng)器中的4xca.1+2批模式延伸階段)后將具有約200-300mg/L rhEpo的回收發(fā)酵物冷卻到2-8℃，且不經(jīng)過中間的存儲(chǔ)階段即進(jìn)行澄清，所述澄清首先通過圓盤層疊分離器離心隨后通過深度過濾(Seitz Bio10或CunoA90M08，產(chǎn)量約300L/m2過濾面積)以及0.2μ過濾(PP Polygard 0.1μm，Sartobran P，Sartorius或Duropore 0.22μ，Millipore)。為避免高度細(xì)胞裂解以及隨后的HCPs(宿主細(xì)胞蛋白質(zhì))的高產(chǎn)物污染，重要的是首先在最佳的時(shí)間點(diǎn)(主培養(yǎng)的約12天，氧消耗停滯)回收，其次是應(yīng)用專門為脆弱的真核細(xì)胞設(shè)計(jì)的細(xì)胞分離設(shè)備，例如具有水氣密入口的CSC6(6000m2ECA，15500xg，約200L/h，Westfalia)或具有平緩圓盤入口和箭豬樣出口的BTPX 250(11000m2ECA，13000xg，300L/h，Alfa Laval)。對(duì)包括切向流動(dòng)過濾和離心的不同分離技術(shù)進(jìn)行比較揭示出細(xì)胞裂解中剪切力(通過胞內(nèi)標(biāo)志酶LDH的釋放測(cè)定)的差異。離心為最溫和的分離方法(＜3U LDH/mg rhEpo)并成為優(yōu)選。
最為備選，僅將以上描述的通過圓盤層疊分離器(不含深度過濾步驟)的離心用于細(xì)胞分離步驟。在另一備選中，應(yīng)用以上描述的深度過濾步驟(不含離心步驟)。
通過陰離子交換(AEX)層析進(jìn)行捕獲澄清后用約3倍體積的水稀釋原始上清以使最終導(dǎo)電率達(dá)到小于或等于5mS/cm并用Tris堿將pH調(diào)至7.5，之后加到AEX-捕獲樹脂。
應(yīng)用的AEX-柱子的床高度約10-20cm，充填以具有較好流動(dòng)特性的QCeramic HyperD F(Biosepra)。柱子用20mM Tris pH7.5和50mM NaCl平衡。然后將稀釋的細(xì)胞上清加樣到(每mL樹脂10-15mg rhEpo)柱子，流速為4-8cm/分鐘并用10-15倍柱體積(CV)的平衡緩沖液洗滌柱子。通過改換到具更高電導(dǎo)率的緩沖液逐步洗脫產(chǎn)物，所述緩沖液為20mM Tris pH7.5，含150mM NaCl。收集峰級(jí)分且產(chǎn)量為約50-60％。
在一備選中，通過超濾濃縮級(jí)分池以減小中間體體積并使隨后的沉淀?xiàng)l件標(biāo)準(zhǔn)化。優(yōu)選地應(yīng)用5到10kDa的截止膜并將靶產(chǎn)物濃度調(diào)整為約20mg/ml。
硫酸銨沉淀來自先前步驟的捕獲池通常應(yīng)用2.4M(NH4)2SO4進(jìn)行進(jìn)一步的純化以沉淀污染的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。在此硫酸銨濃度下的沉淀中不存在任何產(chǎn)物，留下純化的無宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)的上清，在隨后的RPC純化前所述上清必須經(jīng)過稀釋以使RPC中(NH4)2SO4＜240mM。
向1倍體積的捕獲池中加1.5倍體積的硫酸銨母液(4M(NH4)2SO4，20mM Tris pH7.5)進(jìn)行沉淀，于10-15℃孵育30分鐘并通過深度過濾(SeitzBio10或Cuno A90M08)和0.2μ過濾(Sartobran P，Sartorius或Duropore0.22μ，Millipore)分離沉淀。在高洗脫體積＝稀釋的rhEpo洗脫池(＜5mgrhEpo/ml)的情形下，可通過任選的UF-濃縮步驟(10kDa截止)提高HCP沉淀。
硫酸銨沉淀的效率高于疏水交互作用層析。
為降低來自前面沉淀步驟中的硫酸銨含量，含產(chǎn)物的上清必須經(jīng)過如上提及的稀釋。備選是超濾/滲濾步驟。優(yōu)選地應(yīng)用5到10kDa截止的膜并將靶硫酸銨濃度調(diào)整為小于240mM以及產(chǎn)物濃度調(diào)整為約30mg/ml。應(yīng)用至滲濾步驟中的緩沖液為20mM Tris/HCl pH7.0。
反相層析下一純化步驟為反相層析，可用于多個(gè)方面a)可根據(jù)其糖骨架(高度糖基化/唾液酸化形式在較低糖基化/唾液酸化形式之前洗脫)很好地分離不同的同種型，b)通過此高效層析移除殘余的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，以及c)該層析對(duì)于移除病毒以及對(duì)于通過有機(jī)溶劑滅活病毒是一有力的步驟。Source30RPC(Amersham Biosciences)為聚合樹脂，其能夠a)在中等壓力(＜10巴)下運(yùn)行，以及b)通過高濃度NaOH進(jìn)行滅菌處理。優(yōu)選的床高度在10至15cm之間，推薦的上樣范圍為8-12mg rhEpo/ml填充樹脂。
在反相層析(RPC)步驟之前，需將含產(chǎn)物的上清中硫酸銨的終濃度調(diào)整為小于0.24M。該條件可通過進(jìn)行以下步驟實(shí)現(xiàn)，a)通過隨后的直接稀釋步驟(在RPC上樣時(shí)用1體積的rhEpo上清+4體積的20mM Tris/HClpH7.0+5體積的50％(v/v)的CAN在20mM Tris/HClpH7.0，或?yàn)榱嗣庥冒嘿F的有機(jī)溶劑優(yōu)選地在上樣步驟前再次對(duì)20mM Tris/HCl pH7.0進(jìn)行滲濾/濃縮(10kDa截止的UF)。之前柱子已進(jìn)行平衡并在上樣后用溶于20mM Tris pH7.0中的25％(v/v)乙腈(ACN)洗滌。用從25％到50％ACN的線性梯度洗脫產(chǎn)物，以小級(jí)分(特別是約0.2CV，備選地，約0.3-0.5CV)收集在預(yù)先用4體積稀釋緩沖液(50mM Tris pH 7.0)預(yù)填充的容器內(nèi)，以立即降低可誘導(dǎo)聚合并影響隨后AEX層析的溶劑濃度。收集約頭半個(gè)洗脫峰的級(jí)分作為RPC池，用于進(jìn)一步的處理。該池包含有利的高度糖基化的同種型。通過此級(jí)分方法，在細(xì)胞培養(yǎng)基中水平接近20％的126位Ser缺失O-多糖的脫-O-糖基化的rhEpo產(chǎn)物得以移除。
在一備選方法中，為通過暴露于有機(jī)溶劑而誘導(dǎo)病毒滅活，將級(jí)分再充填0.5倍體積的20mM Tris pH7.0，而不是如以上描述的4倍體積的同一緩沖液，并孵育20-40分鐘或更長(zhǎng)。此孵育步驟后，另加入與原始未稀釋級(jí)分體積對(duì)應(yīng)的3.5倍體積的20mM Tris pH7.0，并因此終止病毒滅活。
收集進(jìn)行或未進(jìn)行病毒滅活的級(jí)分用于進(jìn)一步的純化。通常在50-100％最高OD的升點(diǎn)處開始并于級(jí)分為大于約70-80％最高OD的降點(diǎn)處結(jié)束。更早洗脫的級(jí)分可能包含宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，而較后洗脫的級(jí)分包含較少唾液酸化、較低活性的同種型?？闪硗膺M(jìn)行CZE分析以支持對(duì)特定同種型的收集。
陰離子交換層析然后將稀釋的RPC池上樣至高效AEX柱子，所述柱子可再次有助于篩選特定同種型并移除宿主蛋白質(zhì)。此次根據(jù)等電點(diǎn)分離同種型，即根據(jù)與糖基化程度成比例的唾液酸的數(shù)目。應(yīng)用高效樹脂Q-SepharoseHP(Amersham Biosciences)，所述樹脂具有卓越的分離效率。床高度在15至20cm之間。確定所有條件如裝載、梯度和床高度以保持相當(dāng)?shù)偷漠a(chǎn)物濃度，否則由于溶劑誘導(dǎo)的產(chǎn)物聚合可在洗脫過程中導(dǎo)致明顯的后峰。
在20mM Tris pH7.0預(yù)平衡的Q Sepharose HP上將RPC池裝載2-4mg Epo/mL樹脂。在平衡緩沖液的洗滌步驟后，產(chǎn)物以10CV、在平衡緩沖液中的從0到300mM NaCl線性鹽梯度洗脫。以0.1CV或0.25Cv級(jí)分收集洗脫峰并通過CZE分析待分析池以發(fā)現(xiàn)含所需促紅細(xì)胞生成素同種型的正確級(jí)分池。AEX池通常由洗脫峰的后半部分組成，該部分級(jí)分洗脫有高度糖基化和唾液酸化的同種型。
通過應(yīng)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)作為程序進(jìn)行中的控制，甚至當(dāng)由于不同的發(fā)酵條件或宿主細(xì)胞使得來源物中僅含有少數(shù)高度唾液酸化異構(gòu)體時(shí)，它也可產(chǎn)生精確定義的促紅細(xì)胞生成素同種型混合物。
CZE是能夠分離帶不同電荷同種型的高分辨方法。該方法對(duì)每個(gè)級(jí)分中的每一單個(gè)同種型給出定量結(jié)果。該信息使得能夠收集特定級(jí)分并導(dǎo)致批發(fā)酵之間保持一致的同種型特征。一般通過僅收集較后洗脫級(jí)分可去除較早洗脫的低唾液酸化同種型。
大小排阻層析在最后的層析步驟中，通過可移除潛在二聚體和多聚體的大小排阻對(duì)AEX池進(jìn)行加工，并進(jìn)行改變緩沖液用于最終的制劑。用于此步驟的制備級(jí)Superdex75(Pharmacia)甚至在高達(dá)15％柱體積的較高上樣體積時(shí)也具有高分辨率。床高度優(yōu)選地在60至80cm之間。
由于不可能以前一步驟中獲得AEX池中高產(chǎn)度濃度的方式進(jìn)行AEX層析，因此必須在凝膠過濾前濃縮該池。濃縮通過超濾步驟進(jìn)行，所述超濾步驟應(yīng)用10kDa UF-膜，并導(dǎo)致UF-保留物的濃度提高約10倍，即每mL中約10mg促紅細(xì)胞生成素。
約3-7 CV％的UF-保留物直接上樣至20mM磷酸鈉pH7.0，75mMNaCl預(yù)平衡的Superdex75 pg柱子。約1-1.5 CV后產(chǎn)物開始從柱子洗脫并收集洗脫峰以產(chǎn)生SEC-池。
納米過濾為移除潛在的病毒載量，另外進(jìn)行一個(gè)終末的病毒過濾步驟。應(yīng)用設(shè)計(jì)為可移除如15nm小顆粒的特殊膜進(jìn)行該過濾步驟，所述膜如Planova15N(Asahi)。備選的終末納米過濾單元為PALL Ultipor VF Grade DV20或MilliporeViresolve NFP盒或囊。特別對(duì)于小的無包膜病毒如細(xì)小病毒來說，幾乎沒有其它的移除或滅活病毒的工具。
無菌的經(jīng)過濾的SEC-池通過終末的具有適宜膜的濾器且濾液代表最終的散裝藥物物質(zhì)。備選地，可在UF-濃縮和大小排阻層析之間插入納米過濾。
以上說明中提及的所有出版物在此引用作為參考。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將會(huì)明曉，本發(fā)明所描述的方法和系統(tǒng)的多種改變和變更并不背離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明的描述與特定的優(yōu)選實(shí)施方案相關(guān)聯(lián)，但應(yīng)當(dāng)理解所要求權(quán)利的本發(fā)明不應(yīng)過度限制于此類特定實(shí)施方案。實(shí)際上，分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所熟知的那些進(jìn)行本發(fā)明描述模式的多種變更包括在以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
表1重組CHO細(xì)胞用Epo/neo和Epo/dhfr進(jìn)行轉(zhuǎn)染T25轉(zhuǎn)染
96孔轉(zhuǎn)染
不同克隆的擴(kuò)增
表2細(xì)胞池3D5的亞克隆條件和鋪板效率(用0.38μM MTX)
表3亞克隆3D5/1H9和3D5/18E5的亞克隆條件和鋪板效率(1.54M MTX)3D5/1H996孔板編號(hào) 接種細(xì)胞的數(shù)目/孔 ％生長(zhǎng)孔 ％單克隆8(編號(hào)9-16) 106.4％ 85％8(編號(hào)1-8) 3019％ 46％3D5/18E596孔板編號(hào) 接種細(xì)胞的數(shù)目/孔 ％生長(zhǎng)孔 ％單克隆8(編號(hào)9-16) 4 15％ 56％8(編號(hào)1-8) 8 29％ 44％
表4重組CHO克隆的比生產(chǎn)率和比生長(zhǎng)特性
權(quán)利要求
1.用于產(chǎn)生表達(dá)目的重組多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞的方法，該方法包括將下列載體導(dǎo)入真核宿主細(xì)胞(a)第一多核苷酸載體，其包含(i)編碼目的重組多肽的第一核苷酸序列，以及(ii)編碼選擇性標(biāo)記的第二核苷酸序列，其中當(dāng)宿主細(xì)胞與選擇性試劑接觸時(shí)所述第二核苷酸序列被擴(kuò)增，以及(b)第二多核苷酸載體，其具有的核苷酸序列與第一多核苷酸載體基本相同，不同之處在于將第二核苷酸序列替換為編碼不同選擇性標(biāo)記的第三核苷酸序列；第一多核苷酸載體和第二多核苷酸載體被整合入宿主細(xì)胞的基因組中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將第一和第二多核苷酸載體同時(shí)導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中第二核苷酸序列編碼二氫葉酸還原酶多肽且選擇性試劑為氨甲蝶呤。
4.權(quán)利要求1的方法，其中目的重組多肽為人促紅細(xì)胞生成素。
5.權(quán)利要求1的方法，其中第三核苷酸序列編碼對(duì)抗生素的抗性。
6.權(quán)利要求5的方法，其中抗生素為G-418、新霉素或新霉素組的不同抗生素。
7.權(quán)利要求1的方法，其中宿主細(xì)胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
8.用于產(chǎn)生表達(dá)人促紅細(xì)胞生成素的經(jīng)轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞的方法，該方法包括將下列載體導(dǎo)入CHO宿主細(xì)胞(a)第一多核苷酸載體，其包含(i)編碼人促紅細(xì)胞生成素的第一核苷酸序列，以及(ii)編碼二氫葉酸還原酶的第二核苷酸序列；以及(b)第二多核苷酸載體，其具有的核苷酸序列與第一多核苷酸載體基本相同，不同之處在于將編碼二氫葉酸還原酶的核苷酸序列替換為編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的第三核苷酸序列，所述氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶賦予對(duì)G-418、新霉素或新霉素組的不同抗生素的抗性；第一多核苷酸載體和第二多核苷酸載體被整合入宿主細(xì)胞的基因組中。
9.權(quán)利要求8的方法，其中第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列可操作地與SV40早期啟動(dòng)子連接。
10.權(quán)利要求8的方法，其中第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列可操作地與編碼SV40大T多聚腺苷酸化信號(hào)的核苷酸序列連接。
11.產(chǎn)生目的重組多肽的方法，該方法包括在允許第一核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)由權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的方法，其中在引起第二核苷酸序列擴(kuò)增的選擇性試劑存在下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的方法，其中第二核苷酸序列編碼二氫葉酸還原酶多肽且選擇性試劑為氨甲蝶呤。
14.權(quán)利要求11的方法，其中目的重組多肽為促紅細(xì)胞生成素。
15.權(quán)利要求11的方法，其中表達(dá)的目的重組多肽分泌到培養(yǎng)基中。
16.權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基中回收表達(dá)的目的重組多肽。
17.權(quán)利要求16的方法，其中目的重組多肽為促紅細(xì)胞生成素。
18.經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核宿主細(xì)胞，其包含整合入其一條或多條染色體中的下列載體(a)第一多核苷酸載體，其包含(i)編碼目的重組多肽的第一核苷酸序列；以及(ii)第二核苷酸序列，其中當(dāng)該第二核苷酸序列整合入宿主細(xì)胞基因組，在宿主細(xì)胞與引起該核苷酸序列擴(kuò)增的選擇性試劑接觸時(shí)，該第二核苷酸序列被擴(kuò)增，以及(b)第二多核苷酸載體，其具有的核苷酸序列與第一多核苷酸載體基本相同，不同之處在于將第二核苷酸序列替換為編碼不同選擇性標(biāo)記的第三核苷酸序列。
19.權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中第二核苷酸序列編碼二氫葉酸還原酶多肽。
20.權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中目的重組多肽為促紅細(xì)胞生成素。
21.權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其為CHO細(xì)胞。
22.經(jīng)轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其包含穩(wěn)定整合入其一條或多條染色體中的下列多核苷酸序列(a)編碼二氫葉酸還原酶多肽和促紅細(xì)胞生成素的多核苷酸序列，以及(b)與(a)的多核苷酸序列不同且編碼促紅細(xì)胞生成素和編碼賦予抗生素抗性的多肽的多核苷酸序列。
23.權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞，其中抗生素為G-418、新霉素或新霉素組中的不同抗生素。
24.權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞，其為CHO細(xì)胞。
25.用于產(chǎn)生重組人促紅細(xì)胞生成素的方法，該方法包括在允許編碼人促紅細(xì)胞生成素的多核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞。
26.權(quán)利要求25的方法，其中在氨甲蝶呤存在下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
27.權(quán)利要求25的方法，其中表達(dá)的目的重組多肽分泌到培養(yǎng)基中。
28.權(quán)利要求27的方法，其進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基中回收表達(dá)的目的重組多肽。
29.組合物，其包含(a)第一多核苷酸載體，其包含(i)編碼目的重組多肽的第一核苷酸序列，以及(ii)第二核苷酸序列，其中當(dāng)該第二核苷酸序列整合入宿主細(xì)胞基因組，在宿主細(xì)胞與引起該核苷酸序列擴(kuò)增的選擇性試劑接觸時(shí)，該第二核苷酸序列被擴(kuò)增，以及(b)第二多核苷酸載體，其具有的核苷酸序列與第一多核苷酸載體基本相同，不同之處在于將第二核苷酸序列替換為編碼不同選擇性標(biāo)記的第三核苷酸序列。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中目的重組多肽為人促紅細(xì)胞生成素。
31.權(quán)利要求29的組合物，其中第二核苷酸序列編碼二氫葉酸還原酶。
32.權(quán)利要求29的組合物，其中第三核苷酸序列編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生表達(dá)目的重組多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞的方法，該方法包括將下列物質(zhì)導(dǎo)入真核宿主細(xì)胞(a)第一多核苷酸載體，其包含(i)編碼目的重組多肽的第一核苷酸序列；以及(ii)編碼選擇性標(biāo)記的第二核苷酸序列，其中當(dāng)宿主細(xì)胞與選擇性試劑接觸時(shí)該第二核苷酸序列被擴(kuò)增；以及(b)第二多核苷酸載體，其核苷酸序列與第一多核苷酸載體基本相同，不同之處在于第二核苷酸序列替換為編碼不同選擇性標(biāo)記的第三核苷酸序列；第一多核苷酸載體和第二多核苷酸載體被穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞基因組中。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1596310SQ02823696
公開日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2002年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月28日
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